CN104359892B - 一种不同模态分子振动光谱检测与成像装置 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种不同模态分子振动光谱检测与成像装置及方法，该装置主要由激光器单元、光学扫描显微单元、受激拉曼散射信号探测与获取单元以及自发拉曼光谱检测部件等功能单元的相关器件构成。依据该方法实施，可以在活细胞、离体的生物组织和活体小动物上快速实现单激光束工作方式下的自发拉曼光谱检测和双激光束工作方式下的受激拉曼散射显微成像二种不同模态分子振动散射信号的原位获取，实现对靶目标的定量显微成像和定性光谱分析，获得靶目标组成成分的特征信息，为样本的光学诊断与深入分析提供重要数据。
Description
技术领域
本发明涉及一种不同模态分子振动光谱检测与成像装置及方法。
背景技术
光学显微成像技术由于对生物样本具有无损伤、非侵入等优点，使其在生物学领域有着重要地位。特别地，十九世纪末期新出现的激光共焦扫描显微成像和双光子激发荧光成像技术等，由于它们具有较高的空间分辨能力和三维光学成像能力，使得光学显微术在生物学、医学及其相关交叉学科的基础研究和临床上获得了广泛的应用。然而，由于生物样本荧光显微成像通常需要借助外源性荧光染料，而外源性染料的添加在一定程度上会干扰和影响一些小分子的特性，从而影响光学分子成像的实验结果。因此，作为无需荧光标记的分子振动光谱技术，如自发拉曼光谱检测与显微成像技术应运而生。
自发拉曼信号是一种光散射信号，当入射的激光被物质中的分子散射时，其中一大部分的散射光与入射激光具有相同的波长或颜色，即发生瑞利散射。此外，还有极小一部分(大约10-9)散射光的波长与入射光不同，产生了偏离，即发生了自发拉曼散射。入射光与散射光波长偏离量的大小取决于测试样品的组成成分或化学键结构，其中波长增大的散射光称为斯托克斯散射，它是自发拉曼散射光谱的主要组成。
虽然自发拉曼散射光谱是一种免荧光标记的分子影像技术，但由于自发拉曼散射的分子横截面积(约10-30cm2)远小于荧光色团分子的横截面积(约10-16cm2)，因此自发拉曼散射的光信号很微弱，采集一幅拉曼光谱图像一般需要数小时，直接制约了自发拉曼显微成像技术在生物样品，特别是活细胞上的分子成像。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种不同模态分子振动光谱检测与成像装置及方法，该方法可以无损地在包括活细胞在内的生物样本快速实施受激拉曼散射显微成像和自发拉曼散射光谱检测的原位测量，实现对靶目标特定化学键的分子振动进行显微成像，尔后根据显微图像定位和选择检测位置，进行原位自发拉曼光谱检测，进一步定性分析靶目标的物质成份。
为了实现上述目的，本发明的技术方案一是：一种不同模态分子振动光谱检测与成像装置，包括激光器系统，所述激光器系统的输出方向沿第一光路依次设置有第一脉冲激光功率调节单元、光路切换器件、脉冲展宽器件和时间延迟单元，所述激光器系统的输出方向沿第二光路依次设置有第二脉冲激光功率调节单元和声光调制器，所述时间延迟单元和第二脉冲激光功率调节单元的输出方向共同依次设置有第一二向色镜、激光束扫描单元、第二二向色镜、第一物镜以及用于放置待测样品的载物台，所述第二二向色镜的输出端沿其反射方向依次设置有第一会聚透镜、孔径光栏以及第一凹面反射镜，所述第一凹面反射镜的输出光通过反射型光栅输入到第二凹面反射镜，所述第二凹面反射镜的输出光输入到CCD探测器。
进一步的，所述第一脉冲激光功率调节单元包含沿第一光路依次设置的第一半波片和第一偏振分光片，所述第二脉冲激光功率调节单元包含沿第二光路依次设置的第二半波片和第二偏振分光片。
进一步的，所述脉冲展宽器件的输出端与时间延迟单元的输入端之间设置有第一反射镜。
进一步的，所述激光器系统的输出端与第二脉冲激光功率调节单元的输入端之间设置有光开关。
进一步的，所述激光束扫描单元的输出端与第二二向色镜的输入端之间设置有第二反射镜。
进一步的，所述载物台下方从上往下依次设置有第二物镜、第三反射镜、第二会聚透镜、光学滤光片以及光电探测器。
进一步的，所述声光调制器和光电探测器分别通过锁相放大器电性连接至数据处理中心。
为了实现上述目的，本发明的技术方案二是：一种不同模态分子振动光谱检测与成像方法，采用上述的不同模态分子振动光谱检测与成像装置，将待测样品放置于载物台上，包括以下两种模式：
（1）自发拉曼散射光谱检测模式：从激光器系统仅出射一束的飞秒脉冲激光，先经过第一脉冲激光功率调节单元实现对飞秒脉冲激光的功率调节后，然后经光路切换器件和脉冲展宽器件实现飞秒脉冲激光的脉冲展宽大于100ps以作为自发拉曼光谱的激发光源，并依次通过时间延迟单元、第一二向色镜、激光束扫描单元、第二二向色镜和第一物镜，最后辐照在待测样品上；当施行后向测量方式时，激发光束与待测样品相互作用产生的自发拉曼散射光信号经第一物镜向后返回，并经第二二向色镜反射、第一会聚透镜会聚后经过孔径光栏，再经第一凹面反射镜成一平行光束照射在反射型光栅上，经反射型光栅分光后的光束再由第二凹面反射镜进行反射，并传送给CCD探测器进行信号采集；
（2）受激拉曼散射显微成像模式：从激光器系统出射两束光，分别为泵浦光和探测光；探测光先经过第一脉冲激光功率调节单元，接着经过时间延迟单元后形成探测光束；泵浦光先经过第二脉冲激光功率调节单元，接着经过声光调制器后形成高频调制的脉冲光束，并与探测光束在第一二向色镜处实现时间和空间上的耦合与共线，耦合后的光束入射进入激光束扫描单元，最后经过第一物镜会聚作用在待测样品上，两束超短脉冲激光在它们的波长或波数差与待测样品中相关分子化学键振动光谱的拉曼位移相同或相近时，诱导特定化学键分子振动的受激拉曼散射效应。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：该装置主要由激光器单元、光学扫描显微单元、受激拉曼散射信号探测与获取单元以及自发拉曼光谱检测部件等功能单元的相关器件构成。依据该方法实施，可以在活细胞、离体的生物组织和活体小动物上快速实现单激光束工作方式下的自发拉曼光谱检测和双激光束工作方式下的受激拉曼散射显微成像二种不同模态分子振动散射信号的原位获取，实现对靶目标的定量显微成像和定性光谱分析，获得靶目标组成成分的特征信息，为样本的光学诊断与深入分析提供重要数据。
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步详细的阐述。
附图说明
图1为本发明实施例的原理示意图。
图中标记：1-激光器系统，2-第一半波片，3-第一偏振分光片，4-光路切换器件，5-脉冲展宽器件，6-第一反射镜，7-时间延迟单元，8-第一二向色镜，9-光开关，10-第二半波片，11-第二偏振分光片，12-声光调制器，13-激光束扫描单元，14-第二反射镜，15-第二二向色镜，16-第一会聚透镜，17-孔径光栏，18-第一凹面反射镜，19-数据处理中心，20-锁相放大器，21-反射型光栅，22-第一物镜，23-CCD探测器，24-第二凹面反射镜，25-待测样品，26-第二物镜，27-第三反射镜，28-第二会聚透镜，29-光学滤光片，30-光电探测器。
具体实施方式
如图1所示，一种不同模态分子振动光谱检测与成像装置，包括激光器系统1，所述激光器系统1的输出方向沿第一光路依次设置有第一脉冲激光功率调节单元、光路切换器件4、脉冲展宽器件5和时间延迟单元7，所述激光器系统1的输出方向沿第二光路依次设置有第二脉冲激光功率调节单元和声光调制器12，所述时间延迟单元7和第二脉冲激光功率调节单元的输出方向共同依次设置有第一二向色镜8、激光束扫描单元13、第二二向色镜15、第一物镜22以及用于放置待测样品25的载物台，所述第二二向色镜15的输出端沿其反射方向依次设置有第一会聚透镜16、孔径光栏17以及第一凹面反射镜18，所述第一凹面反射镜18的输出光通过反射型光栅21输入到第二凹面反射镜24，所述第二凹面反射镜24的输出光输入到CCD探测器23。
在本实施例中，所述第一脉冲激光功率调节单元包含沿第一光路依次设置的第一半波片2和第一偏振分光片3，所述第二脉冲激光功率调节单元包含沿第二光路依次设置的第二半波片10和第二偏振分光片11。所述脉冲展宽器件5的输出端与时间延迟单元7的输入端之间设置有第一反射镜6。所述激光器系统1的输出端与第二脉冲激光功率调节单元的输入端之间设置有光开关9。所述激光束扫描单元13的输出端与第二二向色镜15的输入端之间设置有第二反射镜14。所述载物台下方从上往下依次设置有第二物镜26、第三反射镜27、第二会聚透镜28、光学滤光片29以及光电探测器30。所述声光调制器12和光电探测器30分别通过锁相放大器20电性连接至数据处理中心19，即计算机。
如图1所示，一种不同模态分子振动光谱检测与成像方法，采用上述的不同模态分子振动光谱检测与成像装置，将待测样品25放置于载物台上，包括以下两种模式：
（1）自发拉曼散射光谱检测模式：在此工作模式下，只需要单激光光束，上述装置就可以实现自发拉曼散射光谱检测，具体如下：从激光器系统1仅出射一束的飞秒脉冲激光，先经过第一半波片2和第一偏振分光片3实现对飞秒脉冲激光的功率调节后，然后经光路切换器件4和脉冲展宽器件5实现飞秒脉冲激光的脉冲展宽大于100ps以作为自发拉曼光谱的激发光源（单光子激发）；由于测量信号为自发拉曼光谱信号，因此选择激光束扫描单元13工作在点方式下，即暂停扫描，此时激光束经第一反射镜6反射后，并依次通过时间延迟单元7、第一二向色镜8、激光束扫描单元13、第二反射镜14、第二二向色镜15和第一物镜22，最后辐照在待测样品25上；当施行后向测量方式时，激发光束与待测样品25相互作用产生的自发拉曼散射光信号经第一物镜22向后返回，并经第二二向色镜15反射、第一会聚透镜16会聚后经过孔径光栏17，再经第一凹面反射镜18成一平行光束照射在反射型光栅21上，经反射型光栅21分光后的光束再由第二凹面反射镜24进行反射，并传送给制冷型CCD探测器23进行信号采集；
（2）受激拉曼散射显微成像模式：在此工作模式下，需要双激光光束，上述装置就可以实现受激拉曼散射显微成像，具体如下：从激光器系统1出射两束光，分别为泵浦光和探测光；探测光先经过第一脉冲激光功率调节单元，接着经过时间延迟单元7后形成探测光束；泵浦光先经过第二脉冲激光功率调节单元，接着经过声光调制器12后形成高频调制的脉冲光束，并与探测光束在第一二向色镜8处实现时间和空间上的耦合与共线（共水平方向），耦合后的光束入射进入激光束扫描单元13，最后经过第一物镜22会聚作用在待测样品25上，由于是两束超短脉冲激光同时作用于待测样品25，当它们的波长或波数差与待测样品25中相关分子化学键振动光谱的拉曼位移相同或相近时，能够诱导特定化学键分子振动的受激拉曼散射效应。
本发明考虑到CCD表面是一个平面，因此采用了两个凹面反射镜，从而能有效地保证到达CCD的光谱信号在同一平面上，从而提高信号的空间分辨率和信噪比。本发明实施例测量的拉曼信号是一高频的调制信号，因此受激散射光信号经光电探测器30后连接至锁相放大器20进行频率解调，最后再传送到数据处理中心19进行数据分析与处理。当待测样品25为组织切片或活细胞时，可以选择在待测样品25的前方（前向探测方式）或后方（后向探测方式）进行探测，选择合适的窄带滤光片便能够获得受激相干拉曼散射光信号；当待测样品25为活体小动物或厚的组织样品时，则只能采用后向测量方式测量受激相干拉曼散射信号。
为了实施受激拉曼散射显微成像和自发拉曼光谱的原位快速获取，实现对生物样品中特定化学键分子振动的显微成像及其自发拉曼光谱的原位检测，本发明仅给了前向式的受激拉曼散射信号获取和后向式的自发拉曼散射光谱信号的获取方案。实际上，对于生物组织的切片或活细胞的实验测量，二种不同模态（受激拉曼散射和自发拉曼散射）都可以采用同时采用前向式或后向式测量，但对于活体小动物实验，则只能采用后向式测量方式。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (7)
1.一种不同模态分子振动光谱检测与成像装置，包括具备第一脉冲激光功率调节单元和第二脉冲激光功率调节单元的激光器系统，其特征在于：所述激光器系统的输出方向沿第一光路依次设置有第一脉冲激光功率调节单元、光路切换器件、脉冲展宽器件和时间延迟单元，所述激光器系统的输出方向沿第二光路依次设置有第二脉冲激光功率调节单元和声光调制器，所述时间延迟单元和第二脉冲激光功率调节单元的输出方向共同依次设置有第一二向色镜、激光束扫描单元、第二二向色镜、第一物镜以及用于放置待测样品的载物台，所述第二二向色镜的输出端沿其反射方向依次设置有第一会聚透镜、孔径光栏以及第一凹面反射镜，所述第一凹面反射镜的输出光通过反射型光栅输入到第二凹面反射镜，所述第二凹面反射镜的输出光输入到CCD探测器。
2.根据权利要求1所述的不同模态分子振动光谱检测与成像装置，其特征在于：所述第一脉冲激光功率调节单元包含沿第一光路依次设置的第一半波片和第一偏振分光片，所述第二脉冲激光功率调节单元包含沿第二光路依次设置的第二半波片和第二偏振分光片。
3.根据权利要求1或2所述的不同模态分子振动光谱检测与成像装置，其特征在于：所述脉冲展宽器件的输出端与时间延迟单元的输入端之间设置有第一反射镜。
4.根据权利要求1或2所述的不同模态分子振动光谱检测与成像装置，其特征在于：所述激光器系统的输出端与第二脉冲激光功率调节单元的输入端之间设置有光开关。
5.根据权利要求1所述的不同模态分子振动光谱检测与成像装置，其特征在于：所述激光束扫描单元的输出端与第二二向色镜的输入端之间设置有第二反射镜。
6.根据权利要求5所述的不同模态分子振动光谱检测与成像装置，其特征在于：所述载物台下方从上往下依次设置有第二物镜、第三反射镜、第二会聚透镜、光学滤光片以及光电探测器。
7.根据权利要求6所述的不同模态分子振动光谱检测与成像装置，其特征在于：所述声光调制器和光电探测器分别通过锁相放大器电性连接至数据处理中心。
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