CN106092986B - 脑组织的无标记高分辨成像系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于探测脑组织内源性不同分子的双光子激发荧光信号、二次谐波信号和特征拉曼光谱信号，对脑组织的微结构进行无标记高分辨成像的系统。钛宝石飞秒激光器产生飞秒激光脉冲通过分光镜将飞秒激光分成两路，一路入射到光学参量振动器后经由光声调制器进行高频强度调制，通过全反射镜与另一路同步汇合，经过双色分光镜，由光纤耦合透镜聚焦，入射到光纤，光纤的另一端连接激发信号光探头，将光聚焦到脑组织上，激光与脑组织产生的双光子激发荧光信号、二次谐波信号和受激拉曼散射光信号，反向通过相同的小型激发信号光探头收集，经光纤和光纤耦合透镜收集，由双色分光镜反射到探测系统。本发明能对脑组织内源性不同成分的微结构进行高对比度成像。

Description

脑组织的无标记高分辨成像系统
技术领域
本发明涉及一种基于探测脑组织内源性不同分子的双光子激发荧光信号、二次谐波信号和特征拉曼光谱信号，对脑组织的微结构进行无标记高分辨成像的系统。
技术背景
无标记成像技术因其具有可以用于术中原位病理状态实时诊断的潜力，而在医学成像技术领域引起关注。双光子激发荧光显微成像技术和二次谐波成像技术是无标记多光子显微成像技术的主要成像模式，自1990年Denk 和 Webb 实现了双光子激发荧光显微成像以来，生物组织的许多内源性分子，如：弹力蛋白、角蛋白、NADH、FAD等，被发现在无须外加分子探针的情况就能产生较强的双光子激发荧光信号，同时，生物组织内源性具有非中心对称结构的胶原蛋白、肌浆球蛋白和微管等能产生较强的二次谐波信号。基于脑组织内源性不同分子的双光子激发荧光和二次谐波信号，可以获得达到组织病理学高分辨率的神经元细胞、胶质细胞、柱状上皮细胞、神经纤维束、弹力纤维束、胶原纤维束等脑组织微结构成像。受激拉曼散射显微技术是一种新型的相干拉曼散射成像技术，通过受激过程增强拉曼信号，利用生物组织中脂类、蛋白和核酸等不同分子的特征拉曼光谱性质，实现不同生物分子的无标记显微成像。因其具有不受非共振背景的干扰、光谱与自发拉曼光谱高度相似以及信号强度正比于探测分子的浓度等独特优势，成为可以实现对活细胞的无标记和新型非荧光标记成像的一种新技术，在脑组织等生命科学成像领域显示了极大的应用潜力。上述脑组织的无标记高分辨成像技术，从三种完全不同的物理机制出发，实现对脑组织中不同微结构的无标记高分辨成像。集三种先进的无标记成像技术于一身的高分辨成像系统，将能够更全面地反映脑组织的生理病理状态变化引起的组织中不同成分的改变，从而拓展无标记高分辨成像在生物医学领域的应用。
发明内容
本发明涉及一种基于探测脑组织内源性不同分子的双光子激发荧光信号、二次谐波信号和特征拉曼光谱信号，对脑组织的微结构进行无标记高分辨成像的系统。
本发明采用以下技术方案实现：一种脑组织的无标记高分辨成像系统，其包括一钛宝石飞秒激光器；所述钛宝石飞秒激光器产生飞秒激光脉冲通过一个分光镜将飞秒激光分成两路，一路拥有80%能量的光作为泵浦光，入射到光学参量振动器后产生斯托克斯光，再经由光声调制器进行高频强度调制，再通过全反射镜与另一路拥有20%能量的飞秒激光脉冲线性同步汇合；汇合后的光经过第一双色分光镜，再由光纤耦合透镜聚焦，入射到能够同时传输激发光源和激发信号的空芯双包层光子晶体光纤，所述光纤的另一端连接一小型激发信号光探头，所述激发信号光探头由光纤扫描器和梯度折射率透镜构成；所述激发信号光探头将光聚焦到脑组织上；激光与脑组织产生的双光子激发荧光信号、二次谐波信号和受激拉曼散射光信号，反向通过相同的激发信号光探头收集，经光纤和光纤耦合透镜收集，由第二双色分光镜反射到探测系统；双光子激发荧光和二次谐波信号由光电倍增管探测，光电倍增管探测将光信号转换成电信号接至计算机的输入端；受激拉曼散射光信号由光电二极管探测，经锁相放大器放大接至计算机的输入端，最后由计算机同时显示来自脑组织内源性不同成分微结构的高对比度成像。
在本发明一实施例中，所述钛宝石飞秒激光器的激发波长选用810nm，频率为80MHz；经光学参量振动器后产生的斯托克斯光波长应选在1052.56 nm，频率为80MHz；斯托克斯光，经由光声调制器4进行高频强度调制，脉冲重复频率调制到10MHz；此时，拉曼散射频率位移为2845cm-1, 将有利于脑组织中脂类、蛋白、核酸及其他不同分子的无标记受激拉曼散射显微成像。
在本发明一实施例中，所述第一双色分光镜能透过810nm的泵浦光源，并同时反射1052.56nm的斯托克斯光。
在本发明一实施例中，所述第二双色分光镜能透过810nm的泵浦光源和1052.56nm的斯托克斯光，同时反射激发光源与脑组织样品相互作用产生的发射信号光。
在本发明一实施例中，所述长通滤波片选择LPF420 nm，透射大于420nm的双光子激发荧光信号，反射小于420nm的二次谐波信号光，所述的滤波片15 应透过395nm-415nm波段的二次谐波信号。
本发明的显著优点在于： (1) 钛宝石飞秒激光器产生810 nm、80MHz的飞秒激光脉冲，既作为生物内源性分子的双光子激发荧光和二次谐波信号的激发光源，又作为生物内源性分子的受激拉曼散射光信号的泵浦光源。(2)斯托克斯光经由光声调制器进行高频强度调制，脉冲重复频率调制到10MHz，同时，由光电二极管探测到的受激拉曼散射光信号经锁相放大器放大接至计算机的输入端，二者的结合，保证了在较弱的受激拉曼散射信号强度下，也可获得清晰的受激拉曼散射成像。(3) 能够同时传输激发光源和激发信号光的空芯双包层光子晶体光纤，连接由光纤扫描器和梯度折射率透镜构成的小型激发信号光探头，可以实现在自由移动的脑组织上的成像。
附图说明
图1为本发明一实施例的构造示意图。
【标号说明】：1为钛宝石飞秒激光器，2为分光镜，3为光学参量振荡器，4为光声调制器，5为全反射镜，6为双色分光镜，7为光纤耦合透镜，8为光纤，9为小型激发信号光探头，10为双色分光镜；11为半透半反镜，12为长通滤波片，13为光电倍增管；14为计算机；15为滤波片，16为光电倍增管，17为光电二极管，18为锁相放大器。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例作进一步的阐述，以使本发明更明显易懂。
本发明提供一种脑组织的无标记高分辨成像系统，其包括一钛宝石飞秒激光器；所述钛宝石飞秒激光器产生飞秒激光脉冲通过一个分光镜将飞秒激光分成两路，一路拥有80%能量的光作为泵浦光，入射到光学参量振动器后产生斯托克斯光，再经由光声调制器进行高频强度调制，再通过全反射镜与另一路拥有20%能量的飞秒激光脉冲线性同步汇合；汇合后的光经过第一双色分光镜，再由光纤耦合透镜聚焦，入射到能够同时传输激发光源和激发信号的空芯双包层光子晶体光纤，所述光纤的另一端连接一小型激发信号光探头，所述激发信号光探头由光纤扫描器和梯度折射率透镜构成；所述激发信号光探头将光聚焦到脑组织上；激光与脑组织产生的双光子激发荧光信号、二次谐波信号和受激拉曼散射光信号，反向通过相同的激发信号光探头收集，经光纤和光纤耦合透镜收集，由第二双色分光镜反射到探测系统；双光子激发荧光和二次谐波信号由光电倍增管探测，光电倍增管探测将光信号转换成电信号接至计算机的输入端；受激拉曼散射光信号由光电二极管探测，经锁相放大器放大接至计算机的输入端，最后由计算机同时显示来自脑组织内源性不同成分微结构的高对比度成像。
具体实施例参见图1。
钛宝石飞秒激光器1产生810 nm、80MHz的飞秒激光脉冲，通过一个80/20的分光镜2将飞秒激光分成两路，一路光拥有80%能量的光作为泵浦光，入射到光学参量振动器3后产生1052.56 nm、80MHz的斯托克斯光，经由光声调制器4进行高频强度调制，脉冲重复频率调制到10MHz，通过全反射镜5与另一路拥有20%能量的810 nm、80MHz的飞秒激光脉冲在时间上和空间上线性同步汇合，经过双色分光镜6，由光纤耦合透镜7聚焦，入射到能够同时传输激发光源和激发信号的空芯双包层光子晶体光纤8，光纤8的另一端连接由光纤扫描器和梯度折射率透镜构成的小型激发信号光探头9，将光聚焦到脑组织上，激光与脑组织相互作用产生的双光子激发荧光信号、二次谐波信号和受激拉曼散射光信号，反向通过相同的小型激发信号光探头9收集，经光纤8和光纤耦合透镜7收集，由双色分光镜10反射，通过半透半反镜11，将激发信号光分成两路，一路由长通滤波片12 (LPF420 nm) 透射大于420nm的双光子激发荧光信号，到达光电倍增管13，将光信号转换成电信号接至计算机14的输入端，探测810 nm的光激发产生的430 nm-700 nm波段的双光子激发荧光信号；长通滤波片12(LPF420 nm) 反射小于420nm的光信号，经由滤波片15到达光电倍增管16，将光信号转换成电信号接至计算机14的输入端，探测810 nm的光激发产生的395nm-415nm波段的二次谐波信号；另一路由光电二极管17探测受激拉曼散射光信号，经锁相放大器18放大接至计算机14的输入端，最后由计算机同时显示来自脑组织内源性不同成分微结构的高对比度成像。
在本发明的最佳实施例中，钛宝石飞秒激光器1的激发波长选用810nm，该激发波长有利于同时获得较强的生物组织内源性分子的双光子激发荧光和二次谐波信号，从而获得神经元细胞、胶质细胞、柱状上皮细胞、神经纤维束、弹力纤维束、胶原纤维束等脑组织微结构高对比度成像。
当钛宝石飞秒激光器1作为生物组织内源性分子受激拉曼散射光信号的泵浦光源的波长选用810nm，经光学参量振动器3后产生的斯托克斯光波长应选在1052.56 nm，此时，拉曼散射频率位移为2845cm-1, 将有利于脑组织中脂类、蛋白和核酸等不同分子的无标记受激拉曼散射显微成像。
上述的第一双色分光镜6，应该满足可透过810nm的泵浦光源，并同时反射1052.56nm的斯托克斯光。
上述的第二双色分光镜10，应该满足可透过810nm的泵浦光源和1052.56nm的斯托克斯光，同时，反射激发光源与脑组织样品相互作用产生的发射信号光。
上述的长通滤波片12 选择LPF420 nm，透射大于420nm的双光子激发荧光信号，反射小于420nm的二次谐波信号光。
上述的滤波片15 透过395nm-415nm波段的二次谐波信号。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (5)

1.一种脑组织的无标记高分辨成像系统，其特征在于：包括一钛宝石飞秒激光器；所述钛宝石飞秒激光器产生飞秒激光脉冲通过一个分光镜将飞秒激光分成两路，一路拥有80%能量的光作为泵浦光，入射到光学参量振动器后产生斯托克斯光，再经由光声调制器进行高频强度调制，再通过全反射镜与另一路拥有20%能量的飞秒激光脉冲线性同步汇合；汇合后的光经过第一双色分光镜，再由光纤耦合透镜聚焦，入射到能够同时传输激发光源和激发信号的空芯双包层光子晶体光纤，所述光纤的另一端连接一小型激发信号光探头，所述激发信号光探头由光纤扫描器和梯度折射率透镜构成；所述激发信号光探头将光聚焦到脑组织上；激光与脑组织产生的双光子激发荧光信号、二次谐波信号和受激拉曼散射光信号，反向通过相同的激发信号光探头收集，经光纤和光纤耦合透镜收集，由第二双色分光镜反射到探测系统；双光子激发荧光和二次谐波信号由光电倍增管探测，光电倍增管探测将光信号转换成电信号接至计算机的输入端；受激拉曼散射光信号由光电二极管探测，经锁相放大器放大接至计算机的输入端，最后由计算机同时显示来自脑组织内源性不同成分微结构的高对比度成像。
2.根据权利要求1所述的脑组织的无标记高分辨成像系统，其特征在于：所述钛宝石飞秒激光器的激发波长选用810nm，频率为80MHz；经光学参量振动器后产生的斯托克斯光波长应选在1052.56 nm，频率为80MHz；斯托克斯光，经由光声调制器进行高频强度调制，脉冲重复频率调制到10MHz；此时，拉曼散射频率位移为2845cm-1, 将有利于脑组织中脂类、蛋白、核酸及其他不同分子的无标记受激拉曼散射显微成像。
3.根据权利要求1所述的脑组织的无标记高分辨成像系统，其特征在于：所述第一双色分光镜能透过810nm的泵浦光源，并同时反射1052.56nm的斯托克斯光。
4.根据权利要求1所述的脑组织的无标记高分辨成像系统，其特征在于：所述第二双色分光镜能透过810nm的泵浦光源和1052.56nm的斯托克斯光，同时反射激发光源与脑组织样品相互作用产生的发射信号光。
5.根据权利要求1所述的脑组织的无标记高分辨成像系统，其特征在于：第二双色分光镜反射光通过半透半反镜，将激发信号光分成两路，一路由一长通滤波片透射大于420nm的双光子激发荧光信号，到达光电倍增管，将该光信号转换成电信号接至计算机的输入端，探测810 nm的光激发产生的430 nm-700 nm波段的双光子激发荧光信号；长通滤波片反射的小于420nm的光信号经一滤波片到达光电倍增管，将该光信号转换成电信号接至计算机的输入端，探测810 nm的光激发产生的395nm-415nm波段的二次谐波信号；另一路由光电二极管探测受激拉曼散射光信号，经锁相放大器放大接至计算机的输入端，最后由计算机同时显示来自脑组织内源性不同成分微结构的高对比度成像；所述长通滤波片选择LPF420 nm，透射大于420nm的双光子激发荧光信号并反射小于420nm的二次谐波信号光，所述的滤波片应透过395nm-415nm波段的二次谐波信号。
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