WO2023199919A1 - フローサイトメータ、判別方法、及びプログラム - Google Patents

Abstract

フローサイトメータは、蛍光染色剤によって標識されていない測定対象を流体とともに流通させる流路と、照明光を照射する光源と、光源が照射する照明光を、流路における照射位置において流路の幅方向と深さ方向との少なくとも一方について集光させた照明光であるスポット光として流路を流通する測定対象に照射する照明光学系と、測定対象が固有に有する分子から照明光学系によるスポット光の照射によって発出される蛍光を検出する光検出器と、蛍光を光検出器に伝搬させる検出光学系と、光検出器によって検出された蛍光の情報に基づいて、当該測定対象が目的の対象か否かについて判別を行う判別部とを備える。

Description

フローサイトメータ、判別方法、及びプログラム

　本発明は、フローサイトメータ、判別方法、及びプログラムに関する。
　本願は、２０２２年４月１５日に、日本に出願された特願２０２２－０６７７７６号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

　顕微鏡や内視鏡による観察において自家蛍光を用いた観察が診断上の有用な指標として機能することが知られている。例えば、蛍光診断において組織の自家蛍光スペクトルの変化から組織構造、病状（癌化の状態）等の診断を非侵襲に行なうことが知られている（非特許文献１、２）。また、自家蛍光を用いた観察は、細胞における特定の現象の観察に有用であることが知られている。

　例えば、内視鏡による観察において自家蛍光を用いることによって、従来の内視鏡では見つけることが難しかったがん組織や微小がんを検出する応用例が知られている。また、反射顕微鏡法により細胞の位置および形態情報を取得するとともに、共焦点レーザー顕微鏡法により細胞の自家蛍光情報を取得し細胞を個体毎に画像解析を行ない、各細胞の自家蛍光情報を自家蛍光シグネチャーとして再構築する共焦点顕微鏡による一細胞内在性蛍光分析法が知られている（特許文献１）。
　また、自家蛍光のイメージングにより、活性化したＴ細胞を分離特定できることが知られている（非特許文献３、４）。

　一方、ｉＰＳ細胞などの幹細胞による再生医療やＣＡＲＴによる免疫療法の進展に伴い、大量の細胞について高速で単細胞解析を行えるフローサイトメトリー技術に、創薬などのヘルスケア分野を中心に強い需要がある。フローサイトメータにおける測定では、流路を移動する測定対象である細胞から、感度良く短時間で細胞に発現するタンパク質量などの情報を読み取る必要があるため、測定対象を蛍光標識して測定する方法が広く流布している。当該方法では、測定対象の細胞の特定の構造を可視化するために蛍光を発する染色剤（蛍光ラベルされた抗体など）を計測試料に加えて、機能的に細胞観察する。

　蛍光色素で標識した抗体を用いるフローサイトメータによる測定では、生体由来の自家蛍光シグナルは、興味のあるマーカー物質由来の蛍光シグナルの検出を妨げるバックグランドノイズとなる。さらに、他のチャネルへの自家蛍光シグナルの漏れ込みも、発現量の低い特定タンパク質由来のシグナルを隠してしまう阻害要因となる。そのため、蛍光色素で標識した抗体を用いるフローサイトメータによる測定では、測定対象の自家蛍光は、蛍光標識を施す測定を阻害する要因として、その影響を最小化するための方策をとって測定が行われてきた。

　このように、従来のフローサイトメータでは、細胞由来の自家蛍光をいかに抑えバックグランドノイズを防止するかという観点での取組が多く行われ、測定対象自体の自家蛍光を利用して測定を行なうことは行われてこなかった。上述の顕微鏡や内視鏡による観察のように、フローサイトメータにおいても、細胞自体の自家蛍光を用いて測定することができれば、細胞を蛍光染色剤によって標識することなく非侵襲の状態で細胞の状態や細胞の特定を行なうことが期待できる。しかしながら、フローサイトメータにおいて流路を移動する細胞から、短時間で判別に必要な感度と精度で細胞自体の自家蛍光を測定することは困難であった。

国際公開第２０１８／１１７２７３号

"蛍光診断"、［ｏｎｌｉｎｅ］、株式会社光響、［２０２１年１２月２０日検索］、インターネット〈ＵＲＬ：　ｈｔｔｐｓ：／／ｏｐｔｉｐｅｄｉａ．ｉｎｆｏ／ｌａｓｅｒ／ｈａｎｄｂｏｏｋ／ｌａｓｅｒ－ｈａｎｄｂｏｏｋ－９ｔｈ－ｓｅｃｔｉｏｎ／３８－６／〉 "ＡＵＴＯＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ　ＩＭＡＧＩＮＧ"、［ｏｎｌｉｎｅ］、ＴＨＥ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　ＯＦ　ＣＯＬＵＭＢＩＡ、［２０２１年１２月２０日検索］、インターネット〈ＵＲＬ：　ｈｔｔｐｓ：／／ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ．ｍｅｄ．ｕｂｃ．ｃａ／ｐａｔｉｅｎｔ－ｃａｒｅ／ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ－ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｙ／ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ｉｍａｇｉｎｇ／〉 「ＮＡＴＵＲＥ　ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ　ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ」、２０２０年７月２７日、第５巻、ｐ．７７－８８ 「ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＢＩＯＰＨＯＴＯＮＩＣＳ」、２０１９年１０月２９日、第１３巻、第３号

　細胞由来の自家蛍光は強度が弱く、マーカー物質由来の蛍光シグナルに比べて測定の感度が低くなる。測定対象が固定されて観察が行われる顕微鏡や内視鏡では、測定時間を十分に長くすることでＳＮ比（ｓｉｇｎａｌ－ｎｏｉｓｅ　ｒａｔｉｏ）を高め、観察の感度を上げることができる。一方フローサイトメータでは、顕微鏡や内視鏡とは異なり、測定対象である細胞が流路を移動するため、観察時間を長くすることで感度を上げるとのアプローチを取ることができない。従い、フローサイトメータおいて、流路を移動する測定対象から発出された自家蛍光由来の信号を、測定対象の判別に必要な感度と精度が得られるＳＮ比で測定することは難しいと考えられていた。
　しかしながら、細胞を高速かつ非侵襲的に単細胞解析し、特定の現象が発現している目的細胞のみを精度よく取得することについては、創薬などのヘルスケア分野を中心に強い需要がある。そのため、フローサイトメータによる測定においても、自家蛍光に基づいて測定対象の判別ができることが期待されている。

　本発明は上記の点に鑑みてなされたものであり、フローサイトメータによる測定において自家蛍光に基づいて測定対象の判別ができるフローサイトメータ、判別方法、及びプログラムを提供する。

　本発明は上記の課題を解決するためになされたものであり、本発明の一態様は、蛍光染色剤によって標識されていない測定対象を流体とともに流通させる流路と、照明光を照射する光源と、前記光源が照射する前記照明光を、前記流路における照射位置において前記流路の幅方向と深さ方向との少なくとも一方について集光させた照明光であるスポット光として前記流路を流通する前記測定対象に照射する照明光学系と、前記測定対象が固有に有する分子から前記照明光学系による前記スポット光の照射によって発出される蛍光を検出する光検出器と、前記蛍光を前記光検出器に伝搬させる検出光学系と、前記光検出器によって検出された前記蛍光の情報に基づいて、当該測定対象が目的の対象か否かについて判別を行う判別部と、を備えるフローサイトメータである。

　また、本発明の一態様は、上記のフローサイトメータにおいて、前記照明光学系は、前記光源が照射する前記照明光を、前記照射位置において前記測定対象の大きさに集光させて前記スポット光として前記流路を流通する前記測定対象に照射する。

　また、本発明の一態様は、上記のフローサイトメータにおいて、前記流路を流通する前記測定対象のサンプル流を前記流路の幅方向に所定の範囲に収束させるフォーカシング機構をさらに備え、前記照明光学系は、前記スポット光の幅の前記流路の幅に対する割合を所定の割合以下にして、前記照射位置において前記スポット光を前記測定対象に照射する。

　また、本発明の一態様は、上記のフローサイトメータにおいて、前記流路を流通する前記測定対象のサンプル流を前記流路の深さ方向に所定の範囲に収束させるフォーカシング機構をさらに備え、前記照明光学系は、前記スポット光を前記流路の深さ方向について特定の位置に集光させ、前記照射位置において前記スポット光を前記測定対象に照射する。

　また、本発明の一態様は、上記のフローサイトメータにおいて、前記流路は、所定の速度未満の速度において前記測定対象を流体とともに流通させる。

　また、本発明の一態様は、上記のフローサイトメータにおいて、前記検出光学系は、前記蛍光をスペクトル成分に分離させ、前記光検出器は、前記検出光学系によってスペクトル成分に分離された前記蛍光を当該スペクトル成分毎に検出し、前記判別部は、前記光検出器によって検出された前記蛍光のスペクトル成分の情報であるスペクトル情報に基づいて当該測定対象について前記判別を行う。

　また、本発明の一態様は、上記のフローサイトメータにおいて、前記測定対象について前記スペクトル情報が入力されると当該測定対象が前記目的の測定対象であるか否かを判別する学習済みモデルを生成する学習部をさらに備え、前記判別部は、前記学習済みモデルに基づいて前記測定対象の前記スペクトル情報から当該測定対象ついて前記判別を行なう。

　また、本発明の一態様は、上記のフローサイトメータにおいて、前記学習部は、前記測定対象として前記目的の測定対象と前記目的の測定対象以外の測定対象とを含む学習サンプルについて、前記光検出器によって検出されたスペクトル成分の情報と、前記目的の測定対象を識別する情報とを組み合わせた学習データを用いて機械学習を行うことによって前記学習済みモデルを生成し、前記判別部は、前記学習部が生成した前記学習済みモデルと、前記流路を流通する前記測定対象について前記光検出器によって検出されたスペクトル成分の情報とに基づいて、当該測定対象について判別を行う。

　また、本発明の一態様は、上記のフローサイトメータにおいて、前記照明光学系あるいは前記検出光学系の少なくとも１つが、空間光変調器を含み、前記光検出器は、前記蛍光を動的ゴーストイメージングシグナルとして検出し、前記判別部は、前記動的ゴーストイメージングシグナルに含まれる前記測定対象の形態情報のうち解像度が所定の解像度よりも高い形態情報を利用して測定対象の判別を行なう。

　また、本発明の一態様は、上記のフローサイトメータにおいて、前記測定対象について、前記動的ゴーストイメージングシグナルが入力されると当該測定対象が前記目的の測定対象であるか否かを判別する学習済みモデルを生成する学習部をさらに備え、前記判別部は、前記学習済みモデルに基づいて前記測定対象の前記動的ゴーストイメージングシグナルから当該測定対象について前記判別を行なう。

　本発明の一態様は、蛍光染色剤によって標識されていない測定対象を流体とともに流通させる流路と、照明光を照射する光源と、前記光源が照射する前記照明光を、前記流路における照射位置において前記流路の幅方向と深さ方向との少なくとも一方について集光させた照明光であるスポット光として前記流路を流通する前記測定対象に照射する照明光学系と、前記測定対象が固有に有する分子から前記照明光学系による前記スポット光の照射によって発出される蛍光を検出する光検出器と、前記蛍光を前記光検出器に伝搬させる検出光学系と、を備えるフローサイトメータによって検出された結果に基づいて測定対象について判別を行う判別方法であって、前記流路を流通する前記測定対象について前記光検出器によって検出された前記蛍光の強度を示すデータを取得する取得ステップと、前記取得ステップにおいて取得された前記データに基づいて前記蛍光の情報を生成する生成ステップと、前記生成ステップにおいて生成された前記蛍光の情報に基づいて、当該測定対象が目的の対象か否かについて判別を行う判別ステップと、を有する判別方法である。

　本発明の一態様は、蛍光染色剤によって標識されていない測定対象を流体とともに流通させる流路と、照明光を照射する光源と、前記光源が照射する前記照明光を、前記流路における照射位置において前記流路の幅方向と深さ方向との少なくとも一方について集光させた照明光であるスポット光として前記流路を流通する前記測定対象に照射する照明光学系と、前記測定対象が固有に有する分子から前記照明光学系による前記スポット光の照射によって発出される蛍光を検出する光検出器と、前記蛍光を前記光検出器に伝搬させる検出光学系と、を備えるフローサイトメータによって検出された結果に基づいて情報処理を行うコンピュータに、前記流路を流通する前記測定対象について前記光検出器によって検出された前記蛍光の強度を示すデータを取得する取得ステップと、前記取得ステップにおいて取得された前記データに基づいて前記蛍光の情報を生成する生成ステップと、前記蛍光の情報に基づいて、当該測定対象が目的の対象か否かについて判別を行う判別ステップと、を実行させるためのプログラムである。

　本発明によれば、フローサイトメータによる測定において自家蛍光に基づいて測定対象の判別ができる。

本発明の第１の実施形態に係るフローサイトメータの構成の一例を示す図である。 本発明の第１の実施形態に係るフローサイトメータでの照射位置における照明光（スポット光）の形状の一例を示す図である。 従来のフローサイトメータでの照射位置における照明光の形状の一例を示す図である。 従来のフローサイトメータによって検出された蛍光の強度の時系列波形の一例を示す図である。 本発明の第１の実施形態に係るフローサイトメータによって検出された蛍光の強度の時系列波形の一例を示す図である。 本発明の第１の実施形態に係る情報処理装置の構成の一例を示す図である。 本発明の第１の実施形態に係る判別処理の一例を示す図である。 本発明の第１の実施形態の変形例に係るスポット光の形状の一例を示す図である。 本発明の第２の実施形態に係るフローサイトメータの構成の一例を示す図である。 本発明の第３の実施形態に係るフローサイトメータの構成の一例を示す図である。 本発明の実施例に係る測定結果のまとまりを示す図である。 本発明の実施例に係る本実施例に係るリンパ球間の判別の方法を説明する図である。

（第１の実施形態）
　以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について詳しく説明する。図１は、本実施形態に係るフローサイトメータ１の構成の一例を示す図である。フローサイトメータ１は、マイクロ流体装置２と、光源３と、照明光学系４と、検出光学系５と、光検出器６と、ＤＡＣ７と、情報処理装置８とを備える。

　マイクロ流体装置２は、流路２０と、フォーカシング機構２１（不図示）とを備える。流路２０は、細胞Ｃ１を流体とともに流通させる。流路２０は、所定の速度未満の速度において細胞Ｃ１を流体とともに流通させる。流路２０を流れる流体の流速は、一例として、従来のフローサイトメータにおいて用いられる流速未満である。本実施形態では、流路２０を流れる流体の流速は、一例として、流速は５ｍ／ｓ未満である。

　従来のフローサイトメータでは、高速解析のニーズを実現するため流路を流れる流体流速の高速化が図られることが多い。本実施形態に係るマイクロ流体装置２でも、従来のフローサイトメータにおいて用いられる流速と同程度の速度で細胞Ｃ１を流体とともに流通させることができる。そのため、マイクロ流体装置２において、流路２０を流れる流体の流速は、所定の速度以上であってもよい。ただし、細胞Ｃ１から発出される自家蛍光を感度良く検出する目的からは、従来のフローサイトメータにおいて高速解析を意図して用いられる流速と比較すると、流路２０を流れる流体の流速は低速であることが好ましい。
　マイクロ流体装置２は、流路２０に複数の細胞を逐次流すが、一度に流路２０の照射位置を流れる細胞の個数は１個である。

　細胞Ｃ１は、蛍光染色剤によって標識されていない。細胞Ｃ１は、蛍光染色剤によって標識されていない測定対象の一例である。なお、測定対象は、細胞Ｃ１に限られず、他の例として、スフェロイド（細胞塊）、微粒子、または微生物などであってもよい。微粒子には、花粉、マイクロプラスチック、脂質微粒子、またはポリマー微粒子（例えば、フローサイトメータ校正用粒子）などの微粒子が含まれる。微生物には、細菌、菌類、またはウイルス原生動物などが含まれる。

　フローサイトメータにおける測定では、測定対象を蛍光標識して測定する方法が広く流布しているが、細胞Ｃ１は蛍光染色剤によって標識されていない。蛍光染色剤は、蛍光を発する染色剤であれば特に限定されないが、一例として、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、Ａｕｒａｍｉｎｅ　Ｏ、Ａｕｒａｍｉｎｅ　Ｏ・Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　Ｂ、Ａｃｒｉｄｉｎｅ　ｏｒａｎｇｅ、ＤＡＰＩ（４’，６－ｄｉａｍｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ、Ｃｙ３やＣｙ５などのＣｙカルボン酸（Ｃｙ　ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ）、Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ、Ｅｔｈｉｄｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅなどの蛍光色素あるいは蛍光プローブである。

　また蛍光染色剤による標識の方法には、蛍光染料試薬による細胞Ｃ１の特定成分の染色や、蛍光標識された抗体、遺伝子、レクチンなどと細胞Ｃ１を反応させて標識する方法などがある。また、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）やルシフェラーゼなどの蛍光タンパク質を蛍光染色剤として用い細胞Ｃ１を標識することもできる。細胞Ｃ１は、こうした蛍光染色剤による標識を施されていない細胞であり、人為的な処理によって蛍光標識されていない細胞である。

　ここで図面には適宜、３次元直交座標系として、ｘｙｚ座標系を示す。本実施形態において、ｘ軸方向は、流路２０の幅方向である。また、ｙ軸方向は、流路２０の長さ方向である。ｚ軸方向は、流路２０と直交する方向であって、流路２０の高さあるいは深さ方向である。流路２０内の流体の流れは、ｙ軸方向の＋ｙ方向に細胞Ｃ１を移動させる。流路２０の幅方向とは、換言すれば、細胞Ｃ１と共に流れる流体の流れの方向と垂直な方向である。

　フォーカシング機構２１は、流路２０において細胞Ｃ１をより細い絞られた層流として流通させる。例えば、フォーカシング機構２１は、流路２０を流通する細胞Ｃ１の流れを流路２０の幅方向に所定の範囲に収束させる。フォーカシング機構２１は、流路２０を流通する細胞Ｃ１の流れを流路２０の深さ方向にも所定の範囲に収束させる。即ち、フォーカシング機構２１は、流路２０における細胞Ｃ１の流れを絞り込む機構である。フォーカシング機構２１により、細胞Ｃ１は流路２０の所定の範囲に収束されて流通する。以降では、流路２０における細胞Ｃ１の流れを単にサンプル流と記載する場合がある。

　フォーカシング機構２１は、ハイドロダイナミックフォーカシング、またはアコースティックフォーカシングなどの手法を用いてサンプル流を絞る（流路２０の流体の流れに垂直な断面において細胞Ｃ１が流通する断面積を狭くする）機構である。ハイドロダイナミックフォーカシングは、細胞等の測定対象の流れに対し、シース液を包み込むように配置することにより、測定対象を同じ軸上に一列に配置しておよそ同じ速度で移動させる技術である。ハイドロダイナミックフォーカシングでは、シース液を側面方向あるいは上下方向から合流させることで、流路２０におけるサンプル流を流路２０の特定の位置に絞り込むことができる。アコースティックフォーカシングは、アコースティック（超音波）を利用してサンプル流を絞る技術である。

　なお、フォーカシング機構２１は、ハイドロダイナミックフォーカシングと、アコースティックフォーカシングとの両方を用いてもよい。また、上記以外に、誘電泳動（ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）やイナーシャルフォーカシング（ｉｎｅｒｔｉａｌ　ｆｏｃｕｓｉｎｇ）の手法を利用して流路おけるサンプル流を絞り込む方法が報告されており、こうした手法をフォーカシング機構２１において採用することも可能である。以下の説明では、フォーカシング機構２１により測定対象である細胞が流路２０の中心位置に絞り込まれる例を中心に説明を行うが、フォーカシング機構２１によりサンプル流が絞り込まれる位置は、これに限られない。フォーカシング機構２１は、その設定により、流路２０の所望の特定の位置においてサンプル流を絞り込むことができる。

　光源３は、照明光Ｌ１を照射する。光源３は、一例として、レーザー光源である。光源３は、ＬＥＤ光源などの光源であってもよい。照明光Ｌ１は、単一波長の光である。照明光Ｌ１のピーク波長は３５０ｎｍから５００ｎｍの範囲に含まれることが望ましい。

　光源３は、一例として、１つの光源から構成される。なお、光源３は、後述するように、複数の光源から構成されてもよい。当該複数の光源がそれぞれ照射する照明光の波長は、照明光Ｌ１と同様に３５０ｎｍから５００ｎｍの範囲に含まれることが望ましい。

　照明光学系４は、光源３から発出された照明光Ｌ１を、流路２０を流通する細胞Ｃ１に照射するための光学的な機構であり、複数の光学素子により構成される。図１では、照明光学系４は、第１レンズ４１と、第２レンズ４３と、ダイクロイックミラー４４と、対物レンズ４５とを備える。第１レンズ４１と、第２レンズ４３と、ダイクロイックミラー４４と、対物レンズ４５とは、光源３に近い側からこの順に、光源３と流路２０との間の光路上に配置される。なお、照明光学系４は、図１に示される構成に限らない。

　第１レンズ４１は、光源３から発出された照明光Ｌ１を集光する。
　第２レンズ４３は、第１レンズ４１によって集光された照明光Ｌ１を平行光にする。図１の例では第１レンズ４１と第２レンズ４３はともに凸レンズである。第２レンズ４３の焦点距離は、第１レンズ４１の焦点距離よりも長い。他の例として、第１レンズ４１を凹レンズとし、第２レンズ４３を凸レンズとする構成とすることもできる。また、これらのレンズの代わりに市販のビームエキスパンダーを使用する構成とすることもできる。第１レンズ４１と第２レンズ４３により、照明光Ｌ１は、より一様に広がった平行光としてダイクロイックミラー４４に入射される。
　ダイクロイックミラー４４は、第２レンズ４３から出射された平行化された照明光Ｌ１を反射する。ダイクロイックミラー４４は、反射した照明光Ｌ１を対物レンズ４５に入射させる。

　対物レンズ４５は、ダイクロイックミラー４４によって反射された照明光Ｌ１を集光し、流路２０の照射位置にスポット光Ｌ２を照射する。対物レンズ４５によってスポット光Ｌ２が流路２０の照射位置に照射されることによって、照明光学系４はスポット光Ｌ２を当該照射位置に照射する。対物レンズ４５は、ドライ対物レンズあっても、液浸対物レンズであってもよい。液浸対物レンズとは、油浸レンズや、水浸レンズなどである。

　照明光学系４は、光源３が照射する照明光Ｌ１を、スポット光Ｌ２として流路２０を流通する細胞Ｃ１に照射する。スポット光Ｌ２とは、流路２０における照射位置において照明光Ｌ１を集光させた照明光である。照明光学系４は、照明光Ｌ１を流路２０における照射位置において流路２０の幅方向と深さ方向との両方について集光させてスポット光Ｌ２として流路２０を流通する細胞Ｃ１に照射する。

　ここで図２を参照し、集光される照明光Ｌ１（スポット光Ｌ２）について説明する。
　図２は、本実施形態に係るフローサイトメータでの照射位置における照明光Ｌ１（スポット光Ｌ２）の形状の一例を示す図である。図２では、一例として、細胞Ｃ１は流路２０の幅方向について流路２０の中心付近を通過している。細胞Ｃ１が流路２０の中心を通過するとは、流路２０を流れる細胞Ｃ１のサンプル流の中心が流路２０の中心付近を通過することである。また、図２では、細胞Ｃ１は、流路２０の深さ方向について流路２０の特定の位置付近を通過している。当該特定の位置は、一例として、深さ方向についての流路２０の中心であり、図２では、細胞Ｃ１は流路２０の中心付近を通過している。

　図２（Ａ）は、流路２０にスポット光Ｌ２が照射される様子を－ｚ方向に向かってみた図である。図２（Ａ）に示すように、照明光Ｌ１は、流路の照射位置において流路２０の幅方向に集光されたスポット光Ｌ２として照射されている。照射位置は流路２０を通過する細胞Ｃ１をスポット光Ｌ２が照射する位置である。照明光Ｌ１を流路２０の幅方向に集光させるとは、一例として、幅方向（ｘ軸方向）について流路２０の側面から流路２０の中心へと近づくにつれて、照明光Ｌ１を集光させることである。スポット光Ｌ２は、流路２０の幅方向に、幅が狭くなるように一定の範囲に集光されている。

　ここで流路２０において細胞Ｃ１が通過する流路２０の中心付近において、スポット光Ｌ２の流路２０の幅方向の幅が測定対象である細胞Ｃ１の大きさ（径）程度となるように、照明光Ｌ１は集光される。スポット光Ｌ２の流路２０の幅方向の幅は、測定対象の細胞の大きさや観察したい現象に応じて異なるが、２－１００μｍ程度とすることが好ましく、５－５０μｍ程度とすることがより好ましい。

　図２（Ｂ）は流路２０にスポット光Ｌ２が照射される様子を－ｘ方向に向かって見た図である。図２（Ｂ）に示すように、照明光Ｌ１は、流路の照射位置において流路２０の深さ方向に集光されたスポット光Ｌ２として照射されている。スポット光Ｌ２は、照明光学系４により、流路２０の照射位置において、深さ方向に特定の位置に集光されるように照射される。照明光Ｌ１を流路２０の深さ方向（ｚ軸方向）に集光させるとは、一例として、流路２０の深さ方向について、流路２０の上面から特定の位置へと近づくにつれて、スポット光Ｌ２の流路２０の深さ方向の幅が狭くなるように照明光Ｌ１を集光させることである。また、スポット光Ｌ２の流路２０の深さ方向の幅は、深さ方向について、特定の位置から流路２０の下面へと遠ざかるにつれて広くなる。

　ここで図２（Ｂ）では、流路２０の深さ方向について、流路２０において細胞Ｃ１が通過する流路２０の中心付近においては、スポット光Ｌ２の流路２０の深さ方向の幅が最も集光されるように設定されている。スポット光Ｌ２の流路２０の深さ方向の幅は、測定対象の細胞の大きさや観察したい現象に応じて異なるが、０．２－２０μｍ程度とすることが好ましく、０．１－１０μｍ程度とすることがより好ましい。スポット光Ｌ２の流路２０の深さ方向の幅は、サブμｍから２０μｍ程度となる。

　ここで本実施例との比較のために、従来の一般的なフローサイトメータにおける照明光の形状について図３で説明する。図３は、従来のフローサイトメータでの照射位置における照明光の形状を図式化して示している。図３の照明光Ｌ２０は従来のフローサイトメータに用いられている照明光である。

　図３（Ａ）に示すように、照明光Ｌ２０は、流路２００の幅方向において流路２００より広く、流路を一様に照射できるように設定される。また、その際に、照明光Ｌ２０の流れの方向（ｙ軸方向）には、流路２００と交差する部分において、照明光Ｌ２０の幅が一定となるように照射される。一方、図３（Ｂ）に示すように、照明光Ｌ２０は、流路２００の深さ方向には略平行な光であり、流路２００の深さにかかわらず照射される光の強度は一定である。つまり、照明光Ｌ２０は、照射位置において流路２００の幅方向には、流路全体を一様に照射できる広がった形状となっており、流路２００の深さ方向にも略平行な一様な光として照射されている。従来の一般的なフローサイトメータでは、照明光Ｌ２０は、流路２００の照射位置に集光されておらず、光源から発出される照明光の強度が同じ場合、照射位置における照明光Ｌ２０の強度は本実施例に係るフローサイトメータ１に比べて弱くなる。

　フローサイトメータ１では、従来の一般的なフローサイトメータと比較すると、照明光Ｌ１は、流路２０における照射位置において流路２０の幅方向と深さ方向との両方についてより集光されたスポット光Ｌ２として流路２０を流通する細胞Ｃ１に照射されるため、細胞Ｃ１に照射されるスポット光Ｌ２の強度は、細胞Ｃ１が固有に有する分子から発出される蛍光の強度を、上記のように集光させない場合に比べて強くすることができる。

　なお、照明光学系４は、照明光Ｌ１を流路２０における照射位置において流路２０の幅方向のみについて集光させてもよい。また、照明光学系４は、照明光Ｌ１を流路２０における照射位置において流路２０の深さ方向のみについて集光させてもよい。したがって、照明光学系４は、照明光Ｌ１を流路２０の幅方向と深さ方向との少なくとも一方について従来の一般的なフローサイトメータに比べより集光させ、流路２０における照射位置においてより強度の強いスポット光Ｌ２として流路２０を流通する細胞Ｃ１に照射する。

　なおここで、照明光Ｌ１を流路２０における照射位置において幅方向に集光させることを、スポット光Ｌ２の流路２０の幅方向の幅の流路２０の幅に対する割合を所定の割合以下にすることであるともいう。細胞Ｃ１が流路２０の中心を通過する場合には、スポット光Ｌ２の流路２０の幅方向の幅は、流路２０の幅方向の中心において、流路２０の幅に対する割合が所定の割合以下に設定される。スポット光Ｌ２の流路２０の幅方向の幅の流路２０の幅に対する割合は、測定対象の大きさにより異なりこれに限定されるものではないが、例えば、１／２０から１／２である。

　同様に、照明光Ｌ１を流路２０における照射位置において深さ方向に集光させることを、スポット光Ｌ２の流路２０の深さ方向の幅の流路２０の深さに対する割合を所定の割合以下にすることであるともいう。細胞Ｃ１が流路２０の深さ方向の特定の位置を通過する場合には、その流路２０の深さ方向の特定の位置において、スポット光Ｌ２の流路２０の深さ方向の幅は、流路２０の深さに対する割合が所定の割合以下に設定される。スポット光Ｌ２の流路２０の深さ方向の幅の流路２０の深さに対する割合は、測定対象の細胞の大きさにより異なりこれに限定されるものではないが、例えば、１／２０００から１／１０である。

　なお、スポット光Ｌ２の流路２０の幅方向の幅と、スポット光Ｌ２の流路２０の深さ方向の幅との一方、またはその両方が、細胞Ｃ１の大きさよりも狭くなってもよい。スポット光Ｌ２は、十分な強度を有して細胞Ｃ１の部分に照射されれば当該部分から蛍光が発出されるため、スポット光Ｌ２の幅は、流路２０の幅方向あるいは深さ方向の幅（その一方またはその両方）が、細胞Ｃ１の大きさよりも狭くなってもよい。

　上述したように、照明光学系４は、光源３が照射する照明光Ｌ１を、流路２０の照射位置において細胞Ｃ１の大きさに集光させてスポット光Ｌ２として流路２０を流通する細胞Ｃ１に照射してもよい。

　また、照明光Ｌ１を流路２０における照射位置において幅方向に集光させるとは、流路２０の幅方向の中心におけるスポット光Ｌ２の強度と、流路２０の側面付近のスポット光Ｌ２の強度との比（つまり、コントラスト）を所定の比より大きくすることであるともいう。
　同様に、照明光Ｌ１を流路２０における照射位置において深さ方向に集光させるとは、流路２０の深さ方向の特定の位置におけるスポット光Ｌ２の強度と、流路２０の上面及び下面付近のスポット光Ｌ２の強度との比（つまり、コントラスト）を所定の比より大きくすることであるともいう。

　上述に加え、フローサイトメータ１では、照明光Ｌ１は、照明光学系４により流路２０の流れ方向（ｙ軸方向）にも集光されている。スポット光Ｌ２は、流路２０における照射位置において、流路２０の流れ方向（ｙ軸方向）について対物レンズ４５の回折限界まで集光されることが望ましい。

　ここで本実施形態に係るフローサイトメータ１におけるＳＮ比について、従来のフローサイトメータと比較しながら説明する。
　図４は、従来のフローサイトメータによって検出された蛍光の強度の時系列波形の一例を示す図である。図５は、本実施形態に係るフローサイトメータによって検出された蛍光の強度の時系列波形の一例を示す図である。従来のフローサイトメータと本実施形態に係るフローサイトメータとのいずれの場合にも、蛍光染色剤によって標識されていない細胞が測定対象として用いられ、それぞれのフローサイトメータを用いて、細胞が固有に発する自家蛍光の強度を時系列波形として検出している。図４及び図５ではそれぞれ、オシロスコープで観察された時系列波形のデータを模式的に示したものである。

　図４に示す蛍光の強度の時系列波形は、図３に示した照明光Ｌ２０のような照明光を成形して流路の照射位置において測定対象である細胞に照射した場合に検出される蛍光の強度の時系列波形を示す。上述したように照明光Ｌ２０は、照射位置において流路２００の幅方向には、流路全体を一様に照射できる広がった形状となっており、流路２００の深さ方向にも略平行な一様な光として照射されている。従来のフローサイトメータでは、照射位置における照明光の分布の一様性が重視されている。照明光の分布の一様性を重視するとは、換言すれば、照明光の分布を一様にし、測定対象の通過位置によるシグナル強度のばらつきを抑えることに相当する。

　従来のフローサイトメータでは、照明光の分布の一様性が重視されているため、測定対象の単位体積当たりの励起光のパワーが弱くなる。その結果、強い強度の蛍光シグナルを得ることができず、ＳＮ比が低い蛍光シグナル（図４においてシグナルＳＧ１）しか得られない。ここでＳＮ比は、例えば、測定対象の自家蛍光に起因する蛍光強度に対するバックグランドノイズの強度の標準偏差の比として数値化することができる。図４の例では、ＳＮ比は、シグナルＳＧ１のピークの高さに対するノイズＮ１の強度の標準偏差の比である。

　一方、図５に示す蛍光の強度の時系列波形は、図２に示したスポット光Ｌ２のような照明光を成形して流路の照射位置において測定対象である細胞に照射した場合に検出される蛍光の強度の時系列波形を示す。上述したようにスポット光Ｌ２は、照射位置において流路２０の幅方向と深さ方向との両方について集光された形状の照明光として照射されている。本実施形態に係るフローサイトメータ１では、照射位置において測定対象である細胞に集光したスポット光として照明光を照射することができる。これによって、本実施形態に係るフローサイトメータ１では、強い強度の蛍光シグナル（図５においてシグナルＳＧ２）を得ることができるため、ＳＮ比が高い蛍光シグナルを得ることができる。図５の例では、ＳＮ比は、シグナルＳＧ２のピークの高さに対するノイズＮ２の強度の標準偏差の比である。

　図１に戻ってフローサイトメータ１の構成の説明を続ける。
　照明光学系４によってスポット光Ｌ２が流路２０の照射位置に照射されると、流路２０を流れる細胞Ｃ１は、蛍光を発出する。ここで当該蛍光は、細胞Ｃ１が固有に有する分子から照明光学系４によるスポット光Ｌ２の照射によって発出される。つまり、当該蛍光は、自家蛍光と呼ばれる細胞Ｃ１の生物学的構造がスポット光Ｌ２を吸収した際に発出される光の自然放出である。ここで細胞Ｃ１の自家蛍光によって発出された蛍光のうち対物レンズ４５に入射するものを蛍光Ｆ１とする。

　細胞Ｃ１から発出された蛍光Ｆ１は、対物レンズ４５に入射する。対物レンズ４５に入射した蛍光Ｆ１は、平行光としてダイクロイックミラー４４に入射する。ダイクロイックミラー４４は、対物レンズ４５から平行光として出射された蛍光Ｆ１を検出光学系５の側へと透過させる。

　検出光学系５は、細胞Ｃ１から発出される蛍光Ｆ１を後述の光検出器６に伝搬させる。図１のフローサイトメータ１では、検出光学系５は、細胞Ｃ１から発出される蛍光Ｆ１をスペクトル成分に分離して光検出器６に伝搬させる。検出光学系５は、対物レンズ４５と、ダイクロイックミラー４４と、レンズ５１と、スリット５２と、レンズ５３と、回折格子５４と、レンズ５５とを備える。対物レンズ４５と、ダイクロイックミラー４４と、レンズ５１と、スリット５２と、レンズ５３と、回折格子５４と、レンズ５５とは、流路２０に近い側からこの順に、流路２０と光検出器６との間の光路上に配置される。なお、対物レンズ４５とダイクロイックミラー４４とは、照明光学系４と検出光学系５のいずれにも含まれる。

　流路２０を流れる細胞Ｃ１にスポット光Ｌ２が照射され、細胞Ｃ１から自家蛍光である蛍光Ｆ１が発出される。細胞Ｃ１から発出された蛍光Ｆ１は対物レンズ４５に入射する。対物レンズ４５に入射した蛍光Ｆ１は、ダイクロイックミラー４４に入射し、ダイクロイックミラー４４を透過した蛍光Ｆ１が、レンズ５１に伝搬する。

　レンズ５１は、両凸レンズである。レンズ５１は、ダイクロイックミラー４４を透過した平行光である蛍光Ｆ１を、スリット５２の位置に集光する。
　スリット５２は、絞りである。スリット５２は、レンズ５１の焦点の位置に配置される。当該焦点の位置は、レンズ５３の焦点の位置とも一致している。スリット５２は、レンズ５１によって集光された蛍光Ｆ１を発散させてレンズ５３に入射させる。
　レンズ５３は、両凸レンズである。スリット５２から発散されて出射された蛍光Ｆ１を平行光にして回折格子５４へと入射させる。

　回折格子５４は、レンズ５３から平行光として出射された蛍光Ｆ１を、蛍光Ｆ１の波長に応じたスペクトル成分ＳＰ１に分離する。回折格子５４は、入射する蛍光Ｆ１を、回折によって波長毎に分離する。回折格子５４は、分離したスペクトル成分ＳＰ１をレンズ５５に入射させる。
　なお、検出光学系５は、分散、屈折、または反射によって蛍光Ｆ１を波長の異なるスペクトル成分に分離させることができれば、他の構成であってもよい。例えば、検出光学系５は、回折格子５４に代えて、プリズム、または光学フィルターなどを備えてもよい。

　レンズ５５は、回折格子５４によって分離されたスペクトル成分ＳＰ１を光検出器６へと集光させる。レンズ５５は、スペクトル成分ＳＰ１が複数の場合、複数のスペクトル成分ＳＰ１それぞれを集光させて光検出器６へと入射させる。

　光検出器６は、検出光学系５によってスペクトル成分ＳＰ１に分離された蛍光Ｆ１を当該スペクトル成分ＳＰ１毎に検出する。光検出器６は、スペクトル成分ＳＰ１を光信号として検出して電気信号に変換する。光検出器６は、一例として、光電子増倍管（ＰＭＴ：Ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ　Ｔｕｂｅ）である。光検出器６は、光信号を時系列に検出する。光検出器６は、一例として、マルチセンサーである。

　光検出器６は、一例として、複数のチャネルが配置されたマルチアノードＰＭＴである。当該複数のチャネルはそれぞれ、波長に対する感度が異なる。当該複数のチャネルはそれぞれ、異なる波長の複数のスペクトル成分ＳＰ１をそれぞれ検出する。したがって、光検出器６は、検出光学系５によってスペクトル成分ＳＰ１に分離された蛍光Ｆ１を当該スペクトル成分ＳＰ１毎に検出する複数の光検出器（チャネル）を備える。

　なお、光検出器６が備えるチャネルの数は１であってもよい。つまり、光検出器６は、シングルセンサー（シングルＰＭＴ）であってもよい。光検出器６がシングルセンサーである場合、光検出器６は、１種類の波長に対応するスペクトル成分ＳＰ１を検出する。
　なお、図１では、スペクトル成分ＳＰ１は３種類が示されているが、スペクトル成分ＳＰ１の数は蛍光Ｆ１によって異なる。スペクトル成分ＳＰ１は３種類以外の種類であってもよい。

　ＤＡＱデバイス７は、光検出器６が出力する電気信号パルスを、パルス毎に電子データに変換する。電子データには、時間と、電気信号パルスの強度との組が含まれる。ＤＡＱデバイス７は、一例として、オシロスコープである。

　情報処理装置８は、ＤＡＱデバイス７から出力される電子データに基づいて、各種の分析を行う。情報処理装置８は、一例として、パーソナルコンピュータ（ＰＣ：Ｐｅｒｓｏｎａｌ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ）である。

［情報処理装置８の構成］
　次に図６を参照し、情報処理装置８の構成について説明する。図６は、本実施形態に係る情報処理装置８の構成の一例を示す図である。情報処理装置８は、制御部８０と、記憶部８５とを備える。

　制御部８０は、例えばＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　Ｕｎｉｔ）や、ＧＰＵ（Ｇｒａｐｈｉｃｓ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　Ｕｎｉｔ）、ＦＰＧＡ（ｆｉｅｌｄ－ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ　ｇａｔｅ　ａｒｒａｙ）などを備えており、種々の演算や情報の授受を行う。
　制御部８０は、信号強度取得部８１と、スペクトル情報生成部８２と、判別部８３と、学習部８４とを備える。

　信号強度取得部８１は、ＤＡＱデバイス７から出力される電子データを取得する。電子データは、光検出器６が検出するスペクトル成分ＳＰ１の信号強度を時間ごとに示した電子データである。

　スペクトル情報生成部８２は、信号強度取得部８１が取得した電子データに基づいてスペクトル情報Ａ１を生成する。スペクトル情報Ａ１は、測定対象である細胞Ｃ１についてのスペクトル成分ＳＰ１の情報である。

　スペクトル情報Ａ１は、以下の値のうちいずれか１以上が含まれる。
（イ）光検出器６によって検出された個々の励起された蛍光波長における蛍光強度；
（ロ）上記の蛍光強度を特定の波長における蛍光強度で規格化した値（強度比）；
（ハ）照明光Ｌ１あるいはスポット光Ｌ２の光強度（総量、高さ）で規格化した値；（ニ）異なる波長の励起光それぞれによって励起された蛍光波長について、上記の（イ）、（ロ）、（ハ）の処理のいずれか１以上によって得られる値

　上記（イ）において、蛍光強度は、スペクトル成分ＳＰ１の強度であり、総量、高さによって示される。蛍光強度を示す総量は、ＤＡＱデバイス７から出力される電子データにおいて、スペクトル成分ＳＰ１の信号強度を時間について積分して得られる面積である。蛍光強度を示す高さは、当該電子データにおいて、スペクトル成分ＳＰ１の信号強度のピーク（最大値）の高さである。

　上記（ロ）には、細胞Ｃ１が複数の波長の異なる励起光（スポット光Ｌ２）の照射を受ける場合に、それぞれの励起光により発出した蛍光のうち特定波長の蛍光で、発出した蛍光強度を規格化する場合が含まれる。また上記（ロ）には、細胞Ｃ１が複数の波長の異なる励起光（スポット光Ｌ２）の照射を受ける場合に、それぞれの励起光により発出した蛍光のうち特定波長の蛍光で、その励起光により発出した蛍光強度を規格化する場合も含まれる。

　上記（ロ）について説明するために、まず、励起光が１つの波長のみの場合を考える。その場合、Ｎ個の蛍光波長で検出される蛍光強度をそれぞれａ１、ａ２，…，ａＮとすると、ある蛍光波長における蛍光強度ａｉで他の蛍光波長における強度（ａｘ，ｘ＝１，…，Ｎ）が規格化できる。規格値はａｘ／ａｉと表される。蛍光強度ａｘはｘ＝１，…，ＮなのでＮ個あるため、Ｎ個の規格値が得られる。
　次に、複数（Ｍ個とする）の励起光が存在し、複数（Ｎ個とする）の蛍光波長で検出する場合、Ｎ×Ｍ個の蛍光強度が検出される。上記（ロ）には、Ｎ×Ｍ個の蛍光強度の規格化の方法として少なくとも二通りの方法が含まれる。

　１つ目の方法では、波長λｉ（ｉ＝１，…，Ｍ）の各励起光についてＮ個の蛍光波長で検出する蛍光強度をそれぞれａ１（λｉ）、ａ２（λｉ），…，ａＮ（λｉ）とする。このとき、ある波長λｉの励起光に対して、ある波長で検出された蛍光強度ａｊ（λｉ）で、すべて波長の励起光それぞれに対するすべての蛍光波長それぞれで検出された蛍光強度が規格化される。規格値はａｘ（λｙ）／ａｊ（λｉ），（ｘ＝１，…，Ｎ，ｙ＝１，…，Ｍ）と表される。１つ目の方法では、励起波長の数に蛍光波長の数を乗じた結果に等しいＮ×Ｍ個の規格値が得られる。

　２つ目の方法では、波長λｉ（ｉ＝１，…，Ｍ）の各励起光について、一つ選択された蛍光波長で検出された蛍光強度ａｊ（λｉ）で、他の蛍光波長で検出された蛍光強度ａｘ（λｉ）が規格化される。規格値はａｘ（λｉ）／ａｊ（λｉ），（ｘ＝１，…，Ｎ）と表される。２つ目の方法では、規格化に用いられる値はＭ個の励起波長毎に異なる。

　スペクトル情報Ａ１は、スポット光Ｌ２の照射により、細胞Ｃ１が固有に有する分子から発出される蛍光Ｆ１の総量に対応する。スペクトル情報Ａ１が示すスペクトル成分ＳＰ１の情報と細胞Ｃ１固有の蛍光特性とは対応しており、スペクトル情報Ａ１は細胞Ｃ１を判別するために用いることができる。

　判別部８３は、学習済みモデルＢ１と、スペクトル情報Ａ１とに基づいて、測定対象である細胞Ｃ１について判別を行う。学習済みモデルＢ１は、例えば、測定対象についてスペクトル情報Ａ１が入力されると当該測定対象が目的の測定対象であるか否かを判別するモデルである。

　学習部８４は、学習済みモデルＢ１を生成する。学習部８４は、学習サンプルについて、スペクトル情報Ａ１と、識別情報とを組み合わせた学習データを用いて機械学習を行うことによって学習済みモデルＢ１を生成する。学習サンプルは、機械学習に用いるスペクトル情報Ａ１を取得するためのサンプルであり、目的の測定対象と当該目的の測定対象以外の測定対象とが含まれる。識別情報とは、目的の測定対象を識別する情報である。識別情報は、一例として、細胞の種類を示すラベルである。

　学習部８４が行う機械学習のアルゴリズムは、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、決定木分析、ニューラルネットワークなどである。当該機械学習のアルゴリズムは、上記以外の教師あり学習のアルゴリズムであってもよい。学習部８４が行う機械学習には、教師あり学習のアルゴリズムと教師なし学習のアルゴリズムを組み合わせて用いてもよい。

　学習部８４は、生成した学習済みモデルＢ１を記憶部８５に記憶させる。
　上述したように、学習部８４は、目的の測定対象と当該目的の測定対象以外の測定対象とを含む学習サンプルについて、光検出器６によって検出されたスペクトル成分の情報（スペクトル情報Ａ１）と、目的の測定対象を識別する情報（識別情報）とを組み合わせた学習データを用いて機械学習を行うことによって学習済みモデルＢ１を生成する。学習済みモデルＢ１の生成方法はこれに限られず、公知の別の方法により学習を行い生成することができる。

　なお、学習済みモデルＢ１は、フローサイトメータ１の外部の情報処理装置によって予め生成されてもよい。その場合、制御部８０は学習部８４を含まず、情報処理装置８は、当該外部の情報処理装置によって生成された学習済みモデルＢ１を取得し、記憶部８５に記憶させる。また、学習済みモデルＢ１は、スペクトル情報Ａ１と、識別情報とを組み合わせた学習データを外部の情報処理装置に送信し、当該情報処理装置に学習済みモデルＢ１を生成させることもできる。その場合、制御部８０は学習部８４を含まず、情報処理装置８は生成された学習済みモデルＢ１を当該外部の情報処理装置から取得し、記憶部８５に記憶させて使用する。

　記憶部８５は、各種の情報を記憶する。記憶部８５が記憶する情報には、スペクトル情報Ａ１、学習済みモデルＢ１が含まれる。記憶部８５は、磁気ハードディスク装置や半導体記憶装置等の記憶装置を用いて構成される。

　なお、制御部８０が備える各機能部は、一例として、ＣＰＵがＲＯＭ（Ｒｅａｄ　Ｏｎｌｙ　Ｍｅｍｏｒｙ）からプログラムを読み込んで処理を実行することにより実現される。また、判別部８３は、ＦＰＧＡ（Ｆｉｅｌｄ－Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ　Ｇａｔｅ　Ａｒｒａｙ）などのＰＬＤ（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ　ｌｏｇｉｃ　ｄｅｖｉｃｅ）に設定された学習済みモデルＢ１に基づいて測定対象の判別を行なってもよい。

［判別処理］
　次に図７を参照し、情報処理装置８が目的の測定対象を判別する処理である判別処理について説明する。図７は、本実施形態に係る判別処理の一例を示す図である。判別処理は、フローサイトメータ１において、流路２０に複数の細胞Ｃ１が流される最中において、即時に実行される。また、学習済みモデルＢ１は、学習部８４によって生成されて予め記憶部８５に記憶されている。判別処理の対象となる測定サンプルには、目的の測定対象と当該目的の測定対象以外の測定対象を含む複数の細胞Ｃ１が含まれている。フローサイトメータ１は、流路２０に流される複数の細胞Ｃ１について、目的の測定対象と当該目的の測定対象以外の測定対象とを学習済みモデルＢ１を用いて判別する。

ステップＳ１０：信号強度取得部８１は、ＤＡＱデバイス７から出力される電子データを取得する。

ステップＳ２０：スペクトル情報生成部８２は、信号強度取得部８１が取得した電子データに基づいてスペクトル情報Ａ１を生成する。

ステップＳ３０：判別部８３は、学習済みモデルＢ１と、スペクトル情報Ａ１とに基づいて、測定対象について判別を行う。ここで判別部８３は、学習済みモデルＢ１と、スペクトル情報Ａ１とに基づいて、測定対象である細胞Ｃ１が目的の測定対象か否かを判別する。なお、判別部８３は、学習済みモデルＢ１と、スペクトル情報Ａ１とに基づいて、測定対象である細胞Ｃ１が目的の測定対象であるか、または目的の測定対象以外の別の測定対象であるかを判別してもよい。

ステップＳ４０：判別部８３は、判別結果を出力装置に出力する。出力装置とは、例えば、ディスプレイである。判別部８３は、判別結果を記憶部８５に記憶させてもよい。
　以上で、情報処理装置８は、判別処理を終了する。

　なお、図６および図７では、本実施形態に係るフローサイトメータ１において、情報処理装置８が学習部８４を備え、学習部８４により生成される学習済みモデルに基づいて判別処理が行われる場合の一例について説明したが、これに限らない。本実施形態に係るフローサイトメータ１は、判別処理に学習済みモデルを用いず、情報処理装置８が学習部８４を含まない構成とすることもできる。この場合、本実施形態に係るフローサイトメータ１は、スポット光の照射によって測定対象から発出される蛍光についての蛍光情報に基づき、当該測定対象が目的の対象か否かの判別を行なう。

（変形例１）
　照明光学系４は、流路２０の照射位置に複数の光点が形成されるようにスポット光Ｌ２を照射してもよい。例えば、図８に示すように、照明光学系４は、流路２０の照射位置に流路の流れ方向（＋ｙ方向）に複数の光点が直線状に配置されるようにスポット光Ｌ２を照射する。図８では、直線パターンＬＰ１は、複数の光点が、流路２０の幅方向（図８のｘ軸方向）について同じ位置（一例として、細胞Ｃ１が通過する流路２０の中心付近）に、流路の流れ方向に相互に適当に間隔（一例として、等間隔）を空けて、直線状に配置されている。それにより流路２０の幅方向（図８のｘ軸方向）の同じ位置を通過する細胞を、直線状に配置される複数の光点により連続的に照射することができる。

　流路２０の照射位置に複数の光点を形成するために、光源３は、複数の光源から構成されてもよい。光源３が複数の光源から構成される場合、当該複数の光源それぞれが照射する照明光のピーク波長は、同じであってもよいし、互いに異なっていてもよい。例えば、複数の光点が異なる波長の励起光を発する光源により構成されている場合には、異なる波長の励起光に対する細胞の自家蛍光スペクトルを同時に取得することができ、スペクトル情報Ａ１を豊富な情報として取り出すことが可能になる。

　また、流路２０の照射位置に複数の光点を形成するために、１つの光源から照射される照明光を複数の照明光に分割して使用することができる。照明光が複数の照明光に分割される場合には、ミラー、レンズなどの光学素子によって当該照明光の光路が複数の光路に分割されてもよいし、空間光変調器によって当該照明光が分割されてもよい。

　照射位置に配置される複数の光点の数は、任意の数であってよい。１つの光源からの照明光を分割する場合には、当該１つの光源につき当該複数の光点の数は５個以内とすることが照明光Ｌ１の強度を確保するためには好ましい。

（第２の実施形態）
　以下、図面を参照しながら本発明の第２の実施形態について詳しく説明する。
　上記第１の実施形態では、フローサイトメータ１は、細胞Ｃ１から発出される蛍光Ｆ１のスペクトル成分ＳＰ１を検出する場合について説明をした。本実施形態では、フローサイトメータが、蛍光Ｆ１とともに、蛍光Ｆ１以外に散乱光を検出する場合について説明をする。本実施形態に係るフローサイトメータをフローサイトメータ１ａという。
　なお、上述した第１の実施形態と同一の構成については同一の符号を付して、同一の構成及び動作についてはその説明を省略する場合がある。

　図９は、本実施形態に係るフローサイトメータ１ａの構成の一例を示す図である。フローサイトメータ１ａは、マイクロ流体装置２と、光源３と、照明光学系４ａと、検出光学系５と、光検出器６と、ＤＡＣ７と、情報処理装置８と、ＦＳＣ検出光学系９と、ＰＭＴ１０と、ＢＳＣ検出光学系１１と、ＰＭＴ１２とを備える。

　本実施形態に係るフローサイトメータ１ａ（図９）と第１の実施形態に係るフローサイトメータ１（図１）とを比較すると、フローサイトメータ１ａでは、ＦＳＣ検出光学系９、ＰＭＴ１０、ＢＳＣ検出光学系１１、及びＰＭＴ１２を備える点が異なる。ＦＳＣ検出光学系９、及びＰＭＴ１０は、前方散乱光（Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｓｃａｔｔｅｒ：ＦＳＣ）を検出するための構成である。ＢＳＣ検出光学系１１、及びＰＭＴ１２は、後方散乱光（Ｂａｃｋｗａｒｄ　Ｓｃａｔｔｅｒ：ＢＳＣ）を検出するための構成である。またフローサイトメータ１ａでは、ＦＳＣ検出及びＢＳＣ検出を自家蛍光検出と同時に行なうため、照明光学系として照明光学系４ａを備える点がフローサイトメータ１とは異なる。

　照明光学系４ａは、第３レンズ４１ａと、第４レンズ４２ａと、第５レンズ４３ａと、ダイクロイックミラー４４と、対物レンズ４５とを備える。第３レンズ４１ａと、第４レンズ４２ａと、第５レンズ４３ａと、ダイクロイックミラー４４と、対物レンズ４５とは、光源３に近い側からこの順に、光源３と流路２０との間の光路上に配置される。

　第３レンズ４１ａは、シリンドリカルレンズである。第３レンズ４１ａは、光源３から発出された照明光Ｌ１を一方向にのみ集光する。第３レンズ４１ａは、図９の構成例において、ｙ軸方向を見た場合に、照明光Ｌ１が平行光となるように照明光Ｌ１を第４レンズ４２ａに入射させる。一方、第３レンズ４１ａは、図９の構成例において、ｚ軸方向を見た場合に、照明光Ｌ１が発散するように照明光Ｌ１を第４レンズ４２ａに入射させる。

　第４レンズ４２ａは、両凸レンズである。第４レンズ４２ａは、図９の構成例において、ｙ軸方向を見た場合に、平行光となるように第３レンズ４１ａから出射する照明光Ｌ１を、ｚ軸方向について第４レンズ４２ａの焦点の位置に集光させた後、発散させて第５レンズ４３ａに入射させる。一方、図９の構成例においてｚ軸方向を見た場合に、照明光学系４ａに含まれる第４レンズ４２ａは、第３レンズ４１ａが出射する照明光Ｌ１を、照明光Ｌ１が平行光となるようにして第５レンズ４３ａに入射させる。

　第５レンズ４３ａは、シリンドリカルレンズである。第５レンズ４３ａは、ｙ軸方向を見た場合に、平面側が光源３の側となりかつ凸面側が流路２０の側となる向きに配置される。第５レンズ４３ａは、第４レンズ４２ａから発散して出射された照明光Ｌ１をｚ軸方向について集光してダイクロイックミラー４４に入射させる。一方、照明光学系４ａをｚ軸方向を見た場合に、第５レンズ４３ａは、第４レンズ４２ａを通過して出射された照明光Ｌ１を、照明光Ｌ１の幅が第４レンズ４２ａから出射されたときのままとなるように、ダイクロイックミラー４４に入射させる。

　ダイクロイックミラー４４は、第５レンズ４３ａから出射され平行光とされた照明光Ｌ１を反射する。ダイクロイックミラー４４は、反射した照明光Ｌ１を対物レンズ４５に入射させる。

　ＦＳＣ検出光学系９は、対物レンズ９１と、空間フィルター９２と、バンドパスフィルター９３と、レンズ９４と、対物レンズ４５と、ダイクロイックミラー４４とを備える。対物レンズ９１と、空間フィルター９２と、バンドパスフィルター９３と、レンズ９４とは、流路２０に近い側からこの順に、流路２０とＰＭＴ１０との間の光路上に配置される。

　対物レンズ９１は、前方散乱光ＦＳ１を集光して空間フィルター９２へと入射させる。前方散乱光ＦＳ１は、流路２０を流れる細胞Ｃ１に照射されたスポット光Ｌ２が、細胞Ｃ１によってスポット光Ｌ２の照射方向（図９において－ｚ方向）に散乱された散乱光である。

　空間フィルター９２は、入射する光のうち、直接光を遮断し、前方方向に伝搬する前方散乱光ＦＳ１を透過させる。
　バンドパスフィルター９３は、ＦＳＣ検出を行うための所定の波長域に含まれる波長の光を透過させ、この波長域に含まれない波長の光を透過させない。

　レンズ９４は、平凸レンズである。レンズ９４は平面側がＰＭＴ１０の側に、凸面側が流路２０の側となる向きに配置される。レンズ９４は、空間フィルター９２及びバンドパスフィルター９３を透過した前方散乱光ＦＳ１をＰＭＴ１０へと集光する。
　ＰＭＴ１０は、前方散乱光ＦＳ１を検出する。

　ＢＳＣ検出光学系１１は、ミラー１１１と、レンズ１１２と、スリット１１３と、レンズ１１４と、バンドパスフィルター１１５と、レンズ１１６と、対物レンズ４５と、ダイクロイックミラー４４とを備える。ミラー１１１と、レンズ１１２と、スリット１１３と、レンズ１１４と、バンドパスフィルター１１５と、レンズ１１６とは、流路２０に近い側からこの順に、流路２０とＰＭＴ１２との間の光路上に配置される。

　後方散乱光ＢＳ１は、流路２０を流れる細胞Ｃ１に照射されたスポット光Ｌ２が、細胞Ｃ１によってスポット光Ｌ２の照射方向とは反対の方向（図９において＋ｚ方向）に散乱された散乱光である。後方散乱光ＢＳ１は、対物レンズ４５に入射する。対物レンズ４５に入射した後方散乱光ＢＳ１は、平行光としてダイクロイックミラー４４に入射する。ダイクロイックミラー４４は、対物レンズ４５から平行光として出射された後方散乱光ＢＳ１をミラー１１１の側へと反射させる。
　ミラー１１１は、後方散乱光ＢＳ１をレンズ１１２の側へと反射する。

　レンズ１１２は、平凸レンズである。レンズ１１２は凸面側がミラー１１１の側に、平面側がＰＭＴ１２の側となる向きに配置される。レンズ１１２は、ミラー１１１によって反射された後方散乱光ＢＳ１をスリット１１３へと集光する。スリット１１３は、絞りである。スリット１１３は、レンズ１１２の焦点の位置に配置される。当該焦点の位置は、レンズ１１４の焦点の位置と一致している。スリット１１３は、レンズ１１２によって集光された後方散乱光ＢＳ１を発散させてレンズ１１４に入射させる。

　レンズ１１４は、平凸レンズである。レンズ１１２は平面側がミラー１１１の側に、凸面側がＰＭＴ１２の側となる向きに配置される。レンズ１１４は、スリット１１３から発散されて出射された後方散乱光ＢＳ１を平行光にしてバンドパスフィルター１１５へと入射させる。
　バンドパスフィルター１１５は、ＢＳＣ検出を行うための所定の波長域に含まれる波長の光を透過させ、この波長域に含まれない波長の光を透過させない。
　レンズ１１６は、平凸レンズである。レンズ１１６は凸面側がミラー１１１の側に、凸面側がＰＭＴ１２の側となる向きに配置される。レンズ１１６は、バンドパスフィルター１１５を透過した後方散乱光ＢＳ１をＰＭＴ１２へと集光する。
　ＰＭＴ１２は、後方散乱光ＢＳ１を検出する。

　本実施形態に係るフローサイトメータ１ａでは、前方散乱光ＦＳ１を検出するための構成（ＦＳＣ検出光学系９、ＰＭＴ１０）と、後方散乱光ＢＳ１を検出するための構成（ＢＳＣ検出光学系１１、ＰＭＴ１２）とを備えるため、蛍光Ｆ１とともに、前方散乱光ＦＳ１と、後方散乱光ＢＳ１とを検出できるため、測定対象に関する複数の種類の光学的情報を同時に取得することができる。したがって、フローサイトメータ１ａでは、上述した第１の実施形態に係るフローサイトメータ１に比べて、１回の測定において測定対象について取得できる情報の量を増やすことができる。即ち、フローサイトメータ１ａでは、測定対象の自家蛍光（蛍光Ｆ１）の情報に加え、前方散乱光ＦＳ１と、後方散乱光ＢＳ１の情報を適宜用いて、測定対象の判別を行うことができる。

（第３の実施形態）
　上述した各実施形態に係るフローサイトメータにおいて、ゴーストサイトメトリー技術を用いて細胞Ｃ１から発出される蛍光Ｆ１を検出することができる。ゴーストサイトメトリー技術では、動的ゴーストイメージング（ＧＭＩ：Ｇｈｏｓｔ　Ｍｏｔｉｏｎ　Ｉｍａｇｉｎｇ）法を利用して、細胞Ｃ１の形態情報を含むＧＭＩシグナルとして測定対象に照射された光が検出される。ゴーストサイトメトリー技術では、細胞Ｃ１の形態情報を含むＧＭＩシグナルを直接機械学習させて生成した判別器を用いて細胞Ｃ１の判別を行なうため、測定対象をより解像度の高い形態情報に基づいて判別あるいは分別することができる。本実施形態では、上述した各実施形態に係るフローサイトメータにゴーストサイトメトリー技術を組み合わせた実施形態について説明する。本実施形態に係るフローサイトメータは、上述した各実施形態に係るフローサイトメータに比べて、細胞Ｃ１由来の自家蛍光に基づいて細胞Ｃ１の形態情報をより解像度の高い情報として取得できる。

　なお、ＧＭＩ法を用いてＧＭＩシグナルとして蛍光を検出する方法は、上述した各実施形態に係るフローサイトメータの照明光学系に照明光を構造化する構造化照明の構成を追加する方法と、各実施形態に係るフローサイトメータの検出光学系に自家蛍光を構造化して検出する構造化検出の構成を追加する方法とが知られているが、以下の説明では構造化照明の構成を追加した実施形態を中心に説明する。

　以下、図面を参照しながら本発明の第３の実施形態について詳しく説明する。本実施形態に係るフローサイトメータをフローサイトメータ１ｂという。上述した第１の実施形態と同一の構成については同一の符号を付して、同一の構成及び動作についてはその説明を省略する場合がある。

　図１０は、本実施形態に係るフローサイトメータ１ｂの構成の一例を示す図である。フローサイトメータ１ｂは、マイクロ流体装置２と、光源３と、照明光学系４ｂと、検出光学系５ｂと、光検出器６ｂと、ＤＡＣ７と、情報処理装置８とを備える。本実施形態に係るフローサイトメータ１ｂ（図１０）と第１の実施形態に係るフローサイトメータ１（図１）及び第２の実施形態に係るフローサイトメータ１ａ（図１０）とを比較すると、フローサイトメータ１ｂでは、照明光学系４ｂと、検出光学系５ｂと、光検出器６ｂとを備える点が異なる。

　図１０の例では、照明光学系４ｂは、空間光変調器４６ｂ、第１レンズ４１と、空間フィルター４２ｂと、第２レンズ４３と、ダイクロイックミラー４４と、対物レンズ４５とを備える。空間光変調器４６ｂは、光源３から照射される照明光Ｌ１を構造化する。照明光学系４ｂは、照明光Ｌ１を構造化し、流路２０の照射位置において集光して構造化されたスポット光Ｌ２ｂとして細胞Ｃ１に照射する。図１０では、空間光変調器４６ｂ、第１レンズ４１と、空間フィルター４２ｂと、第２レンズ４３と、ダイクロイックミラー４４と、対物レンズ４５とは、光源３に近い側からこの順に、光源３と流路２０との間の光路上に配置されているが、空間光変調器４６ｂは、光源３と流路２０との間の光路上に配置されていれば、照明光学系４ｂの他の場所に配置されてもよい。

　第１レンズ４１は、空間光変調器４６ｂから発出された構造化された照明光Ｌ１を空間フィルター４２ｂに集光する。空間フィルター４２ｂは、第１レンズ４１によって集光された照明光Ｌ１を、空間的に変化する雑音に相当する成分を除去することによって、照明光Ｌ１の強度分布をガウス分布に近づける。第２レンズ４３は、空間フィルター４２ｂによって雑音が除去された照明光Ｌ１を平行光にする。

　照明光Ｌ１を構造化するとは、照明光Ｌ１の入射面に含まれる複数の領域ごとに照明光Ｌ１の光学特性を変調することである。空間光変調器４６ｂは、入射される光の空間的な分布を、計算された微細構造によって変化させ入射光の光学特性を変調する光学素子である。空間光変調器４６ｂの光が入射する面は、複数の領域を有しており、照明光Ｌ１の光学特性は通過する複数の領域でそれぞれ個別に変調される。すなわち、照明光Ｌ１の光学特性は、空間光変調器４６ｂを通過させることにより、その光学特性が複数の領域で互いに異なるように変化している。空間光変調器４６ｂは、複数の領域で光学特性を変化させることにより、照明光Ｌ１にパターンを付与して構造化された照明光として照射することを可能にする。

　ここで光学特性とは、例えば、強度、波長、位相、及び偏光状態のいずれか１つ以上に関する光の特性であるが、光学特性は、これらに限定されない。空間光変調器４６ｂは、一例として、光の回折現象を利用して照明光Ｌ１を空間的に分岐させ、流路の照射部位において複数の光点を形成する構造照明光として照射されるように照明光Ｌ１の光学特性を変調する。

　空間光変調器４６ｂは、例えば、回折光学素子（ＤＯＥ：Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｖｅ　Ｏｐｔｉｃａｌ　Ｅｌｅｍｅｎｔ）である。空間光変調器４６ｂは、空間光変調器（ＳＬＭ：Ｓｐａｔｉａｌ　Ｌｉｇｈｔ　Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）、またはデジタルミラーデバイス（ＤＭＤ：Ｄｉｇｉｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｍｉｒｒｏｒ　Ｄｅｖｉｃｅ）などであってもよい。なお、光源３が発する照明光Ｌ１がインコヒーレント光である場合、空間光変調器４６ｂは、ＤＭＤである。

　照明光学系４ｂは、流路２０の照射位置に構造化されたスポット光Ｌ２ｂを照射する。構造化されたスポット光Ｌ２ｂは、例えば、流路２０の照射位置に、複数の光点によるパターンを形成するように照射される。構造化されたスポット光Ｌ２ｂの形成するパターンは、流路２０の照射位置において、例えば、複数の光点が不規則に配置される。また、好適な１つの光点のサイズは測定対象の大きさに依存するが、測定対象が細胞の場合には、数μｍ－１０μｍ程度の大きさが望ましい。

　照明光学系４ｂは、構造化されたスポット光Ｌ２ｂを、第１の実施形態におけるスポット光Ｌ２と同様の範囲に集光して照射する。例えば、構造化されたスポット光Ｌ２ｂは、流路２０の幅方向に、幅が狭くなるように一定の範囲に集光される。また、構造化されたスポット光Ｌ２ｂは、流路２０の深さ方向に、特定の位置から一定の範囲に集光して照射することもできる。構造化されたスポット光Ｌ２ｂが流路２０において集光されて照射される位置と範囲は、第１の実施形態においてスポット光Ｌ２について説明されている位置と範囲と同様である。

　本構成では、照明光学系４ｂに包含された空間光変調器４６ｂにより、細胞Ｃ１に照射される光量が減弱化される可能性がある。そのため、流路２０の照射位置において構造化されたスポット光Ｌ２ｂを集光して細胞Ｃ１に照射する機構を有することは、細胞Ｃ１から発出される自家蛍光（蛍光Ｆ１）を感度良く取得するために効果的である。

　なお、図１０では、構造化照明の構成を、照明光学系４ｂが空間光変調器４６ｂを含む構成により説明したが、これに限らない。変形例１のように流路２０の照射位置に複数の光点が形成されるようにスポット光Ｌ２を照射する構成を、構造化照明の構成として利用することもできる。流路２０の照射位置に複数の光点が形成されるようにスポット光Ｌ２を照射する構成は、例えば、流路２０の照射位置に複数の光源から照明光を照射することによって構成することができる。

　フローサイトメータ１ｂでは、検出光学系５ｂは、対物レンズ４５と、ダイクロイックミラー４４と、結像光学系５１ｂとを備える。結像光学系５１ｂは、細胞Ｃ１からの蛍光Ｆ１のＧＭＩシグナルを光検出器６に集光させるための光学的な仕組みであり、結像レンズを構成に含む。なお、当該結像レンズは、細胞Ｃ１からのＧＭＩシグナルを光検出器６の位置に集光しさえすれば結像させなくてもよいが、信号光ＬＳを光検出器６の位置に結像させる位置に配置されるのがより好ましい。また、検出光学系５ｂは、さらにダイクロイックミラーや波長選択的なフィルターを備えてもよい。

　対物レンズ４５とダイクロイックミラー４４を透過した蛍光Ｆ１は、結像光学系５１ｂを介してＧＭＩシグナルとして光検出器６ｂに集光される。光検出器６ｂは、蛍光Ｆ１のＧＭＩシグナルを光信号として検出して電気信号に変換する。光検出器６は、一例として、光電子増倍管（ＰＭＴ：Ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ　Ｔｕｂｅ）である。

　なお、構造化されたスポット光Ｌ２により発出した蛍光Ｆ１は、第１の実施形態と同様の検出光学系５を用いて検出することもできる。その場合、回折格子５４において分離された各スペクトル成分が、分離後、個別成分毎のＧＭＩシグナルとして独立した複数の光検出器６によって検出される。

　一方、本実施形態に係るフローサイトメータ１ｂでは、構造化検出の構成によりＧＭＩシグナルとして蛍光を検出する構成とすることができる。その場合、フローサイトメータ１ｂの構成において、照明光学系４ｂから空間光変調器４６ｂを除くことができる。また、フローサイトメータ１ｂは、蛍光Ｆ１の光路上においてマスクと、マスク結像用レンズとが、検出光学系５ｂに追加される。当該マスクと当該マスク結像用レンズとは、例えば、ダイクロイックミラー４４とレンズ５１との間に備えられる。その構成により、本実施形態に係るフローサイトメータ１ｂでは、照明光学系４ｂによってスポット光Ｌ２が細胞Ｃ１に照射されて細胞Ｃ１から発出される蛍光Ｆ１は、マスク結像用レンズを介してマスクに照射され構造化される。光信号（つまり、蛍光Ｆ１）を構造化するとは、光信号のマスクの入射面に含まれる複数の領域ごとに当該光信号の光学特性を変調することである。

　上述の構造化検出に用いるマスクは、マスクに光が入射する面に複数の領域を有している空間フィルターである。当該マスクの複数の領域は、光を透過させる領域（光透過領域）と、光を遮断させる領域（光遮断領域）とからなっており、入射する蛍光Ｆ１の光学特性をマスクの複数の領域ごとに変調する。
　なお別の例として、検出光学系５ｂは、マスクの代わりに、光透過領域と光遮断領域とを有して空間フィルターとして機能するミラーが備えられてもよい。

　マスク結像用レンズは、細胞Ｃ１から発出された蛍光Ｆ１を集光し、マスク上に結像させる。光検出器６は、検出光学系５ｂに含まれるマスクの光透過領域を介して構造化された蛍光を検出する。

　なおゴーストサイトメトリー技術を用いて蛍光を検出する場合には、信号強度取得部８１が取得した光検出器６がＧＭＩシグナルとして検出する構造化された蛍光の信号強度を時間ごとに示した電子データが、スペクトル情報Ａ１の代わりに機械学習に用いられる。即ち、本実施形態に係るフローサイトメータ１ｂでは、蛍光の信号強度を時間ごとに示した電子データと識別情報とを組み合わせた学習データを用いた機械学習により判別のための学習済みモデルＢ１が生成され、当該学習済みモデルＢ１に基づいて、測定対象である細胞Ｃ１から検出した蛍光ＧＭＩシグナルの信号強度を時間ごとに示した電子データから、細胞Ｃ１の判別が行なわれる。

　また、本実施形態に係るフローサイトメータ１ｂでは、ＧＭＩ法により検出されたＧＭＩシグナルに含まれる測定対象の形態情報のうち解像度が所定の解像度よりも高い形態情報を画像に再構成して細胞Ｃ１の判別に利用してもよい。所定の解像度は照明光の波長により異なるが、ここで所定の解像度とは、例えば、０．５μｍ程度である。また、第２の実施形態におけるフローサイトメータ１ａと同様に、本実施形態に係るフローサイトメータ１ｂにおいても、ゴーストサイトメトリー技術を用いた蛍光Ｆ１のＧＭＩシグナルとしての検出を、蛍光Ｆ１以外の散乱光の検出と同時に行う構成とすることができる。

（各実施形態のまとめ）
　以上に説明したように、各実施形態に係るフローサイトメータ１、１ａ、１ｂは、流路２０と、光源３と、照明光学系４と、検出光学系５、５ｂと、光検出器６と、判別部８３と、を備える。
　流路２０は、蛍光染色剤によって標識されていない測定対象（本実施形態において、細胞Ｃ１）を流体とともに流通させる。
　光源３は、照明光Ｌ１を照射する。
　照明光学系４、４ａ、４ｂは、光源３が照射する照明光Ｌ１を、流路２０における照射位置において流路２０の幅方向と深さ方向との少なくとも一方について集光させた照明光であるスポット光Ｌ２として流路２０を流通する測定対象（本実施形態において、細胞Ｃ１）に照射する。
　光検出器６、６ｂは、測定対象（本実施形態において、細胞Ｃ１）が固有に有する分子から照明光学系４、４ａ、４ｂによるスポット光Ｌ２の照射によって発出される蛍光Ｆ１を検出する。
　検出光学系５、５ｂは、蛍光Ｆ１を光検出器６、６ｂに伝搬させる。
　判別部８３は、光検出器６、６ｂによって検出された蛍光Ｆ１の情報（本実施形態において、スペクトル情報Ａ１、または蛍光Ｆ１の信号強度）に基づいて、当該測定対象（本実施形態において、細胞Ｃ１）が目的の対象か否かについて判別を行う。

　この構成により、各実施形態に係るフローサイトメータ１、１ａ、１ｂは、流路２０の幅方向と深さ方向との少なくとも一方について集光させたスポット光Ｌ２を流路２０を流通する測定対象に照射することによって、自家蛍光である蛍光Ｆ１の強度に対する感度を向上させることができるため、フローサイトメータによる測定において、自家蛍光に基づいて測定対象の判別ができる。

　なお、上述した各実施形態に係るフローサイトメータは、セルソータの機能を備えていてもよい。フローサイトメータは、情報処理装置８によって生成される光学的情報に含まれる細胞の形態を示す情報に基づいて、細胞をソーティングする。ソーティングとは、流路を流れる測定対象のうちから、目的の測定対象を分取することである。この目的の測定対象は、例えば、ユーザによって予め選択される。
　フローサイトメータがセルソータの機能を備える場合、フローサイトメータは、例えば、分取部を備える。分取部は流路２０を流れる測定対象のうちから、目的の測定対象を分取する。分取部は、判別部８３による判別結果に基づいて目的の測定対象を分取する。

　なお、上述した実施形態における情報処理装置８が備える機能のうち一部あるいは全部が、情報処理装置８とは別体の外部の情報処理装置に備えられてもよい。外部の情報処理装置は、例えば、情報処理装置８とは別体のＰＣである。また、情報処理装置８が備える機能のうち一部あるいは全部が、クラウドサーバに備えられてもよい。

　なお、上述した各実施形態に係るフローサイトメータは、自家蛍光を検出する低速モードと、自家蛍光以外の種類の光を検出する高速モードとが切替可能な構成とされてもよい。例えば、自家蛍光を検出する低速モードでは、マイクロ流体装置２は、流路２０を流れる流体の流速を所定の速度（例えば、５ｍ／ｓ）未満に制御する。自家蛍光以外の種類の光を検出する高速モードでは、マイクロ流体装置２は、当該流速を当該所定の速度以上に制御する。
　低速モードと高速モードとの切り替えは、例えば、入力装置からユーザによる操作によって行われる。当該操作は、情報処理装置８によって受け付けられて、情報処理装置８によってマイクロ流体装置２が制御される。

　なお、上述した各実施形態では、自家蛍光に基づいて測定対象の判別ができるフローサイトメータの構成を中心に説明を行ってきたが、当該フローサイトメータの構成に基づいて測定対象の自家蛍光の強度を示すデータの取得することにより、取得したデータに基づいて測定対象の自家蛍光の情報を生成し、生成された測定対象の自家蛍光の情報に基づいて、当該測定対象が目的の対象か否かについて判別を行う判別方法も、この発明の範囲に同様に含まれる。

（実施例）
　以下では、上記の各実施形態に係る実施例について説明する。
［測定対象の調整方法］
　本実施例では、測定対象として凍結ヒト末梢血単核細胞から単離したリンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、及びナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞））を、蛍光色素蛍光染色剤により標識せずに用い、各細胞から発出される自家蛍光に基づいて、異なる２細胞間の二クラス分類を行ないその分類精度を試験的に確認した。

［細胞処理］
　凍結ヒト末梢血単核細胞（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）からＭＡＣＳ　Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社Ｐａｎ　Ｔ　ｃｅｌｌ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ、ＮＫ　Ｃｅｌｌ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ、Ｂ　ｃｅｌｌ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ）を用いて各リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、及びＮＫ細胞）を分離し、洗浄後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ溶液ともいう）中で１ｘ１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度となるように調整した。精製した各リンパ球試料の純度は、試料の一部を採取して、蛍光標識された抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製　ＦＩＴＣ標識　ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＣＤ３抗体、ＰＥ標識　ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＣＤ１９抗体、ＡＰＣ標識　ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＣＤ５６抗体）による染色を施し、Ａｔｔｕｎｅ　ＮｘＴ　Ｆｌｏｗ　Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて確認した。その結果、調整後の各リンパ球試料に含まれるリンパ球細胞の純度は、それぞれＴ細胞で９９．３％、Ｂ細胞で９８．２％、ＮＫ細胞で９３．９％であった。

［自家蛍光の測定］
　自家蛍光を用いた細胞サンプルの判別には、フローサイトメータ１ａ１を用いた。フローサイトメータ１ａ１の構成は、第２の実施形態において説明したフローサイトメータ１ａの構成に準じている。フローサイトメータ１ａ１では、光源は複数の光源から構成される。フローサイトメータ１ａ１は、フローサイトメータ１ａ（光源は１つの光源から構成される）と、光源の構成が異なっているが、それ以外の構成は同様である。

　フローサイトメータ１ａ１では、光源は、波長の異なる照明光を照射する複数のレーザー光源により構成される。光源は、蛍光測定用の光源と、散乱光測定用の光源とから構成される。蛍光測定用の光源として、波長３６０ｎｍの照明光を照射するレーザー光源、及び３７５ｎｍの照明光を照射するレーザー光源を使用した。散乱光測定用の光源として、４０５ｎｍの照明光を照射するレーザー光源を使用した。

　また、フローサイトメータ１ａ１では、流路の照射位置におけるスポット光の大きさを、流路の幅方向に１０μｍ未満の幅となるように、流路の垂直方向に１μｍ未満の幅となるように集光した。フローサイトメータ１ａ１では、自家蛍光を検出する光検出器にマルチアノードＰＭＴ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ　ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ製）を用いた。対物レンズに入射する蛍光のうち、ダイクロイックミラーで４２０ｎｍ以下の波長をカットした４２０ｎｍ以上の波長の光を細胞由来の自家蛍光として取得した。ここで波長３６０ｎｍの励起光により励起された蛍光、及び波長３７５ｎｍの励起光により励起された蛍光は、それぞれマルチアノードＰＭＴによって１５チャネルに分画して検出された。
　なお、フローサイトメータ１ａ１では、アコースティックフォーカシングの手法により、測定対象である細胞を流路の中央部付近に収束させており、０．５ｍｌ／ｍｉｎ（～５０ｃｐｓ）の流速で細胞を分散させた流体を流通させて細胞由来の蛍光を散乱光（ＢＳＣ）と同時に測定した。

［細胞の判別］
　図１１は、本実施例に係る測定結果のまとまりを示す図である。上述したように、本実施例では、３種類のリンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、及びＮＫ細胞）を測定対象として用い、連続的に繰り返して測定を行った。
　ここで図１１を用いて、複数の測定についてのまとまり（集団）について説明する。本実施例において、各リンパ球の測定は、３万個から４万個程度の個数の細胞について連続的に行われた。このリンパ球について連続的に行われる測定（３万回から４万回程度）の１つのまとまりを以降ではイベントと記載する。また本実施例の測定は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞の順で連続して行われ、３種類のリンパ球について連続的に実施された３つのイベントからなる測定のまとまりを以降ではセットと記載する。

　本実施例では、図１１に示すように、第１セットから第５セットまで連続して５セットの測定が実施された。各セットには３種類のリンパ球について１つずつイベントが含まれるため、これらの５セットには、合計１５個のイベントが含まれる。
　各イベントでは、個別細胞ごとに蛍光情報及び散乱光（ＢＳＣ）情報が測定データとして取得された。図１１に示すように、例えば第３イベントでは、ＮＫ細胞について蛍光情報及び散乱光情報が取得されている。
　なお本実施例では、蛍光情報について、それぞれの励起波長について、個別のチャネルで取得した蛍光強度の総量をその各励起波長において得られた最大の蛍光強度の総量で規格化した特徴量が、以下に説明するリンパ球間の判別に用いられた。すなわち、規格化した蛍光情報について１５×２個の特徴量（波長３６０ｎｍの励起光、及び波長３７５ｎｍの励起光それぞれについてマルチアノードＰＭＴの１５チャネル分）と、ＢＳＣ１個の特徴量とが、以下に説明するリンパ球間の学習と検証に用いられている。

　リンパ球間の判別とは、特定の２種のリンパ球間で２つのクラスに分類する二クラス分類である。図１２は、本実施例に係るリンパ球間の判別の方法を説明する図である。図１２では、一例として、Ｔ細胞とＢ細胞についての二クラス分類を行う場合について説明している。特定の２種のリンパ球間の判別では、第１セットから第５セットまでの測定データのうち、ある１つのセットで取得された２種の細胞についての測定データを学習データとして用い判別器が作成される。次に、他の４つのセットで取得された同じ２種の細胞の測定データを検証データとして用い、作成した判別器による判別が検証のために行われる。この一連の手順が、判別器を作成するために用いる学習データのセットを変えながら繰り返し実施される。なお、この繰り返しの単位を以降ではラウンドと記載する。

　例えば図１２では、第１ラウンドの検証で、第１セットにおいて測定したＴ細胞とＢ細胞の測定データを学習データとして用いて判別器が作成される。第１セットの測定データを学習データとして利用して作成した判別器について、第２セットから第５セットにおいて測定したＴ細胞とＢ細胞のデータを検証データとして用いた判別を行う検証が、それぞれのセット（第２セットから第５セット）について行われる。ここで学習データとして用いられる２種のリンパ球のデータは、検証データとして用いられる２種のリンパ球のデータと、リンパ球の種類が同じである。

　さらに第２ラウンドから第５ラウンドの検証では、他の４セット（第２セットから第５セット）において、それぞれのセットで取得された測定データを学習データとして用い作成した判別器について、他のセットにおいて取得された測定データを検証データとして用いた判別が同様に繰り返し行われる。
　上記の通り、本実施例では、クロスオーバーで合計２０個のＲＯＣ－ＡＵＣ値がそれぞれの２種のリンパ球間の判別について計算され、その平均値により当該２種のリンパ球間についての二クラス分類の精度を評価した。なお、判別器の作成にはランダムフォレストアルゴリズムを用いた。

［判別結果］
　リンパ球間の判別の結果、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及びＮＫ細胞の各二クラス間のＲＯＣ－ＡＵＣの平均値（ＡＵＣ値）として以下の値が得られた。Ｔ細胞とＢ細胞間の判別におけるＡＵＣ値は０．８７であり、Ｔ細胞とＮＫ細胞間の判別におけるＡＵＣ値は０．９０であり、Ｂ細胞とＮＫ細胞間の判別におけるＡＵＣ値は０．９５であった。一方、同様の評価を、同じ細胞種タイプの測定時間が近い２つのセットの測定データ（規格化した蛍光情報とＢＳＣ）について行った場合には、ＡＵＣ値は０．５程度と算出された。このＡＵＣ値によって、測定間誤差は十分に小さいことが示された。
　上記のとおり、本実施例の結果から、自家蛍光を用いた測定により、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及びＮＫ細胞のいずれの２種細胞間においても高い分類精度（特定の２種のリンパ球間における二クラス分類の精度）が得られていることが確認された。

　なお、上述した実施形態における情報処理装置８に備えられる制御部８０の一部、例えば、信号強度取得部８１、スペクトル情報生成部８２、判別部８３、及び学習部８４をコンピュータで実現するようにしてもよい。その場合、この制御機能を実現するためのプログラムをコンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録して、この記録媒体に記録されたプログラムをコンピュータシステムに読み込ませ、実行することによって実現してもよい。なお、ここでいう「コンピュータシステム」とは、情報処理装置８に内蔵されたコンピュータシステムであって、ＯＳや周辺機器等のハードウェアを含むものとする。また、「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ、ＣＤ－ＲＯＭ等の可搬媒体、コンピュータシステムに内蔵されるハードディスク等の記憶装置のことをいう。さらに「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、インターネット等のネットワークや電話回線等の通信回線を介してプログラムを送信する場合の通信線のように、短時間、動的にプログラムを保持するもの、その場合のサーバやクライアントとなるコンピュータシステム内部の揮発性メモリのように、一定時間プログラムを保持しているものも含んでもよい。また上記プログラムは、前述した機能の一部を実現するためのものであってもよく、さらに前述した機能をコンピュータシステムにすでに記録されているプログラムとの組み合わせで実現できるものであってもよい。
　また、上述した実施形態における情報処理装置８の一部、または全部を、ＬＳＩ（Ｌａｒｇｅ　Ｓｃａｌｅ　Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）等の集積回路として実現してもよい。情報処理装置８の各機能ブロックは個別にプロセッサ化してもよいし、一部、または全部を集積してプロセッサ化してもよい。また、集積回路化の手法はＬＳＩに限らず専用回路、または汎用プロセッサで実現してもよい。また、半導体技術の進歩によりＬＳＩに代替する集積回路化の技術が出現した場合、当該技術による集積回路を用いてもよい。

　以上、図面を参照してこの発明の一実施形態について詳しく説明してきたが、具体的な構成は上述のものに限られることはなく、この発明の要旨を逸脱しない範囲内において様々な設計変更等をすることが可能である。

１、１ａ、１ｂ…フローサイトメータ、２０…流路、３…光源、４、４ａ、４ｂ…照明光学系、５、５ｂ…検出光学系、６、６ｂ…光検出器、８３…判別部、Ｃ１…細胞、Ｌ１…照明光、Ｌ２…スポット光、Ｆ１…蛍光、ＳＰ１…スペクトル成分、Ａ１…スペクトル情報、Ｂ１…学習済みモデル

Claims (12)

1. 　蛍光染色剤によって標識されていない測定対象を流体とともに流通させる流路と、
   　照明光を照射する光源と、
   　前記光源が照射する前記照明光を、前記流路における照射位置において前記流路の幅方向と深さ方向との少なくとも一方について集光させた照明光であるスポット光として前記流路を流通する前記測定対象に照射する照明光学系と、
   　前記測定対象が固有に有する分子から前記照明光学系による前記スポット光の照射によって発出される蛍光を検出する光検出器と、
   　前記蛍光を前記光検出器に伝搬させる検出光学系と、
   　前記光検出器によって検出された前記蛍光の情報に基づいて、当該測定対象が目的の対象か否かについて判別を行う判別部と、
   　を備えるフローサイトメータ。
2. 　前記照明光学系は、前記光源が照射する前記照明光を、前記照射位置において前記測定対象の大きさに集光させて前記スポット光として前記流路を流通する前記測定対象に照射する
   　請求項１に記載のフローサイトメータ。
3. 　前記流路を流通する前記測定対象のサンプル流を前記流路の幅方向に所定の範囲に収束させるフォーカシング機構をさらに備え、
   　前記照明光学系は、前記スポット光の幅の前記流路の幅に対する割合を所定の割合以下にして、前記照射位置において前記スポット光を前記測定対象に照射する
   　請求項１に記載のフローサイトメータ。
4. 　前記流路を流通する前記測定対象のサンプル流を前記流路の深さ方向に所定の範囲に収束させるフォーカシング機構をさらに備え、
   　前記照明光学系は、前記スポット光を前記流路の深さ方向について特定の位置に集光させ、前記照射位置において前記スポット光を前記測定対象に照射する
   　請求項１に記載のフローサイトメータ。
5. 　前記流路は、所定の速度未満の速度において前記測定対象を流体とともに流通させる
   　請求項１に記載のフローサイトメータ。
6. 　前記検出光学系は、前記蛍光をスペクトル成分に分離させ、
   　前記光検出器は、前記検出光学系によってスペクトル成分に分離された前記蛍光を当該スペクトル成分毎に検出し、
   　前記判別部は、前記光検出器によって検出された前記蛍光のスペクトル成分の情報であるスペクトル情報に基づいて当該測定対象について前記判別を行う
   　請求項１に記載のフローサイトメータ。
7. 　前記測定対象について前記スペクトル情報が入力されると当該測定対象が前記目的の測定対象であるか否かを判別する学習済みモデルを生成する学習部をさらに備え、
   　前記判別部は、前記学習済みモデルに基づいて前記測定対象の前記スペクトル情報から当該測定対象ついて前記判別を行なう
   　請求項６に記載のフローサイトメータ。
8. 　前記学習部は、前記測定対象として前記目的の測定対象と前記目的の測定対象以外の測定対象とを含む学習サンプルについて、前記光検出器によって検出されたスペクトル成分の情報と、前記目的の測定対象を識別する情報とを組み合わせた学習データを用いて機械学習を行うことによって前記学習済みモデルを生成し、
   　前記判別部は、前記学習部が生成した前記学習済みモデルと、前記流路を流通する前記測定対象について前記光検出器によって検出されたスペクトル成分の情報とに基づいて、当該測定対象について判別を行う
   　請求項７に記載のフローサイトメータ。
9. 　前記照明光学系あるいは前記検出光学系の少なくとも１つが、空間光変調器を含み、
   　前記光検出器は、前記蛍光を動的ゴーストイメージングシグナルとして検出し、
   　前記判別部は、前記動的ゴーストイメージングシグナルに含まれる前記測定対象の形態情報のうち解像度が所定の解像度よりも高い形態情報を利用して測定対象の判別を行なう
   　請求項１に記載のフローサイトメータ。
10. 　前記測定対象について、前記動的ゴーストイメージングシグナルが入力されると当該測定対象が前記目的の測定対象であるか否かを判別する学習済みモデルを生成する学習部をさらに備え、
    　前記判別部は、前記学習済みモデルに基づいて前記測定対象の前記動的ゴーストイメージングシグナルから当該測定対象について前記判別を行なう
    　請求項９に記載のフローサイトメータ。
11. 　蛍光染色剤によって標識されていない測定対象を流体とともに流通させる流路と、
    　照明光を照射する光源と、
    　前記光源が照射する前記照明光を、前記流路における照射位置において前記流路の幅方向と深さ方向との少なくとも一方について集光させた照明光であるスポット光として前記流路を流通する前記測定対象に照射する照明光学系と、
    　前記測定対象が固有に有する分子から前記照明光学系による前記スポット光の照射によって発出される蛍光を検出する光検出器と、
    　前記蛍光を前記光検出器に伝搬させる検出光学系と、
    　を備えるフローサイトメータによって検出された結果に基づいて測定対象について判別を行う判別方法であって、
    　前記流路を流通する前記測定対象について前記光検出器によって検出された前記蛍光の強度を示すデータを取得する取得ステップと、
    　前記取得ステップにおいて取得された前記データに基づいて前記蛍光の情報を生成する生成ステップと、
    　前記生成ステップにおいて生成された前記蛍光の情報に基づいて、当該測定対象が目的の対象か否かについて判別を行う判別ステップと、
    　を有する判別方法。
12. 　蛍光染色剤によって標識されていない測定対象を流体とともに流通させる流路と、
    　照明光を照射する光源と、
    　前記光源が照射する前記照明光を、前記流路における照射位置において前記流路の幅方向と深さ方向との少なくとも一方について集光させた照明光であるスポット光として前記流路を流通する前記測定対象に照射する照明光学系と、
    　前記測定対象が固有に有する分子から前記照明光学系による前記スポット光の照射によって発出される蛍光を検出する光検出器と、
    　前記蛍光を前記光検出器に伝搬させる検出光学系と、
    　を備えるフローサイトメータによって検出された結果に基づいて情報処理を行うコンピュータに、
    　前記流路を流通する前記測定対象について前記光検出器によって検出された前記蛍光の強度を示すデータを取得する取得ステップと、
    　前記取得ステップにおいて取得された前記データに基づいて前記蛍光の情報を生成する生成ステップと、
    　前記蛍光の情報に基づいて、当該測定対象が目的の対象か否かについて判別を行う判別ステップと、
    　を実行させるためのプログラム。

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