WO2021132484A1 - フローサイトメータ性能評価方法、及び標準粒子懸濁液 - Google Patents

フローサイトメータ性能評価方法、及び標準粒子懸濁液 Download PDF

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啓史 中川
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Definitions

  • the present invention relates to a flow cytometer performance evaluation method and a standard particle suspension.
  • the present application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2019-238089 filed in Japan on December 27, 2019, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • a flow cytometer is an analyzer that uses a technique called the flow cytometry method, in which individual cells are dispersed in a fluid and the fluid is allowed to flow down for optical analysis. It is a cell measuring device used.
  • a general method is to arrange cells that have been fluorescently stained with a fluorescent probe in a row in a fluid and analyze the intensity of fluorescence or scattered light generated by irradiating cells flowing through the flow path with laser light. Will be done.
  • measurement using a flow cytometer it is common practice to confirm that the flow cytometer to be used is in a state suitable for measurement, and to adjust in advance if necessary. In order to perform such calibration, a method using a suspension in which fine beads or the like is suspended is already known.
  • a standard particle suspension for a flow cytometer containing polystyrene-based polymer particles having a scattered light intensity similar to that of bacteria and polyvinyl acetate particles having a fluorescence intensity similar to that of bacteria after staining is described.
  • Patent Document 1 a standard particle suspension for a flow cytometer containing polystyrene-based polymer particles having a scattered light intensity similar to that of bacteria and polyvinyl acetate particles having a fluorescence intensity similar to that of bacteria after staining is described.
  • Patent Document 1 a standard particle suspension for a flow cytometer containing polystyrene-based polymer particles having a scattered light intensity similar to that of bacteria and polyvinyl acetate particles having a fluorescence intensity similar to that of bacteria after staining is described.
  • Patent Document 1 a standard particle suspension for a flow cytometer containing polystyrene-based polymer particles having a scattered light intensity similar to that of bacteria and polyvinyl acetate particles having
  • a two-dimensional image of a cell is generated by irradiating an excitation light while flowing down a fluorescently labeled cell in a flow path and acquiring the fluorescence brightness emitted from each cell.
  • An imaging cytometer that separates cells is known as a prior art.
  • a technique for directly analyzing cell morphology information from measurement data without converting it into a two-dimensional image has been developed in recent years, and a ghost cytometry technique is known as an example (Non-Patent Document 1).
  • the ghost cytometry technique is a single-pixel compression imaging technique that captures an object image by utilizing the movement of cells to be measured passing over optical structure illumination.
  • cells can be irradiated with structured illumination, and cells can be separated directly from the time-series waveform of the obtained optical signal, resulting in high speed, high sensitivity, low cost, and compactness.
  • a flexible flow cytometer can be provided (Patent Document 2).
  • the target cells can be discriminated or sorted based on a model created in advance by machine learning without labeling such as fluorescent staining. In quality control of cells produced for regenerative medicine and cell therapy, there is an increasing need for technology for discriminating or separating target cells without such labeling.
  • the standard particle suspension for a flow cytometer described in Patent Document 1 is used for a flow cytometer that discriminates bacteria based on the total amount of scattered light intensity and fluorescence intensity, and is a flow using a ghost cytometry technique. It was insufficient to evaluate the discrimination performance in a flow cytometer with higher resolution, such as a cytometer. Image-based signal-to-noise ratios are used to evaluate performance in flow cytometers that separate cells using imaging technology, but flow cytometry that does not use visually determinable two-dimensional images such as ghost cytometry technology For meters, there has been no simple method for evaluating the ability of flow cytometers to discriminate cells.
  • the present invention has been made in view of the above points, and like a flow cytometer based on ghost cytometry technology, morphological information is directly acquired from time-series waveform information of an optical signal without using a two-dimensional image.
  • a standard particle suspension that can easily evaluate the discrimination performance in a flow cytometer that discriminates measurement objects such as cells with higher spatial resolution than the flow cytometer that evaluates the evaluation target based on the total amount of scattered light intensity and fluorescence intensity. Provide a turbid liquid.
  • the present invention has been made to solve the above problems, and one aspect of the present invention is a method for evaluating the performance of a flow cytometer that uses two or more types of calibration particles having different morphologies in combination.
  • the first discrimination step in which the flow cytometer to be evaluated discriminates the calibration particles from each other based on the first optical characteristic, and the discriminant at a spatial resolution lower than the spatial resolution at which the first optical characteristic can be discriminated.
  • a second discrimination step in which the calibration particles are discriminated from each other based on a possible second optical characteristic, a first discrimination result determined by the first discrimination step, and a second discrimination step determined by the second discrimination step.
  • This is a flow cytometer performance evaluation method including an evaluation step for evaluating one or both of the particle discrimination performance and the resolution of the flow cytometer based on the discrimination result.
  • the two or more types of calibration particles are premixed with a combination of the two or more types of calibration particles to form a standard particle suspension. Used in an inclusive manner.
  • the calibration particles 2 are obtained from the time-series waveform information of the optical signal acquired by the flow cytometer based on the first optical characteristic. It is a flow cytometer that directly discriminates the calibration particles without using a two-dimensional image.
  • the flow cytometer is a flow cytometer based on the ghost cytometry technique, and the optical signal detected as the first optical characteristic is used.
  • the calibration particles are determined based on the reflected morphological information.
  • one aspect of the present invention is a standard particle suspension for evaluating the performance of a flow cytometer containing two or more types of calibration particles in combination, and the two or more types of calibration particles are the first.
  • a standard particle suspension in which the optical characteristics of the above particles are different from each other and the second optical characteristics that can be discriminated even at a lower spatial resolution than the spatial resolution in which the first optical characteristics can be discriminated are different from each other. is there.
  • the two or more types of calibration particles further have a third optical property that is substantially the same as each other.
  • the third optical characteristic is the intensity of scattered light emitted by the calibration particles in response to the light applied to the calibration particles. is there.
  • the first optical characteristic is a characteristic regarding the morphology of the calibration particle. That is, in the above standard particle suspension, the first optical characteristic is a characteristic regarding the morphology of the calibration particle reflected in the optical signal acquired in the present invention.
  • the second optical property is one or both of the wavelength and intensity of fluorescence emitted by the calibration particles according to the irradiated light. ..
  • the specific gravity of the calibration particles with respect to the standard particle suspension is in the range of 1 to a predetermined range.
  • the size of the calibration particles is 0.1 ⁇ m or more and 100 ⁇ m or less.
  • the calibration particles are composed of a material containing agarose gel, polyethylene glycol (Polyethylene glycol), and polystyrene (Polystyrene).
  • the flow cytometer to be evaluated uses the time-series waveform information of the optical signal acquired based on the first optical characteristic to obtain the calibration particles. It is a flow cytometer that directly discriminates the calibration particles without using a two-dimensional image.
  • the flow cytometer in the above standard particle suspension, is a flow cytometer based on the ghost cytometry technique, and is reflected in the optical signal detected as the first optical characteristic.
  • the calibration particles are discriminated based on the morphological information.
  • a flow cytometer using a ghost cytometry technique that can separate a measurement target with a higher spatial resolution than a conventional flow cytometer that evaluates an evaluation target based on the total amount of scattered light intensity and fluorescence intensity.
  • the sorting performance can be easily evaluated.
  • the result of measuring the total amount of fluorescence intensity using structured illumination at a wavelength of 525 nm and the measurement of the total amount of fluorescence intensity using spot light were performed at a detection wavelength of 676 nm. It is a figure which shows the result. It is a figure which shows the result of discriminating two kinds of calibration beads based on the ghost cytometry technique by the flow cytometer which concerns on embodiment of this invention.
  • the standard particle suspension L according to the present embodiment is poured into the flow cell of the flow cytometer and used to evaluate the discrimination performance of the flow cytometer.
  • the flow cytometer whose discrimination performance is evaluated using the standard particle suspension L according to the present embodiment is, for example, a flow cytometer that performs measurement based on ghost cytometry technology, and has fluorescence intensity and scattered light intensity. It is a flow cytometer having higher spatial resolution than the conventional flow cytometer that evaluates the measurement target based on the total amount of.
  • the discrimination performance higher than that of the conventional flow cytometer is, for example, the same as the discrimination performance of the flow cytometer using the ghost cytometry technique capable of discriminating or sorting the target cells based on the cell morphology. It refers to the degree of discrimination performance, and is the sorting performance that allows recognition of minute differences in the morphology of measurement objects that could not be discriminated by conventional flow cytometers.
  • a flow cytometer for measuring based on the ghost cytometry technique As a flow cytometer for evaluating the discrimination performance by the standard particle suspension L according to the present embodiment, a flow cytometer for measuring based on the ghost cytometry technique will be described as an example.
  • the standard particle suspension L according to the morphology is a measurement target with higher spatial resolution than a conventional flow cytometer that evaluates an evaluation target based on the total amount of fluorescence intensity and scattered light intensity without converting it into image information. It can also be used for a flow cytometer capable of extracting morphological information. Further, in the following description, a flow cytometer that evaluates an evaluation target based on the total amount of fluorescence intensity and scattered light intensity may be described as a conventional flow cytometer.
  • FIG. 1 shows an example of a signal obtained when the standard particle suspension L is measured by a flow cytometer, which is an evaluation target of the separation performance.
  • the standard particle suspension L includes two or more types of particles for evaluating the sorting performance of the flow cytometer to be evaluated.
  • the particles included in the standard particle suspension are described as calibration particles in order to evaluate the separation performance of the flow cytometer to be evaluated.
  • an example in which the standard particle suspension L contains two types of particles, particles 1 and particles 2 will be described.
  • the signal SG1 is a signal of scattered information obtained by acquiring the intensity of scattered light as a total amount.
  • the signal SG2 is a signal of fluorescence information obtained as a total amount of fluorescence brightness.
  • the signal SG3 is a signal capable of obtaining morphological information of the calibration particles contained in the standard particle suspension L at a higher spatial resolution than the signal SG1 and the signal SG2, and is, for example, a time-series detected by a ghost cytometry technique. It is a signal of an optical signal.
  • the signal SG3 has a second optical characteristic based on the first optical characteristic of the calibration particles contained in the standard particle suspension L.
  • the signal SG2 is acquired based on the above, and the signal SG1 is acquired based on the third optical characteristic.
  • the above-mentioned morphological information includes, for example, information indicating the outer shape and internal structure of the calibration particles, and has a high spatial resolution that allows the target cells to be identified or separated from the signal SG3 without labeling such as fluorescent staining.
  • the morphological information having is directly acquired.
  • the signal SG3 is a signal that can acquire morphological information at a higher spatial resolution than the information obtained by measuring the total amount of fluorescence in the signal SG2.
  • the time series signal of is applicable.
  • a specific illumination pattern is applied to the illumination light irradiating an object to be measured moving in a flow path, and the illumination light is irradiated by a structured illumination configuration or by irradiating the illumination light.
  • the morphological information of the object to be measured is compressed into the signal light detected by the optical detector by the structured detection configuration that detects by adding a specific pattern to the light such as fluorescence and scattered light emitted from the object to be measured. Can be granted. Therefore, the time-series waveforms of the optical signals obtained by detecting the particles 1 and 2 obtained by the flow cytometer using the ghost cytometry technique reflect the difference in morphology between the particles 1 and the particles 2 and each other.
  • the first optical characteristic of the calibration particles contained in the standard particle suspension L according to the present embodiment is a characteristic (morphological characteristic) regarding the morphology of the particles, and reflects the difference in the first optical characteristic. It is determined based on the optical signal. In the example of the flow cytometer using the ghost cytometry technique, the above-mentioned first optical characteristic is reflected in the detected optical signal.
  • the types of light detected by the flow cytometer using the ghost cytometry technique are transmitted light, fluorescence, scattered light, interference light, diffracted light, and polarized light emitted from or transmitted through the calibration particles. Any of these may be used, and suitable light is selected according to the measurement target of the flow cytometer to be evaluated. In this embodiment, an example of measuring the diffracted light generated through the calibration particles will be described.
  • the flow cytometer to be evaluated by the standard particle suspension L in the present embodiment.
  • the discrimination performance differs from the information regarding the morphology obtained from the scattered information by the signal SG1 in the spatial resolution of the information that can be acquired.
  • the standard particle suspension L of the present embodiment has a flow cytometer that evaluates a discrimination performance having a higher spatial resolution than that obtained by acquiring scattered light information as the total amount of scattered light by a conventional flow cytometer. It is used to evaluate whether or not.
  • FIG. 2 is an example showing the form of the calibration particles contained in the standard particle suspension L according to the present embodiment.
  • the standard particle suspension L contains particles 1 and 2.
  • the liquid can also be used in a method in which two types of particles, particle 1 and particle 2, are separately provided, and suspensions prepared for each are used in combination when evaluating the discrimination performance of a flow cytometer.
  • Particle 1 and particle 2 are, for example, fine particles having a size of about 0.1 ⁇ m to 100 ⁇ m, and more preferably have a size of 1 ⁇ m or more and 100 ⁇ m or less. It is desirable that the calibration particles contained in the standard particle suspension L according to the present embodiment have the same size as the morphological discrimination target, and when the discrimination target is a cell, the particle size of the calibration particles. Is more preferably 5 ⁇ m or more and 40 ⁇ m or less, and further preferably 10 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less. The size of the calibration particles contained in the standard particle suspension L may be selected according to the size of the morphological discrimination target and the sensitivity required for the flow cytometer.
  • the particles 1 and 2 contained in the standard particle suspension L according to the present embodiment have different forms.
  • the morphology of the particles 1 and 2 can be selected according to the morphology of the discrimination target and the sensitivity required for the flow cytometer to be evaluated.
  • the embodiment in the present embodiment includes, for example, the outer shape of the particle and the internal structure of the particle.
  • the particles 1 and 2 have different outer shapes. As shown in FIG. 2, the particle 1 has a substantially spherical shape, and the particle 2 has a shape having a plurality of convex portions. An example of particles having different internal structures from each other will be described in the embodiment described later.
  • Particle 1 and particle 2 have different fluorescence characteristics from each other.
  • the fluorescence characteristic is, for example, one or both of the wavelength and intensity of fluorescence emitted by the particles when the particles are irradiated with laser light.
  • the particle 1 and the particle 2 have different fluorescent characteristics.
  • Particle 1 and particle 2 may be dyed with different types of fluorescent dyes. The dyeing with the fluorescent dye may be performed at the same time as the preparation of the calibration particles contained in the standard particle suspension L, or the prepared particles may be dyed after the preparation.
  • the different fluorescent characteristics of the particles 1 and 2 are examples of the second optical characteristics of the calibration particles contained in the standard particle suspension L according to the present embodiment.
  • the second optical characteristic is an optical characteristic for performing correct labeling to distinguish the particle 1 and the particle 2.
  • the second optical characteristic is also used when acquiring teacher data at the time of learning in a flow cytometer using a ghost cytometry technique.
  • the difference in the second optical characteristics imparted to the particles 1 and 2 is the difference in the optical characteristics that can discriminate between the particles 1 and the particles 2 even in the conventional flow cytometer.
  • the discrimination performance of the flow cytometer to be evaluated can be determined using the measured value determined by the second optical characteristic using the conventional flow cytometer as an index.
  • FIG. 3 shows an example of the fluorescence characteristics of the particles 1 and 2.
  • Graphs F1 and F2 are graphs showing the relationship between the measured fluorescence intensity and the frequency of the particles 1 and 2, respectively.
  • the particles 1 and 2 have different fluorescence intensities from each other. As a result, the particles 1 and 2 can be distinguished from each other even in a conventional flow cytometer based on the fluorescence intensity.
  • Particle 1 and particle 2 have substantially the same scattered light intensity as each other.
  • the scattered light intensity is, for example, the intensity of scattered light generated by the laser light irradiating the calibration particles hitting the particles and scattering.
  • the types of scattered light include forward scattered light, side scattered light, and backscattered light, but in the present embodiment, the type of scattered light is not limited, and the intensity of the scattered light is the forward scattered light. , Side scattered light, and backscattered light at least one intensity.
  • FIG. 4 shows an example of the scattered light intensity of the particles 1 and 2.
  • Graph S1 and graph S2 are graphs showing the relationship between the intensity and frequency of scattered light measured for particle 1 and particle 2, respectively. From the graph S1 and the graph S2, it can be seen that the characteristics of the scattered light measured for the particles 1 and 2 are substantially the same. Note that FIG. 4 shows a preferred example in which the shapes of the graph S1 and the graph S2 substantially overlap, but the distribution of the scattered light intensity of the particles 1 and 2 determines the scattered light intensity in the conventional flow cytometer. It suffices if the graphs overlap to the extent that it is difficult to distinguish between the two types of particles.
  • the particles 1 and 2 are composed of, for example, substances having similar compositions so as to have substantially the same scattered light intensity as each other. Although the scattered light intensity depends on the shape of the calibration particles, the composition of the particles 1 and 2 is selected so as to have substantially the same scattered light intensity as each other.
  • the materials of the particles 1 and 2 are, for example, hydrogels such as agarose gel and polyethylene glycol, and polystyrene.
  • the specific densities of the particles 1 and the particles 2 with respect to the standard particle suspension L are in a range of 1 to a predetermined range in order to allow the flow cell of the flow cytometer to flow in a mixed state with the fluid. Is, for example, 0.2.
  • the calibration particles contained in the standard particle suspension L according to the present embodiment can be prepared by a known method.
  • hydrogel particles similar to the target cell can be prepared by the method described in US Pat. No. 9,915,598 or WO2016 / 130489.
  • the particles contained in the standard particle suspension L according to the present embodiment can be prepared by incorporating commercially available fluorescent polystyrene into agarose gel beads as in the example described later.
  • the flow cytometer that is the evaluation target of the discrimination performance is called the evaluation target flow cytometer, and the measured value that discriminates the calibration particles to which the identification mark is given and serves as an index of the discrimination performance of the evaluation target flow cytometer.
  • the flow cytometer that obtains the above is called the reference flow cytometer.
  • the particles 1 and 2 have different morphologies from each other, but at the same time have different fluorescence characteristics.
  • the particle 1 and the particle 2 are preliminarily discriminated by a reference flow cytometer based on the fluorescence characteristics (for example, the total amount of fluorescence intensity detected at a specific wavelength).
  • the particle 1 and the particle 2 are discriminated based on the morphological information using the same standard particle suspension L by the flow cytometer to be evaluated.
  • the discrimination result based on the morphological information by the evaluation target flow cytometer is compared with the discrimination result based on the fluorescence characteristics obtained in advance by the reference flow cytometer, and the degree of agreement between the two discrimination results is the discrimination performance index of the evaluation target flow cytometer. It is said that.
  • a conventional flow cytometer is adopted as the reference flow cytometer will be described as an example, but a flow cytometer having a higher spatial resolution than the conventional flow cytometer may be used as the reference flow cytometer. it can.
  • the fluorescence characteristics imparted to the particles 1 and 2 are lower than the spatial resolution required for the flow cytometer to be evaluated to discriminate the difference in particle morphology based on the first optical characteristics. It is a characteristic that can be discriminated by resolution. Therefore, even if the spatial resolution of the reference flow cytometer is lower than the spatial resolution when the evaluation target flow cytometer measures morphological information, the reference flow cytometer discriminates between particles 1 and 2 using the fluorescence characteristics as an index. it can. That is, even when a conventional flow cytometer having low spatial resolution is adopted as the reference flow cytometer, the calibration particles are calibrated by the total amount of fluorescence intensity detected at a specific wavelength given to the particles 1 and 2. The discrimination can be performed, and the discrimination performance of the flow cytometer to be evaluated is evaluated by comparing with the discrimination result.
  • the present invention is not limited to this.
  • the evaluation target flow cytometer itself may be used as the reference flow cytometer.
  • the state of the evaluation target flow cytometer can be managed by verifying whether the discrimination performance of the evaluation target flow cytometer has changed from the past discrimination performance.
  • the standard particle suspension L contains particles 1 and particles 2 having different and distinguishable morphologies.
  • the characteristic of the optical signal that reflects the difference in the morphology of the calibration particles contained in the standard particle suspension L is the first optical characteristic.
  • the fluorescence characteristic of the calibrated particles is an example of the second optical characteristic. That is, the second optical characteristic is one or both of the wavelength and intensity of fluorescence emitted by the particles of the calibration particles contained in the standard particle suspension L according to the irradiated light. Fluorescence characteristics such as the total amount of fluorescence intensity measured as the second optical characteristic in the present embodiment can be discriminated even at a lower spatial resolution than the spatial resolution at which the morphology of particles, which is the first optical characteristic, can be discriminated. is there.
  • the particle 1 and the particle 2 have substantially the same scattered light intensity as each other. Therefore, the flow cytometer to be evaluated cannot discriminate between the particles 1 and the particles 2 based on the total amount of scattered light intensity.
  • the information regarding the total amount of scattered light intensity is an example of the third optical property, which is the scattered light intensity emitted from the included calibration particles according to the light applied to the standard particle suspension L.
  • the standard particle suspension L may contain three or more types of calibration particles. These three or more types of calibration particles have a first optical characteristic that is different from each other and a second optical characteristic that is different from each other and can be discriminated even at a spatial resolution lower than the spatial resolution at which the first optical characteristic can be discriminated. Have.
  • the first optical characteristic is the morphological characteristic of the calibration particle, and the first optical characteristic is determined based on the diffracted light generated through the calibration particle, but is not limited to this.
  • the morphological characteristics of the calibrated particles contained in the standard particle suspension can also be determined based on scattered light.
  • the flow cytometer to be evaluated detects scattered light from the calibration particles using ghost cytometry technology, and the calibration particles are discriminated based on the morphological characteristics of the calibration particles contained in the standard particle suspension. Will be done. That is, the morphological characteristics of the calibrated particles are discriminated by the scattered light from the calibrated particles contained in the standard particle suspension, and the discriminating performance of the morphological characteristics of the flow cytometer to be evaluated is evaluated by the discrimination accuracy.
  • the standard particle suspension according to the present embodiment is referred to as a standard particle suspension La, and the calibration particles contained in the standard particle suspension are referred to as particles 1a and particles 2a.
  • FIG. 5 is a diagram showing an example of an optical signal signal detected when the standard particle suspension La is measured by the flow cytometer to be evaluated according to the present embodiment.
  • the fluorescence information measured by the signal SG3 at a spatial resolution lower than the spatial resolution at which the morphological characteristics can be discriminated.
  • Signal SG2 which is a signal of
  • signal SG11 and signal SG12 are measured as signals of scattering information.
  • the signal SG3 and the signal SG2 which is the signal of the fluorescence information are the signals acquired by the evaluation target flow cytometer in the first embodiment. It is a signal similar to.
  • Signal SG11 is a signal of forward scattering information acquired as the total amount of forward scattered light intensity that can be measured by a reference flow cytometer.
  • the signal SG12 is a signal of scattering information acquired as the total amount of side scattered light intensity.
  • the signal SG12 may be a signal of the scattered information of the backscattered light.
  • the combination of the signal SG11 and the signal SG12 may be a combination of the signal of the side scattering information and the signal of the backscattering information.
  • the signal SG11 and the signal SG12 are signals that can be measured even with a conventional flow cytometer.
  • the signal SG3 is acquired based on the first optical characteristics of the contained particles 1a and 2a, and based on the second optical characteristics of the calibration particles.
  • the signal SG2 is acquired, and the signals SG11 and SG12 are acquired based on the third optical property of the calibration particles.
  • FIG. 6 is a diagram showing an example of a scatter diagram regarding the intensity of the forward scattered light and the intensity of the side scattered light for the particles 1a and 2a according to the present embodiment.
  • Regions D11 and D12 show the combination of the intensity of the forward scattered light and the intensity of the side scattered light measured for the particles 1a and 2a, respectively. Since the distributions of the regions D11 and D12 almost overlap, it can be seen that the intensity of the forward scattered light and the intensity of the side scattered light measured for the particles 1a and 2a are substantially equal to each other.
  • the particles 1a and the particles 2a have substantially the same scattering characteristics. Therefore, the flow cytometer to be evaluated cannot discriminate between the particles 1 and the particles 2 based on the light scattering characteristics based on the total amount of the scattering intensities of the particles.
  • the particles 1a and the particles 2a have different morphologies and have different fluorescence characteristics, which is the same as that of the first embodiment.
  • the fluorescence characteristic is an example of the second optical characteristic, and the particle 1a and the particle 2a can be distinguished from each other by the total amount of fluorescence intensity detected at a specific wavelength.
  • the discrimination result based on the morphological information by the evaluation target flow cytometer is compared with the discrimination result based on the fluorescence characteristics obtained in advance by the reference flow cytometer. It can be used as a discrimination performance index.
  • the standard particle suspension according to the present embodiment is referred to as a standard particle suspension Lb, and the calibration particles contained in the standard particle suspension are referred to as particles 1b and particles 2b.
  • the first and second particles 1b and 2b are dyed with at least two types of fluorescence, and the first optical property relating to the morphology of the calibration particles can be obtained by measuring the fluorescence of one of the first and second types. It is different from the second embodiment. That is, in the standard particle suspension Lb of the embodiment of the present invention, the first optical characteristics and the second optical characteristics of the contained particles 1b and particles 2b are imparted by two types of fluorescent dyeing that stain the particles. ing.
  • Particle 1b and particle 2b have substantially the same total amount of the intensity of the applied first fluorescence, but the morphology of the particles is different and the fluorescence distribution is different.
  • the flow cytometer to be evaluated with high spatial resolution, it is possible to discriminate between different morphologies of calibrated particles using the difference in fluorescence distribution based on the difference in particle morphology as an index, but the standard with lower spatial resolution. With a flow cytometer, it is difficult to distinguish particles 1b and particles 2b from each other using the total amount of the first fluorescence intensity as an index.
  • the particles 1b and the particles 2b are given different second fluorescence characteristics for labeling to correctly discriminate the calibration particles, and if the second fluorescence characteristics are used, more space is provided.
  • the point that mutual discrimination is possible even with a reference flow cytometer having a low resolution is the same as in the first and second embodiments.
  • the particles 1b and the particles 2b have substantially the same intensity of scattered light as in the first embodiment and the second embodiment.
  • the particles 1b and the particles 2b are dyed by, for example, the same type of first fluorescence, and one of the particles 1b and the particles 2b is dyed by a second fluorescence of a type different from the first fluorescence. It will be dyed.
  • the total amount of fluorescence intensity of the first fluorescence is substantially the same for the particles 1b and the particles 2b.
  • FIG. 7 is a diagram for further explaining the fluorescence characteristics of the particles 1b and 2b according to the present embodiment, and is an example of the results of measuring the fluorescence characteristics of the particles 1b and 2b at a low resolution with a reference flow cytometer. It is a figure which shows.
  • FIG. 7 shows the total amount of fluorescence intensity for the first fluorescence and the second fluorescence at a spatial resolution lower than the spatial resolution at which the flow cytometer to be evaluated discriminates the calibration particles based on the first optical characteristic described above. The fluorescence intensity distribution when measured is shown. Regions D21 and D22 show the distribution of the first and second total fluorescence measured for particle 1b and particle 2b, respectively.
  • the particles 1b and the particles 2b are particles having different morphologies, the morphology of the particles cannot be discriminated from the signal obtained from the information because the total amount of the first fluorescence is the same.
  • the particles 1b and the particles 2b are further stained with a second fluorescence different from each other, and the fluorescence is different even when measured at a low resolution with a reference flow cytometer. It can be seen that the characteristic (total fluorescence amount of the second fluorescence) is exhibited.
  • the accuracy of discriminating the particles of the flow cytometer to be evaluated by the first optical characteristic is the fluorescence imparted by the second fluorescence because the fluorescence characteristic of the second fluorescence that can be discriminated by the calibration particles at a low resolution is given. Determined by a reference flow cytometer based on the characteristics.
  • the standard particle suspension according to the present embodiment is referred to as a standard particle suspension Lc, and the calibration particles contained in the standard particle suspension are referred to as particles 1c and particles 2c.
  • the present invention is not limited to this.
  • the calibration particles contained in the standard particle suspension Lc may have substantially the same outer shape of the particles, and the internal structures of the particles may be different from each other.
  • the flow cytometer to be evaluated recognizes and discriminates the difference in the internal structure of the calibration particles contained in the standard particle suspension Lc as a difference in morphological information.
  • FIG. 8 is a diagram showing an example of different internal structures of the calibration particles contained in the standard particle suspension Lc according to the present embodiment.
  • Particles 1c-1 to 1c-4 are examples of particles 1c, respectively, and particles 2c-1 to 2c-4 are examples of particles 2c, respectively. Both the particles 1c and the particles 2c have substantially spherical outer shapes. Both the particle 1c and the particle 2c contain particles inside. The particles contained inside the particles 1c and the particles 2c are dyed with a fluorescent dye. (However, only in the case of particle 2c-2, the outer part of the inner particle of particle 2c-2 is dyed.)
  • the particles contained inside each of the particles 1c and 2c are referred to as internal particles.
  • the internal structure of the particles is, for example, the position, distribution, size, and shape of the internal particles.
  • the particles 1c and 2c are the same as those in the first to third embodiments, in that the internal structures of the particles are different from each other and different fluorescence characteristics are given to distinguish them.
  • the fluorescence characteristic imparted to the particle 1c and the particle 2c is a second optical characteristic possessed by the calibration particle, and is used as an index for discriminating between the particle 1c and the particle 2c in the reference flow cytometer.
  • the discrimination result based on the morphological information by the evaluation target flow cytometer is compared with the discrimination result based on the fluorescence characteristics by the reference flow cytometer, and the discrimination performance of the evaluation target flow cytometer is improved. Be evaluated.
  • Particle 1c-1 contains a plurality of internal particles inside.
  • the particle 2c-1 includes one internal particle larger than the internal particle contained in the particle 1c-1.
  • Particle 1c-2 contains one internal particle.
  • Particle 2c-2 also contains one internal particle, but the spherical shell-like portion located near the outer surface of the internal particle is stained with fluorescence.
  • Both the particle 1c-3 and the particle 2c-3 contain a plurality of internal particles inside.
  • the shape of the internal particles is substantially spherical.
  • the shape of the internal particles is a shape having a convex portion.
  • Particle 1c-4 contains one internal particle inside.
  • Particle 2c-4 also contains one internal particle, but the size of the internal particle is larger than that of particle 1c-4.
  • Particle 1c-1 and particle 2c-1, particle 1c-2 and particle 2c-2, particle 1c-3 and particle 2c-3, and particle 1c-4 and particle 2c-4 have different fluorescent characteristics. The total amount of fluorescent dye contained in the particles is different from each other.
  • the standard particle suspension contains at least two types of calibration particles, and the standard particle suspension is used to evaluate the discrimination performance of the flow cytometer to be evaluated.
  • the resolution of the flow cytometer is the image information acquired by the flow cytometer to be evaluated, which is an index of how small the internal particles to be evaluated can be discriminated without deteriorating the discrimination performance. Performance related to spatial resolution.
  • the standard particle suspension according to the present embodiment is referred to as a standard particle suspension Ld, and the calibration particles contained in the standard particle suspension are referred to as particles 1d, particles 2d, particles 3d, particles 4d, and particles 5d.
  • FIG. 9 is a diagram showing an example of the internal structure of the calibration particles contained in the standard particle suspension Ld according to the present embodiment.
  • Particles 1d to 5d contain internal particles of different sizes.
  • the size of the internal particles contained in the particles 1d to 5d is larger in the order of the particles 1d to 5d.
  • the number of internal particles contained in the particles 1d to 5d is smaller in the order of the particles 1d to 5d.
  • the total volume of the internal particles contained in the particles 1d to 5d is substantially the same between the particles 1d and the particles 5d.
  • the particle 5d contains one internal particle
  • the particle 4d contains two internal particles
  • the internal particles contained in the particle 3d, the particle 2d, and the particle 1d respectively.
  • the size is getting smaller and the number is getting bigger. Since the flow cytometer that measures based on the ghost cytometry technique can acquire morphological information with high spatial resolution, it is standardized based on the difference in the internal structure of these particles contained in the standard particle suspension Ld according to the present embodiment.
  • the calibration particles contained in the particle suspension Ld can be identified.
  • the standard particle suspension Ld according to the present embodiment is used to evaluate the resolution of a flow cytometer having a high spatial resolution, such as a flow cytometer based on ghost cytometry technology, as a flow cytometer to be evaluated.
  • the first optical characteristic is the optical characteristic derived from the internal structure of the calibration particle detected by the flow cytometer to be evaluated.
  • the first optical characteristics detected by the flow cytometer to be evaluated are the same as those in the first to fourth embodiments.
  • FIG. 10 is a diagram showing an example of a scatter diagram regarding the intensity of the forward scattered light and the intensity of the lateral scattered light for the particles 1d to 5d according to the present embodiment.
  • the region D3 is a plurality of regions showing the intensity of the scattered light measured for the particles 1d to 5d, the intensity of the forward scattered light and the intensity of the lateral scattered light for each of the particles 1d to 5d. From the region D3, it can be seen that the intensity of the forward scattered light measured for the particles 1d to 5d and the intensity of the side scattered light are substantially equal.
  • the intensity of scattered light is a third optical characteristic of the calibration particles. Since the total amount of scattered light intensity of the calibration particles contained in the standard particle suspension Ld is substantially the same, it is difficult to make a determination based on the total amount of scattered light intensity using a conventional flow cytometer.
  • FIG. 11 shows an example of the fluorescence characteristics of the particles 1d to 5d.
  • Graph F1d, graph F2d, graph F3d, graph F4d, and graph F5d are graphs showing the relationship between the fluorescence intensity and frequency measured for particle 1d, particle 2d, particle 3d, particle 4d, and particle 5d, respectively.
  • the particles 1d to 5d have different fluorescence characteristics from each other, and in the case of FIG. 11, the intensity of the emitted fluorescence is different from each other.
  • the fluorescence intensity is the second optical property of the calibration particles.
  • the reference flow cytometer can discriminate particles 5d from particles 1d based on the second optical characteristic.
  • the discrimination result based on the morphological information by the evaluation target flow cytometer is compared with the discrimination result based on the fluorescence characteristics by the reference flow cytometer, and the resolution of the evaluation target flow cytometer is evaluated.
  • FIG. 12 is a diagram showing an example in which the resolution of the flow cytometer to be evaluated is evaluated by combining and measuring the standard particle suspension Ld in which the size of the internal particles according to the present embodiment is changed.
  • Plot A1 shows the discrimination performance of the flow cytometer to be evaluated when the standard particle suspension Ld contains particles 1d and particles 2d.
  • the discrimination performance is defined as the discrimination result between the particles 1d and the particles 2d performed by the flow cytometer to be evaluated based on the difference in the size of the internal particles using the first fluorescence intensity as an index. It is an index showing the degree of agreement of the discrimination results verified based on the optical characteristics.
  • Plot A2 shows the discriminant performance of the flow cytometer when the standard particle suspension Ld contains particles 2d and particles 3d.
  • Plot A3 shows the discriminant performance of the flow cytometer when the standard particle suspension Ld contains particles 3d and particles 4d.
  • Plot A4 shows the discriminant performance of the flow cytometer when the standard particle suspension Ld contains particles 4d and particles 5d.
  • the discrimination performance is kept high and constant as long as the size of the internal particles is large.
  • the discrimination performance decreases as the size of the internal particles decreases.
  • the resolution of the flow cytometer is the performance of the spatial resolution of the image information acquired by the flow cytometer to be evaluated.
  • the standard particle suspension according to the present embodiment is referred to as a standard particle suspension Le
  • the calibration particles contained in the standard particle suspension are referred to as particles 1e, particles 2e, particles 3e, particles 4e, and particles 5e.
  • FIG. 13 is a diagram showing an example of the internal structure of the calibration particles contained in the standard particle suspension Le according to the present embodiment.
  • Each of the particles 1e to 5e contains an internal particle.
  • the size of the internal particles contained in the particles 1e to 5e is larger in the order of the particles 1e to 5e.
  • the number of internal particles contained in each of the particles 1e to 5e is the same, and is one as an example in the present embodiment.
  • the amounts of fluorescent dyes used to dye the internal particles contained in the particles 1e to 5e are substantially the same, and therefore the fluorescence intensities are substantially the same.
  • the density of the fluorescent dye of the internal particles is higher in the order of particle 1e, particle 2e, particle 3e, particle 4e, and particle 5e.
  • the wavelengths of fluorescence emitted from the particles 1e to 5e are different from each other.
  • the identification that the wavelength of fluorescence emitted by the fluorescent dye contained in each calibration particle is different is the second optical characteristic of the particle, and is a reference flow cytometer. Can discriminate particles 5e from particles 1e based on the second optical characteristic.
  • the optical characteristics derived from the internal structure of the calibration particles are the first optical characteristics of the particles, and are evaluated in the first to fifth embodiments. It is a signal similar to the signal acquired by the flow cytometer.
  • the flow cytometer to be evaluated discriminates the particles contained in the standard particle suspension Le based on the first optical characteristic.
  • the size of the internal particles contained in the particles contained in the standard particle suspension Le is reduced, immediately before the discrimination performance deteriorates.
  • the size of the internal particles can be determined as the resolution of the flow cytometer.
  • the standard particle suspension according to the present embodiment is referred to as a standard particle suspension Lf
  • the calibration particles contained in the standard particle suspension are referred to as particles 1f, particles 2f, particles 3f, particles 4f, and particles 5f.
  • a plurality of fluorescent dyes are used for dyeing the internal particles.
  • the particles 1f to 5f have the same total amount of first fluorescence contained therein, and have substantially the same fluorescence intensity from each other. Therefore, even if the total amount of fluorescence intensity of the first fluorescence commonly contained in the particles 1f to 5f is measured with a reference flow cytometer at a low resolution, it is difficult to distinguish them as different calibration particles. ..
  • the particles 1f to 5f are dyed by the second fluorescence, which is a different type from the first fluorescence.
  • the second fluorescent dyes contained in the particles 1f to 5f have different total amounts of fluorescence contained therein, and are measured at a low resolution using the fluorescence intensity of the second fluorescence as an index with a reference flow cytometer. Even so, the particles 5f can be distinguished from each other from the particles 1f. That is, in the standard particle suspension Lf according to the present embodiment, as in the third embodiment, the first optical characteristics of the particles 1f to 5f containing the calibration particles contained in the standard particle suspension are exhibited.
  • the second optical property is imparted by two types of fluorescent staining that stain the particles.
  • FIG. 14 is a diagram showing the results of measuring the fluorescence characteristics imparted to the particles 1f to 5f with a reference flow cytometer at a low resolution as an example in the present embodiment.
  • FIG. 14 shows the fluorescence intensity distribution when the first fluorescence and the second fluorescence are measured at a spatial resolution lower than the spatial resolution that can be discriminated by the first optical characteristic described above.
  • Region D31, region D32, region D33, region D34, and region D35 are a combination of the intensity distributions of the first fluorescence and the second fluorescence measured for the particles 1f, 2f, 3f, 4f, and 5f, respectively. Is shown.
  • Particle 1f, particle 2f, particle 3f, particle 4f, and particle 5f are calibrated particles having different forms from each other, but as shown in FIG. 14, the total amount of the first fluorescence that can be detected is the same. Even when measured with a reference flow cytometer having a low spatial resolution, it is not possible to distinguish each other's particles contained in the standard particle suspension Lf.
  • the flow cytometer based on the ghost cytometry technique is different from the conventional flow cytometer that evaluates based on the total amount of fluorescence, and has a form of a measurement object having a high spatial resolution based on the detected first fluorescence signal. Information can be obtained, and based on the information, the measurement target can be discriminated based on the difference in the shape and internal structure of the calibration particles.
  • the discriminating performance of the flow cytometer by the ghost cytometry technique is evaluated using the standard particle suspension Lf, the optical characteristic of the time-series waveform of the detected optical signal due to the first fluorescence is the first.
  • the calibration particles contained in the standard particle suspension Lf are discriminated from each other by the optical signal information which is an optical characteristic and reflects the difference in the morphology of the particles 1f, 2f, 3f, 4f, and 5f to be discriminated. Is possible.
  • the particles 1f to 5f can be distinguished from each other by the second fluorescence characteristics different from each other as described above.
  • the second fluorescence contained in the calibration particles corresponds to the second optical characteristic. Therefore, the accuracy of discriminating the calibration particles by the flow cytometer to be evaluated based on the first optical characteristic can be verified by the fluorescence characteristic due to the second fluorescence that can be measured with a lower spatial resolution.
  • the fluorescence characteristics due to the second fluorescence which can be measured with lower spatial resolution, have been given by the difference in fluorescence intensity.
  • the fluorescence from the particles 1f to the particles 5f has different wavelengths. May be given.
  • the standard particle suspensions L, La, Lb, Lc, Ld, Le, and Lf according to the above-described embodiment have the first optical characteristics (reflecting the morphological characteristics in the above-described embodiment).
  • the optical characteristics of the light are different from each other, and the first optical characteristic (the optical characteristic of the light reflecting the morphological characteristics in the above embodiment) is lower than the discriminable spatial resolution.
  • Two or more types of calibration particles (particles 1, 1a, 1b, 1c, 1d, 1e, 1f in the above embodiment) having different distinguishable second optical characteristics (fluorescence characteristics in the above embodiment). , Particles 2, 2a, 2b, 2c, 2d, 2e, 2f, Particle 3d, 3e, 3f, Particle 4d, 4e, 4f, Particle 5d, 5e, 5f).
  • the first optical characteristic (light reflecting the morphological characteristics in the above embodiment)
  • the discrimination result based on (optical characteristics) can be discriminated at a lower spatial resolution than the spatial resolution that can be discriminated by the first optical characteristics (optical characteristics of light reflecting morphological characteristics in the above embodiment). Since the performance of discriminating the particles of the flow cytometer to be evaluated can be evaluated based on the degree of agreement with the discrimination result based on the second optical characteristics (fluorescence characteristics in the above embodiment) that are different from each other, the flow cytometer can be evaluated. The ability to discriminate between forms can be easily and objectively evaluated.
  • two or more types of calibration particles are substantially the same as each other. It may further have 3 optical properties (scattered light intensity in the above embodiment).
  • the flow cytometer to be evaluated has a third optical characteristic (scattered light intensity in the above embodiment).
  • the calibration particles cannot determine the calibration particles. Therefore, two or more types of calibration particles (particles 1, 1a, 1b, 1c, 1d, 1e, 1f, particles 2, 2a, 2b, 2c, 2d, 2e, 2f in the above embodiment) are evaluated by the flow cytometer to be evaluated.
  • the third optical property is the calibration particles (particles 1, 1a, in the above embodiment). 1b, 1c, 1d, 1e, 1f, particles 2, 2a, 2b, 2c, 2d, 2e, 2f, particles 3d, 3e, 3f, particles 4d, 4e, 4f, particles 5d, 5e, 5f) were irradiated. It is the total amount of scattered light intensity emitted by the particles in response to light.
  • the calibration particles cannot be discriminated based on the total amount of scattered light intensity.
  • Two or more types of calibration particles (particles 1, 1a, 1b, 1c, 1d, 1e, 1f, particles 2, 2a, 2b, 2c, 2d, 2e, 2f, particles 3d, 3e in the above embodiment) by a meter.
  • particles 4d, 4e, 4f, particles 5d, 5e, 5f it is not the scattered light intensity that is different from each other that can be discriminated by a conventional flow cytometer with low spatial resolution, but the first optical characteristic (the above). It is possible to reliably evaluate whether the discrimination can be performed based on the optical characteristics of light reflecting the morphological characteristics in the embodiment.
  • the first optical property is the calibration particles (particles 1, 1a, 1b in the above embodiment). , 1c, 1d, 1e, 1f, particles 2, 2a, 2b, 2c, 2d, 2e, 2f, particles 3d, 3e, 3f, particles 4d, 4e, 4f, particles 5d, 5e, 5f) It is a characteristic of light derived from the difference in morphology that can be discriminated in terms of resolution.
  • Morphologically derived light characteristics that can be discriminated at higher spatial resolutions include, for example, optical signal information obtained based on ghost cytometry techniques, and scattered light detected when the sample is illuminated with structured illumination. , Interference light, diffracted light, fluorescence, and other time-series optical signal information directly obtains information about the measurement particle.
  • the standard particle suspensions L, La, Lb, Lc, Ld, Le, and Lf according to the present embodiment are used for the calibrated particles without converting the information detected by irradiating the sample into image information. It can be used for the technique of directly extracting the morphological information of.
  • the discrimination result based on the morphology of the calibration particles of the flow cytometer to be evaluated is the determination result of the particles. Based on the degree of agreement with the discrimination result based on the second optical characteristics (fluorescence characteristics in the above embodiment) that are different from each other and can be discriminated even at a lower spatial resolution than the spatial resolution at which the difference in morphology can be discriminated. Since the performance of discriminating the form of the flow cytometer to be evaluated can be evaluated, the performance of discriminating the form of the flow cytometer to be evaluated can be easily evaluated.
  • the second optical characteristic is the calibrated particles according to the irradiated light (the above-described embodiment).
  • particles 1, 1a, 1b, 1c, 1d, 1e, 1f, particles 2, 2a, 2b, 2c, 2d, 2e, 2f, particles 3d, 3e, 3f, particles 4d, 4e, 4f, particles 5d, 5e It is one or both of the wavelength and intensity of the fluorescence (fluorescence characteristic) emitted by 5f).
  • the first optical characteristic of the flow cytometer to be evaluated (higher space in the above embodiment).
  • the discrimination result based on the morphological information that can be measured by the resolution) is different from each other given to the fluorescence characteristics (calibrated particles having different morphological characteristics) that can be discriminated even at the spatial resolution lower than the first optical characteristic. Since the performance of discriminating the form of the evaluation target flow cytometer can be evaluated based on the degree of agreement with the discrimination result based on the (fluorescence characteristic), the evaluation target flow cytometer is based on the above-mentioned first optical characteristic. The discrimination performance can be evaluated easily and objectively.
  • FIG. 15 is a diagram showing an example of the structure of the calibration beads according to this embodiment.
  • the agarose gel beads contain a certain number of fluorescent polystyrene beads to give a characteristic shape.
  • the suspension beads C1 and the calibration beads C2 are used.
  • the calibration bead C1 has two particles in the particle.
  • the calibration bead C2 has one particle in the particle. The method for preparing the calibration beads is described below.
  • a commercially available material can be used for the agarose used for preparing the agarose gel beads.
  • Sigma-Aldrich's Agarose Ultra-low Gelling Temperature was used.
  • the following two types of fluorescent polystyrene bead-containing solutions manufactured by Spherotech are used as the fluorescent polystyrene beads included in the agarose gel beads.
  • the first type of fluorescent polystyrene beads is "SPHEROTM Fluorescent Particles FH2056-2 (High-Intensity, ⁇ 2 ⁇ m, Nilered)".
  • the second type of fluorescent polystyrene beads is "SPHEROTM Fluorescent Particles FL2052-2 (Low-Intensity, ⁇ 2 ⁇ m, Yellow)".
  • Other materials can be substituted for the particles contained in the agarose gel beads.
  • two types of calibration beads having different morphologies were prepared by including different numbers of different fluorescent polystyrene beads in the agarose gel beads.
  • Agarose gel beads for calibration were created by generating W / O type (water droplet type in oil) droplets with a flow focusing type microfluidic device. More specifically, while sending an agarose mixture containing a surfactant and fluorescent polystyrene beads with a syringe pump, the agarose mixture and a carrier oil containing a surfactant (in this example, manufactured by Bio-rad). (Droplet Generator was used) was mixed at the branch of the microchannel. As a result, the agarose mixture sheared the carrier oil, and surface tension generated spherical droplets in the carrier oil.
  • W / O type water droplet type in oil
  • a technique for creating water droplets in oil by such a microchannel technique is described in, for example, "Dynamics of Microfluidic droplets (C.N. Baraud, et al., Lab Chip, (2010) 10, 2032-2045)". Will be done.
  • the agarose gel beads produced by the above method were used as calibration beads for a flow cytometer based on ghost cytometry technology after washing and checking the bead characteristics. Confirmation of bead characteristics is confirmation of the number of fluorescent beads contained in agarose gel beads, the abundance ratio of leaked beads and doublet particles, and the like.
  • the measurement examples of the two types of calibration beads, the calibration beads C1 and the calibration beads C2 shown in FIG. 15, and the calibration beads C1 and the calibration beads C2 are one.
  • a measurement example for a standard particle suspension prepared to be contained in a ratio of 1 is described.
  • the average particle size of the agarose gel beads contained in the prepared standard particle suspension was about 20 ⁇ m as a result of measurement with an electronic biomicroscope (Thermo Fisher Scientific EVOS) before washing.
  • the illumination light of the laser beam having a wavelength of 488 nm is structured to irradiate the observation object passing through the flow path, and the fluorescence emitted from the observation object is detected and acquired as a time-series fluorescence signal waveform.
  • the flow cytometer FCM1 is a conventional type that measures the total amount of scattered light intensity and fluorescence intensity from an observation object by irradiating a laser beam having a wavelength of 637 nm as spot light in addition to the measurement based on the ghost cytometry technique. The measurements obtained with a flow cytometer can be made.
  • the total amount of the time-series fluorescence signal waveforms detected by the structured illumination is obtained as the same information as the total amount of the fluorescence intensity measured by irradiating the spot light. Can be done.
  • the flow cytometer FCM1 detects the fluorescence signal waveform based on the above-mentioned ghost cytometry technique at a wavelength of 525 nm. Further, for the included calibration beads, detection by the total amount of fluorescence intensity using spot light (detection wavelength 676 nm) and detection by the total amount of scattered light (FSC) intensity were performed on different independent channels.
  • FIG. 16 shows the results of measuring the scattering characteristics of the calibration beads C1 and the calibration beads C2 contained in the standard particle suspension using spot light (wavelength 637 nm) with the flow cytometer FCM1.
  • Graph G1 shows the result of measuring the scattering characteristics of the calibration beads C1.
  • Graph G2 shows the result of measuring the scattering characteristics of the calibration beads C2. It was suggested that the distributions of the FSC (forward scattering) intensity of the calibration beads C1 and the calibration beads C2 overlap, and it is difficult to distinguish between the calibration beads C1 and the calibration beads C2 using the total amount of the FSC intensity as an index.
  • FSC forward scattering
  • FIG. 17 shows the results of measurement of the calibration beads C1 and the calibration beads C2 by the total amount of fluorescence intensity using structured illumination with the flow cytometer FCM1 at a wavelength of 525 nm, and the fluorescence intensity using spot light.
  • the result of the measurement based on the total amount of the above is shown at the detection wavelength of 676 nm.
  • the wavelength of 525 nm is a wavelength used by the flow cytometer FCM1 for detecting a fluorescent signal based on the ghost cytometry technique.
  • Data H1 shows the measurement result based on the total amount of fluorescence intensity of the calibration beads C1.
  • Data H2 shows the measurement result by the total amount of fluorescence intensity of the calibration beads C2.
  • the difference in fluorescence intensity between the calibration beads C1 and the calibration beads C2 is detected.
  • the difference in the detected fluorescence intensity is due to the fact that each calibration bead contains a different fluorescent dye.
  • machine learning is performed by assigning a correct answer label to the training data based on the different fluorescence characteristics of the calibration beads.
  • the calibration beads C1 and the calibration beads C2 showed almost the same fluorescence intensity in terms of the total amount of fluorescence.
  • FIG. 18 shows the results of discriminating the calibration beads C1 and the calibration beads C2 contained in the standard particle suspension with the flow cytometer FCM1 based on the ghost cytometry technique.
  • Graph J1 shows the result (score distribution) when the calibration beads C1 are discriminated using the model created by machine learning.
  • Graph J2 shows the result (score distribution) of discriminating the calibration beads C2 using a model created by machine learning.
  • the structure having two particles in the particles of the calibration bead C1 and the structure having one particle in the particles of the calibration bead C2 are satisfactorily discriminated based on the ghost cytometry technique. Can be done.
  • FIG. 18 shows the results of discriminating the calibration beads C1 and the calibration beads C2 contained in the standard particle suspension with the flow cytometer FCM1 based on the ghost cytometry technique.
  • the two types of caliber beads contained in the standard particle suspension have substantially the same fluorescence intensity detected at a wavelength of 525 nm, and it is difficult to distinguish between the two types using the “total amount of fluorescence intensity” as an index. Therefore, this result suggests that the discrimination based on the ghost cytometry technique can recognize the "morphological difference" between the calibration beads C1 and the calibration beads C2 contained in the standard particle suspension. doing.

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Abstract

フローサイトメータ性能評価方法は、互いに形態が異なる２種類以上のキャリブレーション粒子を組み合わせて使用するフローサイトメータの性能を評価する方法で、評価対象のフローサイトメータが第１の光学特性に基づいてキャリブレーション粒子を互いに判別する第１判別ステップと、第１の光学特性が判別可能な空間解像度に比べて低い空間解像度において判別可能な第２の光学特性に基づいてキャリブレーション粒子を互いに判別する第２判別ステップと、第１判別ステップによって判別した第１の判別結果と、第２判別ステップによって判別した第２の判別結果とに基づいてフローサイトメータの粒子判別性能、及び分解能の一方または両方を評価する評価ステップと、を有する。

Description

フローサイトメータ性能評価方法、及び標準粒子懸濁液
　本発明は、フローサイトメータ性能評価方法、及び標準粒子懸濁液に関する。
　本願は、２０１９年１２月２７日に、日本に出願された特願２０１９－２３８０８９号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　フローサイトメータは個々の細胞を流体中に分散させ、その流体を流下させて光学的に分析するフローサイトメトリー法と呼ばれる技術を用いた分析装置であり、主に細胞を個々に観察する際に用いられる細胞計測装置である。フローサイトメータでは、蛍光プローブにより蛍光染色を施した細胞を流体中に１列に並べ、流路を流れる細胞にレーザー光を照射することで発生する蛍光あるいは散乱光の強度を分析する方法が汎用される。
　フローサイトメータを用いた測定では、使用するフローサイトメータが測定に適した状態にあるかを確認し、必要な場合には事前に調整するという事が一般的に行われている。そうしたキャリブレーションを行うために、微小ビーズなどを懸濁させた懸濁液を用いる方法が既に知られている。例えば、細菌と同程度の散乱光強度を有するポリスチレン系重合体粒子と、染色後に細菌と同程度の蛍光強度を有するポリ酢酸ビニル粒子とを含むフローサイトメータ用標準粒子懸濁液が記載されている（特許文献１）。また汎用されるフローサイトメータでは、形状がほぼ球体の市販ポリスチレン蛍光ビーズを流し、ビーズから生じる蛍光の強度分布を確認することでフローサイトメータの状態の確認を行うことが行われている。
　近年ｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ）などの幹細胞を用いた再生医療や、ＣＡＲ‐Ｔ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ　Ａｎｔｉｇｅｎ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｔ　ｃｅｌｌ）による免疫療法などの新しい治療法の実用化に向けた動きが活発化するに伴い、細胞群の中から一以上の細胞を計測し個々の細胞単位で解析を行うことに対する強い需要が生じてきている。しかしながら従来の蛍光輝度や散乱光の総量により評価対象の特徴を評価するフローサイトメータでは、細胞の形状やオルガネラの分布などの形態情報に基づいて個々の細胞の判別を行なうことは難しかった。
　フローサイトメトリー法では、例えば、流路中に蛍光標識された細胞を流下しながら励起光を照射し、個々の細胞から発せられる蛍光輝度を取得することによって、細胞の２次元画像を生成し細胞の分別を行うイメージングサイトメータが従来技術として知られている。一方で、細胞の形態情報を２次元画像に変換せずに計測データから直接解析する技術が近年開発され、その一例としてゴーストサイトメトリー技術が知られている（非特許文献１）。ゴーストサイトメトリー技術は、光構造照明上を通過する測定対象である細胞の動きを利用して対象像を捉える単一画素圧縮撮像手法である。ゴーストサイトメトリー技術を用いたフローサイトメータでは、例えば、構造化した照明を細胞に照射し、得られた光信号の時系列波形から直接細胞の分別ができ、高速、高感度、低コストかつコンパクトなフローサイトメータが提供できる（特許文献２）。また、ゴーストサイトメトリー技術を用いたフローサイトメータでは、予め機械学習により作成されたモデルに基づいて、蛍光染色等のラベル付け行わずに目的細胞の判別あるいは分別することもできる。再生医療や細胞治療に向けて生産される細胞の品質管理において、こうしたラベル付けを行わずに目的細胞を判別あるいは分別する技術のニーズは益々高まっている。
特開２００４－１５０８３２号公報 国際公開第２０１７／０７３７３７号
「Ｓｃｉｅｎｃｅ」、２０１８年６月１５日、３６０巻、６３９４号、ｐ．１２４６－１２５１
　特許文献１に記載のフローサイトメータ用標準粒子懸濁液は、散乱光強度や蛍光強度の総量に基づいて細菌を判別するフローサイトメータに用いられるものであり、ゴーストサイトメトリー技術を用いたフローサイトメータのように、より分解能の高いフローサイトメータにおいて判別性能を評価するには不十分であった。
　イメージング技術を用いて細胞を分別するフローサイトメ―タでは性能の評価に画像ベースのＳＮ比等が使用されているが、ゴーストサイトメトリー技術など視覚的に判断できる２次元画像を介さないフローサイトメ―タについてはこれまでフローサイトメータが細胞を判別する性能を簡便に評価する手法がなかった。
　そこで光信号の時系列波形情報から測定対象の細胞の形態情報を直接取得して目的細胞を判別するゴーストサイトメトリー技術を利用するフローサイトメトリーにおいても、フローサイトメータの分別性能を簡便に評価できる手法が求められていた。
　本発明は上記の点に鑑みてなされたものであり、ゴーストサイトメトリー技術に基づくフローサイトメータのように、２次元画像を介さずに光信号の時系列波形情報から形態情報を直接取得して散乱光強度や蛍光強度の総量に基づいて評価対象を評価するフローサイトメータよりも高い空間分解能で細胞などの測定対象物を判別するフローサイトメータにおいて、その判別性能を簡便に評価できる標準粒子懸濁液を提供する。
　本発明は上記の課題を解決するためになされたものであり、本発明の一態様は、互いに形態が異なる２種類以上のキャリブレーション粒子を組み合わせて使用するフローサイトメータの性能を評価する方法で、評価対象のフローサイトメータが第１の光学特性に基づいて前記キャリブレーション粒子を互いに判別する第１判別ステップと、前記第１の光学特性が判別可能な空間解像度に比べて低い空間解像度において判別可能な第２の光学特性に基づいて前記キャリブレーション粒子を互いに判別する第２判別ステップと、前記第１判別ステップによって判別した第１の判別結果と、前記第２判別ステップによって判別した第２の判別結果とに基づいて前記フローサイトメータの粒子判別性能、及び分解能の一方または両方を評価する評価ステップと、を有するフローサイトメータ性能評価方法である。
　また、本発明の一態様は、上記のフローサイトメータ性能評価方法において、前記２種類以上のキャリブレーション粒子を、前記２種類以上のキャリブレーション粒子の組み合せが予め混合されて標準粒子懸濁液に包含される態様で使用する。
　また、本発明の一態様は、上記のフローサイトメータ性能評価方法において、前記フローサイトメータが、前記第１の光学特性に基づき取得した光信号の時系列波形情報から、前記キャリブレーション粒子の２次元画像を介さず、前記キャリブレーション粒子を直接判別するフローサイトメータである。
　また、本発明の一態様は、上記のフローサイトメータ性能評価方法において、前記フローサイトメータが、ゴーストサイトメトリー技術に基づくフローサイトメータであり、前記第１の光学特性として検出される光信号に反映される形態情報に基づいて前記キャリブレーション粒子が判別される。
　また、本発明の一態様は、２種類以上のキャリブレーション粒子を組み合わせて含むフローサイトメータの性能を評価するための標準粒子懸濁液であり、前記２種類以上のキャリブレーション粒子は、第１の光学特性が互いに異なっており、且つ、前記第１の光学特性が判別可能な空間解像度に比べて低い空間解像度においても判別可能な第２の光学特性が互いに異なっている標準粒子懸濁液である。
　また、本発明の一態様は、上記の標準粒子懸濁液において、前記２種類以上のキャリブレーション粒子は、互いに略同じである第３の光学特性をさらに有する。
　また、本発明の一態様は、上記の標準粒子懸濁液において、前記第３の光学特性とは、前記キャリブレーション粒子に照射された光に応じて前記キャリブレーション粒子が発する散乱光の強度である。
　また、本発明の一態様は、上記の標準粒子懸濁液において、前記第１の光学特性が、前記キャリブレーション粒子の形態についての特性である。即ち、上記の標準粒子懸濁液において前記第１の光学特性とは、本発明の中で取得される光信号に反映された前記キャリブレーション粒子の形態についての特性である。
　また、本発明の一態様は、上記の標準粒子懸濁液において、前記第２の光学特性が、照射された光に応じて前記キャリブレーション粒子が発する蛍光の波長及び強度の一方または両方である。
　また、本発明の一態様は、上記の標準粒子懸濁液において、前記キャリブレーション粒子の前記標準粒子懸濁液に対する比重が１から所定の範囲である。
　また、本発明の一態様は、上記の標準粒子懸濁液において、前記キャリブレーション粒子のサイズが０．１μｍ以上かつ１００μｍ以下である。
　また、本発明の一態様は、上記の標準粒子懸濁液において、前記キャリブレーション粒子がアガロースゲル（Ａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｌ）、ポリエチレングリコール（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ）、ポリスチレン（Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）を含む材料により構成される。
　また、本発明の一態様は、上記の標準粒子懸濁液において、評価対象のフローサイトメータが、前記第１の光学特性に基づき取得した光信号の時系列波形情報から、前記キャリブレーション粒子の２次元画像を介さず、前記キャリブレーション粒子を直接判別するフローサイトメータである。
　また、本発明の一態様は、上記の標準粒子懸濁液において、前記フローサイトメータが、ゴーストサイトメトリー技術に基づくフローサイトメータであり、前記第１の光学特性として検出される光信号に反映される形態情報に基づいて前記キャリブレーション粒子が判別される。
　本発明によれば、散乱光強度や蛍光強度の総量に基づいて評価対象を評価する従来のフローサイトメータよりも高い空間分解能で測定対象物を分別できるゴーストサイトメトリー技術を用いたフローサイトメータにおいて、その分別性能を簡便に評価できる。
本発明の第１の実施形態に係る標準粒子懸濁液をフローサイトメータにおいて測定した際に得られるシグナル（光信号の時系列波形）の一例を示す図である。 本発明の第１の実施形態に係る標準粒子懸濁液に含まれるキャリブレーション粒子の形態の一例を示す図である。 本発明の第１の実施形態に係る標準粒子懸濁液に含まれるキャリブレーション粒子の蛍光特性の一例を示す図である。 本発明の第１の実施形態に係る標準粒子懸濁液に含まれるキャリブレーション粒子の散乱光特性の一例を示す図である。 本発明の第２の実施形態に係る標準粒子懸濁液をフローサイトメータにおいて測定した際に得られるシグナルの一例を示す図である。 本発明の第２の実施形態に係る標準粒子懸濁液に含まれるキャリブレーション粒子についての前方散乱光の強度と、側方散乱光の強度ついての散布図の一例を示す図である。 本発明の第３の実施形態に係る標準粒子懸濁液に含まれるキャリブレーション粒子に付与されている２種類の蛍光特性の一例を説明する散布図である。 本発明の第４の実施形態に係る標準粒子懸濁液に含まれるキャリブレーション粒子が有する内部構造の一例を示す図である。 本発明の第５の実施形態に係る標準粒子懸濁液に含まれるキャリブレーション粒子が有する内部構造の一例を示す図である。 本発明の第５の実施形態に係る標準粒子懸濁液に含まれるキャリブレーション粒子についての前方散乱光の強度と側方散乱光の強度についての散布図の一例を示す図である。 本発明の第５の実施形態に係る標準粒子懸濁液に含まれるキャリブレーション粒子の蛍光特性の一例を示す図である。 本発明の第５の実施形態に係る標準粒子懸濁液に含まれるキャリブレーション粒子に包含される内部粒子のサイズを変えた場合のフローサイトメータの分別性能の一例を示す図である。 本発明の第６の実施形態に係る標準粒子懸濁液に含まれるキャリブレーション粒子が有する内部構造の一例を示す図である。 本発明の第７の実施形態に係る標準粒子懸濁液に含まれるキャリブレーション粒子に付与されている２種類の蛍光特性の一例を説明する散布図である。 本発明の実施例に係るキャリブレーションビーズの構造を示す図である。 本発明の実施例に係るフローサイトメータでスポット光（波長６３７ｎｍ）を用いて標準粒子懸濁液に含まれる２種類のキャリブレーションビーズの散乱特性をそれぞれ測定した結果を示す図である。 本発明の実施例に係るフローサイトメータにおいて、構造化照明を用いた蛍光強度の総量による測定を波長５２５ｎｍにおいて行った結果と、スポット光を用いた蛍光強度の総量による測定を検出波長６７６ｎｍにおいて行った結果とを示す図である。 本発明の実施例に係るフローサイトメータでゴーストサイトメトリー技術に基づいて２種類のキャリブレーションビーズを判別した結果を示す図である。
（第１の実施形態）
　以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について詳しく説明する。
　本実施形態に係る標準粒子懸濁液Ｌは、フローサイトメータのフローセルに流し込まれて、フローサイトメータの判別性能を評価するために用いられる。本実施形態に係る標準粒子懸濁液Ｌを用いて判別性能の評価が行われるフローサイトメータは、例えば、ゴーストサイトメトリー技術に基づいて測定を行うフローサイトメータであり、蛍光強度や散乱光強度の総量に基づいて測定対象を評価する従来のフローサイトメータよりも高い空間分解能を有するフローサイトメータである。ゴーストサイトメトリー技術に基づいて測定を行うフローサイトメータでは、包含される蛍光強度の総量が略同じであるが形態に違いがある粒子を、粒子の形態の違いに基づく蛍光分布の違いにより判別することができる。即ち、本実施形態において従来のフローサイトメータよりも高い判別性能とは、例えば、細胞の形態に基づいて目的細胞を判別あるいは分別できるゴーストサイトメトリー技術を用いたフローサイトメータが有する判別性能と同程度の判別性能を指し、従来のフローサイトメータでは判別できなかった測定対象物の微細な形態の違いを認識できるような分別性能である。
　以下の説明では、本実施形態に係る標準粒子懸濁液Ｌにより判別性能を評価するフローサイトメータとして、ゴーストサイトメトリー技術に基づいて測定を行うフローサイトメータを例に説明を行うが、本実施形態に係る標準粒子懸濁液Ｌは、画像情報に変換せずに、蛍光強度や散乱光強度の総量に基づいて評価対象を評価する従来のフローサイトメータよりも高い空間分解能で測定対象物の形態情報を取り出すことができるフローサイトメータに対して同様に用いることが可能である。また以下の説明では、蛍光強度や散乱光強度の総量に基づいて評価対象を評価するフローサイトメータを従来のフローサイトメータと記載することがある。
　図１に、標準粒子懸濁液Ｌを分別性能の評価対象であるフローサイトメータで測定した際に得られるシグナルの一例を示す。標準粒子懸濁液Ｌには、評価対象であるフローサイトメータの分別性能を評価するための２種類以上の粒子が包含される。なお以下の説明では、評価対象であるフローサイトメータの分別性能を評価するために標準粒子懸濁液に包含される粒子をキャリブレーション粒子として記載する。また以下の説明では標準粒子懸濁液Ｌには粒子１と粒子２の２種類の粒子が含まれる例について説明する。
　シグナルＳＧ１は、散乱光の強度が総量として取得される散乱情報のシグナルである。シグナルＳＧ２は、蛍光輝度が総量として取得される蛍光情報のシグナルである。シグナルＳＧ３は、シグナルＳＧ１およびシグナルＳＧ２より高い空間解像度で標準粒子懸濁液Ｌに包含されるキャリブレーション粒子の形態情報を取得できるシグナルであり、例えば、ゴーストサイトメトリー技術によって検出される時系列の光信号のシグナルである。評価対象であるフローサイトメータを用いた標準粒子懸濁液Ｌの測定により、標準粒子懸濁液Ｌに含まれるキャリブレーション粒子の第１の光学特性に基づいてシグナルＳＧ３が、第２の光学特性に基づいてシグナルＳＧ２が、第３の光学特性に基づいてシグナルＳＧ１が、それぞれ取得される。
　上述した形態情報には、例えばキャリブレーション粒子の外形や内部構造を示す情報が含まれ、シグナルＳＧ３から、蛍光染色等のラベル付け行わずとも目的細胞の判別あるいは分別が可能な程度の高い空間解像度をもつ形態情報が直接取得される。シグナルＳＧ３は、シグナルＳＧ２における蛍光総量の測定により得られる情報より高い空間解像度で形態情報が取得できるシグナルで、例えば、ゴーストサイトメトリー技術を用いたフローサイトメータによって取得される形態情報を含む光信号の時系列シグナルが該当する。
　ゴーストサイトメトリー技術を用いたフローサイトメータでは、流路内を移動する測定対象物に照射される照明光に特定の照明パターンを付与して照射する構造化照明の構成により、あるいは照明光の照射により測定対象物から発せられる蛍光や散乱光などの光に特定のパターンを付加して検出する構造化検出の構成により、光検出器により検出される信号光に測定対象物の形態情報を圧縮して付与することができる。そのため、ゴーストサイトメトリー技術を用いたフローサイトメータにより取得された前記の粒子１と粒子２とを検出した光信号の時系列波形は、粒子１と粒子２との形態の違いを反映して互いに異なっており、粒子１と粒子２を検出した光信号の時系列波形を教師データとして判別モデルを作成することで、そのモデルに基づいて粒子１と粒子２とを相互の形態の違いに基づいて判別することができる。即ち、本実施形態に係る標準粒子懸濁液Ｌに含まれるキャリブレーション粒子が有する第１の光学特性は、粒子の形態についての特性（形態特性）であり、第１の光学特性の違いを反映した光信号に基づいて判別される。ゴーストサイトメトリー技術を用いたフローサイトメータの例では、検出される光信号に上記の第１の光学特性が反映される。
　なお、ゴーストサイトメトリー技術を用いたフローサイトメータにおいて検出される光の種類は、キャリブレーション粒子から発せられるまたはキャリブレーション粒子を介して生じる透過光、蛍光、散乱光、干渉光、回折光、偏光のいずれであってもよく、評価対象のフローサイトメータの測定対象物に応じて好適な光が選択される。本実施形態ではキャリブレーション粒子を介して生じる回折光を測定する例について説明する。
　なお、シグナルＳＧ１の散乱光が総量として取得される散乱情報からもキャリブレーション粒子の形態に関する情報を得ることが可能であるが、本実施形態において標準粒子懸濁液Ｌにより評価したいフローサイトメータの判別性能は、シグナルＳＧ１により散乱情報から得られる形態に関する情報とは取得できる情報の空間解像度が異なる。本実施形態の標準粒子懸濁液Ｌは、従来のフローサイトメータが散乱光の総量として散乱光情報を取得して得るよりも高い空間分解能の判別性能を、評価するフローサイトメータが有しているかを評価するために使用される。例えば、従来のセルソーターの場合には、細胞から発せられる蛍光信号はその強度総量のみが細胞判別に用いられており、細胞の蛍光形態情報や蛍光局在は判別に用いられていない。一方、標準粒子懸濁液Ｌにより評価したいフローサイトメータでは、例えば、細胞の蛍光形態情報や蛍光局在などの微細な形態情報に基づいて細胞の判別が行われる。
　図２は、本実施形態に係る標準粒子懸濁液Ｌに含まれるキャリブレーション粒子の形態を示す一例である。標準粒子懸濁液Ｌは、粒子１と粒子２とを含む。なお以下の説明では標準粒子懸濁液Ｌに粒子１と粒子２との２種類のキャリブレーション粒子が予め混合されて懸濁液に包含される例について説明するが、本発明の標準粒子懸濁液は、粒子１と粒子２の２種類の粒子を別々に提供し、フローサイトメータの判別性能を評価する際にそれぞれ調製した懸濁液を組み合わせて使用する方法で使用することもできる。
　粒子１及び粒子２は、一例として、０．１μｍから１００μｍ程度の大きさを有する微小粒子であり、１μｍ以上かつ１００μｍ以下程度の大きさを有することがより望ましい。本実施形態に係る標準粒子懸濁液Ｌに含まれるキャリブレーション粒子は形態の判別対象と同程度の大きさを有することが望ましく、判別対象が細胞である場合には、キャリブレーション粒子の粒子サイズは５μｍ以上かつ４０μｍ以下であることがより望ましく、１０μｍ以上かつ３０μｍ以下であることがさらに好適である。標準粒子懸濁液Ｌが含むキャリブレーション粒子の大きさは、形態の判別対象の大きさと、フローサイトメータに対して要求される感度とに応じて選択されてよい。
　本実施形態に係る標準粒子懸濁液Ｌに含まれる粒子１と粒子２とは互いに形態が異なる。粒子１と粒子２の形態は、判別対象の形態と評価対象のフローサイトメータが要求される感度とに応じて選択できる。ここで本実施形態における形態には、例えば、粒子の外形と、粒子の内部構造とが含まれる。本実施形態では、一例として、粒子１と粒子２とは互いに外形が異なる。図２に示すように、粒子１は略球状であり、粒子２は複数の凸部を有する形状である。なお、粒子の内部構造が互いに異なる粒子の例については後述の実施形態において説明する。
　粒子１と粒子２とは、互いに異なる蛍光特性を有する。蛍光特性とは、例えば、粒子にレーザー光が照射されて粒子が発する蛍光の波長及び強度の一方または両方である。例えば、粒子１と粒子２とのうち少なくとも一方が蛍光色素によって染色されることによって、粒子１と粒子２とは互いに異なる蛍光特性を有する。粒子１と粒子２とは互いに異なる種類の蛍光色素によって染色されてもよい。なお、前記蛍光色素による染色は、標準粒子懸濁液Ｌに含まれるキャリブレーション粒子の調製と同時に行われても、調製された粒子を調製のあとで染色しても、そのいずれでもよい。前記粒子１と粒子２とが有する互いに異なる蛍光特性が、本実施形態に係る標準粒子懸濁液Ｌに含まれるキャリブレーション粒子の第２の光学特性の一例である。第２の光学特性は粒子１と粒子２を区別する正解ラベル付けを行うための光学特性である。また、第２の光学特性はゴーストサイトメトリー技術を用いたフローサイトメータにおいて学習時の教師データを取得する際にも利用される。また、粒子１と粒子２とに付与される第２の光学特性の違いは、従来のフローサイトメータにおいても粒子１と粒子２を判別できる光学特性の違いである。それにより、従来のフローサイトメータを用いて第２の光学特性により判別した測定値を指標に、評価対象フローサイトメータの判別性能を判定することができる。
　図３に粒子１及び粒子２の蛍光特性の一例を示す。グラフＦ１、及びグラフＦ２は、それぞれ粒子１及び粒子２について測定された蛍光強度と頻度の関係を示すグラフである。図３に示すように、粒子１及び粒子２は、発する蛍光の強度が互いに異なる。それにより粒子１及び粒子２は蛍光強度をもとに、従来のフローサイトメータにおいても、互いを判別することが可能である。
　粒子１と粒子２とでは、互いに略同程度の散乱光強度を有する。散乱光強度とは、一例として、キャリブレーション粒子に照射されたレーザー光が粒子に当たり散乱することで生じる散乱光の強度である。
　なお、散乱光の種類には、前方散乱光、側方散乱光、及び後方散乱光などがあるが、本実施形態では、散乱光の種類は限定されず、散乱光の強度は、前方散乱光、側方散乱光、及び後方散乱光のうち少なくとも１つの強度である。
　図４に、粒子１及び粒子２の散乱光強度の一例を示す。グラフＳ１、及びグラフＳ２は、それぞれ粒子１及び粒子２について測定された散乱光の強度と頻度との関係を示すグラフである。グラフＳ１及びグラフＳ２から、粒子１及び粒子２について測定された散乱光の特性は略等しいことがわかる。なお図４では、グラフＳ１とグラフＳ２の形状がほぼ重複する好適例が示されているが、粒子１及び粒子２が有する散乱光強度の分布は、従来のフローサイトメータにおいて、散乱光強度をもとに２種類の粒子を判別する事が難しい程度にグラフが重複していればよい。
　粒子１及び粒子２は、互いに略同程度の散乱光強度を有するように、例えば、組成が類似した物質により構成される。散乱光強度はキャリブレーション粒子の形状に依存するが、粒子１及び粒子２では、互いに略同程度の散乱光強度を有するように組成が選択される。
　粒子１及び粒子２の材料は、例えば、アガロースゲル（Ａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｌ）やポリエチレングリコール（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ）などのハイドロゲル（ｈｙｄｒｏｇｅｌ）や、ポリスチレン（Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）である。
　また、粒子１と粒子２とのそれぞれの標準粒子懸濁液Ｌに対する比重は、フローサイトメータのフローセルを流体と混合状態で流れるようにするため、１から所定の範囲であり、この所定の範囲とは例えば０．２である。粒子１と粒子２のそれぞれの比重は、例えば、０．８以上かつ１．２以下の範囲に含まれると、懸濁が容易で懸濁状態が長く続くため好ましい。
　本実施形態に係る標準粒子懸濁液Ｌに含まれるキャリブレーション粒子は公知の方法により調製することができる。例えば米国特許番号９，９１５，５９８号あるいはＷＯ２０１６／１３０４８９に記載の方法により目的細胞に類似したハイドロゲル粒子を調製することができる。また本実施形態に係る標準粒子懸濁液Ｌに含まれる粒子は、後述の例のように、アガロースゲルビーズの中に市販の蛍光ポリスチレンをビーズ含有させ調製することもできる。
　以下の説明では、判別性能の評価対象であるフローサイトメータを、評価対象フローサイトメータといい、識別標識を与えたキャリブレーション粒子を判別し評価対象フローサイトメータの判別性能の指標となる測定値を得るフローサイトメータを基準フローサイトメータという。
　上述したように、粒子１と粒子２とは互いに形態が異なるが、同時に互いに異なる蛍光特性を有する。基準フローサイトメータによって、標準粒子懸濁液Ｌを用いて粒子１と粒子２とを蛍光特性（例えば、特定の波長において検出される蛍光強度の総量）に基づいて予め判別しておく。次に、評価対象フローサイトメータによって、同じ標準粒子懸濁液Ｌを用いて粒子１と粒子２とを形態情報に基づいて判別する。
　評価対象フローサイトメータによる形態情報に基づく判別結果が、基準フローサイトメータによって予め得られた蛍光特性に基づく判別結果と比較され、双方の判別結果の一致度が評価対象フローサイトメータの判別性能指標とされる。なお以降の説明では、基準フローサイトメータとして従来のフローサイトメータが採用される場合を例に記載するが、従来のフローサイトメータより空間分解能の高いフローサイトメータを基準フローサイトメータとして用いることもできる。
　ここで粒子１と粒子２に付与されている蛍光特性は、評価対象フローサイトメータが第１の光学特性に基づいて粒子の形態の違いを判別するために必要とする空間解像度に比べて低い空間解像度でも判別可能な特性である。そのため、基準フローサイトメータの空間分解能が、評価対象フローサイトメータが形態情報を測定する際の空間分解能に比べて低くても、基準フローサイトメータは蛍光特性を指標に粒子１と粒子２を判別できる。即ち、基準フローサイトメータとして空間分解能が低い従来のフローサイトメータが採用された場合にも、粒子１と粒子２に付与されている特定の波長において検出される蛍光強度の総量によりキャリブレーション粒子を判別することができ、その判別結果と比較して評価対象フローサイトメータの判別性能が評価される。
　上記の実施形態では、基準フローサイトメータと評価対象フローサイトメータとが異なる場合の一例について説明したが、これに限らない。基準フローサイトメータとして評価対象フローサイトメータ自身が用いられてもよい。この場合、評価対象フローサイトメータの判別性能が、過去の判別性能から変化していないかを検証することによって評価対象フローサイトメータの状態を管理することができる。
　上述したように標準粒子懸濁液Ｌは、互いに異なる区別可能な形態を有する粒子１と粒子２とを含む。標準粒子懸濁液Ｌに含まれるキャリブレーション粒子の形態の違いを反映した光信号が有する特性が、第１の光学特性である。また、キャリブレーション粒子の蛍光特性が第２の光学特性の一例である。つまり、第２の光学特性とは、照射された光に応じて標準粒子懸濁液Ｌが含むキャリブレーション粒子の粒子が発する蛍光の波長及び強度の一方または両方である。本実施形態で第２の光学特性として測定される蛍光強度の総量などの蛍光特性は、第１の光学特性である粒子の形態が判別可能な空間解像度に比べ、低い空間解像度においても判別可能である。
　また、上述したように、粒子１と粒子２とは、互いに略同程度の散乱光強度を有する。そのため、評価対象フローサイトメータは、散乱光強度の総量に基づいて粒子１と粒子２とを判別することはできない。散乱光強度の総量に関する情報は、第３の光学特性の一例であり、標準粒子懸濁液Ｌに照射された光に応じて、包含されるキャリブレーション粒子から発せられる散乱光強度である。
　なお、本実施形態では、標準粒子懸濁液Ｌに含まれるキャリブレーション粒子の種類の数が２である場合の一例について説明したが、これに限らない。標準粒子懸濁液Ｌは３種類以上のキャリブレーション粒子を含んでもよい。それら３種類以上のキャリブレーション粒子は、互いに異なる第１の光学特性と、第１の光学特性を判別可能な空間解像度に比べて低い空間解像度においても判別可能な互いに異なる第２の光学特性とを有する。
　なお、本実施形態では、ゴーストサイトメトリー技術を用いたフローサイトメータにおいて検出される光が回折光の場合について、一例として、説明した。その場合、第１の光学特性はキャリブレーション粒子の形態特性であり、当該第１の光学特性がキャリブレーション粒子を介して生じる回折光に基づいて判別されるが、これに限らない。例えば、本標準粒子懸濁液に含まれるキャリブレーション粒子の形態特性は、散乱光に基づいて判別することもできる。その場合、評価対象フローサイトメータはキャリブレーション粒子からの散乱光がゴーストサイトメトリー技術を用いて検出され、本標準粒子懸濁液に含まれるキャリブレーション粒子の形態特性に基づいてキャリブレーション粒子が判別される。即ち、本標準粒子懸濁液に含まれるキャリブレーション粒子からの散乱光によりキャリブレーション粒子の形態特性が判別され、その判別精度により評価対象フローサイトメータの形態特性についての判別性能が評価される。
（第２の実施形態）
　以下、図面を参照しながら本発明の第２の実施形態について詳しく説明する。本実施形態に係る標準粒子懸濁液を標準粒子懸濁液Ｌａといい、標準粒子懸濁液に含まれるキャリブレーション粒子を粒子１ａ、粒子２ａという。
　図５は、本実施形態に係る評価対象フローサイトメータにおいて標準粒子懸濁液Ｌａを測定した際に検出される光信号のシグナルの一例を示す図である。本実施形態に係る評価対象フローサイトメータでは、キャリブレーション粒子の形態に関する情報を取り出す光信号のシグナルＳＧ３に加え、シグナルＳＧ３が形態特性を判別可能な空間解像度より低い空間解像度で測定される蛍光情報のシグナルであるシグナルＳＧ２、及び散乱情報のシグナルとしてシグナルＳＧ１１とシグナルＳＧ１２とが測定される。なお、本実施形態に係る評価対象フローサイトメータにおいて取得される形態情報に関するにシグナルＳＧ３と蛍光情報のシグナルであるシグナルＳＧ２については、第１の実施形態において評価対象フローサイトメータにより取得されるシグナルと同様のシグナルである。
　シグナルＳＧ１１は、基準フローサイトメータでも測定可能な前方散乱光強度の総量として取得される前方散乱情報のシグナルである。シグナルＳＧ１２は、側散乱光強度の総量として取得される散乱情報のシグナルである。図５では、シグナルＳＧ１２が側方散乱光の散乱情報のシグナルである場合を例に説明しているが、シグナルＳＧ１２は後方散乱光の散乱情報のシグナルであってもよい。また、シグナルＳＧ１１とシグナルＳＧ１２の組み合わせは、側方散乱情報のシグナルと後方散乱情報のシグナルの組み合わせであってもよい。シグナルＳＧ１１とシグナルＳＧ１２は従来のフローサイトメータにおいても測定可能なシグナルである。
　本発明の実施形態の標準粒子懸濁液Ｌａでは、含まれる粒子１ａと粒子２ａが有する第１の光学特性に基づいてシグナルＳＧ３が取得され、キャリブレーション粒子が有する第２の光学特性に基づいてシグナルＳＧ２が取得され、キャリブレーション粒子が有する第３の光学特性に基づいてシグナルＳＧ１１とＳＧ１２とが取得される。
　標準粒子懸濁液Ｌａに含まれる粒子１ａと粒子２ａとでは、前方散乱光の強度と、側方散乱光の強度が複数のキャリブレーション粒子同士において略同じである。図６は、本実施形態に係る粒子１ａと粒子２ａについての前方散乱光の強度と、側方散乱光の強度とについての散布図の一例を示す図である。領域Ｄ１１、及び領域Ｄ１２は、それぞれ粒子１ａ及び粒子２ａについて測定された前方散乱光の強度と側方散乱光の強度との組合せを示す。領域Ｄ１１及び領域Ｄ１２の分布がほとんど重複することから、粒子１ａ及び粒子２ａについて、測定される前方散乱光の強度と側方散乱光の強度とは略等しいことがわかる。
　前記の通り、粒子１ａと粒子２ａは互いに略同じ散乱特性を有する。そのため、評価対象フローサイトメータは、粒子の散乱強度の総量による光散乱特性に基づいて粒子１と粒子２とを判別することはできない。一方、粒子１ａと粒子２ａとが、互いに形態が異なり、互いに異なる蛍光特性を有する点は、上記第１の実施形態と同様である。蛍光特性は第２の光学特性の一例であり、特定の波長において検出される蛍光強度の総量により粒子１ａと粒子２ａとは判別できる。それにより評価対象フローサイトメータによる形態情報に基づく判別結果が、基準フローサイトメータによって予め得られた蛍光特性に基づく判別結果と比較され、例えば、双方の分別結果の一致度を評価対象フローサイトメータの判別性能指標とすることができる。
（第３の実施形態）
　以下、図面を参照しながら本発明の第３の実施形態について詳しく説明する。本実施形態に係る標準粒子懸濁液を標準粒子懸濁液Ｌｂといい、標準粒子懸濁液に含まれるキャリブレーション粒子を粒子１ｂ、粒子２ｂという。
　粒子１ｂと粒子２ｂは、少なくとも２種類の蛍光により染色されており、キャリブレーション粒子の形態に関する第１の光学特性をそのうちの１種の蛍光を測定することにより得る点において、上記第１、第２の実施形態と異なる。即ち、本発明の実施形態の標準粒子懸濁液Ｌｂでは、含まれる粒子１ｂと粒子２ｂが有する第１の光学特性と第２の光学特性とが粒子を染色する２種類の蛍光染色により付与されている。
　粒子１ｂと粒子２ｂは、付与された第１の蛍光の強度はその総量が略同じであるが、その粒子の形態に違いがあり蛍光分布が異なる。空間解像度が高い評価対象フローサイトメータでは、粒子形態の相違に基づく蛍光分布の相違を指標にキャリブレーション粒子の相互に異なる形態の違いを判別することが可能であるが、より空間解像度が低い基準フローサイトメータでは粒子１ｂと粒子２ｂを第１の蛍光強度の総量を指標に相互に判別する事は難しい。
　一方、粒子１ｂと粒子２ｂは、それらキャリブレーション粒子を正しく判別するためのラベル付けのために互いに異なる第２の蛍光特性が付与されており、その第２の蛍光特性を利用すれば、より空間解像度が低い基準フローサイトメータでも相互の判別ができる点は、上記第１、第２の実施形態と同様である。またなお、粒子１ｂと粒子２ｂとは、一例として、さらに上記第１の実施形態、第２の実施形態と同様に略同程度の散乱光の強度を有する。
　このように粒子１ｂと粒子２ｂとは、例えば、互いに同じ種類の第１の蛍光によって染色されて、粒子１ｂと粒子２ｂとのうち一方が第１の蛍光とは異なる種類の第２の蛍光によって染色される。ここで第１の蛍光の蛍光強度の総量は、粒子１ｂと粒子２ｂとで略同じである。
　図７は、本実施形態に係る粒子１ｂと粒子２ｂが有する蛍光特性をさらに説明するための図で、基準フローサイトメータにおいて低い解像度で粒子１ｂと粒子２ｂが有する蛍光特性を測定した結果の一例を示す図である。図７には、評価対象フローサイトメータが上述した第１の光学特性に基づいてキャリブレーション粒子を判別する空間解像度に比べて低い空間解像度で第１の蛍光と第２の蛍光について蛍光強度の総量を測定した際の蛍光強度分布が示されている。領域Ｄ２１、及び領域Ｄ２２は、それぞれ粒子１ｂ及び粒子２ｂについて測定された第１および第２の蛍光総量の分布を示す。粒子１ｂと粒子２ｂとは、異なった形態の粒子であるが、第１の蛍光の総量が等しいため、その情報から得られるシグナルからは粒子の形態を判別できない。なお、領域Ｄ２１、及び領域Ｄ２２から、上述したように粒子１ｂと粒子２ｂとは互いに異なる第２の蛍光によりさらに染色されており、基準フローサイトメータにおいて低い解像度で測定した際にも異なった蛍光特性（第２の蛍光の蛍光総量）を示すことがわかる。
　上述の通り、標準粒子懸濁液Ｌｂに含まれる粒子１ｂと粒子２ｂとは、キャリブレーション粒子が有する第１の蛍光の蛍光強度の総量により相互を区別することは難しいが、評価対象フローサイトメータが第１の光学特性をもとに互いの粒子形態を判別できる高い空間分解能を有していれば、第１の蛍光強度を指標に第１の光学特性をもとに相互を判別することが可能である。第１の光学特性による評価対象フローサイトメータの粒子の判別精度は、キャリブレーション粒子が低い解像度において判別できる第２の蛍光の蛍光特性を付与されているため、第２の蛍光により付与された蛍光特性に基づいて基準フローサイトメータにより判定される。
（第４の実施形態）
　以下、図面を参照しながら本発明の第４の実施形態について詳しく説明する。本実施形態に係る標準粒子懸濁液を標準粒子懸濁液Ｌｃといい、標準粒子懸濁液に含まれるキャリブレーション粒子を粒子１ｃ、粒子２ｃという。
　上記第１から第３の実施形態において、標準粒子懸濁液Ｌｃに含まれるキャリブレーション粒子が互いに外形が異なる場合の例について説明したが、これに限らない。標準粒子懸濁液Ｌｃに含まれるキャリブレーション粒子は、粒子の外形が略同じであり、粒子の内部構造が互いに異なっていてもよい。この場合、評価対象フローサイトメータは、標準粒子懸濁液Ｌｃに含まれるキャリブレーション粒子の内部構造の違いを形態情報の違いとして認識して判別する。
　図８は、本実施形態に係る標準粒子懸濁液Ｌｃに含まれるキャリブレーション粒子の互いに異なった内部構造の一例を示す図である。粒子１ｃ－１から粒子１ｃ－４は、それぞれ粒子１ｃの一例であり、粒子２ｃ－１から粒子２ｃ－４は、それぞれ粒子２ｃの一例である。粒子１ｃと粒子２ｃとは、ともに外形が略球状である。粒子１ｃと粒子２ｃとは、ともに内部に粒子を含む。粒子１ｃと粒子２ｃとのそれぞれの内部に含まれる粒子は、蛍光色素によって染色されている。（但し、粒子２ｃ－２の場合のみ、粒子２ｃ－２の内部粒子の外側の部分が染色されている。）
　以下の説明では、粒子１ｃと粒子２ｃとのそれぞれの内部に含まれる粒子を内部粒子という。本実施形態では、粒子の内部構造とは、一例として内部粒子の位置や分布、大きさや形状である。粒子１ｃと粒子２ｃとは、互いに粒子の内部構造が異なり、それを区別するために互いに異なる蛍光特性が付与されている点は上記第１から第３の実施形態と同様である。前記の粒子１ｃと粒子２ｃに付与される蛍光特性はキャリブレーション粒子が有する第２の光学特性であり、基準フローサイトメータにおいて粒子１ｃと粒子２ｃとを判別するための指標として使用される。上記第１から第３の実施形態と同様に評価対象フローサイトメータによる形態情報に基づく判別結果が、基準フローサイトメータによる蛍光特性に基づく判別結果と比較され、評価対象フローサイトメータの判別性能が評価される。
　粒子１ｃ－１は、内部に複数の内部粒子を含む。一方、粒子２ｃ－１は、粒子１ｃ－１が含む内部粒子よりも大きい１つの内部粒子を含む。
　粒子１ｃ－２では、１つの内部粒子を含む。粒子２ｃ－２も１つの内部粒子を含むが、内部粒子の外側の表面付近に位置する球殻状の部分が蛍光で染色されている。
　粒子１ｃ－３と粒子２ｃ－３とはともに、内部に複数の内部粒子を含む。粒子１ｃ－３では、内部粒子の形状は略球状である。一方、粒子２ｃ－３では、内部粒子の形状は凸部を有する形状である。
　粒子１ｃ－４は内部に１つの内部粒子を含む。粒子２ｃ－４も１つの内部粒子を含むが、内部粒子の大きさが粒子１ｃ－４よりも大きい。
　粒子１ｃ－１と粒子２ｃ－１と、粒子１ｃ－２と粒子２ｃ－２と、粒子１ｃ－３と粒子２ｃ－３と、粒子１ｃ－４と粒子２ｃ－４とでは、互いに蛍光特性が異なっており、粒子に含まれる蛍光色素の総量が互いに異なっている。
　上記では、粒子１ｃと粒子２ｃとに付与されている蛍光特性の違いが包含されている蛍光量の違いによる例について説明しているが、これ以外に、粒子１ｃと粒子２ｃとに異なる蛍光色素が包含され、付与されている蛍光波長が互いに異なることにより粒子１ｃと粒子２ｃが区別される場合もある。この場合、粒子１ｃと粒子２ｃの内部粒子の染色に用いられる蛍光色素の総量は互いに略同じであってもよい。
（第５の実施形態）
　以下、図面を参照しながら本発明の第５の実施形態について詳しく説明する。
　上記第１から第４の実施形態では、標準粒子懸濁液は少なくとも２種類のキャリブレーション粒子を含んでおり、その標準粒子懸濁液が評価対象のフローサイトメータの判別性能を評価するために用いられる場合について説明をした。本実施形態では、標準粒子懸濁液に含まれるキャリブレーション粒子に含まれる内部粒子サイズを変えて、フローサイトメータの判別性能のうち特に分解能を評価する場合について説明をする。ここでフローサイトメータの分解能とは、評価対象のフローサイトメータが、どこまで小さなサイズの内部粒子まで判別性能を低下させずに判別できるのかを指標とした評価対象フローサイトメータにより取得される画像情報の空間解像度に関する性能である。
　本実施形態に係る標準粒子懸濁液を標準粒子懸濁液Ｌｄといい、標準粒子懸濁液に含まれるキャリブレーション粒子を粒子１ｄ、粒子２ｄ、粒子３ｄ、粒子４ｄ、粒子５ｄという。
　図９は、本実施形態に係る標準粒子懸濁液Ｌｄに含まれるキャリブレーション粒子の内部構造の一例を示す図である。粒子１ｄから粒子５ｄは、それぞれ異なった大きさの内部粒子を含む。粒子１ｄから粒子５ｄにそれぞれ含まれる内部粒子のサイズは、粒子１ｄから粒子５ｄの順に大きい。粒子１ｄから粒子５ｄにそれぞれ含まれる内部粒子の数は、粒子１ｄから粒子５ｄの順に少ない。粒子１ｄから粒子５ｄにそれぞれ含まれる内部粒子の体積の合計は、粒子１ｄから粒子５ｄ相互間において略同じである。
　図９に示す例では、粒子５ｄには１つ内部粒子が含まれるのに対して、粒子４ｄには２つ内部粒子が含まれ、粒子３ｄ、粒子２ｄ、粒子１ｄにそれぞれ含まれる内部粒子のサイズは小さくなってゆき、数は多くなっている。
　ゴーストサイトメトリー技術に基づいて測定を行うフローサイトメータでは高い空間解像度で形態情報を取得できるため、本実施形態に係る標準粒子懸濁液Ｌｄに含まれるこうした粒子の内部構造の違いに基づいて標準粒子懸濁液Ｌｄに含まれるキャリブレーション粒子を判別することができる。本実施形態に係る標準粒子懸濁液Ｌｄは、例えばゴーストサイトメトリー技術に基づくフローサイトメータなどの空間分解能が高いフローサイトメータを評価対象のフローサイトメータとして、その分解能を評価するために使用される。評価対象のフローサイトメータが検出するキャリブレーション粒子の内部構造に由来する光学特性が第１の光学特性である。評価対象のフローサイトメータが検出する第１の光学特性については、上記第１から第４の実施形態と同様である。
　粒子１ｄから粒子５ｄは互いに略同じ光散乱特性を示し、取得される散乱情報は略同じになる。図１０は、本実施形態に係る粒子１ｄから粒子５ｄについての前方散乱光の強度と、側方散乱光の強度についての散布図の一例を示す図である。領域Ｄ３は、粒子１ｄから粒子５ｄについて測定された散乱光の強度について、前方散乱光の強度と側方散乱光の強度を、粒子１ｄから粒子５ｄそれぞれについて示す複数の領域である。領域Ｄ３から、粒子１ｄから粒子５ｄについて測定された前方散乱光の強度と、側方散乱光の強度とは、略等しいことがわかる。図１０では、粒子１ｄから粒子５ｄの前方散乱光と側方散乱光が略等しい場合を例に説明しているが、散乱光として後方散乱光が略同じであってもよい。本実施形態に係る標準粒子懸濁液Ｌｄの例では、散乱光の強度はキャリブレーション粒子が有する第３の光学特性である。標準粒子懸濁液Ｌｄに含まれるキャリブレーション粒子の散乱光の強度の総量が略同じであるため、従来のフローサイトメータを用いて散乱光の強度の総量に基づいて判別することは難しい。
　図１１に粒子１ｄから粒子５ｄが有する蛍光特性の一例を示す。グラフＦ１ｄ、グラフＦ２ｄ、グラフＦ３ｄ、グラフＦ４ｄ、及びグラフＦ５ｄは、それぞれ粒子１ｄ、粒子２ｄ、粒子３ｄ、粒子４ｄ、及び粒子５ｄについて測定された蛍光の強度と頻度の関係を示すグラフである。図１１に示すように、粒子１ｄから粒子５ｄでは、互いに有する蛍光特性が異なっており、図１１の場合は発する蛍光の強度が互いに異なる。本実施形態に係る標準粒子懸濁液Ｌｄの例では、蛍光の強度はキャリブレーション粒子が有する第２の光学特性である。基準フローサイトメータは第２の光学特性をもとに粒子１ｄから粒子５ｄを判別できる。評価対象フローサイトメータによる形態情報に基づく判別結果が、基準フローサイトメータによる蛍光特性に基づく判別結果と比較され、評価対象フローサイトメータの分解能が評価される。
　図１２は、本実施形態に係る内部粒子のサイズを変えた標準粒子懸濁液Ｌｄを組み合わせて測定し、評価対象フローサイトメータの分解能を評価した一例を示す図である。プロットＡ１は、標準粒子懸濁液Ｌｄが粒子１ｄと粒子２ｄとを含む場合の評価対象のフローサイトメータの判別性能を示す。ここで判別性能とは、評価対象のフローサイトメータが第１の蛍光強度を指標に内部粒子のサイズの違いに基づいて行った粒子１ｄと粒子２ｄの判別結果を基準フローサイトメータにより第２の光学特性をもとに検証を行った判別結果の一致度を示す指標である。プロットＡ２は、標準粒子懸濁液Ｌｄが粒子２ｄと粒子３ｄとを含む場合のフローサイトメータの判別性能を示す。プロットＡ３は、標準粒子懸濁液Ｌｄが粒子３ｄと粒子４ｄとを含む場合のフローサイトメータの判別性能を示す。プロットＡ４は、標準粒子懸濁液Ｌｄが粒子４ｄと粒子５ｄとを含む場合のフローサイトメータの判別性能を示す。
　図１２に示す例では、プロットＡ４及びプロットＡ３が示すとおり、内部粒子のサイズが大きいうちは、判別性能は高く一定に維持される。一方、プロットＡ２及びプロットＡ１が示すとおり、内部粒子のサイズが小さくなると判別性能は低下してゆく。本実施形態では、標準粒子懸濁液Ｌｄに含まれるキャリブレーション粒子に含まれる内部粒子のサイズを小さくしていった場合に、例えば、判別性能が低下する直前の内部粒子のサイズがフローサイトメータの分解能として判定される。フローサイトメータの分解能とは、評価対象フローサイトメータにより取得される画像情報の空間解像度についての性能である。
（第６の実施形態）
　以下、図面を参照しながら本発明の第６の実施形態について詳しく説明する。
　本実施形態に係る標準粒子懸濁液を標準粒子懸濁液Ｌｅといい、標準粒子懸濁液に含まれるキャリブレーション粒子を粒子１ｅ、粒子２ｅ、粒子３ｅ、粒子４ｅ、粒子５ｅという。
　図１３は、本実施形態に係る標準粒子懸濁液Ｌｅに含まれるキャリブレーション粒子の内部構造の一例を示す図である。粒子１ｅから粒子５ｅは、それぞれ内部粒子を含む。粒子１ｅから粒子５ｅにそれぞれ含まれる内部粒子のサイズは、粒子１ｅから粒子５ｅの順に大きい。粒子１ｅから粒子５ｅにそれぞれ含まれる内部粒子の数は同じ数であり、本実施形態では一例として１つである。粒子１ｅから粒子５ｅにそれぞれ含まれる内部粒子の染色に用いられる蛍光色素の量は互いに略同じであり、したがって蛍光の強度は互いに略同じである。内部粒子の蛍光色素の密度は、粒子１ｅ、粒子２ｅ、粒子３ｅ、粒子４ｅ、粒子５ｅの順に高い。なお、粒子１ｅから粒子５ｅは、発する蛍光の波長が互いに異なる。本実施形態に係る標準粒子懸濁液Ｌｅの例では、各キャリブレーション粒子に含まれる蛍光色素が発する蛍光の波長が異なるという特定は、粒子が有する第２の光学特性であり、基準フローサイトメータは第２の光学特性をもとに粒子１ｅから粒子５ｅを判別できる。
　なお本実施形態に係る標準粒子懸濁液Ｌｅの例では、キャリブレーション粒子の内部構造に由来する光学特性が粒子の有する第１の光学特性であり、第１から第５の実施形態において評価対象フローサイトメータにより取得されるシグナルと同様のシグナルである。評価対象のフローサイトメータは第１の光学特性に基づいて標準粒子懸濁液Ｌｅに含まれる粒子を判別する。本実施形態では、上記第５の実施形態と同様に、例えば、標準粒子懸濁液Ｌｅに含まれる粒子に含まれる内部粒子のサイズを小さくしていった場合に、判別性能が低下する直前の内部粒子のサイズをフローサイトメータの分解能として判定することができる。
　（第７の実施形態）
　以下、図面を参照しながら本発明の第７の実施形態について詳しく説明する。
　本実施形態に係る標準粒子懸濁液を標準粒子懸濁液Ｌｆといい、標準粒子懸濁液に含まれるキャリブレーション粒子を粒子１ｆ、粒子２ｆ、粒子３ｆ、粒子４ｆ、粒子５ｆという。
　粒子１ｆから粒子５ｆでは、内部粒子の染色に複数の蛍光色素が用いられる。粒子１ｆから粒子５ｆは、内部に包含する第１の蛍光の総量が等しく、互いに略同じ蛍光強度を有する。そのため、粒子１ｆから粒子５ｆを共通に含まれる第１の蛍光の蛍光強度の総量を指標に基準フローサイトメータにおいて低い解像度で測定しても、相互に異なったキャリブレーション粒子として区別することは難しい。
　一方、粒子１ｆから粒子５ｆは、第１の蛍光とは異なる種類である第２の蛍光によって染色される。粒子１ｆから粒子５ｆに含まれる第２の蛍光色素は、一例として内部に含まれる蛍光の総量が相互に異なっており、基準フローサイトメータにおいて第２の蛍光の蛍光強度を指標に低い解像度で測定しても粒子１ｆから粒子５ｆを互いに判別できる。即ち本実施形態に係る標準粒子懸濁液Ｌｆでは、第３の実施形態と同様に、標準粒子懸濁液に含まれるキャリブレーション粒子が含まれる粒子１ｆから粒子５ｆが有する第１の光学特性と第２の光学特性とが粒子を染色する２種類の蛍光染色により付与されている。
　図１４は、本実施形態で一例として粒子１ｆから粒子５ｆに付与されている蛍光特性を基準フローサイトメータにおいて低い解像度で測定した結果を示す図である。図１４には上述した第１の光学特性で判別可能な空間解像度に比べて低い空間解像度で第１の蛍光と第２の蛍光を測定した際の蛍光強度分布が示されている。領域Ｄ３１、領域Ｄ３２、領域Ｄ３３、領域Ｄ３４、及び領域Ｄ３５は、それぞれ粒子１ｆ、粒子２ｆ、粒子３ｆ、粒子４ｆ、粒子５ｆについて測定された第１の蛍光と第２の蛍光の強度分布の組合せを示す。粒子１ｆ、粒子２ｆ、粒子３ｆ、粒子４ｆ、粒子５ｆは相互に異なった形態のキャリブレーション粒子であるが、図１４において示されているように、検出できる第１の蛍光の総量が等しいため、空間解像度の低い基準フローサイトメータで測定しても、それによっては標準粒子懸濁液Ｌｆに含まれる互いの粒子を判別できない。
　一方、ゴーストサイトメトリー技術によるフローサイトメータでは、蛍光の総量により評価を行う従来のフローサイトメータとは異なり、検出される第１の蛍光信号をもとに高い空間解像度を有する測定対象物の形態情報が取得でき、その情報をもとにキャリブレーション粒子の形体や内部構造の違いに基づいて測定対象物を判別することができる。ゴーストサイトメトリー技術によるフローサイトメータの判別性能を標準粒子懸濁液Ｌｆを用いて評価する場合には、検出される第１の蛍光による光信号の時系列波形が有する光学的特性が第１の光学特性であり、判別される粒子１ｆ、粒子２ｆ、粒子３ｆ、粒子４ｆ、粒子５ｆの形態の違いを反映した光信号情報により標準粒子懸濁液Ｌｆに含まれるキャリブレーション粒子を互いに判別することが可能である。一方、図１４に示された領域Ｄ３１から領域Ｄ３５から分かるように、上述したように粒子１ｆから粒子５ｆは互いに異なる第２の蛍光特性により判別可能である。本実施形態の例では、キャリブレーション粒子が有する第２の蛍光が第２の光学特性に該当する。従って、第１の光学特性による評価対象フローサイトメータによるキャリブレーション粒子の判別精度は、より低い空間分解能で測定可能な第２の蛍光による蛍光特性によって検証できる。
　本実施形態では、より低い空間分解能で測定可能な第２の蛍光による蛍光特性を蛍光強度の違いにより付与した例により説明したが、第２の蛍光として粒子１ｆから粒子５ｆに互いに異なる波長の蛍光を付与してもよい。
（各実施形態のまとめ）
　以上に説明したように、上記の実施形態に係る標準粒子懸濁液Ｌ、Ｌａ、Ｌｂ、Ｌｃ、Ｌｄ、Ｌｅ、Ｌｆは、第１の光学特性（上記の実施形態において形態的な特徴を反映させた光の光学特性）が互いに異なっており、第１の光学特性（上記の実施形態において形態的な特徴を反映させた光の光学特性）が判別可能な空間解像度に比べて低い空間解像度において判別可能な第２の光学特性（上記の実施形態においては蛍光特性）が互いに異なっている２種類以上のキャリブレーション粒子（上記の実施形態において粒子１、１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、１ｆ、粒子２、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ、２ｆ、粒子３ｄ、３ｅ、３ｆ、粒子４ｄ、４ｅ、４ｆ、粒子５ｄ、５ｅ、５ｆ）を含む。
　この構成により、上記の実施形態に係る標準粒子懸濁液Ｌ、Ｌａ、Ｌｂ、Ｌｃ、Ｌｄ、Ｌｅ、Ｌｆでは、第１の光学特性（上記の実施形態において形態的な特徴を反映させた光の光学特性）に基づく判別結果が、第１の光学特性（上記の実施形態において形態的な特徴を反映させた光の光学特性）で判別可能な空間解像度に比べて低い空間解像度において判別可能な互いに異なる第２の光学特性（上記の実施形態において蛍光特性）に基づく判別結果とどの程度一致するかに基づいて評価対象フローサイトメータの粒子を判別する性能を評価できるため、当該フローサイトメータの形態の違いを判別する性能を簡便に客観的に評価できる。
　また、上記の実施形態に係る標準粒子懸濁液Ｌ、Ｌａ、Ｌｂ、Ｌｃ、Ｌｄ、Ｌｅ、Ｌｆでは、２種類以上のキャリブレーション粒子（上記の実施形態において粒子１、１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、１ｆ、粒子２、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ、２ｆ、粒子３ｄ、３ｅ、３ｆ、粒子４ｄ、４ｅ、４ｆ、粒子５ｄ、５ｅ、５ｆ）は、互いに略同じである第３の光学特性（上記の実施形態において散乱光強度）をさらに有することがある。
　この構成により、上記の実施形態に係る標準粒子懸濁液Ｌ、Ｌａ、Ｌｂ、Ｌｃ、Ｌｄ、Ｌｅ、Ｌｆでは、評価対象フローサイトメータは第３の光学特性（上記の実施形態において散乱光強度）に基づいてキャリブレーション粒子を判別できない。従って、評価対象フローサイトメータにより２種類以上のキャリブレーション粒子（上記の実施形態において粒子１、１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、１ｆ、粒子２、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ、２ｆ、粒子３ｄ、３ｅ、３ｆ、粒子４ｄ、４ｅ、４ｆ、粒子５ｄ、５ｅ、５ｆ）を判別する際に、空間分解能が低い従来のフローサイトメータが判別できる第３の光学特性（上記の実施形態において散乱光強度）ではなく、従来のフローサイトメータでは互いに区別できない第１の光学特性（上記の実施形態において形態的な特徴を反映させた光の光学特性）に基づいて判別できるのかを確実に評価できる。
　また、上記の実施形態に係る標準粒子懸濁液Ｌ、Ｌａ、Ｌｂ、Ｌｃ、Ｌｄ、Ｌｅ、Ｌｆでは、第３の光学特性とは、キャリブレーション粒子（上記の実施形態において粒子１、１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、１ｆ、粒子２、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ、２ｆ、粒子３ｄ、３ｅ、３ｆ、粒子４ｄ、４ｅ、４ｆ、粒子５ｄ、５ｅ、５ｆ）に照射された光に応じて前記粒子が発する散乱光強度の総量である。
　この構成により、上記の実施形態に係る標準粒子懸濁液Ｌ、Ｌａ、Ｌｂ、Ｌｃ、Ｌｄ、Ｌｅ、Ｌｆでは、散乱光強度の総量に基づいてキャリブレーション粒子を判別できないため、評価対象フローサイトメータにより２種類以上のキャリブレーション粒子（上記の実施形態において粒子１、１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、１ｆ、粒子２、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ、２ｆ、粒子３ｄ、３ｅ、３ｆ、粒子４ｄ、４ｅ、４ｆ、粒子５ｄ、５ｅ、５ｆ）を判別する際に、空間分解能が低い従来のフローサイトメータが判別できる互いに異なる散乱光強度ではなく、第１の光学特性（上記の実施形態において形態的な特徴を反映させた光の光学特性）に基づいて判別できるのかを確実に評価できる。
　また、上記の実施形態に係る標準粒子懸濁液Ｌ、Ｌａ、Ｌｂ、Ｌｃ、Ｌｄ、Ｌｅ、Ｌｆでは、第１の光学特性は、キャリブレーション粒子（上記の実施形態において粒子１、１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、１ｆ、粒子２、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ、２ｆ、粒子３ｄ、３ｅ、３ｆ、粒子４ｄ、４ｅ、４ｆ、粒子５ｄ、５ｅ、５ｆ）について、より高い空間解像度において判別できる形態の違いに由来する光の特性である。より高い空間解像度において判別できる形態由来の光の特性には、例えば、ゴーストサイトメトリー技術に基づいて得られる光信号情報が含まれ、サンプルに構造化した照明を照射した際に検出される散乱光、干渉光、回折光、蛍光等の時系列光信号情報から測定粒子についての情報が直接取得される。本実施形態に係る標準粒子懸濁液Ｌ、Ｌａ、Ｌｂ、Ｌｃ、Ｌｄ、Ｌｅ、Ｌｆは、同様に、サンプルに照射して検出される情報から、画像情報に変換せずにキャリブレーション粒子についての形態情報を直接取り出す技術に対して用いることが可能である。
　この構成により、上記の実施形態に係る標準粒子懸濁液Ｌ、Ｌａ、Ｌｂ、Ｌｃ、Ｌｄ、Ｌｅ、Ｌｆでは、評価対象フローサイトメータのキャリブレーション粒子の形態に基づく判別結果が、前記粒子の形態の違いを判別できる空間解像度と比べて低い空間解像度においても判別可能な互いに異なる第２の光学特性（上記の実施形態において蛍光特性）に基づく判別結果と、どの程度一致するかに基づいて当該評価対象フローサイトメータの形態を判別する性能を評価できるため、評価対象フローサイトメータについて形態を判別する性能を簡便に評価できる。
　また、上記の実施形態に係る標準粒子懸濁液Ｌ、Ｌａ、Ｌｂ、Ｌｃ、Ｌｄ、Ｌｅ、Ｌｆでは、第２の光学特性とは、照射された光に応じてキャリブレーション粒子（上記の実施形態において粒子１、１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、１ｆ、粒子２、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ、２ｆ、粒子３ｄ、３ｅ、３ｆ、粒子４ｄ、４ｅ、４ｆ、粒子５ｄ、５ｅ、５ｆ）が発する蛍光（蛍光特性）の波長及び強度の一方または両方である。
　この構成により、上記の実施形態に係る標準粒子懸濁液Ｌ、Ｌａ、Ｌｂ、Ｌｃ、Ｌｄ、Ｌｅ、Ｌｆでは、評価対象フローサイトメータの第１の光学特性（上記の実施形態においてより高い空間解像度で測定可能な形態情報）に基づく判別結果が、上記第１の光学特性より空間解像度が低い空間解像度でも判別可能な蛍光特性（互いに異なる形態特性を有するキャリブレーション粒子に付与されている互いに異なる蛍光特性）に基づく判別結果と、どの程度一致するかに基づいて当該評価対象フローサイトメータの形態を判別する性能を評価できるため、評価対象フローサイトメータが有する上記第１の光学特性をもとに判別性能を簡便に客観的に評価できる。
（実施例）
　以下では、上記の各実施形態に係る実施例について説明する。
［ビーズ調製方法］
　図１５は、本実施例に係るキャリブレーションビーズの構造の一例を示す図である。本実施例では、上記の実施形態における標準粒子懸濁液Ｌに含まれるキャリブレーションビーズの一例として、アガロースゲルビーズの中に蛍光ポリスチレンビーズを一定数個含有させることで形状に特徴を持たせたキャリブレーションビーズＣ１及びキャリブレーションビーズＣ２を用いる。キャリブレーションビーズＣ１は、粒子内に２つの粒子を有する。キャリブレーションビーズＣ２は、粒子内に１つの粒子を有する。当該キャリブレーションビーズを調製する方法を以下に記載する。
　アガロースゲルビーズの調製に用いるアガロースには、市販の材料を使用することができる。以下の測定に使用されたキャリブレーションビーズＣ１及びキャリブレーションビーズＣ２では、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社のＡｇａｒｏｓｅ　Ｕｌｔｒａ－ｌｏｗ　Ｇｅｌｌｉｎｇ　Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅが使用された。本実施例では、アガロースゲルビーズに包含する蛍光ポリスチレンビーズとして、Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ社製の以下の２種類の蛍光ポリスチレンビーズ含有溶液を用いる。１種類目の蛍光ポリスチレンビーズは、「ＳＰＨＥＲＯＴＭ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ　ＦＨ２０５６－２（Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ，Φ２μｍ，Ｎｉｌｅｒｅｄ）」である。２種類目の蛍光ポリスチレンビーズは、「ＳＰＨＥＲＯＴＭ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ　ＦＬ２０５２－２（Ｌｏｗ－Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ，Φ２μｍ，Ｙｅｌｌｏｗ）」である。なお、アガロースゲルビーズに包含する粒子は他の材料を代用することができる。本実施例では、アガロースゲルビーズに異なる蛍光ポリスチレンビーズを異なる個数包含させることで、形態の異なる２種類のキャリブレーションビーズが調製された。
　キャリブレーション用のアガロースゲルビーズは、Ｗ／Ｏ型（油中水滴型）ドロップレットをフローフォーカシング型マイクロ流体デバイスで生成することによって作成した。より具体的には、界面活性剤と蛍光ポリスチレンビーズとを含むアガロース混合液をシリンジポンプで送液しながら、当該アガロース混合液と界面活性剤入りキャリアオイル（本実施例では、Ｂｉｏ－ｒａｄ社製のＤｒｏｐｌｅｔ　Ｇｅｎｅｒａｔｏｒが使用された）とをマイクロ流路の分岐部において混合した。これによって、アガロース混合液がキャリアオイルをせん断し、表面張力により球状の液滴がキャリアオイル中に生成された。こうしたマイクロ流路技術による油中水滴の生成の作成技術については、例えば、「Ｄｙｎａｍｉｃｓ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ　ｄｒｏｐｌｅｔｓ　（Ｃ．　Ｎ．　Ｂａｒｏｕｄ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｌａｂ　Ｃｈｉｐ，　（２０１０）　１０，　２０３２－２０４５）」に記載される。
　上記方法で生成されたアガロースゲルビーズは、洗浄、ビーズ特性の確認を行った後、ゴーストサイトメトリー技術に基づくフローサイトメータのキャリブレーションビーズとして使用された。ビーズ特性の確認とは、アガロースゲルビーズに含まれる蛍光ビーズの個数、漏れビーズやダブレット粒子の存在比率などの確認である。なお以降に記載される測定例では、図１５に示すキャリブレーションビーズＣ１とキャリブレーションビーズＣ２との２種類のキャリブレーションビーズについての測定例と、それらキャリブレーションビーズＣ１とキャリブレーションビーズＣ２とが１：１の割合で含まれるように調製された標準粒子懸濁液についての測定例とが記載されている。なお、調製された標準粒子懸濁液に含まれるアガロースゲルビーズの平均の粒子サイズは、洗浄前に電子生体顕微鏡（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　社ＥＶＯＳ）により測定した結果、約２０μｍであった。
［ゴーストサイトメトリー技術に基づくフローサイトメータによる標準粒子懸濁液の測定例］
　本実施例では、上記の方法で調製したキャリブレーションビーズＣ１とキャリブレーションビーズＣ２を１：１の割合で混合した標準粒子懸濁液を、ゴーストサイトメトリー技術に基づいて取得した蛍光信号波形を用いて判別した結果を一例として記載する。本実施例では、非特許文献１に記載されているゴーストサイトメトリー技術に基づくフローサイトメータ（以降、フローサイトメータＦＣＭ１と記載する）を使用した。フローサイトメータＦＣＭ１では、４８８ｎｍ波長のレーザー光による照明光を構造化して流路を通過する観測対象物に照射し、観測対象物から発せられる蛍光を検出して取得される時系列の蛍光信号波形をもとに測定対象物の形態的な違いを判別する。一方、フローサイトメータＦＣＭ１は、ゴーストサイトメトリー技術に基づく測定に加え、６３７ｎｍ波長のレーザー光をスポット光として照射して、観測対象物からの散乱光強度や蛍光強度の総量を測定する従来型のフローサイトメータで得られる測定を行うことができる。また、フローサイトメータＦＣＭ１では、構造化照明により検出される時系列の蛍光信号波形の総量（蛍光強度の積算値）が、スポット光を照射して測定した蛍光強度の総量と同じ情報として得ることができる。
　本実施例では、フローサイトメータＦＣＭ１は、上述したゴーストサイトメトリー技術に基づいた蛍光信号波形の検出を波長５２５ｎｍで行った。また、包含されるキャリブレーションビーズについて、スポット光を用いた蛍光強度の総量による検出（検出波長６７６ｎｍ）と、散乱光（ＦＳＣ）強度の総量による検出とを独立した別のチャンネルで行った。
［フローサイトメータＦＣＭ１によるキャリブレーションビーズＣ１とキャリブレーションビーズＣ２の測定例、及び両者を１：１で含む標準粒子懸濁液の測定例］
　図１６は、フローサイトメータＦＣＭ１でスポット光（波長６３７ｎｍ）を用いて標準粒子懸濁液に含まれるキャリブレーションビーズＣ１、キャリブレーションビーズＣ２の散乱特性をそれぞれ測定した結果を示す。グラフＧ１は、キャリブレーションビーズＣ１の散乱特性を測定した結果を示す。グラフＧ２は、キャリブレーションビーズＣ２の散乱特性を測定した結果を示す。キャリブレーションビーズＣ１とキャリブレーションビーズＣ２はＦＳＣ（前方散乱）強度の分布が重複し、ＦＳＣ強度の総量を指標としてキャリブレーションビーズＣ１とキャリブレーションビーズＣ２を判別することは難しいことが示唆された。
　図１７は、キャリブレーションビーズＣ１と、キャリブレーションビーズＣ２について、フローサイトメータＦＣＭ１において、構造化照明を用いた蛍光強度の総量による測定を波長５２５ｎｍにおいて行った結果と、スポット光を用いた蛍光強度の総量による測定を検出波長６７６ｎｍにおいて行った結果とを示す。波長５２５ｎｍは、フローサイトメータＦＣＭ１でゴーストサイトメトリー技術に基づく蛍光信号の検出に利用される波長である。データＨ１は、キャリブレーションビーズＣ１の蛍光強度の総量による測定結果を示す。データＨ２は、キャリブレーションビーズＣ２の蛍光強度の総量による測定結果を示す。
　検出波長６７６ｎｍにおける検出では、キャリブレーションビーズＣ１とキャリブレーションビーズＣ２の蛍光強度の差が検出される。検出された蛍光強度の差は、それぞれのキャリブレーションビーズが異なる蛍光色素を包含していることに起因している。フローサイトメータＦＣＭ１では、このキャリブレーションビーズの相互に異なる蛍光特性に基づいて、学習データに正解付けラベルを付与して機械学習が行われる。
　一方、検出波長５２５ｎｍにおける検出では、蛍光総量では、キャリブレーションビーズＣ１とキャリブレーションビーズＣ２とはほぼ同様の蛍光強度を示した。蛍光総量では２種類のキャリブビーズについてほぼ同様の蛍光強度が示されたことは、波長５２５ｎｍで検出される「蛍光強度の総量」を指標として、標準粒子懸濁液に含まれる２種類のキャリブビーズを判別することが難しいことを示唆している。
　図１８は、フローサイトメータＦＣＭ１でゴーストサイトメトリー技術に基づいて、標準粒子懸濁液に含まれるキャリブレーションビーズＣ１とキャリブレーションビーズＣ２とを判別した結果を示す。グラフＪ１は、キャリブレーションビーズＣ１を機械学習により作成したモデルを用いて判別した場合の結果（スコアの分布）を示す。グラフＪ２は、キャリブレーションビーズＣ２を機械学習により作成したモデルを用いて判別した結果（スコアの分布）を示す。
　図１８に示す通り、キャリブレーションビーズＣ１の粒子内に２つの粒子を有する構造と、キャリブレーションビーズＣ２の粒子内に１つの粒子を有する構造とは、ゴーストサイトメトリー技術に基づいて良好に判別することができている。図１７に示したように標準粒子懸濁液に含まれる２種類のキャリブビーズは波長５２５ｎｍで検出される蛍光強度がほぼ等しく、「蛍光強度の総量」を指標として両者を判別することは難しい。従ってこの結果は、ゴーストサイトメトリー技術に基づいた判別が、標準粒子懸濁液に混在して含まれるキャリブレーションビーズＣ１とキャリブレーションビーズＣ２との「形態の差」を認識できていることを示唆している。
　以上、図面を参照してこの発明の一実施形態について詳しく説明してきたが、具体的な構成は上述のものに限られることはなく、この発明の要旨を逸脱しない範囲内において様々な設計変更等をすることが可能である。
Ｌ、Ｌａ、Ｌｂ、Ｌｃ、Ｌｄ、Ｌｅ、Ｌｆ…標準粒子懸濁液、１、１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、１ｆ、２、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ、２ｆ、３ｄ、３ｅ、３ｆ、４ｄ、４ｅ、４ｆ、５ｄ、５ｅ、５ｆ…粒子（キャリブレーション粒子）

Claims (14)

  1. 　互いに形態が異なる２種類以上のキャリブレーション粒子を組み合わせて使用するフローサイトメータの性能を評価する方法で、
    　評価対象のフローサイトメータが第１の光学特性に基づいて前記キャリブレーション粒子を互いに判別する第１判別ステップと、
    　前記第１の光学特性が判別可能な空間解像度に比べて低い空間解像度において判別可能な第２の光学特性に基づいて前記キャリブレーション粒子を互いに判別する第２判別ステップと、
    　前記第１判別ステップによって判別した第１の判別結果と、前記第２判別ステップによって判別した第２の判別結果とに基づいて前記フローサイトメータの粒子判別性能、及び分解能の一方または両方を評価する評価ステップと、
    　を有するフローサイトメータ性能評価方法。
  2. 　前記２種類以上のキャリブレーション粒子を、前記２種類以上のキャリブレーション粒子の組み合せが予め混合されて標準粒子懸濁液に包含される態様で使用する
    　請求項１に記載のフローサイトメータ性能評価方法。
  3. 　前記フローサイトメータが、前記第１の光学特性に基づき取得した光信号の時系列波形情報から、前記キャリブレーション粒子の２次元画像を介さず、前記キャリブレーション粒子を直接判別するフローサイトメータである
    　請求項１記載のフローサイトメータ性能評価方法。
  4. 　前記フローサイトメータが、ゴーストサイトメトリー技術に基づくフローサイトメータであり、
    　前記第１の光学特性として検出される光信号に反映される形態情報に基づいて前記キャリブレーション粒子が判別される
    　請求項３に記載のフローサイトメータ性能評価方法。
  5. 　２種類以上のキャリブレーション粒子を組み合わせて含むフローサイトメータの性能を評価するための標準粒子懸濁液であり、
    　前記２種類以上のキャリブレーション粒子は、第１の光学特性が互いに異なっており、且つ、前記第１の光学特性が判別可能な空間解像度に比べて低い空間解像度においても判別可能な第２の光学特性が互いに異なっている標準粒子懸濁液。
  6. 　前記２種類以上のキャリブレーション粒子は、互いに略同じである第３の光学特性をさらに有する
    　請求項５に記載の標準粒子懸濁液。
  7. 　前記第３の光学特性とは、前記キャリブレーション粒子に照射された光に応じて前記キャリブレーション粒子が発する散乱光の強度である
    　請求項６に記載の標準粒子懸濁液。
  8. 　前記第１の光学特性が、前記キャリブレーション粒子の形態についての特性である
    　請求項５から請求項７のいずれか一項に記載の標準粒子懸濁液。
  9. 　前記第２の光学特性が、照射された光に応じて前記キャリブレーション粒子が発する蛍光の波長及び強度の一方または両方である
    　請求項５から請求項８のいずれか一項に記載の標準粒子懸濁液。
  10. 　前記キャリブレーション粒子の前記標準粒子懸濁液に対する比重が１から所定の範囲である
    　請求項５から請求項９のいずれか一項に記載の標準粒子懸濁液。
  11. 　前記キャリブレーション粒子のサイズが０．１μｍ以上かつ１００μｍ以下である
    　請求項５から請求項１０のいずれか一項に記載の標準粒子懸濁液。
  12. 　前記キャリブレーション粒子がアガロースゲル（Ａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｌ）、ポリエチレングリコール（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ）、ポリスチレン（Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）を含む材料により構成される
    　請求項５から請求項１１のいずれか一項に記載の標準粒子懸濁液。
  13. 　評価対象のフローサイトメータが、前記第１の光学特性に基づき取得した光信号の時系列波形情報から、前記キャリブレーション粒子の２次元画像を介さず、前記キャリブレーション粒子を直接判別するフローサイトメータである
    　請求項５に記載の標準粒子懸濁液。
  14. 　前記フローサイトメータが、ゴーストサイトメトリー技術に基づくフローサイトメータであり、前記第１の光学特性として検出される光信号に反映される形態情報に基づいて前記キャリブレーション粒子が判別される
    　請求項１３に記載の標準粒子懸濁液。
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