JP2014149196A

JP2014149196A - 単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム

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Publication number: JP2014149196A
Application number: JP2013017254A
Authority: JP
Inventors: Tetsuya Tanabe; 哲也田邊; Hiroyuki Taki; 弘幸瀧
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2013-01-31
Filing date: 2013-01-31
Publication date: 2014-08-21

Abstract

【課題】共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡による光計測を用いた走査分子計数法に於いて、試料容器の壁の表面上に付着した汚染物質又は異物の光の信号の少なくとも一部を排除する手法を提供すること。
【解決手段】本発明による試料溶液中の発光粒子の光を検出する光分析技術は、試料溶液内に於いて顕微鏡の光検出領域の位置を所定の経路に沿って複数回周回移動させながら検出された光検出領域からの光の時系列光強度データを生成し、所定の経路上の同一の領域に対応する時系列光強度データの光強度値の特徴量を所定の経路上の領域毎に算出し、特徴量に基づいて不動の発光体が存在すると判定された時系列光強度データの領域のデータをエラー領域として判定し、エラー領域を除く時系列の光強度データに於いて発光粒子の各々からの光を表す信号の特徴を有する信号を個別に検出する。
【選択図】図３

Description

本発明は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はこれらの凝集体（以下、これらを「粒子」と称する。）、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の対象物、或いは、非生物学的な粒子からの光を検出して、それらの状態（相互作用、結合・解離状態など）の分析又は解析に於いて有用な情報を取得することが可能な光分析技術に係り、より詳細には、上記の如き光学系を用いて単一の発光する粒子からの光を個別に検出して種々の光分析を可能にする光分析装置、光分析方法並びに光分析用コンピュータプログラムに係る。なお、本明細書に於いて、光を発する粒子（以下、「発光粒子」と称する。）は、それ自身が光を発する粒子、又は、任意の発光標識若しくは発光プローブが付加された粒子のいずれであってもよく、発光粒子から発せられる光は、蛍光、りん光、化学発光、生物発光、散乱光等であってよい。

近年の光計測技術の発展により、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）も可能な超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出・測定が可能となっている。そこで、そのような微弱光の計測技術を用いて、生体分子等の特性、分子間相互作用又は結合・解離反応の検出を行う光分析技術が種々提案されている。そのような光分析技術としては、例えば、蛍光相関分光分析（Fluorescence Correlation Spectroscopy：ＦＣＳ。例えば、特許文献１−３参照）、蛍光強度分布分析(Fluorescence-Intensity Distribution Analysis：ＦＩＤＡ。例えば、特許文献４)やフォトンカウンティングヒストグラム（Photon Counting Histogram：ＰＣＨ。例えば、特許文献５）などが知られている。また、特許文献６〜８には、共焦点顕微鏡の光学系を用いて計測される試料溶液の蛍光信号の時間経過に基づいて蛍光性物質を検出する方法が提案されている。

更に、本願出願人は、特許文献９〜１１に於いて、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いた光分析技術であって、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術とは異なる原理による新規な光分析技術を提案した。かかる新規な光分析技術（以下、「走査分子計数法」と称する。）では、試料溶液内に於いて光の検出領域である微小領域（以下、「光検出領域」と称する。励起光が使用される場合には、励起光の集光領域に概ね一致する。）の位置を移動させながら、即ち、光検出領域により試料溶液内を走査しながら、光検出領域が試料溶液中に分散してランダムに運動する発光粒子を包含したときに、その発光粒子から発せられる光を個別に検出し、これにより、試料溶液中の発光粒子を一つずつ検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得が可能となる。

特開２００５−０９８８７６特開２００８−２９２３７１特開２００９−２８１８３１特許第４０２３５２３号国際公開２００８−０８０４１７特開２００７−２０５６５特開２００８−１１６４４０特開平４−３３７４４６号公報国際公開第２０１１／１０８３６９国際公開第２０１１／１０８３７０国際公開第２０１１／１０８３７１

上記の走査分子計数法に於いては、既に触れた如く、典型的には、走査型光学顕微鏡の対物レンズの先端の前方に置かれた容器内の試料溶液中にて光検出領域の位置を移動させながら、発光粒子からの光の強度の測定が行われる。従って、対物レンズの光の入出端面と光検出領域との間の光路は、試料容器の壁（底面、頂面若しくは側面）を通過することとなる。その場合、試料容器の壁の表面上に塵や埃などの汚染物質が付着していると、かかる汚染物質からの蛍光や散乱光が対物レンズへ入射して光検出器により検出され、光強度の時系列の計測データ（時系列光強度データ）上に信号として現れてしまうことがある。時系列光強度データ上に於いて、汚染物質からの光を表す信号（ノイズ信号）は、多くの場合、観測されるべき発光粒子の光の信号とは、プロファイル等の特性が異なるので、時系列光強度データ上から発光粒子の信号を抽出する処理過程に於いて排除される。しかしながら、汚染物質由来のノイズ信号の一部には、発光粒子の信号と区別のつきにくい信号も存在し、そのようなノイズ信号は、誤って発光粒子の信号として認識されてしまい、その結果、検出結果の精度を悪化させることと成り得る。

かくして、本発明の主な課題は、走査分子計数法に於いて試料容器の壁の表面上に付着した汚染物質の光の信号の少なくとも一部を排除できる手法を提供することである。

この点に関し、本発明の発明者は、光検出領域が或る経路を周回する場合には、試料容器の壁の表面上に固着した汚染物質の一部については、光検出領域が、かかる汚染物質の存在領域を通過する度に、その光が検出されるので、時系列光強度データ上では、周期的にノイズ信号が生ずる点に着目し、時系列光強度データ上に於いて周期的に常に出現する信号は、ノイズ信号である可能性が高く、かかる周期的に出現する信号を選択的に検出することにより、ノイズ信号の除去が可能であることを見出した。かかる知見は本発明に於いて利用される。

本発明の一つの態様によれば、上記の課題は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析装置であって、試料溶液内に於ける顕微鏡の光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、光検出領域からの光を検出する光検出部と、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を所定の経路に沿って複数回周回移動させながら光検出部にて検出された光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、時系列の光強度データに於いて発光粒子の各々からの光を表す信号の特徴を有する信号を個別に検出する信号処理部とを含み、信号処理部に於いて、発光粒子の各々からの光を表す信号の特徴を有する信号を個別に検出する処理に先立って、所定の経路上の同一の領域に対応する時系列の光強度データの光強度値の特徴量が所定の経路上の領域毎に算出され、特徴量に基づいて不動の発光体が存在するか否かが判定され、不動の発光体が存在すると判定された時系列の光強度データの領域のデータがエラー領域として判定され、エラー領域を除く時系列の光強度データに於いて発光粒子の各々からの光を表す信号の特徴を有する信号を個別に検出することを特徴とする装置によって達成される。

かかる構成に於いて、「試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子」とは、試料溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はそれらの凝集体などの、光を発する粒子であって、基板などに固定されず、溶液中を自由にブラウン運動している粒子であれば任意の粒子であってよい。かかる発光粒子は、典型的には、蛍光性粒子であるが、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する粒子であってもよい。共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、それらの顕微鏡に於いて光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する（共焦点顕微鏡に於いては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。発光粒子が照明光なしで発光する場合、例えば、化学発光又は生物発光により発光する粒子の場合には、顕微鏡に於いて照明光は要しない。）。また、典型的には、光検出部は、所定の計測単位時間（ビンタイム）毎に到来する光子数を計数するフォトンカウンティングにより光検出領域からの光を検出し、その場合、時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータとなる。なお、本明細書に於いて、「発光粒子の信号」という場合には、特に断らない限り、発光粒子からの光を表す信号を指すものとする。

上記から理解される如く、本発明の基本的な構成である走査分子計数法に於いては、まず、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動しながら、即ち、試料溶液内を光検出領域により走査しながら、逐次的に、光の検出が行われる。そうすると、試料溶液内にて移動する光検出領域が、ランダムに運動している発光粒子を包含したときには、発光粒子からの光が検出され、これにより、一つの発光粒子の存在が検出される。従って、逐次的に検出された光に於いて発光粒子からの光の信号を個別に検出して、これにより、粒子の存在を一つずつ個別に逐次的に検出し、粒子の溶液内での状態に関する種々の情報が取得されることとなる。かかる構成に於いて、既に述べた如く、対物レンズの光の入出端面と光検出領域との間の光路が通過する試料容器の壁に塵、埃、汚れ等の異物が存在し、かかる異物が光を発する場合には、時系列光強度データ上に異物からの光を表す信号が出現することとなる。かかる異物の光の信号は、その多くは、発光粒子の信号とは異なる特徴を有しているので、時系列光強度データ上にて発光粒子の信号の特徴、特に、信号のプロファイル（光強度の時間変化）を有する信号を検出する場合にノイズ信号として判定され、除外されるが、発光粒子の信号の特徴と良く似た特徴を有する信号は、異物の光の信号であっても、発光粒子の信号として誤判定され得ることとなる。しかしながら、そのような場合であっても、上記の如き異物は、試料容器の壁に付着し不動であるので、異物の光の信号は、光検出領域の移動に伴って光路が異物の位置と重なる度に発生する。従って、光検出領域の位置を所定の経路に沿って複数回周回移動させる場合、異物の光の信号は、光検出領域の位置の移動周期毎に常に発生することとなるので、かかる状態を捉えれば、異物の光の信号の存在領域の検出が可能となる。そこで、本発明の信号処理部は、上記の如く、発光粒子の各々からの光を表す信号の特徴を有する信号を個別に検出する処理に先立って、まず、所定の経路上の同一の領域に対応する時系列の光強度データの光強度値の特徴量を所定の経路上の領域毎に算出する。そして、かかる特徴量に基づいて不動の発光体、即ち、試料容器の壁に塵、埃、汚れ等の異物が存在するか否かを判定し、不動の発光体が存在すると判定された時系列の光強度データの領域のデータをエラー領域として判定し、これにより、エラー領域を除く時系列の光強度データに於いて発光粒子の各々からの光を表す信号の特徴を有する信号を個別に検出できることとなる。

なお、上記の構成に於いて、「所定の経路上の同一の領域に対応する時系列の光強度データの光強度値の特徴量」とは、所定の経路上の各領域について、光検出領域がその領域を通過する毎に常に有意な光が検出されているか否か、換言すると、時系列の光強度データに於いて、光検出領域の位置の移動周期毎に有意な光が発生しているか否かを判定可能な任意の量であってよい。即ち、光検出領域が所定の経路を複数回周回して光強度値の検出を行う場合、得られた時系列の光強度データは、光検出領域の所定の経路上の周回毎に得られた時系列の光強度データが複数個連結して構成されたデータであり、各周回に対応する時系列の光強度データ上の各領域は、所定の経路の各位置領域に対応し、所定の経路の位置領域の各々に於ける光強度値は、全体の時系列の光強度データ上に於いて光検出領域の位置の移動周期毎に出現する。上記の「特徴量」は、上記の如き時系列の光強度データの構成に於いて、時系列の光強度データ上に於ける所定の経路上の或る領域に対応する（複数個の）光強度値を参照して算出される、その領域に常に有意な光が発生しているか否かを示す指標値であり、所定の経路に沿った各領域に対応した時系列の光強度データ上の領域のそれぞれに対して算出される。

かかる特徴量は、具体的には、一つの態様に於いて、所定の経路上の同一の領域に対応する時系列の光強度データの光強度値の総計値又は平均値であってよい。即ち、かかる総計値又は平均値が所定の閾値を越えて高いときには、光検出領域の位置が、対応する領域を通過する毎に常に有意な光が検出されていることとなるので、かかる総計値又は平均値が所定の閾値を越えて高い領域は、異物の光の発生領域、即ち、エラー領域として判定することができる。

また、別の態様として、上記の特徴量は、所定の経路上の同一の領域に対応する時系列の光強度データの光強度値の「偏り値」であってもよい。かかる「偏り値」とは、所定の経路に於ける或る領域に於いて検出されている光の集中の程度を表す値である。異物が存在していない通常の領域に於いては、発光粒子からの微弱光が検出される程度であるので、その領域内に於いて光が検出される部分が極度に集中することはない。しかしながら、異物が存在している領域に於いては、その領域内に於いて光が検出される部分が異物の存在位置に極度に集中することとなり、その結果、その領域内に於ける光の検出されている部分に大きな「むら」が生ずる。「偏り値」は、かかる領域内の光の検出されている部分の「むら」の程度の大きさの指標値である。そして、所定の経路上に於いて「偏り値」の表すむらが常に大きい領域には、光を発する異物が存在すると判定できることとなる。「偏り値」としては、具体的には、例えば、各領域内の平均光強度値からの光強度値の差の二乗値の積算値、平均光強度値を期待値とし且つ光強度値を観測値とした場合のカイ二乗検定のｐ値の積算値、所定の閉じた経路上に於いて検出された光強度値の重心位置と所定の閉じた経路の中心位置との距離などが用いることができる。

ところで、上記の如き所定の経路を複数回周回して得られた時系列の光強度データに於いて、各周回の時系列光強度データを所定の経路上の位置領域に対応して正確に整合することが達成されない場合がある。即ち、装置上の機械誤差等の要因により、時系列光強度データ上の時間が、所定の経路上の位置に正確に対応させることが困難であり、全周回の時系列の光強度データを各周回の時系列の光強度データに分割した場合、各周回の時系列の光強度データの始点又は終点に対応する所定の経路上の位置が互いにずれている場合がある。その場合、所定の経路の或る領域に対応する時系列光強度データ上の領域の特徴量の算出のために、かかる所定の経路の或る領域に対応する時系列光強度データ上の領域の光強度値を精度よく選択することが困難と成り得る。そこで、そのような場合には、上記特徴量の算出の前に、各周回の時系列光強度データに於ける所定の経路上での位置に対応する時間のずれが補正されるようになっていてよい。具体的には、異物の光が存在する場合には、時系列光強度データ上で周期的に異物の光が検出されることとなるので、かかる異物の光の存在領域の時間を基準にして、各周回の時系列光強度データの間での所定の経路上に於ける位置に対応する時間のずれの大きさが算出され、そのずれがなくなるように、各周回の時系列光強度データの時間軸の修正が為されてよい。

上記の如きエラー領域の検出が為された後の本発明の装置の信号処理部に於ける発光粒子の信号の個別検出に於いては、エラー領域を除去した時系列光強度データ上で発光粒子の信号が検出される。時系列光強度データ上での発光粒子の信号の特徴は、典型的は、或る程度以上の強度を有する釣鐘型のパルス状となっている点であるので、時系列光強度データ上に於いて、所定閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号が単一の発光粒子からの光を表す信号の特徴を有する信号として検出されるよう構成されていてよい。この点に関し、単一の発光粒子からの光の強度は、非常に微弱であり、一つの発光粒子が、蛍光一分子又は数分子などである場合、発光粒子の発する光は確率的に放出されるものであり、微小な時間に於いて信号の値の欠落が生じる可能性がある。そして、そのような欠落が生ずると、一つの発光粒子の存在に対応する信号の特定が困難となる。そこで、信号処理部は、時系列の光強度データを平滑化し、微小な時間に於ける信号値の欠落を無視できるようにデータを加工した後、平滑化された時系列光強度データに於いて所定閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号を単一の発光粒子からの光を表す信号の特徴を有する信号として検出するよう構成されていてよい。

更に、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度が、発光粒子のブラウン運動による移動速度よりも遅い場合、発光粒子のブラウン運動によるよりランダムな動きにより、複数回、光検出領域を出入りする場合には、１つの発光粒子から複数回、（発光粒子の存在を表す）信号が検出されてしまい、検出された信号と１つの発光粒子の存在とを対応させることが困難となる。そこで、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、好適には、検出対象となる発光粒子の拡散移動速度（ブラウン運動による粒子の平均の移動速度）よりも高く設定される。しかしながら、一方、発光粒子が拡散により光検出領域の大きさよりも長い距離移動する時間よりも光検出領域の位置の移動周期が短くなるほど光検出領域の位置の移動速度が速い場合、同一の発光粒子が光検出領域の位置の移動周期毎に複数回光検出領域内へ進入して、検出され易くなることにより、やはり、検出された信号と１つの発光粒子の存在とを対応させることが困難となると共に、試料容器に対して不動の異物からの信号との区別がつき難くなる。そこで、本発明の装置に於いて、好適には、光検出領域の位置の移動速度が発光粒子の拡散移動速度よりも速い値に設定され、光検出領域の位置の移動周期が発光粒子が拡散により前記光検出領域の大きさよりも長い距離移動する時間よりも長い値に設定されてよい。

試料溶液内での光検出領域の位置の移動は、任意の方式で為されてよい。例えば、レーザー走査型光学顕微鏡に於いて採用されているガルバノミラーを用いるなどして、顕微鏡の光学系の光路を変更して光検出領域の位置が変更されるようになっていてよく、或いは、試料溶液の位置を（例えば、顕微鏡のステージを移動するなどして）動かして、光検出領域の試料溶液内に於ける位置を移動するようになっていてよい。光検出領域の位置の移動経路は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線、曲線及びこれらの組合せのうちから選択可能であってよい。

上記の本発明の実施の態様の一つに於いては、発光粒子の信号の数を計数して光検出領域に包含された発光粒子の数を計数するようになっていてよい（粒子のカウンティング）。その場合、検出された発光粒子の数と光検出領域の位置の移動量と組み合わせることにより、試料溶液中の同定された発光粒子の数密度又は濃度に関する情報が得られることとなる。具体的には、例えば、複数の試料溶液の数密度若しくは濃度の比、或いは、濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比が算出されるか、又は、濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比を用いて、絶対的な数密度値又は濃度値が決定されてよい。或いは、任意の手法により、例えば、所定の速度にて光検出領域の位置を移動するなどして、光検出領域の位置の移動経路の全体積を特定すれば、発光粒子の数密度又は濃度が具体的に算定できることとなる。

上記の本発明の装置に於いて試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら光検出を行い、個々の発光粒子からの信号を個別に検出する光分析技術であって、所定の経路上の同一の領域に対応する時系列の光強度データの光強度値の特徴量に基づいて不動の発光体が存在するか否かが判定され、不動の発光体が存在すると判定された時系列の光強度データの領域のデータがエラー領域として判定される光分析技術の処理は、汎用のコンピュータによっても実現可能である。従って、本発明のもう一つの態様によれば、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出するための光分析用コンピュータプログラムであって、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を所定の経路に沿って複数回周回移動する手順と、試料溶液内に於ける前記光検出領域の位置を周回移動させながら光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順と、所定の経路上の同一の領域に対応する時系列の光強度データの光強度値の特徴量を所定の経路上の領域毎に算出し、特徴量に基づいて不動の発光体が存在するか否かを判定し、不動の発光体が存在すると判定された時系列の光強度データの領域のデータをエラー領域として判定する手順と、エラー領域を除く時系列の光強度データに於いて発光粒子の各々からの光を表す信号の特徴を有する信号を個別に検出する手順とをコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラムが提供される。

かかる構成に於いても、特徴量は、所定の経路上の位置又は領域に対応する時系列の光強度データの光強度値の総計値、平均値又は偏り値であってよい。また、特徴量の算出に先立って、所定の経路上の各周回に対応する時系列の光強度データの各々の間に於ける所定の経路上での位置に対応する時間のずれの大きさが時系列の光強度データに於ける光強度値に基づいて決定され、ずれが補正された状態で特徴量の算出が実行されてよい。更に、光検出領域の位置の移動速度が発光粒子の拡散移動速度よりも速い値に設定され、光検出領域の位置の移動周期が発光粒子が拡散により光検出領域の大きさよりも長い距離移動する時間よりも長い値に設定されてよい。光検出領域の位置の移動経路は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線及びこれらの組合せのうちから選択可能であってよい。

また、上記のコンピュータプログラムに於いても、時系列光強度データ上に於いて、所定閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号が単一の発光粒子からの光を表す信号の特徴を有する信号として検出するよう構成されていてよく、時系列の光強度データが平滑化され、平滑化された時系列光強度データに於いて所定閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号が単一の発光粒子からの光を表す信号の特徴を有する信号として検出されるよう構成されていてよい。更に、上記のコンピュータプログラムに於いても、個別に検出された発光粒子からの信号の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された発光粒子の数を計数する手順及び／又は検出された発光粒子の数に基づいて、試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する手順が含まれていてよい。

上記の本発明の装置又はコンピュータプログラムによれば、試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら光検出を行い、個々の発光粒子からの信号を個別に検出する光分析方法であって、所定の経路上の同一の領域に対応する時系列の光強度データの光強度値の特徴量に基づいて不動の発光体が存在するか否かが判定され、不動の発光体が存在すると判定された時系列の光強度データの領域のデータがエラー領域として判定される新規な方法が実現される。かくして、本発明によれば、更に、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析方法であって、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を所定の経路に沿って複数回周回移動する過程と、試料溶液内に於ける光検出領域の位置を周回移動させながら光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する過程と、所定の経路上の同一の領域に対応する時系列の光強度データの光強度値の特徴量を所定の経路上の領域毎に算出し、特徴量に基づいて不動の発光体が存在するか否かを判定し、不動の発光体が存在すると判定された時系列の光強度データの領域のデータをエラー領域として判定する過程と、エラー領域を除く時系列の光強度データに於いて前記発光粒子の各々からの光を表す信号の特徴を有する信号を個別に検出する過程とを含むことを特徴とする方法が提供される。

また、上記の方法に於いても、時系列光強度データ上に於いて、所定閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号が単一の発光粒子からの光を表す信号の特徴を有する信号として検出するよう構成されていてよく、時系列の光強度データが平滑化され、平滑化された時系列光強度データに於いて所定閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号が単一の発光粒子からの光を表す信号の特徴を有する信号として検出されるよう構成されていてよい。更に、上記のコンピュータプログラムに於いても、個別に検出された発光粒子からの信号の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された発光粒子の数を計数する手順及び／又は検出された発光粒子の数に基づいて、試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する過程が含まれていてよい。

上記の本発明の光分析技術は、典型的には、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物の溶液中の状態の分析又は解析の用途に用いられるが、非生物学的な粒子（例えば、原子、分子、ミセル、金属コロイドなど）の溶液中の状態の分析又は解析に用いられてもよく、そのような場合も本発明の範囲に属することは理解されるべきである。

かくして、本発明によれば、走査分子計数法に於いて試料容器の壁の表面上に付着した汚染物質又は異物の光の信号であって、発光粒子の信号の特徴を有する信号を排除することが可能となる。かかる構成によれば、光強度データ上に於いて試料容器の壁上で不動の異物の影響を低減できることとなるので、試料容器の壁の近傍で光検出領域による走査をする場合に異物の信号と発光粒子の信号との区別がつき難いという問題が解消又は軽減され、検出結果の精度の向上が期待される。また、これにより、検査前の試料容器の洗浄の負担の軽減も期待される。

本発明のその他の目的及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。

図１（Ａ）は、本発明による走査分子計数法を実行する光分析装置の内部構造の模式図である。図１（Ｂ）は、コンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の観察領域）の模式図である。図１（Ｃ）は、ミラー７の向きを変更して試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。図１（Ｄ）は、マイクロプレートの水平方向位置を移動して試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。図２（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、本発明が適用される走査分子計数法に於ける光検出の原理を説明する模式図及び計測される光強度の時間変化の模式図である。図２（Ｃ）は、本発明に於ける光学系の光路を変更することによる走査軌道に沿った光検出領域の位置の移動の態様を説明する図である。図２（Ｄ）は、試料溶液の位置の移動の態様を説明する図である。図３（Ａ）は、光検出領域の所定の経路を周期Ｔｓにて周回する場合に試料容器の壁に異物が付着しているときに得られる時系列光強度データの模式図である。図中、Ｉ、II、III…は、周回の回数を示している。図３（Ｂ）は、光検出領域の移動経路（ＣＶ経路）が異物を繰り返し通過する状態の模式図である。図３（Ｃ）は、時系列光強度データを光検出領域の周回毎に分割された状態の時系列光強度データの模式図である。図３（Ｄ）は、光検出領域の移動経路に沿って周回毎に分割された時系列光強度データを重ね合わせた状態の模式図である。図３（Ｅ）は、光検出領域の寸法と発光粒子のブラウン運動による（光検出領域の一周期当たりの）変位との関係を説明する光検出領域の模式図である。図４は、本発明に従って実行される走査分子計数法の処理手順をフローチャートの形式で表した図である。図５は、光検出領域の周回毎に分割された状態の時系列光強度データに於いて、装置の機械精度等の要因によって、時系列光強度データの時間に対応する光検出領域の移動経路の位置にずれが生じている状態の模式図である。図６は、本発明に於けるエラー領域の除去処理の第一の実施形態を説明する図である。（Ａ）は、光検出領域の周回毎に分割された状態の時系列光強度データに於いて、基準データ（上段）の時間に対して、別のデータ（下段）の対応する時間をずらしながら、基準データと別のデータとに於ける時系列の光強度値の相関係数値を算出する処理を説明する図である。（Ｂ）は、基準データの時間に対する別のデータのずれ時間（シフト時間）に対する基準データと別のデータとの相関係数値の変化を模式的に示した図である。（Ｃ）は、エラー領域の除去処理の第一の実施形態の手順をフローチャートの形式で表した図である。図７は、本発明に於けるエラー領域の除去処理の第二の実施形態を説明する図である。（Ａ）は、光検出領域の周回毎に分割された状態の時系列光強度データに於いて、二値化された基準データ（上段）の時間に対して、二値化された別のデータ（下段）の対応する時間をずらしながら、基準データと別のデータとに於ける時系列の二値化された光強度値の論理積の積算値を算出する処理を説明する図である。（Ｂ）は、基準データの時間に対する別のデータのずれ時間（シフト時間）に対する算出された論理積積算値の変化を模式的に示した図である。（Ｃ）は、エラー領域の除去処理の第二の実施形態の手順をフローチャートの形式で表した図である。図８は、本発明に於けるエラー領域の除去処理の第三の実施形態を説明する図である。（Ａ）は、光検出領域の周回毎に分割された状態の時系列光強度データ（Ｉ、II、III）に於ける光強度値と、時系列光強度データの区間（領域）１〜７のそれぞれに於いて算出される偏り値とを示している。（Ｂ）は、光検出領域の移動経路のうちの或る閉じた区間の模式図に於いて、かかる区間に沿って、計測された光強度値を重ねた状態を示している。中心は、閉じた区間の経路の中心であり、重心は、光強度値の重心である。（Ｃ）は、エラー領域の除去処理の第三の実施形態の手順をフローチャートの形式で表した図である。図９（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、発光粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合及び試料溶液内の光検出領域の位置を発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより発光粒子が光検出領域を横切る場合の粒子の運動の態様を表すモデル図である。図９（Ｃ）は、走査分子計数法に従って、計測された時系列光強度データ（フォトンカウントの時間変化）から発光粒子の存在を検出するための処理手順に於ける検出信号の信号処理過程の例を説明する図である。図１０は、計測されたフォトンカウントデータの実測例（棒グラフ）と、データをスムージングして得られる曲線（点線）と、パルス存在領域にてフィッティングされたガウス関数（実線）を示している。図中、「ノイズ」と付された信号は、ノイズ又は異物による信号であるとして無視される。図１１（Ａ）は、図１１（Ｂ）に模式的に描かれている如く光検出領域の位置を移動させた際に得られた時系列光強度データの全体図（左上）と、その一部の拡大図（右下）である。図１１（Ｃ）は、本発明のエラー領域の除去処理の第二の実施形態に従って、光検出領域の周回毎に分割された状態の時系列光強度データに於いて、二値化された基準データの時間に対して、二値化された別のデータの対応する時間をずらしながら算出された基準データと別のデータとに於ける時系列の二値化された光強度値の論理積積算値を基準データと別のデータとの間に於いてずらした時間（シフト時間）に対してプロットしたグラフ図であり、図１１（Ｄ）は、その一部の拡大図である。図１２（Ａ）は、本発明のエラー領域の除去処理の第二の実施形態に従って、エラー領域と判定された領域が濃く示されている時系列光強度データの例を示している。図１２（Ｂ）は、各試料容器（ウェルＡ〜Ｆ）に於ける検出粒子数を示している。「処理なし」は、エラー領域の除去処理を行っていないデータに於ける検出粒子数であり、「処理あり」は、第二の実施形態に従ったエラー領域の除去処理を行ったデータに於ける検出粒子数である。図１３は、各試料容器（ウェルＡ〜Ｆ）に於ける検出粒子数を示している。「処理なし」は、エラー領域の除去処理を行っていないデータに於ける検出粒子数であり、「処理あり」は、相関係数を用いてずれ補正を行う第一の実施形態に従ったエラー領域の除去処理を行ったデータに於ける検出粒子数である。図１４（Ａ）は、時系列光強度データの一部に於ける区間毎の光強度の平均値及び偏り値の例を示している。図１４（Ｂ）は、（Ａ）に対応する時系列光強度データの各区間に於ける光強度の偏り値を、対応する区間の光強度の平均値に対してプロットした図である。図１５（Ａ）は、本発明のエラー領域の除去処理の第三の実施形態に従って、エラー領域と判定された領域が濃く示されている時系列光強度データの例を示している。図１５（Ｂ）は、各試料容器（ウェルＡ〜Ｆ）に於ける検出粒子数を示している。「処理なし」は、エラー領域の除去処理を行っていないデータに於ける検出粒子数であり、「処理あり」は、第三の実施形態に従ったエラー領域の除去処理を行ったデータに於ける検出粒子数である。

１…光分析装置（共焦点顕微鏡）
２…光源
３…シングルモードオプティカルファイバー
４…コリメータレンズ
５…ダイクロイックミラー
６、７、１１…反射ミラー
８…対物レンズ
９…マイクロプレート
１０…ウェル（試料溶液容器）
１２…コンデンサーレンズ
１３…ピンホール
１４…バリアフィルター
１４ａ…ダイクロイックミラー又は偏光ビームスプリッタ
１５…マルチモードオプティカルファイバー
１６…光検出器
１７…ミラー偏向器
１７ａ…ステージ位置変更装置
１８…コンピュータ

以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。

光分析装置の構成
本発明による光分析技術を実現する光分析装置は、基本的な構成に於いて、図１（Ａ）に模式的に例示されている如き、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる装置であってよい。同図を参照して、光分析装置１は、光学系２〜１７と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ１８とから構成される。光分析装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザー光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端に於いて固有のＮＡにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター４によって平行光となり、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。対物レンズ８の上方には、典型的には、１〜数十μＬの試料溶液が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置されており、対物レンズ８から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル１０内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。試料溶液中には、観測対象物である発光粒子、典型的には、蛍光性粒子又は蛍光色素等の発光標識が付加された粒子が分散又は溶解されており、かかる発光粒子が励起領域に進入すると、その間、発光粒子が励起され光が放出される。放出された光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサーレンズ１２にて集光され、ピンホール１３を通過し、バリアフィルター１４を透過して（ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。）、マルチモードファイバー１５に導入されて、光検出器１６に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ１８へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。なお、当業者に於いて知られている如く、上記の構成に於いて、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図１（Ｂ）に模式的に示されている如きレーザー光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール１３を通過し、励起領域以外からの光は遮断される。図１（Ｂ）に例示されたレーザー光の焦点領域は、通常、１〜１０ｆＬ程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり（典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス様分布となる。実効体積は、光強度が中心光強度の１／ｅ^２となる面を境界とする略楕円球体の体積である。）、コンフォーカル・ボリュームと称される。また、本発明では、１つの発光粒子からの光、例えば、一つの蛍光色素分子からの微弱光が検出されるので、光検出器１６としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられる。光の検出がフォトンカウンティングによる場合、光強度の測定は、所定時間に亘って、逐次的に、計測単位時間（ＢＩＮＴＩＭＥ）毎に、光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行される。従って、この場合、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータである。また、顕微鏡のステージ（図示せず）には、観察するべきウェル１０を変更するべく、マイクロプレート９の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置１７ａが設けられていてよい。ステージ位置変更装置１７ａの作動は、コンピュータ１８により制御されてよい。かかる構成により、検体が複数在る場合にも、迅速な計測が達成可能となる。

更に、上記の光分析装置の光学系に於いては、試料溶液内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内に於いて焦点領域、即ち、光検出領域の位置を移動するための機構が設けられる。かかる光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図１（Ｃ）に模式的に例示されている如く、反射ミラー７の向きを変更するミラー偏向器１７が採用されてよい（光検出領域の絶対的な位置を移動する方式）。かかるミラー偏向器１７は、通常のレーザー走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい。或いは、別の態様として、図１（Ｄ）に例示されている如く、試料溶液が注入されている容器１０（マイクロプレート９）の水平方向の位置を移動し、試料溶液内に於ける光検出領域の相対的な位置を移動するべくステージ位置変更装置１７ａが作動されてもよい（試料溶液の絶対的な位置を移動する方式）。また、上記の光路を変更して光検出領域の絶対的な位置を移動する方式によって光検出領域を走査軌道に沿って周回移動させると同時に、試料溶液の位置を移動する方式により、試料溶液内に於ける光検出領域の走査軌道の位置が所定の移動経路に沿って移動されてもよい。いずれの方式による場合も、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するべく、ミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａは、コンピュータ１８の制御の下、光検出器１６による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の走査軌道は、円形、楕円形等の閉じた循環経路であってよく、試料溶液の位置の移動経路は、円形、楕円形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよい（コンピュータ１８に於けるプログラムに於いて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい。）。なお、図示していないが、対物レンズ８又はステージを上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されるようになっていてもよい。

観測対象物となる発光粒子が多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域（光検出領域）のみで光の放出があるので、ピンホール１３は、除去されてよい。また、観測対象物となる発光粒子が化学発光や生物発光現象により励起光によらず発光する場合には、励起光を生成するための光学系２〜５が省略されてよい。発光粒子がりん光又は散乱により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。更に、光分析装置１に於いては、図示の如く、複数の励起光源２が設けられていてよく、発光粒子の励起波長によって適宜、励起光の波長が選択できるようになっていてよい。同様に、光検出器１６も複数個備えられていてよく、試料中に波長の異なる複数種の発光粒子が含まれている場合に、それらから光をその波長によって別々に検出できるようになっていてよい。

コンピュータ１８は、ＣＰＵおよびメモリを備え、ＣＰＵが各種演算処理を実行することにより、本発明の手順を実行する。なお、各手順は、ハードウェアにより構成するようにしてもよい。本実施形態で説明される処理の全て或いは一部は、それらの処理を実現するプログラムを記憶したコンピュータ読み取り可能な記憶媒体を用いて、コンピュータ１８により実行されてよい。即ち、コンピュータ１８は、記憶媒体に記憶されているプログラムを読み出して、情報の加工・演算処理を実行することにより、本発明の処理手順を実現するようになっていてよい。ここで、コンピュータ読み取り可能な記録媒体とは、磁気ディスク、光磁気ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、半導体メモリ等であってよく、或いは、上記のプログラムを通信回線によってコンピュータに配信し、この配信を受けたコンピュータがプログラムを実行するようにしても良い。

本発明の光分析技術の原理
「発明の概要」の欄に記載されている如く、本発明の光分析技術に於いては、端的に述べれば、走査分子計数法に於いて、試料容器の壁に付着した異物からの光の信号を含む時系列光強度データの領域（エラー領域）の判別を可能にするエラー領域判定機構が採用される。以下、本発明の走査分子計数法及びエラー領域判別の原理について説明する。

１.走査分子計数法の原理
「走査分子計数法」（特許文献９〜１１）では、基本的には、光検出領域の位置を移動するための機構（ミラー偏向器１７）を駆動して光路を変更し、或いは、試料溶液が注入されている容器１０（マイクロプレート９）の水平方向の位置を移動して、図２（Ａ）にて模式的に描かれているように、試料溶液内に於いて光検出領域ＣＶの位置を移動しながら、即ち、光検出領域ＣＶにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。そうすると、例えば、光検出領域ＣＶが移動する間（図中、時間ｔ０〜ｔ２）に於いて１つの発光粒子の存在する領域を通過する際（ｔ１）には、発光粒子から光が放出され、図２（Ｂ）に描かれている如き時系列の光強度データ上に有意な光強度（Ｅｍ）のパルス状の信号が出現することとなる。かくして、上記の光検出領域ＣＶの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図２（Ｂ）に例示されている如きパルス状の信号（有意な光強度）を一つずつ検出することによって、発光粒子が個別に検出され、その数をカウントすることにより、計測された領域内に存在する発光粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報が取得できることとなる。かかる走査分子計数法の原理に於いては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き統計的な演算処理は行われず、発光粒子が一つずつ検出されるので、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液でも、粒子の濃度若しくは数密度に関する情報が取得可能である。

上記の走査分子計数法に於ける光検出領域の位置の移動に於いては、既に触れた如く、簡単には、図１のミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａのいずれか一方のみ駆動して、図２（Ｃ）に例示されている如く、光検出領域が単純に（経路の交差がなく）閉じた循環経路（走査軌道）に沿って移動されるようになっていてよく、或いは、図２（Ｄ）の如く、ミラー偏向器１７を駆動して光検出領域を走査軌道に沿って周回移動させながら、ステージ位置変更装置１７ａを連続的に駆動して、試料溶液の位置を移動し、これにより、試料溶液を基準にして光検出領域の走査軌道の位置を移動し、光検出領域が短時間のうちにできるだけ広い面積を走査できるようになっていてよい。

２．エラー領域の判別
既に述べた如く、試料容器の壁上に塵、埃、汚れ等の汚染物質又は異物が付着しており、その異物の存在位置を、光検出領域又はその光路が通過すると、異物が発光してその光が光検出器により検出される場合がある。そのような試料容器の壁上に発光する異物があるとき、多くの場合、異物からの光の信号のプロファイルは、時系列光強度データ上に於いて、発光粒子の信号の描くような釣鐘状のプロファイルとはならないので、後に説明される如き、時系列光強度データに於いて見出されるパルス状の信号の形状的特徴、例えば、ピーク強度、幅、ガウス関数等の釣鐘型関数の形状に対する近似の程度（ガウス関数フィッティングに於ける相関係数）を参照して、発光粒子の信号とノイズ信号とを判別する処理に於いて、異物からの光の信号は、ノイズ信号として判別される。しかしながら、図３（Ｂ）に例示されている如く、光検出領域の位置が異物を瞬間的に通過するような場合、異物からの光の信号が発光粒子の信号と同様に釣鐘型のパルス状のプロファイルを有することがあり、その場合には異物からの光の信号を発光粒子の信号と誤判別してしまうこととなる。

ところで、図３（Ａ）に例示されている如く光検出領域が或る経路を周期Ｔｓにて周回する場合、試料溶液内にて自由に運動する発光粒子の信号Ｓは、ランダムに発生するが、試料容器の壁上に付着した異物は不動であるため、異物の光の信号Ｅは、光検出領域が図３（Ｂ）に例示されている如く異物の存在領域を通過する度に、即ち、周期Ｔｓにて出現することとなる。従って、図３（Ａ）の時系列光強度データを、図３（Ｃ）の如く光検出領域の周回毎に分割し、更に、図３（Ｄ）の如く、各周回の時系列光強度データ上の光強度値を、各周回の開始時点から時間毎に合算した場合、異物の光の信号が存在する領域の光強度値は、その他の領域の光強度値に比して著しく高くなる。そこで、本発明では、そのように、各周回の時系列光強度データに於いて、常に有意な光強度値が存在し、各周回の時系列光強度データを合算すると、光強度値がその他の領域に比して著しく高くなる時間領域を、異物の光の信号が存在する領域、即ち、エラー領域として判別し、発光粒子の検出処理に於いて無視する処理（マスク処理）がなされ、これにより、発光粒子の検出結果の精度の向上が図られる。具体的な処理では、後により詳細に説明される如く、時系列光強度データに於いて、各周回の開始時点から時間毎に常に有意な光が検出されているか否かを表す特徴量が算出され、かかる特徴量に基づいて、時間毎に異物の光の信号が存在するか否か、即ち、各領域がエラー領域となっているか否かが判別される。そのような特徴量としては、時系列光強度データに於ける各周回の開始時点からの時間毎の光強度値の総計値、平均値等が用いられてよい。また、特徴量の別の態様として、各周回の時系列光強度データに於ける各周回の開始時点からの時間毎の光強度の集中の程度を表す「偏り値」が採用されてよい。

なお、上記の構成によれば、或る発光粒子が光検出領域内に包含された後、光検出領域がその移動経路を一巡する間に、発光粒子が光検出領域の在った空間から脱出していないと、同じ発光粒子が再び光検出領域内に包含され、その光が検出されることとなる。そうすると、上記のエラー領域の判別の構成では、発光粒子の信号の存在領域がエラー領域として判別されることとなってしまう。かかる誤判別は、特に、寸法の大きい（拡散係数が比較的小さい）発光粒子の場合に生じ易い。そこで、発光粒子の信号が異物の光の信号として判別されることを回避すべく、好適には、光検出領域の移動周期は、発光粒子が拡散により光検出領域の大きさを移動するのに要する時間よりも長く設定される。具体的には、例えば、図３（Ｅ）を参照して、光検出領域の（ｋ−１）回目の周回の或る場所のときに、拡散係数Ｄの発光粒子が光検出領域内に在ったとすると、ｋ回目の周回の同じ場所に於いて、発光粒子の移動距離ｌが光検出領域の直径２ｒを越えているときには、
（２ｒ）^２＜ｌ＝６Ｄ・Ｔ …（１）
の関係が成立するので、光検出領域の移動周期Ｔは、
Ｔ＞２ｒ^２／３Ｄ …（２）
を満たすよう設定されてよい。

走査分子計数法の処理操作過程
図１（Ａ）に例示の光分析装置１を用いた本発明に従った走査分子計数法の実施形態に於いては、具体的には、（１）発光粒子を含む試料溶液の調製、（２）試料溶液の光強度の測定処理、（３）時系列光強度データに於けるエラー領域の検出及びマスク処理、及び、（４）測定された光強度の分析処理が実行される。図４は、フローチャートの形式にて表した本実施形態に於ける処理を示している。

（１）試料溶液の調製
本発明の光分析技術の観測対象物となる粒子は、溶解された分子等の、試料溶液中にて分散し溶液中にてランダムに運動する粒子であれば、任意のものであってよく、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞、或いは、金属コロイド、その他の非生物学的分子などであってよい。観測対象物となる粒子が光を発する粒子でない場合には、発光標識（蛍光分子、りん光分子、化学・生物発光分子）が観測対象物となる粒子に任意の態様にて付加されたものが用いられる。試料溶液は、典型的には水溶液であるが、これに限定されず、有機溶媒その他の任意の液体であってよい。

（２）試料溶液の光強度の測定（図４（Ａ）−ステップ１００）
本実施形態の走査分子計数法による光分析に於ける光強度の測定は、測定中にミラー偏向器１７及び／又はステージ位置変更装置１７ａを駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行いながら実行される。操作処理に於いて、典型的には、マイクロプレート９のウェル１０に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ１８に対して、測定の開始の指示を入力すると、コンピュータ１８は、記憶装置（図示せず）に記憶されたプログラム（試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する手順と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順）に従って、試料溶液内の光検出領域に於ける励起光の照射及び光強度の計測が開始される。かかる計測中、コンピュータ１８のプログラムに従った処理動作の制御下、ミラー偏向器１７及び／又はステージ位置変更装置１７ａは、ミラー７（ガルバノミラー）及び／又は顕微鏡のステージ上のマイクロプレート９を駆動して、ウェル１０内に於いて光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器１６は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ１８へ送信し、コンピュータ１８では、任意の態様にて、送信された信号から時系列の光強度データを生成して保存する。なお、典型的には、光検出器１６は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出が、フォトンカウンティングによる場合、時系列光強度データは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。

光強度の計測中の光検出領域の位置の移動速度は、任意に、例えば、実験的に又は分析の目的に適合するよう設定された所定の速度であってよい。検出された発光粒子の数に基づいて、その数密度又は濃度に関する情報を取得する場合には、光検出領域の通過した領域の大きさ又は体積が必要となるので、移動距離が把握される態様にて光検出領域の位置の移動が実行される。なお、計測中の経過時間と光検出領域の位置の移動距離とが比例関係にある方が測定結果の解釈が容易となるので、移動速度は、基本的に、一定速度であることが好ましいが、これに限定されない。

ところで、光検出領域の位置の移動速度に関して、計測された時系列の光強度データからの発光粒子の個別の検出、或いは、発光粒子の数のカウンティングを、定量的に精度よく実行するためには、かかる移動速度は、発光粒子のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定されることが好ましい。本発明の光分析技術の観測対象粒子は、溶液中に分散又は溶解されて自由にランダムに運動する粒子であるので、ブラウン運動によって位置が時間と伴に移動する。従って、光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図９（Ａ）に模式的に描かれている如く、粒子が領域内をランダムに移動し、これにより、光強度がランダムに変化し（既に触れた如く、光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。）、個々の発光粒子に対応する有意な光強度の変化を特定することが困難となる。そこで、好適には、図９（Ｂ）に描かれている如く、粒子が光検出領域を略直線に横切り、これにより、時系列の光強度データに於いて、図９（Ｃ）の最上段に例示の如く、個々の発光粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが略一様となり（発光粒子が略直線的に光検出領域を通過する場合には、光強度の変化のプロファイルは、励起光強度分布と略同様となる。）、個々の発光粒子と光強度との対応が容易に特定できるように、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度（拡散移動速度）よりも速く設定される。

具体的には、拡散係数Ｄを有する発光粒子がブラウン運動によって半径Ｗｏの光検出領域（コンフォーカルボリューム）を通過するときに要する時間Δｔは、平均二乗変位の関係式
（２Ｗｏ）^２＝６Ｄ・Δｔ …（３）
から、
Δｔ＝（２Ｗｏ）^２／６Ｄ …（４）
となるので、発光粒子がブラウン運動により移動する速度（拡散移動速度）Ｖdifは、概ね、
Ｖdif＝２Ｗｏ／Δｔ＝３Ｄ／Ｗｏ …（５）
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるＶdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、観測対象粒子の拡散係数が、Ｄ＝２．０×１０^−１０ｍ^２／ｓ程度であると予想される場合には、Ｗｏが、０．６２μｍ程度だとすると、Ｖdifは、１．０×１０^−３ｍ／ｓとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その１０倍以上の１５ｍｍ／ｓなどと設定されてよい。なお、観測対象粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル（典型的には、励起光強度分布と略同様）となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。

（３）エラー領域の検出及びマスク処理（図４（Ａ）−ステップ１０５）
上記の処理により時系列光強度データが得られると、コンピュータ１８に於いて、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、時系列光強度データに於けるエラー領域の検出及びマスク処理が実行される。以下、エラー領域の検出及びマスク処理のいくつかの実施形態について説明する。

（ｉ）第一の実施形態−相関係数を用いて各周回の時系列光強度データのずれ補正をする場合
図３に関連した説明に於いて記載されている如く、本発明に於いては、光検出領域が所定の経路を周期Ｔｓにて周回する場合に、各周回の時系列光強度データ上に於いて、各周回の開始時点からの時間毎に常に有意な光が検出されているか否かを表す特徴量が算出され、かかる特徴量を参照して、エラー領域が検出される。しかしながら、実際の各周回の時系列光強度データに於いては、装置の機械誤差等の要因により、所定の経路上の位置に対応する各周回の時系列光強度データ上の時刻に於いて互いにずれが生じている場合があり、これにより、図５に模式的に示されている如く、時系列光強度データ上に於ける異物の光を表す信号の（各周回の開始時点から計った）出現時間がずれている場合がある。そこで、特徴量の算出の前に、そのような各周回の時系列光強度データの時間のずれの補正が実行されてよい。

かかる各周回の時系列光強度データの時間のずれの補正の一つの態様に於いては、時系列光強度データを周回毎に（即ち、周期Ｔｓ毎に）分割した後、そのうちの一つの周回の時系列光強度データ（例えば、最初の周回の時系列光強度データ）を基準データとして用いて、図６（Ａ）に示されている如く、基準データの時間に対応させる各周回の時系列光強度データの時間を逐次的にシフトさせながら、即ち、各周回の時系列光強度データの時間軸を基準データの時間軸に対して前後にずらしながら、各周回の時系列光強度データの光強度値と基準データの光強度値との相関係数が算出される。具体的には、相関係数ｒは、下記の式にて算出されてよい。
ｒ＝(1/((n-1)sx・sy)Σ(xi-xa)(yi-ya) …（６）
ここで、xiは、基準データの時系列の光強度値であり、xaは、その平均値であり、yiは、各周回の時系列光強度データの光強度値であり、yaは、その平均値である。また、sx、syは、それぞれ、基準データの時系列の光強度値及び各周回の時系列光強度データの光強度値の標準偏差であり、nは、一周回の時系列光強度データに於けるデータ点の数であり、Σは、n個の総和を表している。かかる相関係数値は、基準データxiと各周回の時系列光強度データyiの時間変化が近くなるほど大きくなり、特に、時系列光強度データ上に不動の異物の光の信号が存在しているときには、基準データ上の異物の光の信号と各周回の時系列光強度データの異物の光の信号とが重なるシフト時間δ（基準データの時間に対する各周回の時系列光強度データの時間のずれ）に於いて、図６（Ｂ）に示されている如く、相関係数値は、最大となる。即ち、相関係数値を最大にするシフト時間δが、所定の経路上の位置に対応する各周回の時系列光強度データ上の時刻に於ける互いのずれとなるので、かかるシフト時間δを検出し、検出されたシフト時間δだけ、各周回の時系列光強度データの時間軸を基準データの時間軸に対してずらすことにより、所定の経路上の位置に対応する各周回の時系列光強度データの時刻を互いに一致させることが可能となる。そして、所定の経路上の位置に対応する各周回の時系列光強度データの時刻を互いに一致させた状態で特徴量を算出することにより、精度良く、エラー領域の検出が可能となる。

上記の相関係数値を用いて各周回の時系列光強度データの時間軸のずれの補正を行い、その後にエラー領域の検出を行う実際の処理手順に於いては、図６（Ｃ）に記載されている如く、まず、図４のステップ１００にて得られた時系列光強度データの平滑化処理が実行される（ステップ２００）。なお、ここで実行される平滑化処理に於いては、できるだけ精度良くシフト時間δを検出することを目的にしているので、ランダムに発生する発光粒子の信号による光強度の変化の寄与が低減され、異物の光の信号の光強度の変化の寄与が残るように、後述の発光粒子の信号の検出の前処理として実行される平滑化処理よりも、平滑化の程度が大きくなっていてよい。かくして、平滑化処理が為されると、時系列光強度データが光検出領域の移動経路上の周期Ｔｓ毎に分割され（ステップ２０５）、そのうちの一つのデータを基準データとして用いて、その他の各周回の時系列光強度データと基準データとの相関係数値がそれぞれ算出され、それぞれの時間ずれ（シフト時間δ）が決定される（ステップ２１５）。そして、基準データの時間軸に対して各周回の時系列光強度データの時間軸をそれぞれシフト時間δだけ移動した状態にて、各周回の時系列光強度データの光強度値を時間毎に参照して、時間毎の光強度値の総計値又は平均値が特徴量として参照され、所定の閾値Ｔｈ以上の特徴量が存在する時間領域（図３（Ｄ）参照）がエラー領域として決定される（ステップ２２０）。なお、エラー領域は、所定の閾値Ｔｈ以上の光強度値を与える領域の前後の所定の範囲も含めて画定されてよい。また、エラー領域の判別は、時間毎に参照される光強度値についてカイ二乗検定を用いて実行されてもよい（各データ点に於ける周辺の光強度値の平均値を期待値として各データ点のｐ値を求め、ｐ値が所定値以下である時間領域がエラー領域として判別される。この場合、ｐ値が特徴量となるので、ｐ値が所定の閾値を下回る領域がエラー領域となる。）かくして、エラー領域として決定されると、時系列光強度データに於いて、エラー領域が後の光分析処理に於いて除去又は無視されるよう設定される（マスク処理−ステップ２２５）。

（ii）第二の実施形態−二値化された時系列光強度データを用いて各周回の時系列光強度データのずれ補正をする場合
前記の第一の実施形態の場合と同様に、各周回の時系列光強度データの時間のずれの補正を実行する別の態様として、二値化された時系列光強度データを用いる処理が採用されてよい。具体的には、図７（Ａ）に例示されている如く、まず、光強度値が所定値にて二値化された状態の各周回の時系列光強度データが準備される。そして、そのうちの一つの周回の時系列光強度データが基準データとして用いられて、基準データの時間に対応させる各周回の時系列光強度データの時間を逐次的にシフトさせながら、即ち、各周回の時系列光強度データの時間軸を基準データの時間軸に対して前後にずらしながら、各周回の時系列光強度データの二値化された光強度値と基準データの二値化された光強度値との論理積演算（1+1=1;1+0=0;0+1=0;0+0=0）を時間毎に実行し、更に、かかる演算値の積算値を算出する。論理積の積算値は、第一の実施形態の相関係数値と同様に、基準データと各周回の時系列光強度データの時間変化が近くなるほど大きくなり、特に、時系列光強度データ上に不動の異物の光の信号が存在しているときには、基準データ上の異物の光の信号と各周回の時系列光強度データの異物の光の信号とが重なるシフト時間δ（基準データの時間に対する各周回の時系列光強度データの時間のずれ）に於いて、最大となる。即ち、論理積積算値を最大にするシフト時間δが、所定の経路上の位置に対応する各周回の時系列光強度データ上の時刻に於ける互いのずれとなるので、かかるシフト時間δを検出し、検出されたシフト時間δだけ、各周回の時系列光強度データの時間軸を基準データの時間軸に対してずらすことにより、所定の経路上の位置に対応する各周回の時系列光強度データの時刻を互いに一致させることが可能となる。そして、所定の経路上の位置に対応する各周回の時系列光強度データの時刻を互いに一致させた状態で特徴量を算出することにより、精度良く、エラー領域の検出が可能となる。

上記の二値化された時系列光強度データを用いて各周回の時系列光強度データの時間軸のずれの補正を行い、その後にエラー領域の検出を行う実際の処理手順に於いては、図７（Ｃ）に記載されている如く、まず、図４のステップ１００にて得られた時系列光強度データの平滑化処理が実行される（ステップ２００）。なお、ここで実行される平滑化処理に於いても、第一の実施形態と同様の理由で、平滑化の程度が大きくなっていてよい。かくして、平滑化処理が為されると、時系列光強度データの二値化（ステップ２０３）、二値化された時系列光強度データの分割（ステップ２０５）が実行され、そのうちの一つのデータを基準データとして用いて、その他の各周回の時系列光強度データと基準データとの論理積積算値がそれぞれ算出され（ステップ２１０）、それぞれの時間ずれ（シフト時間δ）が決定される（ステップ２１５）。そして、基準データの時間軸に対して各周回の時系列光強度データの時間軸をそれぞれシフト時間δだけ移動した状態にて、各周回の時系列光強度データの光強度値を時間毎に参照し、時間毎の光強度の総計値又は平均値（特徴量）が所定の閾値Ｔｈ以上である時間領域（図３（Ｄ）参照）がエラー領域として決定される（ステップ２２０）。なお、エラー領域は、所定の閾値Ｔｈ以上の光強度値を与える領域の前後の所定の範囲も含めて画定されてよい。また、エラー領域の判別は、時間毎に参照される光強度値についてカイ二乗検定を用いて実行されてもよい。かくして、エラー領域として決定されると、時系列光強度データに於いて、エラー領域が後の光分析処理に於いて除去又は無視されるよう設定される（マスク処理−ステップ２２５）。

（iii）第三の実施形態−ずれ補正を実行しない場合
上記の如く、実際の各周回の時系列光強度データには、所定の経路上の位置に対応する各周回の時系列光強度データ上の時刻に於いて互いにずれが生じている場合があるが、かかるずれの大きさは、通常、或る程度の範囲内に収まっている。また、エラー領域の除去を行う場合、実際には、確実に異物の光の信号の全体を除去できるようにするためには、実際に、第一及び第二の実施形態の場合に於ける特徴量により異物の光の信号の存在領域として判別される領域よりやや広い範囲がエラー領域として決定されることが好ましい。即ち、除去されるエラー領域は、厳密に異物の光の信号が存在する領域よりもやや広い領域であってよいので、厳密に各周回の時系列光強度データ上の時刻に於ける互いにずれの補正を実行せず、異物の光の信号が存在する領域よりもやや広い領域がエラー領域として判定されるようになっていてもよい。かくして、本実施形態に於いては、各周回の時系列光強度データ上の時刻のずれ補正を行わずに、異物の光の信号が存在する領域をエラー領域として除去することが試みられる。

具体的には、まず、図８（Ａ）に例示されている如く、各周回の時系列光強度データに於いて、複数の短い長さの区間１…（ここでは、「領域」を「区間」と称する。）が設定される。かかる区間は、一つのＢＩＮＴＩＭＥであってもよいが、計測誤差を考慮して１００μ秒〜１００ｍ秒の範囲で任意に設定されてよい。また、例えば、図２（Ｄ）の如く、ミラー偏向器１７を駆動して光検出領域を走査軌道に沿って周回移動させながら、ステージ位置変更装置１７ａを連続的に駆動して、試料溶液の位置を移動する場合には、区間の幅は、ミラー偏向器１７の駆動による走査軌道を一回周回する長さに相当する時間幅であってよい。そして、上記の区間毎に、光強度値の「偏り値」が算出される。ここで、「偏り値」とは、「発明の概要」に於いて触れた如く、各区間に於ける光強度値の集中の程度を表す指標値である。異物が存在していない通常の区間に於いては、発光粒子からの微弱光が検出される程度であるので、その区間内に於いて光が検出される部分が極度に集中することは殆どないのに対し、異物が存在している区間では、多量の光が検出される部分が異物の存在位置に極度に集中することとなる。そこで、かかる光の集中の程度を区間毎に検出することにより、異物が存在している区間が特定できることとなる。かかる「偏り値」としては、例えば、区間内の平均光強度値からの各点の光強度値の差の二乗値の積算値、平均強度値を期待値とし且つ各点の光強度値を観測値とした場合のカイ二乗検定のｐ値の積算値等が用いることができる（差の二乗値の積算値の場合は、大きいほど、異物の存在する可能性が高くなり、カイ二乗検定のｐ値の積算値の場合は、小さいほど、異物の存在する可能性が高くなる。）。また、別の態様として、一つの区間として、ミラー偏向器１７の駆動による走査軌道の一周回に相当する時間幅を設定する場合、図８（Ｂ）に模式的に描かれている如く、走査軌道に沿った光強度値の重心位置との走査軌道の中心位置との距離が用いることができる。即ち、走査軌道上に計測された光強度値を割り当てた状態を想定すると、光強度値と走査軌道の座標値から光強度値の重心位置が決定される。重心位置は、通常の区間に於いては、光強度値の部分的な集中が発生しないために、走査軌道の中心位置に略一致するが、異物が存在している場合には、図示の如く、光強度値の部分的な集中が生じ、これにより、光強度値の重心位置が走査軌道の中心位置から離れることとなる。従って、かかる光強度値の重心位置との走査軌道の中心位置との距離を参照することにより、「光強度値の偏り」の程度が算定され、これにより、或る区間が異物の存在している区間であるか否かの判定ができることとなる。なお、上記の偏り値のみを用いてエラー領域の判別を行っても良いが、偏り値と別の特徴量、例えば、光強度値とを組み合わせてエラー領域の判別を行うと、更に、エラー領域の判別の精度の向上が期待される。例えば、ａ１×（偏り値）＋ａ２×（平均光強度値）［ａ１、ａ２は、重み係数］などの複数の特徴量の線形和を区間毎に算出し、かかる特徴量の線形和が所定の閾値を超えたか否か或いは所定の範囲内にあるか否かで、対応する区間がエラー領域であるか否かを判別してもよい（実施例３参照）。

上記の偏り値又はこれを含む特徴量の線形和（以下、単に「特徴量」と称する。）を用いて区間毎にエラー領域の検出を行う実際の処理手順に於いては、図８（Ｃ）に記載されている如く、まず、図４のステップ１００にて得られた時系列光強度データの平滑化処理が実行される（ステップ２００）。ここで実行される平滑化処理に於いても、第一又は第二の実施形態と同様に、平滑化の程度が大きくなっていてよい。平滑化処理が為されると、時系列光強度データの周期毎の分割（ステップ２０５）が実行される。そして、区間毎に特徴量の算出が為され（ステップ２１０）、更に、各周回の時系列光強度データに於ける特徴量を区間毎に参照し、区間毎の特徴量の総計値又は平均値が所定の範囲にある区間（例えば、特徴量の総計値又は平均値が所定の閾値Ｔｈを超えている区間）がエラー領域として決定される（図８（Ａ）第４段参照−ステップ２２０）。かくして、エラー領域として決定されると、時系列光強度データに於いて、エラー領域が後の光分析処理に於いて除去又は無視されるよう設定される（マスク処理−ステップ２２５）。

（４）光強度の分析処理
時系列光強度データに於けるエラー領域の検出及びマスク処理が為されると、エラー領域を除いた時系列光強度データに於ける光強度値を用いて、下記の如く、発光粒子の信号の検出、発光粒子のカウンティング、濃度算出等の各種分析が実行される。
（ｉ）発光粒子の信号の個別検出（図４−ステップ１１０〜１６０）
既に触れた如く、一つの発光粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図９（Ｂ）に示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する信号に於ける光強度データ上での光強度の変化は、光学系により決定される光検出領域内の光強度分布を反映した略釣鐘状のプロファイルを有する。従って、走査分子計数法では、基本的には、光強度データ上で、適宜設定される閾値Ｉｔｈを超える光強度値が継続する時間幅Δτが所定の範囲にあるとき、その光強度のプロファイルを有する信号が一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されるようになっていてよい。そして、光強度が閾値Ｉｔｈを超えないか、時間幅Δτが所定の範囲にない信号は、ノイズ又は異物の信号として判定される。また、光検出領域の光強度分布が、ガウス分布：
Ｉ＝Ａ・ｅｘｐ（−２ｔ^２／ａ^２） …（６）
であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイル（バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル）に対して式（６）をフィッティングして算出された強度Ａ及び幅ａが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されてよい。（強度Ａ及び幅ａが所定の範囲外にある信号は、ノイズ又は異物の信号として判定され、その後の分析等に於いて無視されてよい。）

光強度データ上の信号の検出の処理の一つの例に於いては、まず、光強度データ（図９（Ｃ）、最上段「検出結果（未処理）」）に対して、スムージング（平滑化）処理が為される（図４（Ａ）−ステップ１１０、図９（Ｃ）中上段「スムージング」）。発光粒子の発する光は確率的に放出されるものであり、微小な時間に於いてデータ値の欠落が生じ得るため、かかるスムージング処理によって、前記の如きデータ値の欠落を無視できることとなる。スムージング処理は、例えば、移動平均法により為されてよい。なお、スムージング処理を実行する際のパラメータ、例えば、移動平均法に於いて一度に平均するデータ点数や移動平均の回数など、は、光強度データ取得時の光検出領域の位置の移動速度（走査速度）、ＢＩＮＴＩＭＥに応じて適宜設定されてよい。

次いで、スムージング処理後の光強度データに於いて、有意なパルス状の信号（以下、「パルス信号」と称する。）が存在する時間領域（パルス存在領域）を検出するために、スムージング処理後の光強度データの時間についての一次微分値が演算される（ステップ１２０）。光強度データの時間微分値は、図９（Ｃ）中下段「時間微分」に例示されている如く、信号値の変化時点に於ける値の変化が大きくなるので、かかる時間微分値を参照することによって、有意な信号の始点と終点を有利に決定することができる。

しかる後、光強度データ上に於いて、逐次的に、有意なパルス信号が検出される（ステップ１３０〜１６０）。具体的には、まず、光強度データの時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値を参照して、一つのパルス信号の始点と終点とが探索され決定され、パルス存在領域が特定される（ステップ１３０）。一つのパルス存在領域が特定されると、そのパルス存在領域に於けるスムージングされた光強度データに対して、釣鐘型関数のフィッティングが行われ（図９（Ｃ）下段「釣鐘型関数フィッティング」）、釣鐘型関数のパルスのピーク（最大値）の強度Ｉpeak、パルス幅（半値全幅）Ｗpeak、フィッティングに於ける（最小二乗法の）相関係数等のパラメータが算出される（ステップ１４０）。なお、フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、ガウス関数であるが、ローレンツ型関数であってもよい。そして、算出された釣鐘型関数のパラメータが、一つの発光粒子が光検出領域を通過したときに検出されるパルス信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲内にあるか否か、即ち、パルスのピーク強度、パルス幅、相関係数が、それぞれ、所定範囲内にあるか否か等が判定される（ステップ１５０）。かくして、図６左に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの発光粒子に対応する信号に於いて想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの発光粒子に対応する信号であると判定され、これにより、一つの発光粒子が検出されたこととなる。一方、図６右に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったパルス信号は、ノイズとして無視される。なお、発光粒子の信号の検出と同時に信号数のカウンティング、即ち、発光粒子のカウンティングが実行されてよい。

上記のステップ１３０〜１５０の処理に於けるパルス信号の探索及び判定は、光強度データの全域に渡って繰り返し実行されてよい（ステップ１６０）。なお、光強度データから発光粒子の信号を個別に検出する処理は、上記の手順に限らず、任意の手法により実行されてよい。

（iv）発光粒子濃度の決定
検出された発光粒子の信号の数を計数して、発光粒子の数の決定が為されている場合、任意の手法にて、光検出領域の通過した領域の総体積が算定されれば、その体積値と発光粒子の数とから試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度が決定可能となる。

光検出領域の通過した領域の総体積は、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に基づいて理論的に算定されてもよいが、実験的に、例えば、発光粒子の濃度が既知の溶液（対照溶液）について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、発光粒子の検出及びカウンティングを行うことにより検出された発光粒子の数と、対照溶液の発光粒子の濃度とから決定されるようになっていてよい。具体的には、例えば、発光粒子の濃度Ｃの対照溶液について、対照溶液の発光粒子の検出数がＮであったとすると、光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔは、
Ｖｔ＝Ｎ／Ｃ …（１２）
により与えられる。また、対照溶液として、発光粒子の複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたＶｔの平均値が光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔとして採用されるようになっていてよい。そして、Ｖｔが与えられると、発光粒子のカウンティング結果がｎの試料溶液の発光粒子の濃度ｃは、
ｃ＝ｎ／Ｖｔ …（１３）
により与えられる。なお、光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡを利用するなどして与えられるようになっていてよい。また、本実施形態の光分析装置に於いては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な発光粒子についての濃度Ｃと発光粒子の数Ｎとの関係（式（１２））の情報をコンピュータ１８の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が光分析を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。

上記に説明した本発明の有効性を検証するために、以下の如き実験を行った。なお、以下の実施例は、本発明の有効性を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではないことは理解されるべきである。

発光粒子として蛍光色素を含む試料溶液を用い、本発明に従って走査分子計数法による時系列光強度データから不動の異物からの光の信号を除去した状態で発光粒子の検出が可能であることを検証した。

トリス緩衝液(10 mM Tris-HCl(pH 8.0), 0.05% Triton X-100)に１００ａＭＡＴＴＯ６４７Ｎ（シグマアルドリッチ社）を含む溶液１００μＬを試料溶液として６つのウェル（Ａ〜Ｆ）に分注して走査分子計数法によって計測及びパルス状信号の検出を行った。光の計測に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を用い、各ウェルについて時系列のフォトンカウントデータを取得した。その際、励起光は、６３３ｎｍのレーザ光（出力１ｍＷ）を用いて照射し、検出光波長帯域は、バンドパスフィルターを用いて６６０〜７１０ｎｍとした。試料溶液中に於ける光検出領域の移動は、ミラー偏向器によって１２０００ｒｐｍにて円軌道（走査軌道、直径５０μｍ）に沿って光検出領域を移動すると共に、ステージの移動によって１mm/sの速さで１０秒の移動周期にて図１１（Ｂ）の如き円弧経路に沿って光検出領域の走査軌道の位置を往復動することにより行った。また、フォトンカウンティングのＢＩＮＴＩＭＥは１０μ秒とし、ウェルを３周回（１．５往復）させた。

走査分子計数法によって光の計測光強度の測定後、取得された時系列のフォトンカウントデータに於いて、第二の実施形態にて説明された処理手順により二値化された時系列のフォトンカウントデータを用いて、各周回の時系列のフォトンカウントデータの時間のずれの補正を行い、ずれの補正が為された各周回の時系列のフォトンカウントデータの時間毎のフォトンカウント値の平均値が０．８以上のデータ領域をエラー領域として決定した。しかる後、決定されたエラー領域を除く時系列のフォトンカウントデータに於いて、「（ｉ）発光粒子の信号の個別検出」及び図４のステップ１１０〜１６０に記載された処理に従って、データのスムージング及びフィッティングを実行して、発光粒子の信号の特徴を有する信号を検出した。データのスムージングに於いては、一度に平均するデータ点は１１個として、移動平均処理を５回繰り返した。フィッティングに於いては、スムージングされたフォトンカウントの有意なパルス状の信号に対してガウス関数を最小二乗法によりフィッティングし、（ガウス関数に於ける）ピーク強度、パルス幅（半値全幅）、相関係数を決定し、下記の条件:
２０μ秒＜パルス幅＜４００μ秒
ピーク強度＞１（フォトン／１０μ秒）
相関係数＞０．９０
を満たすパルス状信号を、発光粒子の信号の特徴を有する信号として判別した。

図１１（Ａ）は、上記の要領にて光検出領域の位置を移動させた際に得られた時系列光強度データの全体図（左上）と、その一部の拡大図（右下）である。全体図から理解される如く、光検出領域の位置が容器の壁に達すると光強度値が増大した（このことから、データ上に於いて、容器内の範囲に相当する時間領域が把握される。）。また、容器内のデータの一部の拡大図を参照すると、ミラー偏向器による走査周期毎に周期的に増大する信号が計測された。これらが、容器内にて不動の異物の光の信号であると考えられる。図１１（Ｃ）は、上記の光検出領域の位置の１回目の周回のデータに対して、２回目の周回のデータの対応する時間をずらしながら、二つの周回のデータの二値化された光強度値の論理積積算値（ビット一致数）をシフト時間（シフト量）に対してプロットしたグラフ図である。同図を参照して、理解される如く、論理積積算値は、ミラー偏向器による走査周期毎に増大した。このことから、二つの周回のデータの二値化された光強度値の論理積積算値を二つの周回のデータの時間を互いにずらしながら算出することにより、二つの周回のデータの時間のずれ（シフト時間）が決定できることが示された。また、論理積積算値が最大となるとき、二つの周回のデータの時間が一致すると考えられるので、論理積積算値が最大値となるシフト時間を、実際の二つの周回のデータの時間のずれ幅として決定した。

図１２（Ａ）は、上記の如く決定された時間のずれ幅にて各周回のデータの時間のずれの補正が為された各周回の時系列のフォトンカウントデータの時間毎のフォトンカウント値の平均値が０．８以上のデータ領域をエラー領域として決定した場合の時系列のフォトンカウントデータの一部を示している。図に於いて、エラー領域として判別された領域は、濃く示されている。同図から理解される如く、上記の一連の処理手順により、周期的に増大する領域がエラー領域として決定された。図１２（Ｂ）は、上記のエラー領域を除去していない時系列のフォトンカウントデータに於いて検出された発光粒子の数（処理なし）と、上記のエラー領域を除去した時系列のフォトンカウントデータに於いて検出された発光粒子の数（処理あり）とを示している。同図を参照して、処理なしの発光粒子の検出数は、ウェル毎のばらつきが大きいが、処理ありの発光粒子の検出数は、ウェル毎のばらつきが大幅に低減され、略一致した。各ウェルには、同一の試料溶液が分注されていることを考慮すると、これらの結果は、上記の如く決定されたエラー領域を除去することにより、周期的に検出される不動の異物の光の信号が発光粒子の検出数から排除できることを示している。

実施例１で得られた時系列フォトンカウントデータを用いて、エラー領域の検出のための各周回のデータの時間のずれの補正を、第一の実施形態にて説明された処理手順により各周回のデータの相関係数を用いて実行した後、実施例１と同様に、エラー領域の検出及び除去、発光粒子信号の検出を実行した。図１３は、エラー領域を除去していない時系列のフォトンカウントデータに於いて検出された発光粒子の数（処理なし）と、エラー領域を除去した時系列のフォトンカウントデータに於いて検出された発光粒子の数（処理あり）とを示している。同図を参照して、実施例１の場合と同様に、処理なしの発光粒子の検出数は、ウェル毎のばらつきが大きいが、処理ありの発光粒子の検出数は、ウェル毎のばらつきが大幅に低減され、略一致した。これらの結果は、各周回のデータの相関係数を用いてずれ補正が為された時系列のフォトンカウントデータに於いて決定されたエラー領域を除去することにより、周期的に検出される不動の異物の光の信号が発光粒子の検出数から排除できることを示している。

実施例１で得られた時系列フォトンカウントデータを用いて、第三の実施形態にて説明された処理手順により「偏り値」を用いてエラー領域の検出及び除去、発光粒子信号の検出を実行した。「偏り値」の算出に於いては、まず、各区間は、ミラー偏向器による走査軌道一周回に相当するデータ領域として設定し、走査軌道上に計測された光強度値を割り当てた状態に於いて算出された光強度値の重心位置と走査軌道の中心位置との距離を「偏り値」として区間毎に算出した（従って、偏り値の単位は、μｍである。）。また、各区間の光強度値の平均値も算出した。そして、各周回の時系列フォトンカウントデータ光強度値の偏り値と平均値とを、それぞれ、区間毎に合算し、区間毎にそれらの平均値を算出した。

図１４（Ａ）は、時系列フォトンカウントデータの一部に於ける区間毎に算出された光強度平均値と偏り値とを示している。同図を参照して、光強度平均値が図中右側の領域に於いて増大するとともに、偏り値も増大した。なお、光強度平均値が極大となる領域に於いて偏り値が低減している理由は、光強度平均値の極大領域に於いては、当該区間内の全域に異物の光の信号が存在しているためであると考えられる。次いで、図１４（Ｂ）に示されている如く、図１４（Ａ）の各区間の光強度平均値に対して対応する区間の偏り値をプロットすると、図１４（Ａ）中の中央部分から左側部分に於ける光強度平均値と偏り値が比較的一定である区間のプロット点は、図１４（Ｂ）中の左下の一画に集中し、図１４（Ａ）に於いて光強度平均値と偏り値とに変化のある部分は、左下以外の部分に分散した。そこで、図１４（Ｂ）中の左下の一画に集中した区間が通常の領域として判別し、図１４（Ｂ）の左下以外の部分に分散した区間がエラー領域であると判別した。かかる判別は、具体的には、図１４（Ｂ）左下の一点鎖線よりも上のプロット点に対応する区間をエラー領域として判定した。即ち、下記の評価値
評価値＝−０．１３３（平均値−１．５）−偏り値
の値が正であるとき、その区間は、エラー領域であるとして判定した。

図１５（Ａ）は、上記の如く決定されたエラー領域が濃く示されている時系列フォトンカウントデータを示している。同図を参照して、相対的に光強度計測値の高い部分がエラー領域として決定されていることが理解される。

かくして、時系列のフォトンカウントデータに於いて上記の如く決定されたエラー領域を除去していない場合とエラー領域を除去した場合のそれぞれに於いて発光粒子の検出を行ったところ、図１５（Ｂ）に示されている如く、エラー領域を除去していない場合に検出された発光粒子の数（処理なし）は、ウェル毎のばらつきが大きいが、処理ありの発光粒子の検出数は、ウェル毎のばらつきが大幅に低減され、略一致した。これらの結果は、偏り値を用いて時系列のフォトンカウントデータに於いて決定されたエラー領域を除去することにより、周期的に検出される不動の異物の光の信号が発光粒子の検出数から排除できることを示している。

かくして、上記の実施例の結果から理解される如く、本発明の教示に従って、光検出領域の移動周期に対応して生ずる信号の領域を試料容器の壁に付着する不動の異物からの光の信号の領域として判別し排除できることが示された。

Claims

共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析装置であって、
前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、
前記光検出領域からの光を検出する光検出部と、
前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を所定の経路に沿って複数回周回移動させながら前記光検出部にて前記検出された前記光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、前記時系列の光強度データに於いて前記発光粒子の各々からの光を表す信号の特徴を有する信号を個別に検出する信号処理部とを含み、
前記信号処理部に於いて、前記発光粒子の各々からの光を表す信号の特徴を有する信号を個別に検出する処理に先立って、前記所定の経路上の同一の領域に対応する前記時系列の光強度データの光強度値の特徴量が前記所定の経路上の領域毎に算出され、前記特徴量に基づいて不動の発光体が存在するか否かが判定され、前記不動の発光体が存在すると判定された前記時系列の光強度データの領域のデータがエラー領域として判定され、前記エラー領域を除く前記時系列の光強度データに於いて前記発光粒子の各々からの光を表す信号の特徴を有する信号を個別に検出することを特徴とする装置。
請求項１の装置であって、前記特徴量が前記所定の経路上の同一の領域に対応する前記時系列の光強度データの光強度値の総計値、平均値又は偏り値であることを特徴とする装置。
請求項1又は２の装置であって、前記特徴量の算出に先立って、前記所定の経路上の各周回に対応する前記時系列の光強度データの各々の間に於ける対応する前記所定の経路上での位置に対応する時間のずれの大きさが前記時系列の光強度データに於ける光強度値に基づいて決定され、前記ずれが補正された状態で前記特徴量の算出が実行されることを特徴とする装置。
共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析方法であって、
前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を所定の経路に沿って複数回周回移動する過程と、
前記試料溶液内に於ける前記光検出領域の位置を周回移動させながら前記光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する過程と、
前記所定の経路上の同一の領域に対応する前記時系列の光強度データの光強度値の特徴量を前記所定の経路上の領域毎に算出し、前記特徴量に基づいて不動の発光体が存在するか否かを判定し、前記不動の発光体が存在すると判定された前記時系列の光強度データの領域のデータをエラー領域として判定する過程と
前記エラー領域を除く前記時系列の光強度データに於いて前記発光粒子の各々からの光を表す信号の特徴を有する信号を個別に検出する過程と
を含むことを特徴とする方法。
請求項４の方法であって、前記特徴量が前記所定の経路上の同一の領域に対応する前記時系列の光強度データの光強度値の総計値、平均値又は偏り値であることを特徴とする方法。
請求項４又は５の方法であって、前記特徴量の算出に先立って、前記所定の経路上の各周回に対応する前記時系列の光強度データの各々の間に於ける対応する前記所定の経路上での位置に対応する時間のずれの大きさが前記時系列の光強度データに於ける光強度値に基づいて決定され、前記ずれが補正された状態で前記特徴量の算出が実行されることを特徴とする方法。
共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出するための光分析用コンピュータプログラムであって、
前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を所定の経路に沿って複数回周回移動する手順と、
前記試料溶液内に於ける前記光検出領域の位置を周回移動させながら前記光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順と、
前記所定の経路上の同一の領域に対応する前記時系列の光強度データの光強度値の特徴量を前記所定の経路上の領域毎に算出し、前記特徴量に基づいて不動の発光体が存在するか否かを判定し、前記不動の発光体が存在すると判定された前記時系列の光強度データの領域のデータをエラー領域として判定する手順と
前記エラー領域を除く前記時系列の光強度データに於いて前記発光粒子の各々からの光を表す信号の特徴を有する信号を個別に検出する手順と
をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラム。
請求項７のコンピュータプログラムであって、前記特徴量が前記所定の経路上の位置又は領域に対応する前記時系列の光強度データの光強度値の総計値、平均値又は偏り値であることを特徴とするコンピュータプログラム。
請求項７又は８のコンピュータプログラムであって、前記特徴量の算出に先立って、前記所定の経路上の各周回に対応する前記時系列の光強度データの各々の間に於ける対応する前記所定の経路上での位置に対応する時間のずれの大きさが前記時系列の光強度データに於ける光強度値に基づいて決定され、前記ずれが補正された状態で前記特徴量の算出が実行されることを特徴とするコンピュータプログラム。