JP2002537570A - 物体構造を見いだし、記録し、場合によっては、評価する方法 - Google Patents

物体構造を見いだし、記録し、場合によっては、評価する方法

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JP2002537570A JP2000589986A JP2000589986A JP2002537570A JP 2002537570 A JP2002537570 A JP 2002537570A JP 2000589986 A JP2000589986 A JP 2000589986A JP 2000589986 A JP2000589986 A JP 2000589986A JP 2002537570 A JP2002537570 A JP 2002537570A
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ヨハン エンゲルハルト，
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Abstract

(57)【要約】 特に、対象担体（１４）上の物体構造、好ましくは、蛍光発生物体構造、例えば、遺伝子スポット（１５）を見つけ、記録し、場合によっては、評価する方法であって、ＣＣＤカメラを備えた顕微鏡、走査（ラスタ）顕微鏡または、好ましくは、共焦点レーザ走査（ラスタ）顕微鏡を記録に使用する形式の方法は、物体構造の迅速且つ確実な検知のために、物体面（５）に投影された明るさパタン（１６）を使用して像データを記録することを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特に、物体ホルダ上の物体構造、好ましくは、蛍光発生物体構造、
例えば、遺伝子スポットを見いだし、記録し、場合によっては、評価する方法で
あって、ＣＣＤカメラを備えた顕微鏡、走査（ラスタ）顕微鏡または、好ましく
は、共焦点レーザ走査顕微鏡を記録に使用する形式のものに関する。
【０００２】
【技術的背景】
多様な用途において、例えば、自動製造プロセスの枠内において、個々の−任
意の−物体構造を位置決めする。しばしば、物体構造を再び見いだして所定の信
頼度で分類する必要がある。
【０００３】 本発明は、基本的に、任意の種類の物体構造を見いだし、記録し、場合によっ
ては、次いで評価する方法に関する。この場合、上記物体構造（例えば、蛍光発
生遺伝子スポット）は、通常、物体ホルダ上に配置または設置される。更に、こ
の場合、従来は、いわゆる遺伝子スキャナを使用する方法が対象となる。物体ホ
ルダまたはこのホルダ上に設置された５０μｍ−１００μｍの範囲の径を有する
蛍光発生スポットを結像する。この場合、通常の微視的像が対象であり、上記像
は、例えば、ＣＣＤカメラと組合せて記録する。更に、走査（ラスタ）顕微鏡ま
たは共焦点レーザ顕微鏡（ＣＬＳＭ）も使用できる。共焦点レーザ顕微鏡の場合
、一般に、検知可能なダイナミック範囲が高いので、共焦点レーザ顕微鏡による
検知技術が好ましい。従来の共焦点レーザ顕微鏡で記録する場合、像は、極めて
高い位置分解能で記録され、従って、例えば、物体特定のため、後から、コンピ
ュータ制御による分割操作（セグメント化）が必要である。この操作は、極めて
時間がかかり、著しいコンピュータ容量を必要とする。検知能に鑑みて、記録・
評価法に対する要求は、通常、μｍ2乗当り１つの分子および約１％にある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】 実際に知られている遺伝子スキャナおよびこの際に使用される方法は、−不必
要に−大きい位置分解能の所要のデータ記録にもとづき且つ所要容量に起因して
高いコンピュータ計算の必要な以降の所要の分割（セグメント化）にもとづき、
極めて大がかりとなり、この場合、装置が、著しく大がかりとなる。更に、コン
ピュータによって実施される各蛍光物体の分割は、しばしば、エラーを伴い、従
って、約１％の所要精度が、必ずしも達成されない。この限りにおいて、実際に
知られている従来の方法は不十分である。
【０００５】 従って、本発明の課題は、物体構造を迅速に且つ十分確実に検知できる形式の
、特に、物体ホルダ上の物体構造、好ましくは、蛍光発生物体構造（例えば、遺
伝子スポット）を見いだし、記録し、場合によっては、評価する方法を提供する
ことにある。物体構造の検知は、高能率でなければならない。この場合、特殊な
評価法によって、物体構造の正確且つ迅速で、更に、確実な特定および位置決め
を実現できる。すべての場合、蛍光物体の放射蛍光強度が限定されることがある
という状態を考慮しなければならない。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記課題は、請求項１の特徴によって解決される。上記請求項にもとづき、上
述の種類の方法は、物体面に投影された照明パタンを使用して像データを記録す
ることを特徴とする。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明にもとづき、物体ホルダ上の物体構造、特に、蛍光発生物体構造−例え
ば、遺伝子スポット−を見いだし、記録し、更に、評価するため、物体空間内の
物体構造を特殊な照明パタンで照明するか、−蛍光発生物体構造の場合は−特殊
な照明パタンによって物体空間内に蛍光を励起すれば有利であることが確認され
る。これは、物体構造上に特殊な照明パタンを投影することによって実現する。
さて、本発明に係る態様で、照明パタンの下方を物体ホルダまたは物体構造−即
ち、例えば、蛍光発生遺伝子スポット−を線形に移動させる。この場合、物体構
造の上方を照明パタンを線形に移動することも考えられる。記録時、照明パタン
の移動推移に対する物体構造の位置に応じて、特定の出力強度曲線（推移）が生
ずる。この強度曲線は、例えば、照明パタンと当該の物体構造とのたたみこみ即
ち重ね合わせによって記述できる。強度曲線の形状を参照して、走査が当該の物
体構造の中心で行われたか縁で行われたかを迅速に且つ簡単な演算ルーチンによ
って確認できる。経費のかかる分割アルゴリズムを要することなく、対象構造を
位置決めでき、この場合、各物体構造の測定強度が相互に異なれば、物体構造の
位置決めを特に簡単に計算できる。特に物体構造および物体構造寸法の所定の配
置において、境界条件の適切な選択によって、即ち、当該の照明パタンについて
記録した像データの“展開”によって、物体構造の分類および物体構造の位置決
めを一義的に行うことができる。
【０００８】 物体空間内に逆反射または蛍光を設定可能な照明パタンによって励起すれば有
利である。即ち、照明パタンの大きさおよびジオメトリを設定でき、かくして、
見いだして記録すべき物体構造に対する最適な適合を取ることができる。
【０００９】 更に、照明光路に設けた照明マスクの投影によって照明パタンを形成すれば有
利である。この照明マスクは、光源またはレーザと分光器との間に設置できる。
更に、分光器と物体面の前に設けた対物レンズとの間の配置も考えられ、このよ
うに配置した場合、逆反射または蛍光を自由に通過させるための特殊な方策およ
び照明パタンで反射された照明光部分の直接的検知を避けるための特殊な方策を
取るべきである。すべての場合、照明パタンは、顕微鏡の照明光路に光軸に対称
に配置でき、この場合、照明光は、レンズまたはレンズ系および対物レンズによ
って−照明マスクを介して−物体面または物体構造に投影される。投影された照
明パタンの形状および大きさは、検知すべき物体構造の形状に、場合によっては
更に、大きさに適合させれば有利である。
【００１０】 物体構造の照明に関して、逆反射の１つのみの波長よりも多数の波長および１
つのみの蛍光染料よりも多数の蛍光染料を同時に検知できるよう、同一のまたは
異なる照明マスクを含む少なくとも２つの照明光源または適切な分光器を含む照
明光源を使用すれば、更なる利点が得られる。少なくとも２つの照明光源を並置
して並行操作することによって、特に、走査速度を著しく増大できる。
【００１１】 逆反射または蛍光分布は、検知光路に設けた検知マスクによって検知され、こ
の場合、分光器と検知器との間に検知マスクを配置すれば更に有利である。検知
マスクのパタンは、−同じく有利な態様で−照明マスクのパタンと少なくとも十
分に同一であり、この限りにおいて、検知すべき物体構造とも一致すれば有利で
ある。
【００１２】 基本的に、物体または物体構造にわたって照明パタンを走査することができる
。この場合は、光走査または光束走査である。位置不変の光束の下方を物体を移
動させれば特に有利である。この場合は、物体走査である。物体走査は、光走査
または光束走査に比して好ましい。なぜならば、この場合、結像光学系をより簡
単に構成でき、結果として、更に、コスト減が達成されるからである。
【００１３】 物体の特徴づけおよび場合による物体位置の決定は、撮像中にまたは撮像直後
に行うことができる。次いで、像情報の十分な処理を行うことができる。
【００１４】 記録中に物体構造を越えて測定された強度曲線は、数学的“処理”によって、
即ち、例えば、照明パタンと当該の物体構造とのたたみこみ即ち重ね合わせによ
って記述される。強度曲線（出力）の形状を参照して、適切な演算ルーチンによ
って、走査が当該の物体構造の中心で行われたか縁で行われたかを確認する。す
べての場合、強度曲線を参照して、各物体構造の具体的位置を決定できる。
【００１５】 更に、−演算作業および管理データの減少は云うまでもないが−照明パタンに
よって測定した像データの数学的展開によって、記録された物体構造に関する情
報を抽出すれば有利である。この場合、少なくとも２つの異なる波長の照明光に
よって像データを同時に記録し、少なくとも２つの異なる検知チャンネルにおい
て検知できる。当該の検知チャンネルにおける数学的展開は、対応する照明マス
クによって実施する。この場合、照明マスクおよび検知マスクを相互に適合させ
れば有利である。
【００１６】 照明および検知は、更に有利な態様で、それぞれ、少なくとも２つの照明マス
クおよび検知マスクによって実施でき、この場合、各照明マスクおよび各検知マ
スクは、異なる形状および大きさを有することができる。照明マスクの所与の形
状に依拠して−更には検知マスクの所与の形状にも依拠して−、特殊なコンピュ
ータ・ハードウェアによって数学的展開を実施できる。この場合、ＦＰＧＡ（＝
Ｆｉｅｌｄ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｇａｔｅ Ａｒｒａｙｓ）を使用でき
、かくして、リアルタイムでの処理が可能である。理想的な場合、当該の物体構
造の抽出された物体情報のみを記憶する。
【００１７】 本発明に係る方法の特別な利点は、データが減少され、かくして、記録・評価
コンピュータの記憶装置および記憶容量に対する要求が減少されるという点にあ
る。更に、この限りにおいて、この場合に必要なシステムのコストも本発明に係
る態様で減少される。
【００１８】 物体または物体構造の照明は、本質的に円形、長方形または多角形の照明マス
クを使用して、好ましくは予設定可能な波長の光によって行う。既述の如く、照
明マスクの形状および寸法を当該の物体構造に適合させれば有利である。この場
合、検知は、照明マスクの形状および寸法に適合させ得る本質的に円形、長方形
または多角形の検知マスクによって行う。データ評価のために、測定した強度信
号が、達成可能な反射強度または蛍光強度に関して照明パタンおよび物体構造の
形状の交差関連性を有すという知見が有利である。この場合、たたみこみないし
重ね合わせの数学的特殊例が対象となる。この場合、照明パタンの寸法は、対応
する回折限定式エアリー・ディスクよりも大きい
【００１９】 更に付言するが、物体構造は、微視的または巨視的寸法を有することができる
。照明マスクおよび検知マスクの対応する適合が可能である。
【００２０】 さて、本発明の教示を有利な態様に構成、改良する多様な可能性がある。これ
に関して、一方では、請求項１に後置の請求項を挙げ、他方では、図面を参照す
る本発明の実施例の以下の説明を挙げる。図面を参照する本発明の好ましい実施
例の説明と組合せて、教示の一般的に好ましい構成および改良を説明する。
【００２１】
【実施例】
図１に示した如く、模式的に示した共焦点レーザ走査顕微鏡ユニットが、本発
明に係る方法の適用に役立つ。このユニットは、−本質的構成部材として−レー
ザ光源１および検知器２を含み、この場合、照明光路３は、２色分光器（ダイク
ロイックビームスプリッタ）４を介して物体面５へ向かって方向変更される。照
明光路３には、レンズ系６，照明マスク７，他のレンズ系８，分光器４および物
体面５の前に対物レンズ９が設けてある。逆反射および蛍光は、物体面５から対
物レンズ９，検知光路１０，分光器４，レンズ系１１を介して検知マスク１２に
達し、検知マスク１２および他のレンズ系１３を介して検知器１２に達する。本
発明に係る方法に関して本質的な構成部材は、共役面に設置され、一方では、形
状および寸法に関して相互に適合され、他方では、（物体面５の）当該の物体構
造に適合された照明マスク７および検知マスク１２である。
【００２２】 図２に、例として、物体構造を載せた物体ホルダ１４を模式的に示した。この
場合、具体的に云えば、物体構造は、遺伝子スポット１５である。図示の遺伝子
スポット１５は、同一の形状および同一の寸法を有し、相互に等間隔に配置され
ている。
【００２３】 物体ホルダ１４は、本発明に係る方法にもとづき、実際の照明パタン１６の下
方においてｘ方向へ直線１７，１８に沿って、即ち、当該の遺伝子スポット１５
の縁範囲では直線１７にもとづき移動され、当該の遺伝子スポット１５の中心で
は直線１８にもとづき移動される。
【００２４】 走査後、図３のグラフに示した−測定された−強度曲線(出力)１９，２０が得
られる。この場合、強度曲線（出力）１９は、図２の直線１７にもとづく走査プ
ロセスから得られた結果であり、強度曲線（出力）２０は、図２の直線１８にも
とづく走査プロセスの結果である。
【００２５】 強度曲線（出力）１９，２０は、照明パタン１６と当該の遺伝子スポット１５
とのたたみこみ（重ね合わせ）によって数学的に記述できる。強度曲線（出力）
１９，２０の形状を参照して、簡単な演算ルーチンによって、走査を図２の直線
１８にもとづき中心で行ったか直線１７にもとづき縁で行ったかを確認できる。
複雑な分割アルゴリズムを要することなく、各遺伝子スポット１５の位置を決定
できる。
【００２６】 上述の説明を補足して云うが、図２には、同図において円形に構成した照明パ
タン１６の径ｄ，同図に同じく円形に示した遺伝子スポット１５の径Ｄおよび隣
接の２つの遺伝子スポット１５の間の距離Ｍ（走査方向へ縁と縁の間で測定した
距離）を示した。上記パラメータは、以下に説明する図３に、同図に示した強度
曲線１９，２０の枠内に対応して示した。
【００２７】 図３に示した出力強度曲線（推移）１９，２０の場合または図２で選択した物
体ホルダ１４上の遺伝子スポット１５の配置の場合、遺伝子スポットは、同一の
蛍光強度を有する。遺伝子スポット１５の測定強度が相互に異なっていても、強
度曲線を参照して、遺伝子スポット１５を位置決めできる。
【００２８】 照明パタン１６が均一な照明強度を有し且つ遺伝子スポット１５の求めた蛍光
強度が均一であると仮定して、測定した強度曲線２０を図３（下部グラフ）に模
式的に示した。
【００２９】 照明パタン１６の面が遺伝子スポット１５の面と完全に重畳していない限り（
完全重畳に至るまで）、測定信号または強度曲線２０は、走査方向（ｘ方向、図
２の符号１８）へほぼ線形に上昇する（強度曲線の左側の上昇範囲，ｄ）。照明
パタン１６の面が、完全に遺伝子スポット１５内にある場合は、範囲Ｄ−ｄにわ
たって一定の信号が測定される。照明パタン１６の面が、走査推移に伴い再び遺
伝子スポット１５の面外に出ると直ちに、ほぼ線形に下降する信号が測定される
（強度曲線の右側の範囲，ｄ）。照明パタン１６の面が遺伝子スポットの面と重
畳しない期間には、信号は検知されない（範囲Ｍ−ｄ）。
【００３０】 図面から知り得ない他の特徴に関しては、反復を避けるため、詳細な説明の総
合的部分を参照されたい。
【００３１】 更に付言するが、上述の実施例は、本発明に係る教示を説明するものであるが
、この実施例に限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明に係る方法を適用するための光学装置の基本的構造の略図である。
【図２】 遺伝子スポットを含む物体ホルダおよび走査路を示す略平面図である。
【図３】 図２に示した走査運動の強度曲線を示す上下に配置した２つのグラフである。
【符号の説明】
１ レーザ光源 ２ 検知器 ３ 照明光路 ４ ２色分光器（ダイクロイックビームスプリッタ） ５ 物体面 ６ レンズ系 ７ 照明マスク ８ レンズ系 ９ 対物レンズ １０ 検知光路 １１ レンズ系 １２ 検知マスク １３ レンズ系 １４ 物体ホルダ １５ 遺伝子スポット １６ 照明パタン １７ 直線（遺伝子スポットの縁範囲の出力強度曲線） １８ 直線（遺伝子スポットの中心の出力強度曲線） １９ （直線１７にもとづく）出力強度曲線 ２０ （直線１８にもとづく）出力強度曲線
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年１１月３日（２０００．１１．３）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の名称】 物体構造を見いだし、記録し、場合によっては、評価する方法
【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】 本発明は、特に、物体ホルダ上の物体構造、好ましくは、蛍光発生物体構造、
例えば、遺伝子スポットを見いだし、記録し、場合によっては、評価する方法で
あって、ＣＣＤカメラを備えた顕微鏡、走査（ラスタ）顕微鏡または、好ましく
は、共焦点レーザ走査顕微鏡を記録に使用する形式のものに関する。
【０００２】
【技術的背景】 ヨーロッパ特許出願公開ＥＰ０４４０３４２には、共焦点顕微鏡のための顕微
鏡的走査法が開示されている。提案された方法の場合、ゲル層を含む物体ホルダ
上に被検ＤＮＡまたはＲＮＡ試料を設置する。各種のＤＮＡまたはＲＮＡ分子は
、ゲル層内を異なる程度に移動する。この場合、共焦点顕微鏡によって、ゲル層
内の移動経路を参照して分子を決定できる。上記ＥＰ出願公開に提案の方法は、
物体ホルダ上の所定の物体構造を迅速に且つ妥当なコストで見いだし、定めるの
には不適である。 多様な用途において、例えば、自動製造プロセスの枠内において、個々の−任
意の−物体構造を位置決めする。しばしば、物体構造を再び見いだして所定の信
頼度で分類する必要がある。
【０００３】 本発明は、基本的に、任意の種類の物体構造を見いだし、記録し、場合によっ
ては、次いで評価する方法に関する。この場合、上記物体構造（例えば、蛍光発
生遺伝子スポット）は、通常、物体ホルダ上に配置または設置される。更に、こ
の場合、従来は、いわゆる遺伝子スキャナを使用する方法が対象となる。物体ホ
ルダまたはこのホルダ上に設置された５０μｍ−１００μｍの範囲の径を有する
蛍光発生スポットを結像する。この場合、通常の微視的像が対象であり、上記像
は、例えば、ＣＣＤカメラと組合せて記録する。更に、走査（ラスタ）顕微鏡ま
たは共焦点レーザ顕微鏡（ＣＬＳＭ）も使用できる。共焦点レーザ顕微鏡の場合
、一般に、検知可能なダイナミック範囲が高いので、共焦点レーザ顕微鏡による
検知技術が好ましい。従来の共焦点レーザ顕微鏡で記録する場合、像は、極めて
高い位置分解能で記録され、従って、例えば、物体特定のため、後から、コンピ
ュータ制御による分割操作（セグメント化）が必要である。この操作は、極めて
時間がかかり、著しいコンピュータ容量を必要とする。検知能に鑑みて、記録・
評価法に対する要求は、通常、μｍ2乗当り１つの分子および約１％にある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】 実際に知られている遺伝子スキャナおよびこの際に使用される方法は、−不必
要に−大きい位置分解能の所要のデータ記録にもとづき且つ所要容量に起因して
高いコンピュータ計算の必要な以降の所要の分割（セグメント化）にもとづき、
極めて大がかりとなり、この場合、装置が、著しく大がかりとなる。更に、コン
ピュータによって実施される各蛍光物体の分割は、しばしば、エラーを伴い、従
って、約１％の所要精度が、必ずしも達成されない。この限りにおいて、実際に
知られている従来の方法は不十分である。
【０００５】 従って、本発明の課題は、物体構造を迅速に且つ十分確実に検知できる形式の
、特に、物体ホルダ上の物体構造、好ましくは、蛍光発生物体構造（例えば、遺
伝子スポット）を見いだし、記録し、場合によっては、評価する方法を提供する
ことにある。物体構造の検知は、高能率でなければならない。この場合、特殊な
評価法によって、物体構造の正確且つ迅速で、更に、確実な特定および位置決め
を実現できる。すべての場合、蛍光物体の放射蛍光強度が限定されることがある
という状態を考慮しなければならない。
【０００６】
【課題を解決するための手段】 上記課題は、請求項１の特徴によって解決される。上記請求項にもとづき、上
述の種類の方法は、物体面に投影された照明パタンを使用して像データを記録す
ることを特徴とする。
【０００７】
【発明の実施の形態】 本発明にもとづき、物体ホルダ上の物体構造、特に、蛍光発生物体構造−例え
ば、遺伝子スポット−を見いだし、記録し、更に、評価するため、物体空間内の
物体構造を特殊な照明パタンで照明するか、−蛍光発生物体構造の場合は−特殊
な照明パタンによって物体空間内に蛍光を励起すれば有利であることが確認され
ている。これは、物体構造上に特殊な照明パタンを投影することによって実現す
る。さて、本発明に係る態様で、照明パタンの下方を物体ホルダまたは物体構造
−即ち、例えば、蛍光発生遺伝子スポット−を線形に移動させる。この場合、物
体構造の上方を照明パタンを線形に移動することも考えられる。記録時、照明パ
タンの移動推移に対する物体構造の位置に応じて、特定の出力強度が生ずる。こ
の出力は、例えば、照明パタンの時間的、位置的移動と当該の物体構造とのたた
みこみ即ち重ね合わせによって記述できる。出力の形状を参照して、走査が当該
の物体構造の中心で行われたか縁で行われたかを迅速に且つ簡単な演算ルーチン
によって確認できる。経費のかかる分割アルゴリズムを要することなく、対象構
造を位置決めでき、この場合、各物体構造の測定強度が相互に異なれば、物体構
造の位置決めを特に簡単に計算できる。特に物体構造の所定の配置および物体構
造寸法において、境界条件の適切な選択によって、即ち、当該の照明パタンにつ
いて記録した像データの“展開”によって、物体構造の分類および物体構造の位
置決めを一義的に行うことができる。
【０００８】 物体空間内に逆反射または蛍光を設定可能な照明パタンによって励起すれば有
利である。即ち、照明パタンの大きさおよびジオメトリを設定でき、かくして、
見いだして記録すべき物体構造に対する最適な適合を取ることができる。
【０００９】 更に、照明光路に設けた照明マスクの投影によって照明パタンを形成すれば有
利である。この照明マスクは、光源またはレーザと分光器との間に設置できる。
更に、分光器と物体面の前に設けた対物レンズとの間の配置も考えられ、このよ
うに配置した場合、逆反射または蛍光を自由に通過させるための特殊な方策およ
び照明パタンで反射された照明光部分の直接的検知を避けるための特殊な方策を
取るべきである。すべての場合、照明パタンは、顕微鏡の照明光路に光軸に対称
に配置でき、この場合、照明光は、レンズまたはレンズ系および対物レンズによ
って−照明マスクを介して−物体面または物体構造に投影される。投影された照
明パタンの形状および大きさは、検知すべき物体構造の形状に、場合によっては
更に、大きさに適合させれば有利である。
【００１０】 物体構造の照明に関して、逆反射の１つのみの波長よりも多数の波長および１
つのみの蛍光染料よりも多数の蛍光染料を同時に検知できるよう、同一のまたは
異なる照明マスクを含む少なくとも２つの照明光源または適切な分光器を含む照
明光源を使用すれば、更なる利点が得られる。少なくとも２つの照明光源を並置
して並行操作することによって、特に、走査速度を著しく増大できる。
【００１１】 逆反射または蛍光分布は、検知光路に設けた検知マスクによって検知され、こ
の場合、分光器と検知器との間に検知マスクを配置すれば更に有利である。検知
マスクのパタンは、−同じく有利な態様で−照明マスクのパタンと少なくとも十
分に同一であり、この限りにおいて、検知すべき物体構造とも一致すれば有利で
ある。
【００１２】 基本的に、物体または物体構造にわたって照明パタンを走査することができる
。この場合は、光走査または光束走査が対象である。位置不動の光束の下方を物
体を移動させれば特に有利である。この場合は、物体走査が対象である。物体走
査は、光走査または光束走査に比して好ましい。なぜならば、この場合、結像光
学系をより簡単に構成でき、結果として、更に、コスト減が達成されるからであ
る。
【００１３】 物体の特徴づけおよび場合による物体位置の決定は、撮像中にまたは撮像直後
に行うことができる。次いで、像情報の十分な処理を行うことができる。
【００１４】 記録中に物体構造を越えて測定された出力量は、照明パタンの時間的、位置的
推移と当該の物体構造との重ね合わせよって求められるか記述される。出力の形
状を参照して、適切な演算ルーチンによって、走査が当該の物体構造の中心で行
われたか縁で行われたかを確認する。すべての場合、強度曲線を参照して、各物
体構造の具体的位置を決定できる。
【００１５】 更に、−演算作業および管理データの減少は云うまでもないが−照明パタンに
よって測定した像データに依存して適切な数学的方法によって、記録された物体
構造に関する情報を抽出すれば有利である。この場合、少なくとも２つの異なる
波長の照明光によって像データを同時に記録し、少なくとも２つの異なる検知チ
ャンネルにおいて検知できる。当該の検知チャンネルにおける数学的展開は、対
応する照明マスクによって実施する。この場合、照明マスクおよび検知マスクを
相互に適合させれば有利である。
【００１６】 照明および検知は、更に有利な態様で、それぞれ、少なくとも２つの照明マス
クおよび検知マスクによって実施でき、この場合、各照明マスクおよび各検知マ
スクは、異なる形状および大きさを有することができる。照明マスクの所与の形
状に依拠して−更には検知マスクの所与の形状にも依拠して−、特殊なコンピュ
ータ・ハードウェアによって数学的展開を実施できる。この場合、ＦＰＧＡ（＝
Ｆｉｅｌｄ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｇａｔｅ Ａｒｒａｙｓ）を使用でき
、かくして、リアルタイムでの処理が可能である。理想的な場合、当該の物体構
造の抽出された物体情報のみを記憶する。
【００１７】 本発明に係る方法の特別な利点は、データが減少され、かくして、記録・評価
コンピュータの記憶装置および記憶容量に対する要求が減少されるという点にあ
る。更に、この限りにおいて、この場合に必要なシステムのコストも本発明に係
る態様で減少される。
【００１８】 物体または物体構造の照明は、本質的に円形、長方形または多角形の照明マス
クを使用して、好ましくは予設定可能な波長の光によって行う。既述の如く、照
明マスクの形状および寸法を当該の物体構造に適合させれば有利である。この場
合、検知は、照明マスクの形状および寸法に適合させ得る本質的に円形、長方形
または多角形の検知マスクによって行う。データ評価のために、測定した強度信
号が、達成可能の反射強度または蛍光強度に関して照明パタンおよび物体構造の
形状の交差関連性を有するという知見が有利である。この場合、たたみこみない
し重ね合わせの数学的特殊例が対象となる。この場合、照明パタンの寸法は、対
応する回折限定式エアリー・ディスクよりも大きい
【００１９】 更に付言するが、物体構造は、微視的または巨視的寸法を有することができる
。照明マスクおよび検知マスクの対応する適合が可能である。
【００２０】 さて、本発明の教示を有利な態様に構成、改良する多様な可能性がある。これ
に関して、一方では、請求項１に後置の請求項を挙げ、他方では、図面を参照す
る本発明の実施例の以下の説明を挙げる。図面を参照する本発明の好ましい実施
例の説明と組合せて、教示の一般的に好ましい構成および改良を説明する。
【００２１】
【実施例】 図１に示した如く、模式的に示した共焦点レーザ走査顕微鏡ユニットが、本発
明に係る方法の適用に役立つ。このユニットは、−本質的構成部材として−レー
ザ光源１および検知器２を含み、この場合、照明光路３は、２色分光器（ダイク
ロイックビームスプリッタ）４を介して物体面５へ向かって方向変更される。照
明光路３には、レンズ系６，照明マスク７，他のレンズ系８，分光器４および物
体面５の前に対物レンズ９が設けてある。逆反射および蛍光は、物体面５から対
物レンズ９，検知光路１０，分光器４，レンズ系１１を介して検知マスク１２に
達し、検知マスク１２および他のレンズ系１３を介して検知器１２に達する。本
発明に係る方法に関して本質的な構成部材は、共役面に設置され、一方では、形
状および寸法に関して相互に適合され、他方では、（物体面５の）当該の物体構
造に適合された照明マスク７および検知マスク１２である。
【００２２】 図２に、例として、物体構造を載せた物体ホルダ１４を模式的に示した。この
場合、具体的に云えば、物体構造は、遺伝子スポット１５である。図示の遺伝子
スポット１５は、同一の形状および同一の寸法を有し、相互に等間隔に配置され
ている。
【００２３】 物体ホルダ１４は、本発明に係る方法にもとづき、実際の照明パタン１６の下
方においてｘ方向へ直線１７，１８に沿って、即ち、当該の遺伝子スポット１５
の縁範囲では直線１７にもとづき移動され、当該の遺伝子スポット１５の中心で
は直線１８にもとづき移動される。
【００２４】 投影された照明パタン１６の形状および、場合によっては、大きさは、検知す
べき物体構造の形状および、場合によって、大きさに適合させることができる。
更に、異なる照明マスク７を含む少なくとも２つの光源を使用できる。少なくと
も２つの照明光源による像記録を比較対照する。走査プロセスは、２つの異なる
方法で実施できる。１つの方法の場合、物体に対して照明パタンを走査させる（
光走査または光束走査）。他の方法の場合、位置不変の照明パタンの下方を物体
を移動することができる。物体の特徴づけは、記録中に既にまたは記録後に行う
ことができる。記録された物体構造は、測定された像データおよび照明パタン１
６の数学的展開による情報抽出によって得られる。像データは、２つの異なる波
長によって同時に記録し、２つの異なる検知器で検知する。各種の検知チャンネ
ルにおいて、対応する照明マスク７によって当該検知信号の展開を実施する。
【００２５】 照明マスク７の所与の形状に依拠して、特殊なコンピュータ・ハードウェアに
よって−好ましくは、ＦＰＧＡ（＝Ｆｉｅｌｄ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｇ
ａｔｅ Ａｒｒａｙｓ）によって−数学的展開をリアルタイムで実現でき、かく
して、理想的な場合、当該の物体構造の抽出された物体情報のみを記憶すればよ
い。
【００２６】 データ減少を実施し、かくして、記録・評価コンピュータの記憶容量に対する
要求が減少される。
【００２７】 走査後、図３のグラフに示した−測定された−出力１９，２０が得られる。こ
の場合、出力１９は、図２の直線１７にもとづく走査プロセスから得られた結果
であり、出力２０は、図２の直線１８にもとづく走査プロセスの結果である。
【００２８】 出力１９，２０は、照明パタン１６の時間的、位置的推移と当該の遺伝子スポ
ット１５との重畳によって数学的に記述できる。出力１９，２０の形状を参照し
て、簡単な演算ルーチンによって、走査を図２の直線１８にもとづき中心で行っ
たか直線１７にもとづき縁で行ったかを確認できる。複雑な分割アルゴリズムを
要することなく、各遺伝子スポット１５の位置を決定できる。
【００２９】 上述の説明を補足して云うが、図２には、同図において円形に構成した照明パ
タン１６の径ｄ，同図に同じく円形に示した遺伝子スポット１５の径Ｄおよび隣
接の２つの遺伝子スポット１５の間の距離Ｍ（走査方向へ縁と縁の間で測定した
距離）を示した。上記パラメータは、以下に説明する図３に、同図に示した出力
強度曲線１９，２０の枠内に対応して示した。
【００３０】 図３に示した出力１９，２０の場合または図２で選択した物体ホルダ１４上の
遺伝子スポット１５の配置の場合、遺伝子スポットは、同一の蛍光強度を有する
。遺伝子スポット１５の出力量が相互に異なっていても、出力を参照して、遺伝
子スポット１５を位置決めできる。
【００３１】 照明パタン１６が均一な照明強度を有し且つ遺伝子スポット１５の求めた蛍光
強度が均一であると仮定して、測定した出力曲線２０を図３（下部グラフ）に模
式的に示した。
【００３２】 照明パタン１６の面が遺伝子スポット１５の面と完全に重畳しない間、測定信
号または出力曲線２０の推移は、走査方向（ｘ方向、図２の符号１８）へほぼ線
形に上昇する（出力曲線の左側の上昇範囲，ｄ）。照明パタン１６の面が、完全
に遺伝子スポット１５内にある場合は、範囲Ｄ−ｄにわたって一定の信号が測定
される。照明パタン１６の面が、走査推移に伴い再び遺伝子スポット１５の面外
に出ると直ちに、ほぼ線形に下降する信号が測定される（出力曲線の右側の範囲
，ｄ）。照明パタン１６の面が遺伝子スポットの面と重畳しない期間には、信号
は検知されない（範囲Ｍ−ｄ）。
【００３３】 本質的に、円形、長方形または多角形の照明マスク７を使用して、好ましくは
予設定可能な波長の光による照明を行う。
【００３４】 照明マスク７は、均一な照明強度を実現できるよう構成されている。
【００３５】 更に、本質的に円形、長方形または多角形の検知マスク１２を使用して、検知
を行う。
【００３６】 測定された強度信号は、達成可能な反射強度または蛍光強度に関する照明パタ
ン１６および物体構造の形状の交差関連性を有し、即ち、たたみこみないし重ね
合わせの数学的特殊例を示す。
【００３７】 照明パタン１６の寸法は、対応する回折限定式エアリー・ディスクよりも大き
く選択されている。
【００３８】 物体構造は、微視的寸法を有することができる。同じく、物体構造は巨視的寸
法を有することも可能である。
【００３９】 図面から知り得ない他の特徴に関しては、反復を避けるため、詳細な説明の総
合的部分を参照されたい。
【００４０】 更に付言するが、上述の実施例は、本発明に係る教示を説明するものであるが
、この実施例に限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明に係る方法を適用するための光学装置の基本的構造の略図である。
【図２】 遺伝子スポットを含む物体ホルダおよび走査路を示す略平面図である。
【図３】 図２に示した走査運動のを示す上下に配置した２つのグラフである。
【符号の説明】 １ レーザ光源 ２ 検知器 ３ 照明光路 ４ ２色分光器（ダイクロックビームスプリッタ） ５ 物体面 ６ レンズ系 ７ 照明マスク ８ レンズ系 ９ 対物レンズ １０ 検知光路 １１ レンズ系 １２ 検知マスク １３ レンズ系 １４ 物体ホルダ １５ 遺伝子スポット １６ 照明パタン １７ 直線（遺伝子スポットの縁範囲の出力） １８ 直線（遺伝子スポットの中心の出力） １９ （直線１７にもとづく）出力曲線（推移） ２０ （直線１８にもとづく）出力曲線（推移）
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 2G043 AA03 BA16 CA09 EA01 FA02 GA02 GA04 GB01 HA01 HA09 JA02 KA02 KA09 LA03 MA01 NA01 NA05 NA06 NA16 2G059 AA05 BB12 CC16 EE02 EE07 FF03 GG01 HH02 JJ07 JJ11 JJ22 KK04 MM01 MM09 MM10 NN01 2H052 AA07 AA08 AA09 AC04 AD19 AD31 AF02

Claims (29)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 特に、物体ホルダ（１４）上の物体構造、好ましくは、蛍光
    発生物体構造、例えば、遺伝子スポット（１５）を見いだし、記録し、場合によ
    っては、評価する方法であって、ＣＣＤカメラを備えた顕微鏡、ラスタ顕微鏡ま
    たは、好ましくは、共焦点レーザ走査顕微鏡を記録に使用する形式のものにおい
    て、物体面（５）に投影された照明パタン（１６）を使用して像データを記録す
    ることを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】 設定可能な照明パタン（１６）によって物体空間内に逆反射
    または蛍光を励起することを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 照明パタン（１６）の大きさおよびジオメトリを設定できる
    ことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 照明光路（３）に設けた照明マスク（７）の投影によって照
    明パタン（１６）を形成することを特徴とする請求項１−３の１つに記載の方法
    。
  5. 【請求項５】 照明パタン（１６）が、照明光路（１３）に光軸に対称に配
    置されていることを特徴とする請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 投影された照明パタン（１６）の形状および、場合によって
    は、大きさを検知すべき物体構造の形状および、場合によっては、大きさに適合
    させ得ることを特徴とする請求項２−５の１つに記載の方法。
  7. 【請求項７】 同一のまたは異なる照明マスク（７）を含む少なくとも２つ
    の照明源を使用することを特徴とする請求項１−６の１つに記載の方法。
  8. 【請求項８】 少なくとも２つの照明源を使用して像記録を並行的に行うこ
    とを特徴とする請求項１−７の１つのに記載の方法。
  9. 【請求項９】 検知光路（１０）に設けた検知マスク（１２）によって逆反
    射、特に、蛍光分布を検知することを特徴とする請求項１−８の１つに記載の方
    法。
  10. 【請求項１０】 照明マスク（７）のパタンが、検知マスク（１２）のパタ
    ンと少なくとも十分に同一であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 物体に対して照明パタン（１６）を走査（光走査または光
    束走査）することを特徴とする請求項１−１０の１つに記載の方法。
  12. 【請求項１２】 位置不変の照明パタン（１６）の下方を物体を移動させる
    （物体走査）ことを特徴とする請求項１−１０の１つに記載の方法。
  13. 【請求項１３】 記録中または記録後に物体の特徴づけおよび、場合によっ
    ては、物体位置の決定を行うことを特徴とする請求項１−１２の１つに記載の方
    法。
  14. 【請求項１４】 記録中に物体構造を越えて測定された複数の出力強度曲線
    （１９，２０）を、照明パタン(１６)と当該物体構造との各出力強度の重ね合わ
    せによって数学的に記述することを特徴とする請求項１−１３の１つに記載の方
    法。
  15. 【請求項１５】 前記複数の出力強度曲線（１９，２０）の形状を参照して
    適切な演算ルーチンによって、走査を物体構造の中心で行ったか縁で行ったかを
    確認することを特徴とする請求項１４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記複数の出力強度曲線（１９，２０）を参照して、各物
    体構造の具体的位置を決定することを特徴とする請求項１４または１５に記載の
    方法。
  17. 【請求項１７】 記録された物体構造に関する情報の抽出を、照明パタン（
    １６）によって測定した像データの数学的展開によって行うことを特徴とする請
    求項１−１６の１つに記載の方法。
  18. 【請求項１８】 少なくとも２つの異なる波長の照明光によって像データを
    同時記録し、少なくとも２つの異なる検知チャンネルにおいて検知することを特
    徴とする請求項１７に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 当該の検知チャンネルにおける数学的展開を対応する照明
    マスク（７）によって実施することを特徴とする請求項１８に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 照明および検知のための少なくとも２つのマスク（７，１
    ２）によってそれぞれ照明および検知を同時に実施し、この場合、各照明および
    検知のための各マスク（７，１２）が、異なる形状および大きさを有することが
    できることを特徴とする請求項１−１９の１つに記載の方法。
  21. 【請求項２１】 照明マスク（７）の所定の形状に依拠して、特殊なコンピ
    ュータ・ハードウェアによって−好ましくは、ＦＰＧＡ（＝Ｆｉｅｌｄ Ｐｒｏ
    ｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｇａｔｅ Ａｒｒａｙｓ）によって−リアルタイムで数学
    的展開を形成でき、従って、理想的な場合には、物体構造の抽出された物体情報
    のみを記憶することを特徴とする請求項１−２０の１つに記載の方法。
  22. 【請求項２２】 データ減少を実施し、かくして、記録・評価コンピュータ
    の記憶容量に対する要求を減少することを特徴とする請求項１−２１の１つに記
    載の方法。
  23. 【請求項２３】 本質的に円形、長方形または多角形の照明マスク（７）を
    使用して、好ましくは波長を予設定できる光によって照明を行うことを特徴とす
    る請求項１−２２の１つに記載の方法。
  24. 【請求項２４】 照明マスク（７）が、均一な照明強度を実現できることを
    特徴とする請求項２３に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 本質的に円形、長方形マスク多角形の検知マスク（１２）
    によって検知を行うことを特徴とする請求項２３または２４に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 測定された強度信号が、照明パタン（１６）および達成可
    能な反射強度または蛍光強度に関する物体構造の形状の交差関連性、即ち、重ね
    合わせの特殊事例であることを特徴とする請求項１−２５の１つに記載の方法。
  27. 【請求項２７】 照明パタン（１６）の寸法が、対応する回折限定式エアリ
    ー・ディスクよりも大きいことを特徴とする請求項１−２６の１つに記載の方法
    。
  28. 【請求項２８】 物体構造が、微視的寸法を有することを特徴とする請求項
    １−２７の１つに記載の方法。
  29. 【請求項２９】 物体構造が、巨視的寸法を有することを特徴とする請求項
    １−２７の１つに記載の方法。
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WO2014020967A1 (ja) * 2012-08-02 2014-02-06 オリンパス株式会社 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム
JPWO2014020967A1 (ja) * 2012-08-02 2016-07-21 オリンパス株式会社 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム

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