WO2021171419A1 - 検体観察装置、検体観察方法 - Google Patents

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WO2021171419A1
WO2021171419A1 PCT/JP2020/007741 JP2020007741W WO2021171419A1 WO 2021171419 A1 WO2021171419 A1 WO 2021171419A1 JP 2020007741 W JP2020007741 W JP 2020007741W WO 2021171419 A1 WO2021171419 A1 WO 2021171419A1
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luminance
sample
scanning line
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健斗 西浦
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株式会社日立ハイテク
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    • G02B7/28—Systems for automatic generation of focusing signals
    • G02B7/282—Autofocusing of zoom lenses

Definitions

  • the present disclosure relates to a sample observation device for observing a sample contained in a sample container.
  • the sample In a sample observation device that images a sample stored in a sample container, in order to accurately observe the sample, the sample is reliably imaged by determining the sample observation area of the sample container or the position of the sample in the sample container. Is useful. This is because if the captured image does not include the sample, correct information about the sample cannot be obtained.
  • Patent Document 1 describes a sample observation device.
  • cells to be measured are detected by using images taken with a plurality of wide viewing angles bonded in a tile shape (see 0113 of the same document).
  • a device that captures a microscope image of a sample stored in a sample container having a well-shaped sample storage portion determines a relative position in the horizontal direction between the sample observation area of the sample container and the imaging field of view, and performs focus adjustment and imaging. It will be carried out automatically.
  • a sample observation device when an observation image is acquired according to a preset imaging position, the sample observation area and the imaging field of view may deviate from each other.
  • the sample container which is a consumable item, is generally a resin molded product and has a larger manufacturing error than a machined product. Therefore, it is difficult to completely eliminate the misalignment due to the manufacturing error of the sample container, no matter how accurately the device mechanism holds the sample container.
  • This deviation leads to a decrease in the accuracy of the captured image and the amount of information, and may lead to an erroneous judgment in post-processing such as image observation and image analysis. Further, if the deviation is large, the focus adjustment may not be determined and imaging may not be possible. For example, in a laser autofocus system, focus adjustment cannot be performed when the laser irradiation position deviates from the sample observation region.
  • the present disclosure has been made in order to solve the above-mentioned problems, and even before the focus position in the vertical direction is adjusted by using the autofocus system, the sample observation area and the imaging field of view of the sample container It is an object of the present invention to provide a technique capable of reliably performing relative positioning in the horizontal direction between the two.
  • the sample observation device acquires the brightness values of images at a plurality of locations of the sample container before performing autofocus, and uses the number of high-brightness regions and the width thereof to make the sample container horizontal.
  • the center position in the direction is specified, or the center position of the sample container in the horizontal direction is specified by using the number of low-luminance regions and the width thereof.
  • the relative positioning in the horizontal direction between the sample observation area of the sample container and the imaging field of view can be performed. It can be carried out reliably.
  • FIG. This is an example of the shape of the sample storage portion of the sample container 101. It is a figure explaining the refraction of light in the vicinity of the inclined portion of the sample container 101. This is an example of a defocus image when the periphery of the sample container 101 is actually imaged with a wide viewing angle. It is a schematic diagram which shows the state which the center position of the bottom surface of the sample container 101 is different between a design value and an actual value. It is a flowchart explaining the procedure of specifying a well real center position. It is a figure which shows the positional relationship when the controller 200 acquires the observation image in step S601.
  • FIG. 9A It is an example of the profile acquired in FIG. 9B. This is an example of a scanning line that meets the conditions (1) and (2). It is an example of the profile acquired in FIG. 10A.
  • FIG. 1 is a configuration diagram of a sample observation device 100 according to the first embodiment of the present disclosure.
  • the sample observation device 100 is a device for observing the sample by acquiring an image of the sample contained in the sample container 101.
  • the sample observation device 100 includes an objective lens 102, an objective lens actuator 103, a dichroic mirror 104, an optical pickup 105, an image sensor 106, an illumination 107 (light source), a sample container holding unit 108, an XY stage 109, and a controller 200.
  • the controller 200 controls each part included in the sample observation device 100.
  • the sample container holding unit 108 holds one or more sample containers 101.
  • the sample container 101 in FIG. 1 assumes a multi-well plate, but the type of container is not limited to this. Any shape may be used as long as it has one or more sample accommodating portions and the determination method described later can be applied to the sample accommodating portions.
  • the well of the multi-well plate corresponds to the sample storage portion, and the bottom surface of the well is the sample observation area and is the subject of imaging.
  • the sample container holding unit 108 is connected to the XY stage 109.
  • the XY stage 109 is a drive mechanism capable of moving the sample container holding portion 108 in the X direction and the Y direction (two directions along the horizontal direction). Since the imaging field of view and the sample container 101 need to be moved relative to each other, the imaging system including the objective lens 102 and the image sensor 106 may be moved instead of moving the sample container holding portion 108. In the operation schematic diagram used in the first embodiment, for convenience of description, the imaging field of view is shown so as to move with respect to the position of the fixed sample container 101.
  • the image sensor 106 has 5 million pixels (2500 ⁇ 2000).
  • the controller 200 After the device user or another automatic transfer device places the sample container 101 on the sample container holding unit 108, the controller 200 performs an imaging operation.
  • the controller 200 drives the XY stage 109 to adjust the positions of the sample container holding portion 108 in the X and Y directions, aligns the imaging field of view with the bottom surface of the well, and drives the objective lens 102 in the Z direction by the objective lens actuator 103.
  • the focus is located near the bottom of the well.
  • the optical pickup 105 has a built-in laser diode and a photodiode, and the photodiode in the optical pickup 105 detects the reflected light of the laser irradiating the bottom surface of the well, so that the focal point of the objective lens 102 is located near the bottom surface of the well.
  • the objective lens actuator 103 is driven as described above.
  • the optical pickup 105 and the objective lens actuator 103 operate as an autofocus mechanism of the objective lens 102. Since autofocus cannot be executed unless the XY position of the imaging field of view is aligned with the bottom surface of the well, the image that can be captured before the execution of autofocus is in principle defocused.
  • the autofocus method is not limited to the one using a laser, and may be a method for evaluating image contrast or a method using a phase difference.
  • the sample is assumed to have a height of about several microns in the Z direction, and the autofocus target position is on the bottom surface of the well or several microns above the bottom surface of the well.
  • FIG. 2 is an example of the shape of the sample storage portion of the sample container 101.
  • the upper part of FIG. 2 is a side sectional view of the sample container 101.
  • the lower part of FIG. 2 shows the distribution of the illumination transmitted light from above the sample container 101.
  • the sample container 101 has an inclined portion so as to surround a flat region perpendicular to the optical axis (hereinafter, this region is referred to as a well bottom surface or a bottom surface), and is transmitted by refraction at the boundary between the well bottom surface portion and the inclined portion. The light is reduced. As a result, an annular low-luminance region S is created.
  • FIG. 3 is a diagram for explaining the refraction of light in the vicinity of the inclined portion of the sample container 101. If the inclination angle of the inclined portion is 30 degrees and the bottom surface thickness is 1.2 mm, a deviation ( ⁇ S) of 0.5 mm occurs due to the refraction of light in the inclined portion.
  • the diameter of the annular low-luminance region S is (well bottom diameter) + 2 ⁇ 0.5 mm. This numerical example is a calculated value based on the real thing, and may be slightly different from the dimensions in the actual defocus image.
  • FIG. 4 is an example of a defocus image when the periphery of the sample container 101 is actually imaged with a wide viewing angle.
  • the annular low-luminance region S can be visually recognized.
  • the low-luminance region S corresponds to a refracted light image obtained by imaging the light refracted by the inclined portion.
  • FIG. 5 is a schematic view showing a state in which the center position of the bottom surface of the sample container 101 differs between the design value and the actual value. Coordinates are defined in the manufacturing stage of the sample observation device 100. In the coordinate system of the XY stage 109, the coordinates such that the center of the imaging field of view matches the design center position of each well are set as (X0 + ax, Y0 + ay). If the position where the distance between the design center position and the center of the imaging field of view is (ax, ay) is defined as the operation start point, the XY stage coordinates of the operation start point are (X0, Y0).
  • the focal position of the objective lens 102 is moved above the bottom surface of the well to ensure that a defocused image of the bottom surface of the well can be obtained.
  • the device is set in advance so that the focal position of the objective lens 102 is located above the bottom surface of the well. Even if the captured image is an in-focus image, it is possible to determine the actual center position of the well, but there is a possibility of erroneous determination due to the influence of minute scratches existing on the bottom surface of the well. Therefore, in the first embodiment, the actual center position of the well is determined by using the defocus image.
  • the XY stage 109 moves the imaging field of view within the operating region (X0 + bx, Y0 + by) starting from the operating start point (X0, Y0).
  • the image pickup device 106 performs imaging at regular intervals and acquires an image of the entire or part of the imaging field of view. A series of operations for acquiring images at regular intervals while driving the XY stage 109 is called scanning.
  • the operation of the XY stage 109 may or may not be stopped during the exposure. If it does not stop, it is desirable that the movement time of a distance equivalent to one pixel is shorter than the exposure time of image acquisition in order to prevent image blurring. As a specific example, when the exposure time is 500 ⁇ s and the pixel resolution is 0.345 ⁇ m / pixel, it is considered that image blurring does not occur if the moving speed of the XY stage 109 is 0.69 mm / s or less. However, in the first embodiment, since the well center position is specified by the defocused image, there is a high possibility that there is no problem with image blurring of several pixels.
  • the controller 200 derives XY stage coordinates in which the actual center position of the well and the center of the imaging field of view match by analyzing the information regarding the brightness value of the acquired image (hereinafter referred to as image information).
  • image information refers to the coordinates obtained from the image, the sum of the luminance values in the image, the average luminance value, the most frequent luminance value, and the like.
  • FIG. 6 is a flowchart illustrating a procedure for specifying the actual center position of the well.
  • the actual center position of the well is specified by utilizing the fact that the bottom surface of the well is a region surrounded by the low-luminance region S.
  • the image acquired during scanning is a part of the imaging field of view (for example, a 900-pixel square image). This image is called a partial image.
  • the partial image may be captured by any part of all the pixels of the image sensor 106, but here, it is the central portion of the image sensor.
  • the coordinates and the sum of the brightness values are used as the image information. Each step of FIG. 6 will be described below.
  • Step S601 The controller 200 sets the center of the imaging field of view at the operation start point (X0, Y0). The planar image of this step will be illustrated in FIG. 7 described later.
  • Step S602 The controller 200 moves the imaging field of view by bx along the scanning line in the X direction. That is, the center of the imaging field of view is moved from (X0, Y0) to (X0 + bx, Y0).
  • the planar image after movement is illustrated in FIG. 8A described later.
  • the controller 200 acquires partial images N times at intervals ⁇ X.
  • the controller 200 holds the acquired partial image in the memory and immediately analyzes it, and calculates the sum of the luminance values of all the pixels (900 pixels in this case) in the partial image.
  • the controller 200 stores in the memory a value (referred to as a profile) in which the sum of the luminance values and the coordinates obtained from the partial image are associated with each other.
  • Step S603 The controller 200 analyzes the profile acquired in S602 and determines whether the following two conditions are satisfied. However, the condition (2) is determined only for the profile that satisfies the condition (1). An example of a plane image when the conditions are met will be illustrated in FIG. 10A, which will be described later, together with the significance of each condition. If the conditions are met, the process proceeds to S605, and if the conditions are not met, the process proceeds to S604.
  • Condition (1) In the profile, there are two or more low-luminance regions below the determination threshold value.
  • Condition (2) In the profile, the high-luminance region width ⁇ H sandwiched between the two low-luminance regions is included in the set allowable range.
  • Step S604 The controller 200 moves the imaging field of view in the Y direction by ⁇ Y, returns to S602, and repeats the same process. In order to shorten the scanning time, it is desirable to switch the scanning direction alternately between the + X direction and the ⁇ X direction each time S602 is performed. An example of scanning in the ⁇ X direction will be illustrated in FIG. 9B described later.
  • Step S605 The controller 200 uses the center of the width ⁇ H of the high-luminance region sandwiched between the two low-luminance regions as the well real center coordinates Xc in the X direction.
  • Xc corresponds to the average value of the X coordinate points included in the high-luminance region. A specific example of this step is shown in FIG. 11 described later.
  • Steps S606 to S608 The controller 200 moves the imaging field of view to (Xc, Y0) (S606). Similar to S602, the controller 200 moves the imaging field of view by by along the scanning line in the Y direction to acquire the profile (S607). Similar to S605, the controller 200 sets the center of the width ⁇ H of the high-luminance region sandwiched between the two low-luminance regions as the well real center coordinates Yc in the Y direction (S608). Examples of how S606 to S608 are carried out are shown in FIGS. 12A to 12B described later.
  • the controller 200 executes autofocus and images a sample by the image sensor 106.
  • the acquired image is used for observation and analysis of the sample.
  • FIG. 7 is a diagram showing a positional relationship when the controller 200 acquires an observation image in step S601.
  • the center of the imaging field of view is set to (X0, Y0).
  • FIG. 8B is a graph illustrating the sum of the luminance values of each partial image acquired in FIG. 8A.
  • the vertical axis represents the sum of the brightness values of each partial image
  • the horizontal axis represents the X coordinate of the partial image.
  • the X coordinate interval ⁇ X for acquiring the partial image needs to be set sufficiently small. Specifically, it is desirable to set it to 1/2 to 1/3 or less of ⁇ S (width of the low brightness region).
  • FIG. 8C is a diagram showing a modified example of step S602.
  • S602 as shown in FIG. 8C, partial images may be acquired simultaneously on a plurality of scanning lines extending in the same direction. As a result, the scanning time can be shortened.
  • FIG. 9A is a diagram showing how the controller 200 moves the imaging field of view in the Y direction by ⁇ Y in step S604. This step is for moving to the next scanning line adjacent in the Y direction when the conditions (1) and (2) are not satisfied on the current scanning line in S603.
  • FIG. 9B is a diagram showing how S602 is carried out following FIG. 9A.
  • an example of scanning the imaging field of view in the ⁇ X direction is shown.
  • FIG. 9C is an example of the profile acquired in FIG. 9B.
  • the condition (1) is incompatible because there is only one low-luminance region. Therefore, the controller 200 moves the imaging field of view again in the Y direction by ⁇ Y in S603 to S604. Such an operation is repeated, and the inside of the bx ⁇ by area is scanned until the condition is satisfied.
  • FIG. 10A is an example of scanning lines satisfying the conditions (1) and (2).
  • the conditions (1) and (2) have significance in specifying a scanning line that intersects the annular low-luminance region S and the bottom surface portion inside the annular low-luminance region S, respectively.
  • the luminance value of the bottom surface portion is high, and the luminance value is low in the low luminance regions S on both sides thereof. Therefore, on the profile, the high-luminance region is sandwiched between the two low-luminance regions. In other words, there is one high-luminance region sandwiched between the two low-luminance regions.
  • FIG. 10B is an example of the profile acquired in FIG. 10A.
  • the condition (1) can be determined by distinguishing the high-luminance region and the low-luminance region by the determination threshold value.
  • the determination threshold value is set in advance to an appropriate value that can distinguish the bottom surface of the well from the region S based on the actual image.
  • the width ⁇ H of the high-luminance region sandwiched between the low-luminance regions is calculated, and it is confirmed that the width ⁇ H is included in the allowable range.
  • the allowable range is set here as ⁇ X ⁇ ⁇ H ⁇ (well bottom diameter). That is, it is confirmed that the high-luminance region in the profile is continuous at two or more points and the width is equal to or less than the well bottom diameter.
  • the high-luminance region is composed of only one point, there is an effect of reducing erroneous judgment and improving the calculation accuracy of the center position. If the lower limit of the allowable range is further increased, the calculation accuracy can be expected to improve, but the time required to complete the judgment will increase.
  • FIG. 11 is a diagram showing how the controller 200 obtains the real center coordinates Xc in step S605. Here, the same profile as in FIG. 10B is illustrated. Since the high-luminance region on the profile is composed of two coordinate points, the controller 200 calculates the midpoint as Xc.
  • FIG. 12A is a diagram showing a state in which a profile is acquired along a scanning line in the Y direction in S607.
  • the image acquisition interval is ⁇ Y.
  • the scanning line passes through the bottom surface of the well sandwiched by the low-luminance region S. Therefore, the scanning line at this time satisfies the conditions (1) and (2).
  • FIG. 12B is an example of the profile acquired in FIG. 12A. Similar to FIG. 10B, the width ⁇ H of the high-luminance region sandwiched between the two low-luminance regions is calculated, and it is confirmed that the width ⁇ H is included in the allowable range.
  • the permissible range of ⁇ H is set as ⁇ Y ⁇ ⁇ H ⁇ (well bottom diameter). Similar to FIG. 10B, the case where the high-luminance region is composed of only one point is excluded.
  • the center point coordinates Yc can be obtained from the average value of the coordinate points in the high-luminance region.
  • ⁇ Embodiment 1 Calculation Example> Estimate the time required for a series of operations using specific numerical values.
  • the average processing time is calculated assuming that the expected value of the actual center position of the bottom of the well matches the design center position.
  • FIG. 13 is a plan view corresponding to the above dimensional example.
  • ⁇ X 0.69 mm / s
  • the calculation of the sum of the brightness values is performed in 0.29 seconds during the movement of ⁇ X. It moves 1.2 mm ( ⁇ Y) in the Y direction, but it may move at a relatively high speed during this period, and if it moves at an average of 20 mm / s, the required time is 0.06 seconds.
  • the movement time from the coordinates (X0, Y0 + 1.2) to the coordinates (X0 + 1.8, Y0) takes 0.09 seconds when both X and Y start moving at an average of 20 mm / s at the same time.
  • the scan in the Y direction takes 5.2 seconds, assuming that 3.6 mm is moved at an average of 0.69 mm / s.
  • the sample observation device 100 uses the number of high-luminance regions sandwiched between the low-luminance regions and the width ⁇ H thereof at the center of the bottom surface of the sample container 101 before the autofocus of the objective lens 102 is performed. Specify the position (Xc, Yc). Since it is not necessary to align the focus position with the sample surface when specifying the center position, the center position can be specified even if the sample observation area and the imaging field of view are deviated to the extent that autofocus is impossible. Since the defocused image is evaluated, the image can be analyzed without being affected by disturbance elements (for example, scratches, scratches, and microcracks generated during the manufacture of the sample container) existing on the actual sample observation surface.
  • disturbance elements for example, scratches, scratches, and microcracks generated during the manufacture of the sample container
  • the operating speed of the XY stage 109 can be increased with respect to the exposure time, and the time required for the determination can be shortened.
  • the sample observation device 100 analyzes only a part of the imaging field of view as an acquired image, the amount of data to be image processed is small even when the scan range (bx ⁇ by) is wide. Image processing time can be shortened. Therefore, the image processing capacity can be kept small, which is advantageous in terms of cost.
  • Condition (1) In the profile, there are one or two low-luminance regions below the determination threshold.
  • Condition (2) All the low-luminance region width ⁇ L in the profile is included in the set allowable range.
  • FIG. 14 is a diagram illustrating the conditions (1) and (2) in the second embodiment.
  • the conditions (1) and (2) and the permissible range in the second embodiment will be described below with reference to the two scanning lines shown in FIG.
  • condition (1) When there is only one low-luminance region on the scanning line (condition (1)), the scanning line has passed through the low-luminance region without crossing the bottom surface of the well.
  • the upper scanning line in FIG. 14 corresponds to this.
  • the permissible range of ⁇ L (condition (2)) is appropriately set to be ⁇ X or more and not more than the maximum length of the low-luminance region along the scanning line. This is because in the second embodiment, the low-luminance region is detected, so it is necessary to set an appropriate range as the width of the low-luminance region as an allowable range.
  • the length of the low-luminance region is maximized. ⁇ L is not more than this maximum length.
  • the lower scanning line of FIG. 14 corresponds to this.
  • the allowable range of ⁇ L (condition (2)) is ⁇ X or more and the width of the low-luminance region S (0.5 mm in the example of FIG. 4) or less. This is because in the second embodiment, the low-luminance region is detected, so it is necessary to set an appropriate range as the width of the low-luminance region as an allowable range.
  • the sample observation device 100 can specify the well center position even if there is only one low-luminance region under the condition (1). That is, the center position can be specified at a relatively early stage of scanning the scan range (bx, by). As a result, the distance for moving the imaging field of view to specify the center position can be shortened, so that there is an advantage that the center position can be specified faster.
  • Condition (1) In the profile, there are N high-luminance regions exceeding the determination threshold value (N ⁇ 1).
  • FIG. 15 is an example in which the bottom surface of the well is directly detected when there is only one high-luminance region.
  • the scan range bx, by
  • only one high-luminance region corresponding to the bottom surface of the well may be included.
  • this method can be said to be suitable when the well position error is relatively small and the risk of erroneous detection is small even if the scan range (bx, by) is set to a certain extent. This is because when the well position error is large, the high-luminance region outside the low-luminance region may be erroneously recognized as the well bottom surface depending on the size of the scan range (bx, by) and the initial position.
  • the sample observation device 100 detects a high-luminance region and distinguishes the high-luminance region from the bottom surface of the well and the other according to a preset allowable range. As a result, the bottom surface of the well to be searched can be directly found, and the determination algorithm can be made relatively simple.
  • the image sensor 106 has 5 million pixels of 2500 ⁇ 2000 and a pixel resolution of 0.345 ⁇ m / pixel.
  • the actual field of view is 0.86 mm ⁇ 0.69 mm.
  • the stacked images are combined as shown in FIG. 4, and a region having a high luminance value is determined by a preset threshold value.
  • the bottom surface of the well is determined by comparing the area of the determined region with a high brightness value with the area allowable value. If the diameter of the bottom surface of the well is 1.5 mm ⁇ 0.1 mm, the allowable area is 1.5 mm 2 to 2.0 mm 2 .
  • the bottom surface of the well can be determined by evaluating the shape features such as the aspect ratio and the roundness of the region having a high brightness value.
  • the geometric center of the determined high-luminance region is calculated, and Xc and Yc are determined at the same time.
  • the controller 200 can be configured by hardware such as a circuit device that implements the function, or an arithmetic unit such as a CPU (Central Processing Unit) executes software that implements the function. It can also be configured by.
  • hardware such as a circuit device that implements the function, or an arithmetic unit such as a CPU (Central Processing Unit) executes software that implements the function. It can also be configured by.
  • CPU Central Processing Unit
  • the image sensor 106 may be arranged on the transmission side of the dichroic mirror 104, and the light pickup 105 may be arranged on the reflection side. Further, an appropriate optical component such as an optical filter (not shown) may be arranged on the optical path.
  • the focal position of the objective lens 102 is set above the bottom surface of the well (inside the sample container 101). If the central axis deviation between the outer bottom surface of the well and the bottom surface of the well (see FIG. 2) is small and negligible, the focal position of the objective lens 102 may be set below the bottom surface of the well. In this case, the defocus image of the outer bottom surface of the well is acquired and analyzed. The procedure for specifying the center position is the same as that in the above embodiment.
  • the center position coordinates are determined in the order of Xc and Yc, but this order may be changed.
  • the threshold value for determining the high-luminance region is set in advance, but the threshold value is automatically set for each observation image by using an arbitrary known method for automatically setting the threshold value. You may.
  • the bottom surface of the well is circular and the inclined portion around the well surface is also arranged concentrically with respect to the bottom surface of the well.
  • the well shape whose center position can be specified by the present invention is not limited to this, and the present invention is applied even to other shapes in which a low-luminance region is formed around the bottom surface of the well by the inclined portion.
  • the bottom surface of the well and the low-luminance region around it are line-symmetrical along the X direction (with respect to the Y-axis)
  • the coordinate average of the high-luminance region or the low-luminance region can be regarded as Xc.
  • the line is symmetric along the Y direction (with respect to the X axis)
  • the coordinate average of the high-luminance region or the low-luminance region can be regarded as Yc.
  • the final center is obtained by averaging the center position coordinates specified when there is only one low-luminance region in the condition (1) described in the second embodiment and the center position coordinates specified in the first embodiment. It is conceivable to specify the position.
  • the final center position can be specified by predetermining the reliability coefficient for each embodiment and adding up the result of multiplying the center position coordinates specified by each embodiment by the reliability coefficient. Conceivable.
  • each embodiment may be used in combination by using an appropriate method.
  • Specimen observation device 101 Specimen container 102: Objective lens 103: Objective lens actuator 104: Dichroic mirror 105: Optical pickup 106: Image sensor 107: Lighting 108: Specimen container holding unit 109: XY stage

Abstract

本開示は、オートフォーカスシステムを用いて垂直方向におけるフォーカス位置を調整する前であっても、検体容器の検体観察領域と撮像視野との間の水平方向における相対位置決めを確実に実施することができる技術を提供する。本開示に係る検体観察装置は、オートフォーカスを実施する前において、検体容器の複数の箇所における画像の輝度値を取得し、高輝度領域の個数とその幅とを用いて、前記検体容器の水平方向における中心位置を特定するか、または、低輝度領域の個数とその幅とを用いて、前記検体容器の前記水平方向における中心位置を特定する（図１参照）。

Description

検体観察装置、検体観察方法
　本開示は、検体容器が収容している検体を観察する検体観察装置に関する。
　検体容器に収納された検体を撮像する検体観察装置において、検体を正確に観察するためには、検体容器の検体観察領域あるいは検体容器内の検体位置を判定することにより、検体を確実に撮像することが有用である。撮像した画像内に検体が含まれていなければ、検体についての正しい情報が得られないからである。
　下記特許文献１は、検体観察装置について記載している。同文献においては、タイル状に貼り合わせた複数の広視野角の撮像画像を用いて、測定対象の細胞を検出することとしている（同文献の０１１３参照）。
特開２０１５－２２７９４０号公報
　例えばウェル状の検体収納部を有する検体容器に格納した検体の顕微鏡像を撮像する装置は、検体容器の検体観察領域と撮像視野との間の水平方向における相対位置を決め、フォーカス調整および撮像を自動的に実施する。このような検体観察装置においては、あらかじめ設定した撮像位置にしたがって観察画像を取得すると、検体観察領域と撮像視野が互いにずれる場合がある。消耗品である検体容器は樹脂成型品が一般的であり、機械加工品よりも製造誤差が大きい。したがって、検体容器の製造誤差由来の位置ずれは、装置機構が如何に精度良く検体容器を保持しても完全に解消することは困難である。このずれは撮像画像の正確性や情報量の低下に繋がり、画像観察・画像解析などの後処理において誤った判断に繋がる可能性が生じる。また、ずれが大きいとフォーカス調整の判定対象外となって、撮像が不可能になる場合がある。例えば、レーザオートフォーカスシステムにおいては、レーザ照射位置が検体観察領域から外れるとフォーカス調整ができない。
　本開示は、上記のような課題を解決するためになされたものであり、オートフォーカスシステムを用いて垂直方向におけるフォーカス位置を調整する前であっても、検体容器の検体観察領域と撮像視野との間の水平方向における相対位置決めを確実に実施することができる技術を提供することを目的とする。
　本開示に係る検体観察装置は、オートフォーカスを実施する前において、検体容器の複数の箇所における画像の輝度値を取得し、高輝度領域の個数とその幅とを用いて、前記検体容器の水平方向における中心位置を特定するか、または、低輝度領域の個数とその幅とを用いて、前記検体容器の前記水平方向における中心位置を特定する。
　本開示に係る検体観察装置によれば、オートフォーカスシステムを用いて垂直方向におけるフォーカス位置を調整する前であっても、検体容器の検体観察領域と撮像視野との間の水平方向における相対位置決めを確実に実施することができる。
実施形態１に係る検体観察装置１００の構成図である。 検体容器１０１の検体収納部の形状例である。 検体容器１０１の傾斜部近傍における光の屈折を説明する図である。 実際に検体容器１０１周辺を広視野角で撮像した場合のデフォーカス画像の例である。 検体容器１０１の底面の中心位置が設計値と実際値との間で異なっている状態を示す模式図である。 ウェル実中心位置を特定する手順を説明するフローチャートである。 ステップＳ６０１においてコントローラ２００が観察画像を取得する際における位置関係を示す図である。 ステップＳ６０２において撮像視野をＸ方向にｂｘだけ移動した状態を示す図である。 図８Ａにおいて取得した各部分画像の輝度値和を例示するグラフである。 ステップＳ６０２の変形例を示す図である。 ステップＳ６０４においてコントローラ２００が撮像視野をＹ方向にΔＹだけ移動させる様子を示す図である。 図９Ａに続いてＳ６０２を実施する様子を示す図である。 図９Ｂにおいて取得するプロファイルの例である。 条件（１）（２）に適合する走査線の例である。 図１０Ａにおいて取得するプロファイルの例である。 ステップＳ６０５においてコントローラ２００が実中心座標Ｘｃを求める様子を示す図である。 Ｓ６０７においてＹ方向の走査線に沿ってプロファイルを取得する様子を示す図である。 図１２Ａにおいて取得するプロファイルの例である。 寸法例に対応する平面図である。 実施形態２における条件（１）（２）について説明する図である。 高輝度領域が１つのみである場合において、ウェル底面を直接検出する場合の例である。
＜実施の形態１＞
　図１は、本開示の実施形態１に係る検体観察装置１００の構成図である。検体観察装置１００は、検体容器１０１が収容している検体の画像を取得することによってその検体を観察する装置である。検体観察装置１００は、対物レンズ１０２、対物レンズアクチュエータ１０３、ダイクロイックミラー１０４、光ピックアップ１０５、撮像素子１０６、照明１０７（光源）、検体容器保持部１０８、ＸＹステージ１０９、コントローラ２００を備える。コントローラ２００は、検体観察装置１００が備える各部を制御する。
　検体容器保持部１０８は、１つ以上の検体容器１０１を保持する。図１における検体容器１０１はマルチウェルプレートを想定しているが、容器の種類はこれに限らない。１つ以上の検体収容部を有し、検体収容部に対して、後述する判定方法が適用できる形状であれば何でもよい。以下では、マルチウェルプレートのウェルが検体収容部に相当し、ウェル底面が検体観察領域であり撮像対象とする。
　検体容器保持部１０８は、ＸＹステージ１０９に接続されている。ＸＹステージ１０９は、Ｘ方向およびＹ方向（水平方向に沿った２方向）へ検体容器保持部１０８を移動させることができる駆動機構である。撮像視野と検体容器１０１が相対的に移動すればよいので、検体容器保持部１０８を移動させることに代えて、対物レンズ１０２や撮像素子１０６を含む結像系が移動してもよい。本実施形態１において用いる動作模式図においては、記載の便宜上、固定された検体容器１０１の位置に対して撮像視野が移動しているように図示することとする。撮像素子１０６は５００万画素（２５００×２０００）とする。
　装置ユーザあるいは別の自動搬送装置などが、検体容器１０１を検体容器保持部１０８へ載置した後、コントローラ２００は撮像動作を実施する。コントローラ２００は、ＸＹステージ１０９を駆動して検体容器保持部１０８のＸ方向およびＹ方向の位置を調整し、撮像視野をウェル底面に合わせ、Ｚ方向に駆動する対物レンズアクチュエータ１０３によって対物レンズ１０２の焦点をウェル底面近傍に位置させる。以上の手順により、ウェル底面の像を得ることができる。
　光ピックアップ１０５はレーザダイオードとフォトダイオードを内蔵しており、ウェル底面に照射したレーザの反射光を光ピックアップ１０５内のフォトダイオードが検出することにより、対物レンズ１０２の焦点がウェル底面近傍に位置するように対物レンズアクチュエータ１０３を駆動する。これにより光ピックアップ１０５と対物レンズアクチュエータ１０３は、対物レンズ１０２のオートフォーカス機構として動作する。撮像視野のＸＹ位置をウェル底面に合わせなければ、オートフォーカスを実行することはできないので、オートフォーカス実行前に撮像できる画像は原則としてデフォーカスしたものである。オートフォーカス方式はレーザを用いるものに限らず、画像コントラストを評価する方式や、位相差を用いる方式でもよい。検体はＺ方向の高さが数ミクロン程度のものを想定しており、オートフォーカスターゲット位置はウェル底面、あるいはウェル底面から数ミクロン上方となる。
　図２は、検体容器１０１の検体収納部の形状例である。図２上段は検体容器１０１の側断面図である。図２下段は検体容器１０１上方からの照明透過光の分布を示す。検体容器１０１は、光軸に垂直な平面領域（以下、この領域をウェル底面または底面と記載する）を取り囲むように傾斜部を有しており、ウェル底面部と傾斜部の境界において屈折によって透過光が減少する。これにより、環状の低輝度領域Ｓが生まれる。
　図３は、検体容器１０１の傾斜部近傍における光の屈折を説明する図である。傾斜部の傾斜角を３０度、底面厚さを１．２ｍｍとすれば、傾斜部における光の屈折によって０．５ｍｍのずれ（ΔＳ）が発生する。環状の低輝度領域Ｓの直径は（ウェル底面直径）＋２×０．５ｍｍとなる。この数値例は実物に基づいた計算値であり、実際のデフォーカス画像中における寸法とはやや異なる場合もある。
　図４は、実際に検体容器１０１周辺を広視野角で撮像した場合のデフォーカス画像の例である。環状の低輝度領域Ｓを視認することができる。低輝度領域Ｓは、傾斜部によって屈折した光を撮像することにより取得した、屈折光画像に相当する。
　図５は、検体容器１０１の底面の中心位置が設計値と実際値との間で異なっている状態を示す模式図である。検体観察装置１００の製造段階において、座標を定義する。ＸＹステージ１０９の座標系において、撮像視野中心が各ウェルの設計中心位置に合致するような座標を（Ｘ０＋ａｘ，Ｙ０＋ａｙ）とおく。設計中心位置と撮像視野中心との間の距離が（ａｘ，ａｙ）となる位置を動作開始点と定義すれば、動作開始点のＸＹステージ座標は（Ｘ０，Ｙ０）となる。少なくともウェルの実中心位置が含まれるように、動作領域（Ｘ０＋ｂｘ，Ｙ０＋ｂｙ）を設定する。具体的には、ウェル底面直径の設計値を１．５ｍｍ、ウェルの設計中心位置を（Ｘ０＋ａｘ±１ｍｍ，Ｙ０＋ａｙ±１ｍｍ）とすれば、ａｘおよびａｙの値は１ｍｍ＋（ウェル底面半径）＝１．７５ｍｍ程度にするべきである。
　実際の装置動作について説明する。初めに、対物レンズ１０２の焦点位置をウェル底面より上方に移動させ、確実にウェル底面のデフォーカス画像を得られるようにする。または、オートフォーカスを実行していない状態において（対物レンズアクチュエータ１０３の原点において）、対物レンズ１０２の焦点位置がウェル底面より上方に位置するようにあらかじめ装置をセットしておく。撮像した画像がインフォーカス画像であっても、ウェルの実中心位置を画像判定することは可能であるが、ウェル底面に存在する微小な傷などの影響を受けて誤判定する可能性がある。そこで本実施形態１においては、デフォーカス画像を用いて、ウェルの実中心位置を判定することとした。
　ＸＹステージ１０９は、撮像視野を、動作開始点（Ｘ０，Ｙ０）を起点として動作領域（Ｘ０＋ｂｘ，Ｙ０＋ｂｙ）内で移動させる。撮像素子１０６は一定間隔で撮像を実施し、撮像視野の全体または一部分の画像を取得する。ＸＹステージ１０９を駆動しながら一定間隔で画像を取得する一連の動作をスキャンと称する。
　ＸＹステージ１０９の動作は、露光中に停止してもよいし、停止しなくてもよい。停止しない場合、像ブレを防ぐため、１画素相当距離の移動時間が画像取得の露光時間に対して短いことが望ましい。具体例として、露光時間５００μｓ、画素分解能０．３４５μｍ／ｐｉｘｅｌである場合、ＸＹステージ１０９の移動速度を０．６９ｍｍ／ｓ以下とすれば像ブレは発生しないと考えられる。ただし本実施形態１においてはデフォーカスした画像によってウェル中心位置を特定するので、数画素の像ブレは問題ない可能性が高い。
　コントローラ２００は、取得した画像の輝度値に関する情報（以下、画像情報と記載する）を解析することにより、ウェル実中心位置と撮像視野中心が合致するＸＹステージ座標を導く。具体的手順は後述する。ここでいう画像情報とは、画像を取得した座標、画像内の輝度値和、輝度値平均、輝度値最頻値などを指す。
　図６は、ウェル実中心位置を特定する手順を説明するフローチャートである。本実施形態１においては、ウェル底面が低輝度領域Ｓによって囲まれた領域であることを利用してウェル実中心位置を特定する。スキャン中に取得する画像は撮像視野の一部分（例えば９００画素の正方画像）とする。この画像を部分画像と呼称する。部分画像は撮像素子１０６の全画素のうち、どの部分で撮像してもよいが、ここでは撮像素子中心部とする。本フローチャートにおいては、画像情報として座標と輝度値和を使用する。以下図６の各ステップについて説明する。
（図６：ステップＳ６０１）
　コントローラ２００は、撮像視野中心を動作開始点（Ｘ０，Ｙ０）にセットする。本ステップの平面イメージについては後述の図７に例示する。
（図６：ステップＳ６０２）
　コントローラ２００は、Ｘ方向の走査線に沿って、撮像視野をｂｘだけ移動させる。すなわち撮像視野中心を（Ｘ０，Ｙ０）から（Ｘ０＋ｂｘ，Ｙ０）へ移動させる。移動後の平面イメージについては後述の図８Ａに例示する。撮像視野を移動する間において、コントローラ２００は、間隔ΔＸごとに部分画像をＮ回取得する。コントローラ２００は、取得した部分画像をメモリ上に保持して即座に解析し、部分画像内の全画素（ここでは９００画素）の輝度値和を計算する。コントローラ２００は、輝度値和と、その部分画像を取得した座標を対応付けたもの（プロファイルと呼称する）をメモリ上に記憶する。
（図６：ステップＳ６０３）
　コントローラ２００は、Ｓ６０２において取得したプロファイルを解析して、以下の２条件を満たすか判定する。ただし条件（２）は、条件（１）を満たしたプロファイルに対してのみ判定する。条件に適合した場合の平面イメージの例については、各条件の意義と併せて後述の図１０Ａに例示する。条件に適合する場合はＳ６０５へ進み、適合しない場合はＳ６０４へ進む。
条件（１）：プロファイルにおいて、判定閾値を下回る低輝度領域が２箇所以上存在する。
条件（２）：プロファイルにおいて、２箇所の低輝度領域に挟まれた高輝度領域幅ΔＨが、設定した許容範囲内に含まれる。
（図６：ステップＳ６０４）
　コントローラ２００は、撮像視野をＹ方向にΔＹだけ移動させ、Ｓ６０２に戻って同様の処理を繰り返す。走査時間を短縮するためには、Ｓ６０２を実施するごとに、走査方向を＋Ｘ方向と－Ｘ方向で交互に切り替えることが望ましい。－Ｘ方向に走査する例については後述の図９Ｂで例示する。
（図６：ステップＳ６０５）
　コントローラ２００は、２つの低輝度領域に挟まれた高輝度領域の幅ΔＨの中心を、Ｘ方向におけるウェル実中心座標Ｘｃとする。Ｘｃは高輝度領域に含まれるＸ座標点の平均値に相当する。本ステップの具体例については後述の図１１に示す。
（図６：ステップＳ６０６～Ｓ６０８）
　コントローラ２００は、撮像視野を（Ｘｃ，Ｙ０）に移動させる（Ｓ６０６）。コントローラ２００は、Ｓ６０２と同様にＹ方向の走査線に沿って撮像視野をｂｙだけ移動させてプロファイルを取得する（Ｓ６０７）。コントローラ２００は、Ｓ６０５と同様に、２つの低輝度領域に挟まれた高輝度領域の幅ΔＨの中心を、Ｙ方向におけるウェル実中心座標Ｙｃとする（Ｓ６０８）。Ｓ６０６～Ｓ６０８を実施する様子の例については後述の図１２Ａ～図１２Ｂに示す。
　本フローチャートにより、実中心位置と撮像視野中心を合致させることができる。本フローチャート実施後、コントローラ２００はオートフォーカスを実行し、撮像素子１０６によって検体を撮像する。取得した画像は検体の観察・解析に用いる。
　図７は、ステップＳ６０１においてコントローラ２００が観察画像を取得する際における位置関係を示す図である。撮像視野の中心は（Ｘ０，Ｙ０）にセットされている。
　図８Ａは、ステップＳ６０２において撮像視野をＸ方向にｂｘだけ移動した状態を示す図である。図８Ａにおいて、動作開始点を含めて１１か所（Ｎ＝１１）で部分画像を取得することとした。
　図８Ｂは、図８Ａにおいて取得した各部分画像の輝度値和を例示するグラフである。縦軸は各部分画像の輝度値和を表し、横軸は部分画像のＸ座標を表す。図８Ａにおいては、全ての部分画像は明るい箇所において取得したものであるので、各部分画像の輝度値和はいずれも閾値以上となっている。部分画像を取得するＸ座標間隔ΔＸは、十分小さく設定する必要がある。具体的には、ΔＳ（低輝度領域の幅）の１/２～１/３以下に設定することが望ましい。
　図８Ｃは、ステップＳ６０２の変形例を示す図である。Ｓ６０２において、部分画像は図８Ｃに示すように、同じ方向に延伸する複数の走査線上で同時に取得してもよい。これにより走査時間を短縮できる。
　図９Ａは、ステップＳ６０４においてコントローラ２００が撮像視野をＹ方向にΔＹだけ移動させる様子を示す図である。本ステップは、Ｓ６０３における現在の走査線上で条件（１）（２）を満たさなかった場合、Ｙ方向に隣接する次の走査線に移動するためのものである。
　図９Ｂは、図９Ａに続いてＳ６０２を実施する様子を示す図である。ここでは撮像視野を－Ｘ方向に走査する例を示した。これにより撮像視野をＸ０まで戻してから改めて＋Ｘ方向に走査する必要がなくなるので、走査時間を抑制することができる。
　図９Ｃは、図９Ｂにおいて取得するプロファイルの例である。図９Ｃのプロファイルにおいては、低輝度領域が１箇所のみであるから条件（１）不適合となる。したがってコントローラ２００は、Ｓ６０３～Ｓ６０４において撮像視野を再度Ｙ方向にΔＹだけ移動させる。このような動作を繰り返し、条件を満たすまでｂｘ×ｂｙの領域内をスキャンする。ウェル底面を確実に検出するためには、ΔＹはウェル底面直径以下に設定することが望ましい。
　図１０Ａは、条件（１）（２）に適合する走査線の例である。条件（１）（２）は、環状の低輝度領域Ｓとその内側の底面部分をそれぞれ交差する走査線を特定する意義がある。図１０Ａの走査線上に沿って輝度値を取得すると、底面部分の輝度値は高く、その両側の低輝度領域Ｓは輝度値が低い。したがってプロファイル上においては、高輝度領域が２つの低輝度領域によって挟まれていることになる。換言すると、２つの低輝度領域によって挟まれた高輝度領域が１つ存在していることになる。
　図１０Ｂは、図１０Ａにおいて取得するプロファイルの例である。条件（１）については、判定閾値によって高輝度領域と低輝度領域を区別することにより、判定できる。判定閾値は、実際の画像に基づき、ウェル底面と領域Ｓとを区別できる適切な値をあらかじめセットしておく。図１０Ｂにおいては、低輝度領域は２箇所存在する。条件（２）については、低輝度領域に挟まれた高輝度領域の幅ΔＨを計算し、幅ΔＨが許容範囲内に含まれていることを確認する。
　ΔＨについて、ここでは許容範囲をΔＸ≦ΔＨ≦（ウェル底面直径）と設定する。つまり、プロファイルにおける高輝度領域が２点以上連続していて、かつ幅がウェル底面直径以下であることを確認する。高輝度領域が１点のみによって構成されている場合を除くことにより、誤判断を減らし、中心位置の計算精度を上げる効果がある。許容範囲の下限値をさらに大きくすれば計算精度向上が見込めるが、判断完了までに掛かる時間が増加する。
　図１１は、ステップＳ６０５においてコントローラ２００が実中心座標Ｘｃを求める様子を示す図である。ここでは図１０Ｂと同じプロファイルを例示した。プロファイル上の高輝度領域は２つの座標点によって構成されているので、コントローラ２００はその中点をＸｃとして算出する。
　図１２Ａは、Ｓ６０７においてＹ方向の走査線に沿ってプロファイルを取得する様子を示す図である。画像取得間隔はΔＹとする。Ｘ座標がＸｃの箇所でＹ方向に走査すると、走査線は低輝度領域Ｓによって挟まれたウェル底面を通過する。したがってこのときの走査線は条件（１）（２）を充足する。
　図１２Ｂは、図１２Ａにおいて取得するプロファイルの例である。図１０Ｂと同様に２つの低輝度領域に挟まれた高輝度領域の幅ΔＨを計算し、幅ΔＨが許容範囲内に含まれていることを確認する。ΔＨの許容範囲はΔＹ≦ΔＨ≦（ウェル底面直径）と設定する。図１０Ｂと同様に、高輝度領域が１点のみによって構成されている場合を除外する。中心点座標Ｙｃは、高輝度領域の座標点の平均値によって求めることができる。
＜実施の形態１：計算例＞
　具体的な数値を用い、一連動作に要する時間を概算する。ウェル底面直径１．５ｍｍ、ΔＳ＝０．５ｍｍ、ウェル位置公差はＸ、Ｙ方向とも±１ｍｍ、ａｘ＝１．８ｍｍ、ａｙ＝１．７ｍｍ、ｂｘ＝３．６ｍｍ、ｂｙ＝３．６ｍｍ、ΔＸ＝０．２ｍｍ、ΔＹｓ＝１．２ｍｍ、ΔＹ＝０．２ｍｍとする。ウェル底面の実中心位置の期待値は設計中心位置に一致すると考えて、平均的な処理時間を計算する。
　図１３は、上記寸法例に対応する平面図である。Ｘｃを算出するまでのＸ方向移動距離は３．６ｍｍ（ｂｘ）×２＝７．２ｍｍである。平均速度０．６９ｍｍ／ｓで移動した場合、Ｘ方向に１回移動するごとに１０．４秒を要する。輝度値和の計算はΔＸ移動中の０．２９秒間に実施する。Ｙ方向に１．２ｍｍ（ΔＹ）移動するが、この間は比較的高速で移動してよく、平均２０ｍｍ／ｓで移動したとすれば所要時間は０．０６秒である。Ｘｃ確定後、座標（Ｘ０，Ｙ０＋１．２）から座標（Ｘ０＋１．８，Ｙ０）への移動時間は、Ｘ、Ｙともに平均２０ｍｍ／ｓで同時に移動開始した場合、０．０９秒掛かる。Ｙ方向のスキャンは、３．６ｍｍを平均０．６９ｍｍ／ｓで移動したとして、５．２秒掛かる。これら掛かる時間を合計し、所要時間は１０．４＋０．０６＋０．０９＋５．２＝１５．７５秒となる。
＜実施の形態１：まとめ＞
　本実施形態１に係る検体観察装置１００は、対物レンズ１０２のオートフォーカスを実施する前において、低輝度領域に挟まれた高輝度領域の個数とその幅ΔＨを用いて、検体容器１０１底面の中心位置（Ｘｃ，Ｙｃ）を特定する。中心位置を特定する際にフォーカス位置を検体面に合わせる必要がないので、検体観察領域と撮像視野がオートフォーカス不可能な程にずれていても中心位置を特定できる。デフォーカスした像を評価するので、実際の検体観察面に存在する外乱要素（例えば、検体容器製造時に発生する傷、スクラッチやマイクロクラック）の影響を受けずに画像を解析することができる。また、検体容器１０１底面の形状を検出する必要がないので、数画素程度の像ブレを許容することができる。したがって、露光時間に対してＸＹステージ１０９の動作速度を大きくして、判定に掛かる時間を短くすることができる。
　本実施形態１に係る検体観察装置１００は、撮像視野の一部分のみを取得画像として解析するので、スキャン範囲（ｂｘ×ｂｙ）を広く取った場合であっても、画像処理するデータ量が小さく、画像処理時間を短くできる。したがって、画像処理能力も小さく抑えることができるので、コスト面で有利である。
＜実施の形態２＞
　本開示の実施形態２では、環状の低輝度領域Ｓの位置と幅を検出することにより、ウェル底面の中心位置を特定する手法について説明する。本実施形態２においては、判定条件（１）と（２）として以下のものを用いる。条件（１）がいずれの場合であっても、中心位置は、低輝度領域に含まれる座標点の平均とする。検体観察装置１００の構成、動作フローなどその他事項は実施形態１と同じである。
条件（１）：プロファイルにおいて、判定閾値を下回る低輝度領域が１箇所または２箇所存在する。
条件（２）：プロファイルにおける全ての低輝度領域幅ΔＬが、設定した許容範囲に含まれる。
　図１４は、本実施形態２における条件（１）（２）について説明する図である。以下図１４に示す２つの走査線を用いて、本実施形態２における条件（１）（２）と許容範囲について説明する。
　走査線上の低輝度領域が１つのみである場合（条件（１））、走査線はウェル底面を交差せず低輝度領域を通過したことになる。例えば図１４の上側の走査線がこれに相当する。ΔＬの許容範囲（条件（２））は、ΔＸ以上、かつ走査線に沿った低輝度領域の最大長以下とするのが適当である。本実施形態２においては低輝度領域を検出するので、低輝度領域の幅として適当な範囲を許容範囲とする必要があるからである。具体的には図１４の上側の走査線に示すように、走査線がウェル底面の画像と接しているとき、低輝度領域の長さは最大となる。ΔＬはこの最大長以下とする。
　走査線上の低輝度領域が２つである場合（条件（２））、走査線は、低輝度領域＝＞高輝度領域（ウェル底面）＝＞低輝度領域の順で通過したことになる。例えば図１４の下側の走査線がこれに相当する。ΔＬの許容範囲（条件（２））は、ΔＸ以上、かつ低輝度領域Ｓの幅（図４の例においては０．５ｍｍ）以下とするのが適当である。本実施形態２においては低輝度領域を検出するので、低輝度領域の幅として適当な範囲を許容範囲とする必要があるからである。
＜実施の形態２：まとめ＞
　本実施形態２に係る検体観察装置１００は、特に条件（１）において低輝度領域が１箇所であっても、ウェル中心位置を特定することができる。すなわちスキャン範囲（ｂｘ，ｂｙ）をスキャンする比較的早い段階において、中心位置を特定できる。これにより、中心位置を特定するために撮像視野を移動させる距離を短くできるので、中心位置をより速く特定できる利点がある。
＜実施の形態３＞
　本開示の実施形態３では、ウェル底面を直接的に検出する手法について説明する。本実施形態２においては、判定条件（１）と（２）として以下のものを用いる。条件（１）がいずれの場合であっても、中心位置は、高輝度領域に含まれる座標点の平均とする。検体観察装置１００の構成、動作フローなどその他事項は実施形態１と同じである。
条件（１）：プロファイルにおいて、判定閾値を上回る高輝度領域がＮ箇所存在する（Ｎ≧１）。
条件（２）：プロファイル上の１箇所の高輝度領域幅ΔＨが設定する許容範囲に含まれ、（Ｎ－１）箇所の高輝度領域幅ΔＨが、設定する許容範囲内に含まれない。
　図１０Ａや図１４の上側走査線の例においては、高輝度領域は３箇所存在している（条件（１）においてＮ＝３である場合に相当）。ウェル底面に相当する高輝度領域については、その幅ΔＨがウェル底面の設計公差範囲内に収まっていると想定される。したがってΔＨの許容範囲は、（ウェル底面直径設計値－ウェル底面直径の下限公差）≦ΔＨ≦（ウェル底面直径設計値＋ウェル底面直径の上限公差）とするのが適当である。他方で低輝度領域よりも外側の高輝度領域の幅は、ウェル底面の設計公差範囲に収まっていないと考えられる。したがって許容範囲を上記のようにセットすることにより、ウェル底面に対応する高輝度領域のみを検出できる。ウェル底面直径を１．５ｍｍ±０．１ｍｍとすれば、１．４≦ΔＨ≦１．６となる。
　図１５は、高輝度領域が１つのみである場合において、ウェル底面を直接検出する場合の例である。スキャン範囲（ｂｘ，ｂｙ）のサイズによっては、全範囲をスキャンしたとしても、高輝度領域がウェル底面に対応するもの１つのみしか含まれない場合がある。図１５はその例を示す。この場合は条件（１）においてＮ＝１であっても、ΔＨが上記設計公差範囲内に収まっていれば、その高輝度領域をウェル底面とみなすことができる。
　ただしこの手法は、ウェル位置誤差が比較的小さく、スキャン範囲（ｂｘ，ｂｙ）をある程度小さくセットしても誤検出のおそれが小さい場合に適しているといえる。ウェル位置誤差が大きい場合、スキャン範囲（ｂｘ，ｂｙ）のサイズと初期位置によっては、低輝度領域の外側の高輝度領域をウェル底面として誤認識する可能性があるからである。
＜実施の形態３：まとめ＞
　本実施形態３に係る検体観察装置１００は、高輝度領域を検出するとともに、あらかじめセットした許容範囲にしたがって、その高輝度領域をウェル底面とそれ以外に区別する。これにより、探索対象であるウェル底面を直接的に発見することができ、判定アルゴリズムを比較的単純にすることができる。
＜実施の形態４＞
　本開示の実施形態４においては、撮像視野全体を取得画像とする例について説明する。検体観察装置１００の構成は図１と同じである。本実施形態４においては、実施形態１～３で説明した条件（１）（２）は用いず、以下の手順によりウェル底面の中心位置を特定する。
　撮像素子１０６が２５００×２０００の５００万画素、画素分解能０．３４５μｍ／ｐｉｘｅｌとすれば。実視野は０．８６ｍｍ×０．６９ｍｍとなる。ｂｘ、ｂｙはそれぞれ０．８６ｍｍ、０．６９ｍｍの整数倍とし、ΔＸ＝０．８６ｍｍ、ΔＹｓ＝０．６９ｍｍとする。ｂｘ×ｂｙ領域をスキャンし、画像をスタックする。スタックした画像を図４のように合成し、あらかじめ設定した閾値によって輝度値の高い領域を判定する。判定した輝度値の高い領域の面積に対して、面積許容値との比較によりウェル底面を判断する。ウェル底面直径を１．５ｍｍ±０．１ｍｍとすれば面積許容範囲は１．５ｍｍ２～２．０ｍｍ２となる。
　ただしウェル位置誤差が大きい場合、すなわちｂｘ、ｂｙが大きい場合には、ウェル外の高輝度領域をウェル底面と認識してしまう可能性が生じる。この場合は、輝度値の高い領域のアスペクト比や真円度などの形状特徴量を合わせて評価することにより、ウェル底面を判定することができる。判定した高輝度領域の幾何中心を計算し、Ｘｃ、Ｙｃを同時に確定する。
＜本開示の変形例について＞
　本開示は、前述した実施形態に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施形態は本開示を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施形態の構成の一部を他の実施形態の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施形態の構成に他の実施形態の構成を加えることも可能である。また、各実施形態の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
　以上の実施形態において、コントローラ２００は、その機能を実装した回路デバイスなどのハードウェアによって構成することもできるし、その機能を実装したソフトウェアをＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　Ｕｎｉｔ）などの演算装置が実行することによって構成することもできる。
　以上の実施形態において、ダイクロイックミラー１０４の透過側に撮像素子１０６を配置し、反射側に光ピックアップ１０５を配置してもよい。また光路上に図示していない光学フィルターなどの適当な光学部品を配置してもよい。
　以上の実施形態において、対物レンズ１０２の焦点位置をウェル底面よりも上方（検体容器１０１内部）にセットすることを説明した。ウェル外側底面とウェル底面（図２参照）との間の中心軸ずれが微小で無視できる場合は、これに代えて、対物レンズ１０２の焦点位置をウェル底面より下方にセットしてもよい。この場合はウェル外側底面のデフォーカス画像を取得・解析することになる。中心位置を特定する手順は以上の実施形態と同様である。
　以上の実施形態において、中心位置座標はＸｃ、Ｙｃの順に確定しているが、この順序は入れ替えてもよい。
　実施形態４において、高輝度領域を判定するための閾値をあらかじめセットすることを説明したが、閾値を自動的にセットする任意の公知手法を用いて、観察画像ごとに閾値を自動的にセットしてもよい。
　以上の実施形態において、ウェル底面は円形であり、その周囲の傾斜部もウェル底面に対して同心円状に配置されている例を説明した。本発明によって中心位置を特定することができるウェル形状はこれに限られるものではなく、傾斜部によって低輝度領域がウェル底面の周辺に形成されるその他形状であっても、本発明を適用することができる。例えばウェル底面とその周辺の低輝度領域がＸ方向に沿って（Ｙ軸に関して）線対称であれば、高輝度領域または低輝度領域の座標平均をＸｃとみなすことができる。同様にＹ方向に沿って（Ｘ軸に関して）線対称であれば、高輝度領域または低輝度領域の座標平均をＹｃとみなすことができる。
　以上の実施形態は、併用することもできる。例えば実施形態２で説明した条件（１）において低輝度領域が１つのみである場合に特定した中心位置座標と、実施形態１によって特定した中心位置座標とを平均することにより、最終的な中心位置を特定することが考えられる。あるいは実施形態ごとに信頼度係数をあらかじめ定めておき、各実施形態によって特定した中心位置座標に対してその信頼度係数を乗算した結果を合算することにより、最終的な中心位置を特定することが考えられる。その他適当な手法を用いて各実施形態を併用してもよい。
１００：検体観察装置
１０１：検体容器
１０２：対物レンズ
１０３：対物レンズアクチュエータ
１０４：ダイクロイックミラー
１０５：光ピックアップ
１０６：撮像素子
１０７：照明
１０８：検体容器保持部
１０９：ＸＹステージ

Claims (15)

  1. 　検体容器が収容している検体を観察する検体観察装置であって、
    　前記検体容器を水平方向に移動させるＸＹステージ、
    　前記検体容器に対して垂直方向に光を照射する光源、
    　前記検体容器を透過した前記光を集光する対物レンズ、
    　前記対物レンズが集光した前記光を用いて前記検体容器の画像を撮像する撮像部、
    　前記対物レンズのフォーカス位置を調整するオートフォーカス機構、
    　前記検体観察装置の動作を制御するコントローラ、
    　を備え、
    　前記検体容器は、前記検体容器の底面と前記検体容器の側面との間が傾斜面によって接続された形状を有しており、
    　前記コントローラは、前記オートフォーカス機構が前記フォーカス位置を調整する前において、前記検体容器の複数の箇所における前記画像の輝度値を取得し、
    　前記コントローラは、
    　　前記画像上において前記輝度値が閾値以上である高輝度領域の個数と、前記高輝度領域の前記水平方向における幅とを用いて、前記検体容器の前記水平方向における中心位置を特定し、
    　　または、
    　　前記画像上において前記輝度値が前記閾値未満である低輝度領域の個数と、前記低輝度領域の前記水平方向における幅とを用いて、前記検体容器の前記水平方向における中心位置を特定する
    　ことを特徴とする検体観察装置。
  2. 　前記コントローラは、前記水平方向における第１走査線に沿って前記箇所を移動させながら各前記箇所における前記輝度値を取得し、
    　前記コントローラは、前記低輝度領域が２つ以上存在し、かつ２つの前記低輝度領域によって挟まれた前記高輝度領域の幅が第１許容範囲内に含まれる、前記第１走査線を探索し、
    　前記コントローラは、前記探索によって取得した前記第１走査線上における前記高輝度領域の幅を用いて、前記第１走査線と平行な第１方向における前記中心位置を特定する
    　ことを特徴とする請求項１記載の検体観察装置。
  3. 　前記コントローラは、前記探索によって取得した前記第１走査線上における前記高輝度領域の座標点の平均値を、前記中心位置として特定する
    　ことを特徴とする請求項２記載の検体観察装置。
  4. 　前記コントローラは、前記第１許容範囲として、前記第１走査線に沿った各前記箇所の間隔以上、かつ前記検体容器の前記底面の直径以下の値を用いる
    　ことを特徴とする請求項２記載の検体観察装置。
  5. 　前記コントローラは、前記水平方向において前記第１走査線に対して直交する第２走査線に沿って前記箇所を移動させながら各前記箇所における前記輝度値を取得し、
    　前記コントローラは、前記低輝度領域が２つ以上存在し、かつ２つの前記低輝度領域によって挟まれた前記高輝度領域の幅が第２許容範囲内に含まれる、前記第２走査線を探索し、
    　前記コントローラは、前記探索によって取得した前記第２走査線上における前記高輝度領域の幅を用いて、前記第２走査線と平行な第２方向における前記中心位置を特定する
    　ことを特徴とする請求項２記載の検体観察装置。
  6. 　前記コントローラは、前記検体容器の前記傾斜面によって屈折した前記光を撮像することにより取得した屈折光画像の位置と幅を特定し、
    　前記コントローラは、前記特定した前記屈折光画像の位置と幅を用いて、前記中心位置を特定する
    　ことを特徴とする請求項１記載の検体観察装置。
  7. 　前記コントローラは、前記水平方向における第３走査線に沿って前記箇所を移動させながら各前記箇所における前記輝度値を取得し、
    　前記コントローラは、前記低輝度領域が１つまたは２つ存在し、かつ前記低輝度領域の幅が第３許容範囲内に含まれる、前記第３走査線を探索し、
    　前記コントローラは、前記探索によって取得した前記第３走査線上における前記低輝度領域の幅を用いて、前記第３走査線と平行な第３方向における前記中心位置を特定する
    　ことを特徴とする請求項１記載の検体観察装置。
  8. 　前記コントローラは、前記探索によって取得した前記第３走査線上における前記低輝度領域の座標点の平均値を、前記中心位置として特定する
    　ことを特徴とする請求項７記載の検体観察装置。
  9. 　前記コントローラは、前記第３走査線上において前記低輝度領域が１つのみ存在する場合、前記第３許容範囲として、前記第３走査線に沿った各前記箇所の間隔以上、かつ前記第３走査線に沿った方向において前記低輝度領域が途切れずに連続する最大長以下の値を用いる
    　ことを特徴とする請求項７記載の検体観察装置。
  10. 　前記コントローラは、前記第３走査線上において前記低輝度領域が２つ存在する場合、前記第３許容範囲として、前記第３走査線に沿った各前記箇所の間隔以上、かつ前記２つの低輝度領域それぞれの幅以下の値を用いる
    　ことを特徴とする請求項７記載の検体観察装置。
  11. 　前記コントローラは、前記水平方向における第４走査線に沿って前記箇所を移動させながら各前記箇所における前記輝度値を取得し、
    　前記コントローラは、前記高輝度領域が２つ以上存在し、かつ１つの前記高輝度領域の幅が第４許容範囲内に含まれ、かつその他の前記高輝度領域の幅が前記第４許容範囲内に含まれていない、前記第４走査線を探索し、
    　前記コントローラは、前記探索によって取得した前記第４走査線上における前記１つの高輝度領域の幅を用いて、前記第４走査線と平行な第４方向における前記中心位置を特定する
    　ことを特徴とする請求項１記載の検体観察装置。
  12. 　前記コントローラは、前記第４許容範囲として、（前記検体容器の底面の直径の設計値－前記設計値の下限公差）以上、かつ（前記設計値＋前記設計値の上限公差）以下の値を用いる
    　ことを特徴とする請求項１１記載の検体観察装置。
  13. 　前記コントローラは、前記検体容器の内部に前記フォーカス位置をセットした上で、前記中心位置を特定し、
    　前記コントローラは、前記画像として、前記撮像部の撮像視野よりも狭い範囲の画像を取得し、
    　前記コントローラは、前記画像として、前記検体容器の前記底面よりも狭い範囲の画像を取得する
    　ことを特徴とする請求項１記載の検体観察装置。
  14. 　前記底面は円形であり、かつ前記傾斜面は前記底面の周囲を同心円状に囲むように形成されており、
    　前記コントローラは、前記箇所において取得した前記画像内の各ピクセルの輝度値を合算することにより、その箇所における前記画像の輝度値を取得し、
    　前記コントローラは、前記中心位置を特定した後、その特定した中心位置において、前記オートフォーカス機構によって前記フォーカス位置を調整する
    　ことを特徴とする請求項１記載の検体観察装置。
  15. 　検体容器が収容している検体を観察する検体観察装置を用いて前記検体を観察する検体観察方法であって、
    　前記検体観察装置は、
    　前記検体容器を水平方向に移動させるＸＹステージ、
    　前記検体容器に対して垂直方向に光を照射する光源、
    　前記検体容器を透過した前記光を集光する対物レンズ、
    　前記対物レンズが集光した前記光を用いて前記検体容器の画像を撮像する撮像部、
    　前記対物レンズのフォーカス位置を調整するオートフォーカス機構、
    　を備え、
    　前記検体容器は、前記検体容器の底面と前記検体容器の側面との間が傾斜面によって接続された形状を有しており、
    　前記検体観察方法は、前記オートフォーカス機構が前記フォーカス位置を調整する前において、前記検体容器の複数の箇所における前記画像の輝度値を取得するステップ、
    　前記検体容器の前記水平方向における中心位置を特定するステップ、
    　を有し、
    　前記検体容器の前記水平方向における中心位置を特定するステップにおいては、
    　　前記画像上において前記輝度値が閾値以上である高輝度領域の個数と、前記高輝度領域の前記水平方向における幅とを用いて、前記検体容器の前記水平方向における中心位置を特定し、
    　　または、
    　　前記画像上において前記輝度値が前記閾値未満である低輝度領域の個数と、前記低輝度領域の前記水平方向における幅とを用いて、前記検体容器の前記水平方向における中心位置を特定する
    　ことを特徴とする検体観察方法。
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