JP5517807B2 - 分析装置 - Google Patents

Description

本発明は、蛍光検出機構および撹拌機構を備えた分析装置に関し、特に核酸検査に用いる分析装置である。

従来、遺伝子検査や生化学検査分野では、核酸やタンパク質などの極微量試料を解析するために、蛍光を利用した定量分析を応用することが極めて多い。これは蛍光強度が非常に高感度に検出可能であるためである。分析装置の自動化をさらに進めるために、従来手作業であった工程を自動化することが重要となってきた。

試料や試薬の撹拌は解析結果に大きく影響するため、撹拌機構の性能評価を行うことは極めて重要である。生化学分析における反応溶液の撹拌方法としては、接触撹拌と非接触撹拌に区別できる。

接触撹拌の場合、撹拌棒を用いる方法とシリンジ機構等を用いた吸引吐出による方法が主である。また、非接触撹拌の場合、反応容器を固定し反応液に超音波を当てることによる撹拌方法と、反応容器と共に反応溶液を激しく動かす機構を用いた撹拌方法がある。

その撹拌状態を判定する手法として、撹拌判定用の試薬を用いて液体試料と撹拌を行い、判定の手法として分光光度計や撹拌装置を搭載した分析装置（特許文献１）を用いて吸光度を測定していた。

また、従来の手作業による遺伝子検査では、微量溶液に対応した反応容器で、キャリーオーバーのリスクが低い撹拌方法として、ボルテックス撹拌と遠心機を組合せることによる非接触撹拌を行い、激しい撹拌によって活性を失い易い酵素を含む反応液の場合、前記ボルテックスミキサーを用いた撹拌方法は実施せずに、反応容器の底を手でたたいて撹拌するタッピング操作を行っており、前記タッピングした反応容器の撹拌状態を確認するには、分光光度計を必要としていた。

特開２００５−３７２９９号公報（特許文献２）には、数十ｐｌの体積の有する混合液滴の均一度を吸光度及び蛍光強度の対称性を算出し判定する手法が開示されている。この手法では、液滴蛍光画像を取得後に液滴の中心を決定し、中心に対して左右の対称度を算出して液滴の均一度を評価している。

特開２００９−１５０７３０号公報 特開２００５−３７２９９号公報

公知技術の吸光度法により撹拌機構の性能評価を装置内部で自動化するためには、吸光度測定のための色素溶液と光度計を搭載させなくてはならず、装置全体が複雑化しコストが増大してしまう。

また、特許文献２では、蛍光強度そのもので比較を行っていないため、撹拌されず不均一であっても取り出す部位によって、液滴の均一度が高い結果を取得してしまう。

本発明の分析装置は、励起光を照射する光源と、蛍光強度を測定する測定部と、容器内の液体を攪拌する攪拌機構と、蛍光強度を測定する際に容器を架設する容器架設部と、を備え、攪拌後に測定部で測定した蛍光強度を基に攪拌不良かどうかを判断している。

本発明によれば、他の装置を用いることなく、自装置内で攪拌性能を判定することができる。

分析装置の概略構成図を示す平面図である。 図１に示す遺伝子検査装置の搬送機構を加えた図である。 図１に示す遺伝子検査装置および外部装置の図である。 実施例１の手順を示すフローチャートである。 実施例１の手順１における蛍光強度測定データ数決定における各ステップを示すフローチャートである。 実施例１の手順６における撹拌機構の撹拌性能自動評価における各ステップを示すフローチャートである。 本発明の撹拌機構の概略を示す図である。 本発明の蛍光検出機構の概略を示す図である。 図８に示す蛍光検出機構の光学ユニットの概略を示す図である。 本発明の撹拌前後の反応容器内の反応液の様子を示す図である。

本発明の一実施形態の核酸検査装置（遺伝子検査装置ともいう）は、図２に示すように、液体を分注可能な分注機構１３，反応容器を搬送する搬送機構１４，試薬分注された反応容器を撹拌する攪拌機構１１，蛍光色素溶液の蛍光強度を測定可能な蛍光検出機構１２を備える。また、核酸検査装置は、さらに、図３に示すように、制御部２１，データ処理装置２５を備える。但し、データ処理装置２５は、核酸検査装置に外付けしてもよい、つまり、データ処理装置２５を核酸検査装置とは別に設けてもよい。好ましくは、攪拌中の温度変化が検査結果に影響する場合は、攪拌機構１１の周囲に温度制御機構（不図示）を備えている。

具体的な動作について説明する。分注機構１３より目標容量の試薬を反応容器７に分注する。次いで、分注された反応容器７を搬送機構１４にて撹拌機構１１へ搬送し、反応容器設置部５２が回転駆動体５１の回転中心とは異なる撹拌機構１１にて、高速回転と遅速回転または回転停止を繰返し実施する（図７）。次いで、撹拌した反応容器７を搬送機構１４で蛍光検出機構１２に搬送し、蛍光検出機構１２から得られる蛍光強度を算出する。この一連の動作を同一条件で複数回繰返して行い、得られた各回のデータから、平均値，標準偏差を求め、次いで標準偏差からプロコトルの最大のバラツキ３ＳＤ（standard Deviation）を算出し、平均値から３ＳＤ減算した値を算出する。最後に、得られた平均値から３ＳＤ減算した値を撹拌機構の性能評価結果とする。以上の過程は、次のように表される。

（ｎ：繰返し測定回数、ｋ：撹拌した反応容器の数量、Ｖ：蛍光強度データ、Ｅｉｊ：サンプル数の蛍光強度データ、Ｅｉ：蛍光強度データの平均、ｓ：蛍光強度データの標準偏差）

次いで、算出した撹拌機構１１の性能評価結果を予め設定した基準値と比較し、基準値以下である場合は撹拌不良であると判定しオペレータに通知する。

撹拌機構１１の撹拌性能評価としてＦｌｘを用いることが好ましいが、撹拌性能評価としてprecisionのみを求めて性能を判定してもよい。

分注の繰返し回数（ｋ）は多いほど好ましいが、撹拌機構１１の性能評価として統計的に妥当な回数であればよい。

攪拌機構１１は、図７に示すように、全体を支える保持具５３，容器架設台５４，容器架設台５４を回転させる回転駆動体５１を備えている。

撹拌機構１１は、反応容器を架設可能な穴（反応容器設置部）５２が空いている。複数穴の空いた反応プレートを設置可能であることが好ましいが、図７に示すように、少なくとも一つ空いていれば連続撹拌することで撹拌機構の性能評価が可能であればよい。

撹拌機構１１は、撹拌動作により反応容器７の垂直軸が傾かず、回転駆動体５１により一定速度で回転させることが可能で、好ましくは速度，回転方向が可変であればよい。

蛍光検出機構１２は、図８に示すように、反応容器７の架設部を有する反応ディスク３０，該反応ディスク３０を保持する保持具３３，保持具３３を介して反応ディスク３０を回転させる回転駆動体３５，反応ディスク３０を覆うケーシング３６、および反応容器７からの蛍光を検出する光学ユニット３４を備えている。反応ディスク３０には、反応容器７の温度制御を行うヒータ３１と温度センサ３２が設けられている。

蛍光検出機構１２による蛍光強度測定は、撹拌機構１１により撹拌された反応容器を必要数量だけ蛍光検出機構１２に架設後に測定する。より好ましくは、温度変化が検査結果に影響する場合は、蛍光検出機構１２内に反応容器内の反応液を温度制御可能な機構（不図示）を備えることが望ましい。なお、蛍光強度測定は、少なくとも一つの反応容器の蛍光強度を測定可能であれば、架設と蛍光強度測定を反応容器の必要数量だけ繰返し行えればよく、撹拌後の反応容器を測定するタイミングによって本発明を限定するものではない。

蛍光試薬は、一連の規定容量だけ前記蛍光色素溶液を含んだ溶液である。また、蛍光試薬は、蛍光検出機構の測定間差を補正するために、内部標準として利用可能な異なる蛍光色素溶液を含んでいることが好ましい。さらに、蛍光強度測定により、蛍光検出機構の校正が可能となることが好ましい。なお、蛍光試薬の蛍光色素溶液は、蛍光検出機構により検出可能なものであればよい。

本実施形態の核酸検査装置は、特定の遺伝子を増幅して特異的に検出可能であればよく遺伝子検査法に限定されない。より具体的には、ＰＣＲ法，ＮＡＳＢＡ法，ＬＡＭＰ法等が挙げられるが、本発明は、特定の遺伝子を増幅検出可能であれば他の手法でもよい。

図９に示す、本発明の反応液４７には、生化学検査，遺伝子検査等、従来の一般的に用いられる試薬であればいかなる試薬でもよく、より具体的にはＮＡＳＢＡ試薬，ＬＡＭＰ試薬，ＰＣＲ試薬が挙げられるが、試薬の種類に限定されない。また、本発明は反応液の蒸発を防ぐためのミネラルオイルが添加されていても効果的な撹拌が可能である。

図１に示すように、容器設置部１には、試薬容器ラック５，試料容器ラック３，反応容器ラック６、および分注チップラック８が設けられている。

本発明の分注機構１３は、核酸検査に用いる反応液を分析に必要な精度で分注可能であればよく、５０μｌ以下の分注が可能で、より好ましくは、１０μｌの分注が可能であればよい。

搬送機構１４は、反応容器ラック６上の反応容器７を、攪拌機構１１および蛍光検出機構１２へ設置する。動作を具体的に説明すると、反応容器７を容器保持機構１９で掴み上方へ持ち上げ搬送し、反応容器７を下降させることによって、攪拌機構１１および蛍光検出機構１２の容器架設部へ設置することができる。なお、容器保持機構１９の上下動は、搬送機構１４に設けられた、アップダウンレール１７で行う。また、容器保持機構１９のＸＹ方向への移動（２次元移動）は、搬送機構１４に設けられた、センターレール１５およびサイドレール１６で行う。

上記の蛍光色素溶液としては、例えば、蛍光色素溶液ＦＡＭ溶液原液５,０００ｎＭ溶液にリン酸緩衝液を添加し、希釈した蛍光色素溶液が挙げられる。蛍光色素溶液の代わりに量子ドット（Ｑｄｏｔ）溶液を用いることで、量子ドットの利点である長時間の励起光照射でも退色による影響がなく、さらには励起スペクトルが広範囲におよぶため、単一励起波長により発光波長の異なる量子ドットを用いて同時に複数の発光を得ることが可能である。さらには、励起波長の異なるＬＥＤを有する光学系に対し、反応液の種類を複数用いることなく撹拌評価が可能である。

上記の蛍光強度の測定とは、用いる蛍光色素に適切な励起波長を照射し、発生する蛍光を検出することを意味する。

また、本実施形態の核酸検査装置は、制御部２１と、データ処理装置２５を備えている。制御部２１は、各機構の制御，温度制御，開口部開閉制御，サンプル導入および廃棄機構の制御，蛍光検出器からのデータ取得，データ解析が可能であればよい。

データ処理装置２５は、演算処理を行うデータ処理部２２と、データの記憶機能を備える記憶装置２４と、撹拌機構の性能評価結果を表示するモニター２３とを備えている。

本発明の一実施例について説明する。

表１に、攪拌機構１１および蛍光検出機構１２の一例を示す。また、表２に、実験器具および試薬の一例を示す。

本実施例の攪拌性能を求める手順について図４を用いて説明する。

蛍光強度測定データ数（ｋ；攪拌する反応容器の数）をオペレータの指示に基づき決定する（Ｓ１０１）。このステップについては、図５を用いて後述する。この後、オペレータによって、表２に示した必要量の試薬と、必要数の反応容器および分注チップが設置される。

オペレータからの指示に基づき、攪拌性能評価を開始する（Ｓ１０２）。

分注機構１３が必要量の試薬，試料，蛍光色素溶液を必要数の反応容器７へ分注する（Ｓ１０３）。このとき、必要に応じて表面に蒸発防止用のオイルを添加してもよい。

次に、図示しない閉栓機構により、反応容器７を閉栓する（Ｓ１０４）。

その後、搬送機構１４を用いて反応容器７を攪拌機構１１へ搬送する（Ｓ１０５）。

搬送後、攪拌機構１１は、高速回転と遅速回転を繰返し、蛍光色素溶液と反応液（試薬および試料）とを混合する（Ｓ１０６）。

攪拌機構１１が、攪拌性能の評価を行う（Ｓ１０７）。この評価の詳細については、図６を用いて後述する。

最後に、攪拌性能の評価結果をオペレータへ通知する（Ｓ１０８）。

上記のＳ１０１を、図５のフローチャートに沿って説明する。蛍光強度測定データのサンプル数（ｋ）は、撹拌機構１１の撹拌性能評価として統計的に妥当な回数が既定値として設定されているが、オペレータの目的に合わせて自由に選択することができる。

蛍光強度データサンプル数（ｋ）を既定値から変更するかどうかをオペレータへ尋ねる（Ｓ２００）。

既定値から変更しない場合、既定値が蛍光強度データサンプル数（ｋ）とする（Ｓ２０１）。

既定値から変更する場合、蛍光強度データサンプル数のリストを表示する（Ｓ２０２）。

このリストからサンプル数が選択された場合（Ｓ２０３）、選択されたサンプル数が蛍光強度データサンプル数（ｋ）となる（Ｓ２０４）。

一方、オペレータから直接サンプル数が入力された場合（Ｓ２０５）、この入力されたサンプル数が蛍光強度データサンプル数（ｋ）となる（Ｓ２０６）。

次に、攪拌性能の評価について図６を用いて説明する。

撹拌機構１１により撹拌した反応容器７を搬送機構１４により、蛍光検出機構１２の反応ディスク３０へ蛍光強度データサンプル数（ｋ）移設する（Ｓ３００）。

蛍光検出機構１２の反応ディスク３０を回転させることにより、反応液４７が保持された反応容器７が光学ユニット３４上を通過する（Ｓ３０１）。

光学ユニット３４は、光学ユニット３４上を通過する反応容器７に励起光を照射し、発光される蛍光の強度を求める（Ｓ３０２）。

制御部２１は、予め定めたサンプリング周期で、反応液４７が発する蛍光強度を予め定めた回数（ｎ）、採取する（Ｓ３０３）。

制御部２１は、採取したサンプリングデータから蛍光強度が一番高いピーク値を算出する（Ｓ３０４）。

サンプル数がｋ個に達しない場合、測定が完了した反応容器７を搬送機構１４にて搬出してから、廃棄し、Ｓ３００へ戻る。一方、サンプル数がｋ個に達した場合、次のステップへ進む（Ｓ３０５）。

制御部２１は、蛍光強度のピーク値を用いて、各反応容器のピーク値の平均値Ｅｊを求める（Ｓ３０６）

撹拌性能の評価結果（Ｆｌｘ）が、基準値以上である場合、撹拌機構１１の撹拌性能自動評価を終了する（Ｓ３１１）。

一方、撹拌性能の評価結果（Ｆｌｘ）が、基準値未満である場合、撹拌機構１１の撹拌性能不良と判断し、エラー表示すると共に算出したデータを出力する（Ｓ３１２）。

以上の手順で行った攪拌性能結果を、以下に示す。ここでは、Ｆｌｘを求めるための蛍光強度データのサンプル数（ｋ）は４８、繰返し回数（ｎ）は４回、コントロール溶液と撹拌なし溶液の反応容器はシングルチューブ、ｅａｓｙＱプロコトル溶液の反応容器は８連チューブとした。

本実施形態とｅａｓｙＱプロコトルを用いて撹拌によるそれぞれの反応液４７を表３に、撹拌性能評価結果を表４に示す。

上記表４において、まず（１）コントロールとして撹拌機構で撹拌したものと、（２）撹拌なしの２種類の溶液を蛍光検出機構にて蛍光強度の測定を行った結果から、（１）コントロールに対して（２）撹拌なしの平均値は約５０％であり、撹拌の有無を認識可能であることが証明された。この結果を図９，図１０を用いて以下に詳細を説明する。

図９は、蛍光検出機構１２の光学ユニット３４の概略構成図である。光源である発光ダイオード３７より放出された光は、第１レンズ３８により平行光となり、励起用バンドパスフィルタ３９により余分な波長域をカットした後、第２レンズ４１で反応ディスクの試料ホルダに支持されている透明な反応容器７内の反応液４７に底面から照射される。指定された回転速度で反応ディスク３０が回転を始めると、第２レンズ４１から照射された励起光を通過する際に反応容器７から蛍光を発光する。

反応容器７から発せられる蛍光は、反応容器７の側面から第３レンズ４２により平行光となり、蛍光用バンドパスフィルタ４３により余分な波長域をカット後、第４レンズ４４で蛍光検出素子４５に照射される。蛍光を蛍光検出素子４５によって検出することにより、反応液４７の光学的特性を測定する機構を持つ。反応ディスク３０の回転，発光ダイオード３７の点灯および蛍光検出素子（蛍光検出器）４５の制御，データ収集を制御部２１で行い、判定結果をデータ処理装置２５へ出力しモニター２３に表示する。

図１０は、撹拌機構１１における撹拌前と撹拌後の反応液４７の概略図である。蛍光発光の強度は、蛍光色素溶液と励起光源の距離に依存する（近距離ほど発光が強い）ことを利用する。反応液を分注後に反応液よりも比重の軽い蛍光色素溶液を分注する。

撹拌前において、反応液４７上面の蛍光色素の濃度が高く、第３レンズ４２で集光する蛍光検出の光軸上の濃度は低く、撹拌後、つまり撹拌性能が良好である場合は、反応液に対し均一に蛍光色素が分布するため、第３レンズ４２で集光する蛍光検出の光軸上の濃度は高くなる。このように撹拌前後の蛍光色素溶液の分布の違いから蛍光強度が変化することが、表４から証明できた。

上記表４において、次に（１）（２）に加えて（３）ｅａｓｙＱプロコトル（８連チューブによる撹拌）に従い撹拌したもの合計３種類の撹拌後の蛍光強度の測定を行った結果、ｅａｓｙＱプロコトルの結果から３ＳＤ（Standard Deviation）の範囲で（３）ｅａｓｙＱプロコトルは８４.９％以上の蛍光強度を持つことが判明した。この結果より、本発明における撹拌機構の性能は、（１）コントロールの蛍光強度に対し、蛍光強度の平均値−３ＳＤが８４.９％以上であればよいことが証明された。

本発明における反応液はＮＡＳＢＡ試薬ＨＩＶ２.０において測定を行ったが、本発明による遺伝子検査装置では、測定する反応液ごとに撹拌性能の基準値を予め設定を行い比較すればよく、反応液の種類によって本発明を限定するものではない。

以上のように、本実施形態によって、撹拌機構１１の撹拌性能の評価を装置内部において自動で実施することができた。

本発明の実態形態である蛍光色素溶液は比重の軽いリン酸緩衝液を用いたが、上記撹拌機構において撹拌前後の蛍光強度を判別できればよく、本発明は当該具体的な例に限定されるものではない。具体的には、蛍光色素溶液は比重の重い反応液に添加してしてもよく、その場合は撹拌前後の蛍光強度の関係が逆にあるため、撹拌後に算出される撹拌性能が予め設定される基準値以上である場合、撹拌不良と判断すればよい。

また、本発明の実態形態である励起光照射と蛍光検出の関係は、反応容器７に対して底面照射−側面検出であるが、上記蛍光検出機構１２において蛍光強度を測定できればよく、本発明は当該具体的な例に限定されるものではない。具体的には、底面照射−底面検出，側面照射−側面検出，上面照射−側面検出，上面照射−上面検出でも構わない。

本発明によれば、蛍光強度が蛍光物質と励起光源の距離に正比例する特性を利用し、試薬添加後に上面付近に上昇する比重の軽い検体溶液に蛍光試薬を添加することにより、反応容器内における撹拌前後の蛍光色素溶液分布の違いによる、反応液中の蛍光色素溶液の濃度から、蛍光強度の強弱を用いて撹拌状態の比較を行うことを特徴とする。

また、本発明の撹拌性能判定方法は、試薬添加後に反応容器に保持された試薬を撹拌し、一定時間反応させた後、反応液の蛍光強度を測定する分析装置の撹拌判定方法であって、添加する試薬と撹拌判定用の蛍光試薬とを前記反応容器で撹拌した試薬の蛍光強度を測定する工程と、撹拌状態を予め設定した基準値と比較し、基準値以下の場合に撹拌不良と判断する判定工程を含むことを特徴とする。

また、上記目的を達成するために、本発明は、当該撹拌機構と撹拌機構周囲に温度調節機構を備え、反応容器を架設する搬送機構，反応容器に試薬を添加する分注機構，反応を検出する検出器を備え、分注機構で反応容器に試薬と蛍光試薬溶液を添加後、搬送機構によって反応容器を撹拌機構に設置し、温度調節機構により所定の温度に維持した状態で前述の撹拌装置で撹拌する遺伝子検査装置内部で自動化することを特徴とする。

本発明によれば、少なくとも試薬と撹拌判定用の蛍光試薬からなる反応容器において、撹拌後に蛍光強度を測定する工程と、撹拌状態を予め設定した基準値と比較する判定工程を備え、装置内部で自動化させることができる。また、最小限度の試薬と消耗品を装置に供するだけで撹拌機構の自動性能評価を装置内部で実施するため、撹拌機構の性能評価を極めて低コストで定量的、かつ簡便迅速に実施することができる。

１ 容器設置部
２ 試料容器
３ 試料容器ラック
４ 試薬容器
５ 試薬容器ラック
６ 反応容器ラック
７ 反応容器
８ 分注チップラック
９ 分注チップ
１０ 定温器
１１ 撹拌機構
１２ 蛍光検出機構
１３ 分注機構
１４ 搬送機構
１５ センターレール
１６ サイドレール
１７ アップダウンレール
１８ シリンジ
１９ 容器保持機構
２０ 分析テーブル
２１ 制御部
２２ データ処理部
２３ モニター
２４ 記憶装置
２５ データ処理装置
３０ 反応ディスク
３１ ヒータ
３２ 温度センサ
３３，５３ 保持具
３４ 光学ユニット
３５ 回転駆動体
３６ ケーシング
３７ 発光ダイオード
３８ 第１レンズ
３９ 励起用バンドパスフィルタ
４０ ハーフミラー
４１ 第２レンズ
４２ 第３レンズ
４３ 蛍光用バンドパスフィルタ
４４ 第４レンズ
４５ 蛍光検出器
４６ 励起光検出器
４７ 反応液
５１ 回転駆動体（ステッピングモータ）
５２ 反応容器設置部
５４ 容器架設台
５５ 蛍光検出素子

Claims (4)

1. 励起光を照射する光源と、容器内の液体を攪拌する攪拌機構と、容器内の液体からの蛍光強度を測定する測定部と、蛍光強度を測定する際に容器を架設する容器架設部と、を備えた分析装置であって、
   前記光源は励起光を前記容器の下方から照射し、前記測定部は前記容器の側方から蛍光強度を測定し、
   前記容器架設部は、前記容器の温度を制御する温度制御部を備えており、
   前記容器架設部は、側方が蛍光強度の測定のために開口しており、
   前記攪拌機構は、回転駆動体および反応容器設置部を有し、この反応容器設置部は、前記回転駆動体の回転軸からずれた位置に設けられており、
   攪拌後に測定部で測定した蛍光強度を基に攪拌不良かどうかを判断する制御部を備え、
   容器内に蛍光色素溶液とこの蛍光色素溶液よりも比重の軽い液体を投入して、投入後に蒸発防止用のオイルを添加し、攪拌前に蛍光色素溶液が位置する側から攪拌後に励起光を照射して、測定部で測定した蛍光強度が所定値以上の場合に攪拌不良であると判断し、
   攪拌不良の場合、攪拌不良であることをオペレータへ通知することを特徴とする、分析装置。
2. 請求項１に記載の分析装置において、
   容器に液体を分注する分注機構を備えていることを特徴とする、分析装置。
3. 請求項１に記載の分析装置において、
   容器を移動させる搬送機構を備えていることを特徴とする、分析装置。
4. 請求項３に記載の分析装置において、
   搬送機構は、容器を掴むアームを有することを特徴とする、分析装置。

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