JP2000503857A

JP2000503857A - 核酸増幅生成物の検出のための受動的内部参照

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Publication number: JP2000503857A
Application number: JP10500823A
Authority: JP
Inventors: ジェイ．リバック，ケニス; ジェイ．マックブライド，リンカーン
Original assignee: ザパーキン―エルマーコーポレーション
Priority date: 1996-06-04
Filing date: 1997-06-03
Publication date: 2000-04-04
Anticipated expiration: 2017-06-03
Also published as: DE69708285D1; CA2256457A1; ATE208826T1; WO1997046708A1; JP3454432B2; CA2256457C; AU710782B2; EP0904411B1; AU3230297A; US5736333A; DE69708285T2; EP0904411A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、核増幅反応における増幅生成物の形成の定量化の際に使用するための、受動的内部参照に関する。本発明の内部増幅参照分子は、バックボーンコネクターを通して共に結合された、第１の発蛍光団および第２の発蛍光団を含む。この第１の発蛍光団および第２の発蛍光団は、第１の発蛍光団から第２の発蛍光団へエネルギーが移動するのを可能にする配置で、バックボーン上で結合される。バックボーンコネクターは、核酸増幅条件下で標的核酸配列に結合しないように選択される。好ましくは、バックボーンコネクターはポリヌクレオチドである。本発明の別の局面は、核酸増幅反応に使用するための、受動的内部参照分子含有試薬組成物を提供することである。この組成物は、本発明の内部増幅参照分子、および核酸増幅反応緩衝液を含む。この試薬組成物は、必要に応じて核酸増幅反応に必要とされるさらなる成分を含む。本発明はまた、フルオレッサー-クエンチャープローブアッセイを使用する、核酸増幅反応における増幅生成物の量を測定する改良された方法を提供し、これは増幅生成物形成のリアルタイム測定のための方法を含む。この方法は、本発明の内部参照分子を、増幅反応混合物に添加する工程を含む。次いで、内部参照の第２の発蛍光団の蛍光が測定され得、そしてフルオレッサー-クエンチャープローブの発蛍光団の蛍光における変化を算出するために使用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】核酸増幅生成物の検出のための受動的内部参照本発明は、一般に、核酸増幅の分野、そしてより詳細には、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のような核酸増幅プロセスからのポリヌクレオチド生成物のリアルタイムでの測定のためのシステムに関する。背景核酸配列分析は、多くの研究、医学分野、および工業分野において、ますます重要になっている（例えば、Caskey，Science 236: 1223-1228(1987); Landegre nら，Science 242: 229-237(1988);および、Arnheimら Ann．Rev．Biochem.,61: 131-156(1992)を参照のこと）。いくつかの核酸増幅系の開発が、この流行において重大な役割を担ってきた（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、Innisら編 PCR Protocols (Academic Press,New York，1990); McPhersonら編，PCR: A Pra ctical Approach(IRL Press，0xford，1991); 連結ベース(ligation-based)増幅技術，Barany，PCR Methods and Applications 1: 5-16(1991);などを参照のこと）。 PCRは特に、クローン化、遺伝子発現分析、DNA配列決定、遺伝子地図化、薬物の発見などにおける応用に関して、非常に重要な研究ツールになった（例えば、 Arnheimら（上記で引用）；Gillilandら，Proc．Natl．Acad．Sci.，87: 2725-2 729(1990);Bevanら，PCR Methods and Applications，1: 222-228(1992);Green ら，PCR Methods and Applications，1: 77-90(1991);Blackwellら，Science，2 50:1104-1110(1990)を参照のこと）。多種多様の機器が、核酸増幅、特にPCRを実行するために開発されてきた（例えば、Johnsonら,米国特許第5,038,852号（コンピュータ制御熱サイクラー）；W ittwerら，Nucleic Acids Research，17: 4353-4357(1989)（キャピラリーチューブPCR）；Hallsby,米国特許第5,187,084号（空気ベース温度制御）;Garnerら，Biotechniques，14: 112-115(1993)（864ウェルプレートの高処理PCR）;Wildi n gら,国際特許出願第PCT/US93/04039号（マイクロマシーン構造のPCR）:Schnipel skyら，欧州特許出願第90301061.9号（公開第0381501 A2号）（ディスポーザブル単使用PCR装置）などを参照のこと）。PCR機器開発に基本的な重要な設計目標は、精密な温度制御、多試料熱サイクルにおける試料-試料間の変動の最小化、P CR前プロセシング工程およびPCR後プロセシング工程の自動化、高速サイクル、試料容量の最小化、増幅生成物のリアルタイム測定、交差汚染の最小化、または試料の持ち越しなどを含む。特に、PCRが閉鎖反応チャンバーで実施され、そしてリアルタイムでモニターされるのを可能にする機器の設計が、非常に所望される。閉鎖反応チャンバーは、交差汚染を防ぐために所望される（例えば、Higuch iら,Biotechnology，10: 413-417(1992)および11: 1026-1030(1993);およびHoll andら,Proc．Natl．Acad．Sci.，88: 7276-7280(1991)を参照のこと）。明らかに、このような設計目標の実現の成功は、特に診断試料の分析（ここでは、高頻度の偽陽性および偽陰性が、PCRベース手順の価値を著しく減少させる）において所望される。PCRのリアルタイムのモニタリングは、隣接濃度の相対値がPCR間の相対濃度値の履歴を考慮することによって決定され得る場合、多標的増幅における初期標的DNA濃度の、さらにより正確な定量を可能にする。リアルタイムモニタリングはまた、PCRの有効性が評価されるのを可能し、このことは、試料中にPCR阻害剤が存在するかどうかを示し得る。 Hollandら（上記で引用）および他は、PCR間の増幅生成物のリアルタイム測定を提供するために蛍光ベースアプローチを提案している。このようなアプローチは、存在する二本鎖DNAの量を示すインタ-カレート色素（例えば、エチジウムブロマイド）を使用するか(Higuchiら,Biotechnology 10: 413-417(1992),Higuchi ら，Biotechnology 11: 1026-1030(1993),米国特許第5,210,015号）、または存在する二本鎖DNAの量に比例する濃度の蛍光生成物を放出するように、増幅間に開裂されるフルオレッサー(fluorescer)-クエンチャー(quencher)対を含有するプローブを使用するかのいずれかである。そのようなシステムの１つの例は、Ta qman^TMLS-50 PCR Detectionシステム(Perkin-Elmer)である。フルオレッサー-クエンチャープローブアッセイは、レポーター(reporter)（すなわち、フルオレッサー）の蛍光をクエンチャーの蛍光で割った比の測定を含む。フルオレッサー -クエンチャープローブは、２個（または２個より多い）の異なる蛍光指示薬で標識したポリヌクレオチドである。第１の蛍光指示薬は、励起の際、検出可能な蛍光発光を生成するというよりむしろ、クエンチャーを励起するように働く。フルオレッサー-クエンチャープローブは、PCRまたは類似の増幅反応における増幅用ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする。増幅反応を触媒するために使用される酵素の5'-3'エキソヌクレアーゼ活性は、ポリヌクレオチドプローブを開裂するのに役立ち、それによってクエンチャーをフルオレッサーに非常に近接したとこらから除去し、フルオレッサーからのシグナルがもはやクエンチされないようにする。フルオレッサー-クエンチャープローブを使用する核酸増幅反応およびフルオレッサー-クエンチャープローブの詳細な記載は、多くの刊行物（Lee ら，Nucleic Acid Research，21: 3761-3766(1993),Livakら，PCR Methods andA pplications，4: 357-362(1995)を含む）で見出され得る。増幅生成物の形成に起因し得る蛍光レベルにおける変化の正確かつ厳密な測定を提供するために、内部蛍光参照を用いてフルオレッサー-クエンチャープローブアッセイを実施することが、興味深い。このようなアッセイ、特にリアルタイムアッセイに適した内部参照を開発することは、標準からのシグナルにゆらぎがあるために、困難であることがわかっている。フルオレッサー-クエンチャープローブアッセイの結果の分析は、開裂後にフルオレッサーの量子収量は増加し、クエンチャーの量子収量は減少するために、複雑化されている。従って、クエンチャーの蛍光測定は、比較的一定の基底線測定を提供するというよりむしろ、増幅に伴って減少する。さらなる蛍光色素が、内部参照として働くように加えられ得る。この内部参照の制限は、それが増幅過程を阻害しないこと、それが増幅の熱レジメを通じて安定な蛍光シグナルを生成すること、ならびにその蛍光発光が、フルオレッサー-クエンチャープローブ中で使用されるすべてのフルオレッサーおよびクエンチャーと識別可能であることを含む。この最後の制限は、一般に内部参照として使用可能である化合物が、プローブ中でフルオレッサーを励起するために使用される波長で、あまり効率的に励起されないことを意味する。この問題は、内部参照色素の濃度を増大させることによって解決され得るが、必要とされる高レベルの蛍光化合物は、増幅過程に有害な影響を有し得る。さらに、高濃度の内部参照色素は、インターフィルター効果によってフルオレッサーからのシグナルを遮幣し得る。さらに、多くの発蛍光団は、水溶液にそれほど高く可溶ではない。核酸増幅生成物の検出のための従来の内部参照に関するこれらの問題を考慮して、新しい内部参照およびそのような標準物を使用する改良した増幅方法を開発することが、興味深い。本明細書中に記載の発明は、そのような内部参照および方法を提供する。発明の要旨本発明は、核酸増幅反応における増幅生成物の形成を定量する際に使用するための、受動的内部参照に関する。本発明の内部増幅参照分子は、バックボーンコネクターを通して共に結合された、第１の発蛍光団(fluorophore)および第２の発蛍光団を含む。この第１の発蛍光団および第２の発蛍光団は、第１の発蛍光団から第２の発蛍光団へエネルギーが移動するのを可能にする配置で、バックボーン上で結合される。バックボーンコネクターは、核酸増幅条件下では標的核酸配列に結合しないように選択される。好ましくは、バックボーンコネクターはポリヌクレオチドである。本発明の別の局面は、核酸増幅反応に使用するための、受動的内部参照分子含有試薬組成物を提供することである。この組成物は、本発明の内部増幅参照分子、および核酸増幅反応緩衝液を含む。この試薬組成物は、必要に応じて核酸増幅反応に必要とされる、さらなる成分を含む。本発明はまた、フルオレッサー-クエンチャープローブアッセイを使用する、核酸増幅反応における増幅生成物の量を測定する改良された方法を提供し、増幅生成物形成のリアルタイム測定のための方法を含む。この方法は、本発明の内部参照分子を、増幅反応混合物に添加する工程を含む。次いで、内部参照の第２の発蛍光団の蛍光が、測定され得、そしてフルオレッサー-クエンチャープローブの発蛍光団の蛍光における変化を算出するために使用され得る。本発明の内部参照の使用は、フルオレッサー-クエンチャープローブアッセイでの多フルオレッサー-クエンチャープローブの同時使用を可能にする。本発明はまた、核酸増幅生成物のリアルタイム蛍光ベース測定を実行するためのシステムに関する。本発明の好ましい実施態様では、励起光線は、以下を含む反応混合物中に集束される：(i)その強度が、励起光線によって照射された反応混合物の容量中の増幅生成物の量に比例する第１蛍光シグナルを生成することが可能な蛍光指示薬、および(ii)反応混合物中に均一に分散され、そして励起光線によって照射された反応混合物の容量に比例する第２蛍光シグナルを生成することが可能な内部増幅参照分子に存在する発蛍光団（すなわち、第２の発蛍光団）。蛍光強度の比例は、有機色素の蛍光発光に独立的に影響をおよぼすパラメータ（例えば、温度、pH、塩濃度など）の定常のセットについてであることが、理解される。好ましくは、励起光線は、反応混合物を含む閉鎖反応チャンバーの壁の一部を通して、レンズによって反応混合物に集束される。さらに好ましくは、同じレンズが、励起光線に応答してプローブ上のフルオレッサーおよび内部参照の第２の発蛍光団によって生成される蛍光シグナルを収集する；このようにして、励起の不整合および収集光による、収集シグナルにおける変動は避けられる。この実施態様において、レンズが、反応混合物に接触しない閉鎖反応チャンバーの壁の一部を通すように励起光線を向ける場合はいつも、壁のその部分は、反応混合物からの凝縮が、レンズによって収集される蛍光シグナルの光路中で形成しないように加熱され、それによって収集シグナルにおける別の変動源を除去する。本装置の最も好ましい実施態様において、反応チャンバーは閉鎖末端（本明細書中では、チューブの底部と呼ぶ）および開放末端（本明細書中では、チューブの上部と呼ぶ）を有するチューブであり、これは耐漏出シールが形成されるようなキャップを用いて封をされ得る。言い換えれば、いったん反応混合物がチューブ内に入れられ、そしてキャップが付けられると、閉鎖反応チャンバーが形成される。この最も好ましい実施態様において、（１）チューブのキャップと反応混合物の上部表面との間に空間を残すように、反応混合物をチューブの一部、一般には、チューブの底部に満たし、ならびに（２）キャップを接触させないレンズか、キャップを通る励起光線を、その上部表面を通して反応混合物中に集束させ、そしてプローブおよび内部参照によって生成される生じた蛍光を収集する。上記に記載のように、励起光線が通るチューブの一部（この実施態様ではキャップ）は加熱され、収集される蛍光シグナルの測定におけるさらなる変動源を導入する凝縮の形成を防ぐ。第１蛍光シグナルおよび第２蛍光シグナルの系列分析から生じ得る潜在的変動は、シグナル光を光検出器のアレイ上にスペクトル分離させること（例えば、シグナルを電荷結合素子(CCD)アレイ上に回析させることによる）によって、シグナルを同時分析することによって除去される。下記でより十分に考察されるように、単一光源によって生成される励起光線（例えば、レーザー）は、好都合には、光ファイバ(fiber optics)によって複数の閉鎖反応チャンバーに分離される。同様に、同じ光ファイバは、単一の検出および分析システムによって、複数の分析用反応チャンバーから蛍光シグナルを収集し得る。好ましくは、システムは核酸のPCR増幅と共に使用される。本発明のシステムは、増幅生成物の量に比例し、そして反応混合物の容量における変化に独立である、安定な蛍光シグナルを生成するための、装置および蛍光試薬を提供することによって、核酸増幅反応の正確なリアルタイムモニタリングを可能にする。増幅反応の進行を示すデータの利用可能性は、標的核酸の相対開始濃度のより正確な概算、増幅反応の効率性の迅速な評価につながり、そして還元試薬の使用およびフィードバック反応の制御の可能性を開く。図面の簡単な説明図１は、本発明のシステムの試料インターフェース成分の好ましい実施態様を図示する。図２は、光ファイバマルチプレクサーを介して反応を順次問い合わせることにより複数の増幅反応を同時にモニタリングするための、好ましい実施態様を図示する。図３は、下記に記載の好ましい実施態様であるCCDアレイによって記録された、テトラメチルローダミン発蛍光団、フルオレセイン発蛍光団、および機器バックグラウンドのスペクトル分離された蛍光強度データを示す。図４は、増幅生成物（第１の発蛍光団）に比例するフルオレセイン色素および典型的なPCR間で第２の発蛍光団として使用されるテトラメチルローダミン色素からの蛍光シグナルの時間依存性を示す。図５は、図３に時間依存性データが示されているものと同じPCR由来のフルオレセインおよびテトラメチルローダミン色素の強度比のサイクル依存性を示す。図６は、増幅生成物の量を、同じ標的核酸の異なる開始濃度を有する別個のPC Rにおけるサイクル数と関連づけるデータを示す。定義本明細書中で使用されるように、蛍光シグナルに関する用語「安定な」は、ノイズによるシグナルでのルート平均平方根(RMS)偏差が、平均シグナル大きさの２％以下であることを意味する。より好ましくは、安定なはノイズによるシグナルでのRMS偏差が、平均シグナル大きさの１％以下であることを意味する。発明の詳細な説明本発明は、核酸増幅反応の進行のリアルタイムでのモニタリングのための蛍光ベースシステムに関する；しかし、そのようなシステムはまた、終点測定に使用され得る。特に、本発明は、核酸増幅反応のリアルタイムモニタリングの正確さおよび厳密さを改良するために使用され得る、受動的内部参照分子に関する。対象参照分子は、参照分子の蛍光が、核酸増幅反応間で有意に変化しないという点において「受動的」である。本発明の内部参照分子の使用は、フルオレッサー- クエンチャープローブアッセイでのプローブ上のクエンチャーの蛍光の測定のみよりも重要な利点を有する。１つ以上のそのような利点は、本発明の選択された実施態様において見出され得る。そのような利点の１つは、内部参照由来の蛍光シグナルのレベルが、フルオレッサー-クエンチャープローブアッセイの間中、本質的に一定であることである。本発明の内部参照の別の利点は、それらが単一増幅反応において、多数のフルオレッサー-クエンチャープローブの同時使用を可能にすることである。本発明の内部増幅参照分子の別の利点は、クエンチャーがフルオレッサーである必要のないフルオレッサー-クエンチャープローブの使用を可能にすることであり、それによってフルオレッサーとして使用され得る蛍光分子の範囲を増やすことである。本発明の内部参照分子は、第１の発蛍光団から第２の発蛍光団へのエネルギーの移動を可能にするように、バックボーンコネクターを通して共に結合された、第１の発蛍光団および第２の発蛍光団を含む。バックボーンは、核酸増幅反応間に、与えられた特定のフルオレッサー-クエンチャープローブアッセイにおける増幅用ポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズしないように選択される。第１の発蛍光団は、オリゴヌクレオチドのようなバックボーンコネクターに共有結合的に結合した適切な蛍光特性を有する任意の色素であり得る。オリゴヌクレオチドに共有結合的に結合した発蛍光団の例は、とりわけ、例えば、Holland ら，Proc．Natl．Acad．Sci.，88: 7276-7280(1991)によって記載されたフルオレッサー-クエンチャープローブアプローチ、および国際特許出願公開公報第WO9 5/21266号に見出され得る。第２の発蛍光団として使用される色素は、蛍光特性が核酸（特に二本鎖DNA）の存在またはそれとの会合によって実質的に影響を受けない蛍光色素を含む。そのような色素は、フルオレッサー-クエンチャープローブに使用されるどの発蛍光団からもスペクトル分解され得るという基準を満たす任意の蛍光色素を実際含み得る。第１の発蛍光団として適した色素はまた、第２の発蛍光団として適し得る。同様に、第２の発蛍光団として適した色素はまた、第１の発蛍光団として適し得る。好ましい第２の発蛍光団は、ローダミン色素およびフルオレセイン色素を含む。より好ましくは、第２の発蛍光団は、Menchenら、米国特許第5,188,934 号によって開示される後者である。本発明の１つの実施態様では、この第１の発蛍光団および第２の発蛍光団の１つは、Leeら,Nucleic Acid Research，21: 3761-3766(1993)によって記載されるように、両方がオリゴヌクレオチド、すなわちバックボーンコネクターに共有結合的に結合する。より詳細には、フルオレセインが第１の発蛍光団として使用され、そして6-カルボキシ-X-ローダミン(ROX)が第２の発蛍光団として使用され、その結果ROX部分はフルオレセイン部分による全ての蛍光発光を実質的に消光する。好ましくは、この実施態様において、励起光線はアルゴンイオンレーザーの 488nmの輝線から生成される。この実施態様において、好ましくは第１の発蛍光団は、フルオレセイン（例えば、6-FAM(Applied Biosystems，Foster Cityから入手可能)）であり、そして第２の発蛍光団は、テトラメチルローダミン、2',4' ,5',7',-テトラクロロ-4,7-ジクロロフルオレセイン、または6-カルボキシ-X-ローダミンのいずれかである。内部参照のバックボーンコネクターは、第１の発蛍光団を第２の発蛍光団に非常に接近させるように設計され、その結果、第１の発蛍光団から第２の発蛍光団への効率的なエネルギー移動を可能にする。適切なバックボーンコネクターの設計において、発蛍光団間のエネルギー移動が1/R⁶（ここで、Ｒは発蛍光団間の距離である）の関数であることを念頭におくことが重要である。所定の実施態様に適した距離の選択に関する指針は、蛍光分子と消光分子（ときにはそれぞれ「ドナー」分子および「アクセプター」分子としても言及される）との間の共鳴エネルギー移動に関する多くの参考文献で見出される（例えば、StryerおよびHaugla nd,Proc.Natl.Acad．Sci.,58: 719-726(1967);Clegg,Meth.Enzymol.,211: 353-3 88(1992);Cardulloら,Proc.Natl.Acad.Sci.,85: 8790-8794(1988); Ozakiら（上記で引用）;Haugland（上記で引用）;Hellerら，Fed．Proc.,46: 1968(1987)；L ivakら，PCR Methods and Applications,4: 357-362(1995)など）。バックボーンは通常、ポリマー鎖であるが、必ずしもそうではない。種々のバックボーン（例えば、核酸(RNAおよびDNAの両方)、種々の合成ポリヌクレオチドアナログ（例えば、ここで酸素は硫黄、炭素、または窒素によって置換され得、リン酸は、硫酸塩またはカルボン酸塩などによって置換され得る）、ポリペプチド、ポリサッカライドなど）が使用され得る。発蛍光団は、発蛍光団および／またはポリマービルディングブロックの適切な官能化によって、バックボーンに結合される。種々のバックボーンへの発蛍光団の結合方法の詳細な記載は、とりわけ、G.Herman sonによるBioconjugate Techniques，Academic Press,San Diego(1996)，欧州特許出願公報第0 229 943号(1987年公開)、およびJuら，Analytical Biochemistry ，231: 131-140(1995)において見出され得る。バックボーンコネクターは、増幅反応の間、所定の増幅反応における増幅用ポリヌクレオチドに、配列特異的様式で有意にハイブリダイズしないように設計される。本発明のいくつかの実施態様において、バックボーンコネクターは、増幅プロセスの前または後のいずれかに、増幅用のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし得る。一般的に、この潜在的な問題は、バックボーンコネクターがポリヌクレオチド（またはその誘導体）である場合にのみ存在する。バックボーンが増幅用の配列に特異的にハイブリダイズする場合、バックボーンは、フルオレッサー-クエンチャープローブが増幅用のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする能力を有意に妨害し得る。バックボーンコネクターとして使用するためのハイブリダイズしないポリヌクレオチドは、増幅用のポリヌクレオチド配列に対する有意な配列相同性を欠くポリヌクレオチドを使用することによって、容易に得られ得る。内部参照分子（バックボーンとしてポリヌクレオチドを有する）は、多くのアプローチ（例えば、Ozakiら,Nucleic Acids Research，20: 5205-5214(1992):Ag rawalら,Nucleic Acids Research，18: 5419-5423(1990);など）によって合成され得る。そのような合成方法はまた、フルオレッサー-クエンチャープローブの合成に適用可能である。好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブは、ホスホルアミダイト化学を使用した自動化固相DNA合成機（例えば、Applied Biosystems ，Inc．モデル392または394 DNA合成機(Foster City，CA))上で合成される。第１および第２の発蛍光団は、反応基を含むヌクレオシドホスホルアミダイトモノマーを使用することによって、オリゴヌクレオチドの所定のヌクレオチドに共有結合され得る。例えば、そのような反応基は、リン酸部分またはリン酸アナログ部分（例えば、Agrawalら（上記で引用））上、結合が5'末端ヌクレオチドに対するものである場合（例えば、Fungら、米国特許第4,757,141号、またはHobbsJr .,米国特許第4,997,928号）5'水酸基部分上に、および塩基部分に存在し得る（例えば、Ruth，米国特許第4,948,882号; Haralambidisら，Nucleic Acids Resea rch，15: 4857-4876(1987); Urdeaら，米国特許第5,093,232号; Cruickshank米国特許第5,091,519号; Hobbs Jr.ら，米国特許第5,151,507号などに開示されるように）。最も好ましくは、ピリミジン部分を有するヌクレオチドが誘導体化される。さらに好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブの3'末端ヌクレオチドが、核酸ポリメラーゼによってブロックされるか、または伸長不可能にされる。そのようなブロッキングは、例えば、HornおよびUrdea，Tetrahedron Lett.,27: 4705(1986)によって記載され、そしてClontech Laboratories(Palo Alto，Calif ornia)から5'Phosphate-ON^TMとして市販されている試薬を介しての、リン酸基の結合によって好都合に実施される。本発明の好ましい実施態様では、ROXは内部参照での第２の発蛍光団として使用され、そしてROX部分は、オリゴヌクレオチド上の3'位に結合される。オリゴヌクレオチドへのROXの3'結合は、参考として援用される、米国特許出願第08/593,031号に記載される。本発明の内部分子内での第１の発蛍光団と第２の発蛍光団の隔離距離は、第１の発蛍光団および第２の発蛍光団の性質、これらが結合する方法、照明源などに依存して変化し得る。第１の発蛍光団および第２の発蛍光団は、好ましくは、第１の発蛍光団に十分接近している結果、第１の発蛍光団由来の蛍光の実質的にすべて（例えば、90％）が消光されている。代表的には、エネルギー移動に基づく消光のために、第１の発蛍光団と第２の発蛍光団との間の距離は10〜100オングストロームの範囲内であるべきである。好ましくは、第１の発蛍光団と第２の発蛍光団とは、約４〜10ヌクレオチドにより隔てられる。しかし、本発明は、発蛍光団を隔てるヌクレオチドの数が10を越え得る実施態様を含む。好ましくは、第１または第２の発蛍光団のいずれかは、オリゴヌクレオチドプローブの5'末端ヌクレオチドに結合される。第１または第２の発蛍光団はまた、3'末端ヌクレオチドに結合され得る。本発明の参照分子の他の実施態様において、第１および第２の発蛍光団は、ポリヌクレオチドの内部部位で結合される。本発明はまた、２つの発蛍光団の一方が内部部位に配置され、そして他方の発蛍光団が、ポリヌクレオチドの末端に結合される実施態様を含む。本発明の実施態様は、核酸増幅反応における使用のための、試薬組成物を含む。本組成物は、本発明の内部参照分子および核酸増幅緩衝液を含む。本明細書中で使用される場合、用語「核酸増幅緩衝液」は、酵素反応または核酸増幅反応のために必要とされる反応を支持する緩衝水溶液をいう。緩衝液組成の選択は、目的の核酸増幅反応を触媒するために選択される特定の酵素によって変化する。核酸増幅技術は、分子生物学の当業者に周知である。適切な緩衝液組成の多くの例は、とりわけ、以下のような出版物中に存在し得る:PCR: A Practlcal Approach ,第１巻,M.J.McPherson,P.Quirke,G.R.Taylor編，IRL Press(1991);PCR: A Practical Approach，第２巻，M.J.McPherson,P．Quirke，G.R．Taylor編，IR L Press(1995),およびPCR Primer，A Laboratory Manual，C.W．Diffenbach,G.S ．Dveksler編，Cold Spring Harbor Press(1995)。Taq DNAポリメラーゼに触媒される増幅反応に適した核酸増幅緩衝液の１例は以下の通りである：10mM Tris( pH 8.4),50mM KCl,1.5mM MgCl₂,0.01％ゼラチン,0.01％ NP40,および0.01％Twee n。一般的に、本試薬組成物中の内部参照分子の濃度は、内部参照分子の第２の発蛍光団から容易に検出可能なシグナルを生成するのに十分に高い。多くの要素が、本試薬組成物中の内部参照分子濃度の選択に影響する；そのような要素は、増幅反応物中のフルオレッサー-クエンチャープローブの量、蛍光検出器の感度、選択された発蛍光団の量子収量などを含む。本組成物は、目的の核酸増幅反応に必要とされる１つ以上のさらなる化合物をさらに含み得、そのような化合物は以下のものを含む：ヌクレオチド、増幅用鋳型、フルオレッサー-クエンチャープローブなど。本発明の試薬組成物は、濃縮形態で、または使用前に有意な希釈を必要としない形態で供給され得る。試薬組成物は、目的のアッセイを実施するために必要とされるさらなる化合物を加えることによって使用され得、そのような化合物は、熱安定性ポリメラーゼ、ヌクレオチド、増幅用鋳型、フルオレッサー-クエンチャープローブなどを含む。必要なさらなる化合物を加えた後、次いで反応混合物をしかるべく処理（例えば、熱サイクル）し、その結果、所望の増幅結果を得る。フルオレッサー-クエンチャープローブアッセイおよび本受動的内部参照分子を、種々の核酸増幅システムとともに使用し得る。一般的に、このアッセイは、エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ、またはモニターされる反応過程の間に増加する二本鎖DNA集団のいずれかの使用を必要とする。本発明のシステムで使用され得る例示的な増幅スキームは、PCR、リガーゼベースの増幅スキーム(例えば、リガーゼ連鎖反応(LCR))、Q-ベータレプリカーゼベースの増幅スキーム、鎖置換増幅(SDA)スキーム（例えば、Walkerら，Nucleic Acids Resea rch，20: 1691-1696(1992)に記載される）などを含む。核酸増幅スキームの総括的な説明は、KellerおよびManak，DNA Probes,第２版(Stockton Press，New Yor k，1993)によって提供される。本発明の好ましい実施態様では、本内部参照分子は、フルオレッサー-クエンチャープローブを使用するPCRで用いられる。本発明はまた、フルオレッサー-クエンチャープローブを使用するポリヌクレオチド増幅反応におけるポリヌクレオチド増幅生成物の量を測定するための、改良された方法を提供する。本方法は、リアルタイムでモニターされる核酸増幅反応において増幅生成物形成を測定するために、特に有利である。本方法は、本発明の方法が増幅反応物に本発明の内部参照を添加する工程を含むということを除いては、フルオレッサー-クエンチャープローブを使用する従来の核酸増幅反応と本質的に同じである。好ましくは、添加工程は反応の開始前（例えば、DNAポリメラーゼの添加前）に実施される。内部参照上の第２の発蛍光団の蛍光は、反応毎に異なるような要素（例えば、容量または試薬の量）について反応を正規化するために測定される。従って、フルオレッサー-クエンチャープローブ上の蛍光レポーターと内部参照の第２の発蛍光団の蛍光強度との比を調べることによって、強度のみに明らかであるほとんどの系統的変動源の影響が除去される。核酸増幅からの生成物のリアルタイム測定のためのシステムに基本的なことは、フルオレッサー-クエンチャープローブ上の蛍光レポーターと、内部参照上に存在する第２の発蛍光団との蛍光強度比の測定である。蛍光レポーターと内部参照の第２の発蛍光団とは、スペクトル的に分離可能でなくてはならない。すなわち、それらのそれぞれの発光スペクトルは、別々の発光ピークが複合スペクトル中に観測されるように十分に非オーバーラップでなくてはならない。明らかに、このシステムは、例えば、単一反応でいくつかの標的核酸の同時増幅をモニターし、その結果多数の蛍光強度比がモニターされるために、多数の蛍光レポーターを含むように一般化され得る。そのような実施態様での使用のために適した、いくつかのスペクトル分離可能な色素は、Fungら，米国特許第4,855,225号; Mench enら，米国特許第5,188,934号; Bergotら，国際出願PCT/US90/05565；および類似の参考文献に開示される。本発明の特定の実施態様の実施の際には、内部参照上の発蛍光団と、フルオレッサー-クエンチャープローブアッセイで使用される蛍光レポーターおよびクエンチャーとの間の関係を考慮しなければならない。内部参照の第２の発蛍光団は、同じアッセイで使用されるフルオレッサー-クエンチャープローブ（単数または複数）上のクエンチャーと異なっていなければならない。内部参照の第１の発蛍光団は、フルオレッサー-クエンチャープローブ上のレポーターとして使用される発蛍光団と同じか、または異なり得る。本発明の別の局面は、本発明の改良された増幅方法を実施するためのキットを提供することである。キットは、本発明の方法の実施を、実施するためにより再現性があり、そしてより容易なものにする。キットは、一般的には本発明を実施するために必要とされる２つ以上の試薬を含む。キットは、本方法の実施を簡便にするために前もって測定した量の試薬を供給し得る。さらに、代表的には、キットは本発明の方法を実施するための詳細な使用説明書を含む。本発明のキットの１つの実施態様で、キットは、本発明の内部参照および１つ以上の以下の品目を含む：フルオレッサー-クエンチャープローブアッセイにおいて使用するのに適した（すなわち、５'−３'エキソヌクレアーゼ活性を有する）、フルオレッサー-クエンチャープローブまたは熱安定性DNAポリメラーゼ（例えば、Taq DNAポリメラーゼ）。本発明のキットは、本方法を実施するために必要なさらなる試薬をさらに含み得、そのような試薬は、dNTP混合物、緩衝液、分子サイズ標準、ワックスビーズなどを含むが、これらに限定されない。リアルタイム検出システムは、試料インターフェース（すなわち、閉鎖反応チャンバーに操作的に連結される光学構成要素）を備え、そのシステムは、励起光線を反応混合物中に集束させるためおよび生じた蛍光を収集するためのレンズ、ならびに励起光線を光源からレンズへ、そして蛍光シグナルをレンズから検出器および分析器へと両方に伝達するための光ファイバを含む。好ましくは、反応混合物は、閉鎖反応チャンバー内に収容され、交差試料汚染（すなわち、いわゆる「キャリーオーバー」）を防ぐ。それゆえ、レンズは、励起光線を集束させ、そして閉鎖反応チャンバーの壁の一部を通った蛍光を収集する。上記で言及されるように、好ましい反応チャンバーは、チューブ（例えば、従来のエッペンドルフチューブの外形および容量を有する）である。チューブは、反応混合物が加えられた後に、キャップをチューブの開放末端に取り付けることによって閉鎖される。PCR用の試料インターフェースの好ましい実施態様では、レンズは図１に図示されるように、励起光線を方向づけ、そしてチューブのキャップを通して蛍光を収集する。図示された配置では、第１の末端光ファイバ２は、フェルール４、ハウジング６、およびプレート10によってレンズ８と共軸配向に保持される。第２の末端光ファイバ２（示されていない）は、以下でより十分に議論される光源ならびに検出器および分析器と操作的に連結される。光ファイバ２の端面とレンズ８との間の距離は、いくつかの要素（光ファイバの開口数、チューブ18の外形、レンズ８の焦点距離、レンズ８の直径などを含む）によって決定される。任意の特定の実施態様においてそのような変数の値を選択するための指針は、光学設計に関する標準的なテキスト(例えば、Optics Guide ５（Melles Griot，Irvine，CA ，1990)、または類似の参考文献で容易に見出される。図示された実施態様で、レンズ８は、８mmの直径を有し、そしてEdmund Scientific(Barrington，NJ)から入手可能な材料BK7から構成される。光ファイバ２は、２の開口数を有する。好ましくは、この設計は、励起光線28の反応混合物22への最大伝達を可能にする。例えば、レンズ８、光ファイバ２の開口数、および光ファイバ２の末端とレンズ８との間の距離は、レンズ８の直径が、励起光線28の直径と同じかまたはそれより大きくなるように選択され、ここで光線28は（図１に図示されるように）レンズに衝突する。励起光線28は、キャップ16、間隙24、および反応混合物22の上面26を通過して、表面26のちようど下で光ファイバのほぼ１〜３倍（例えば１〜３mm）の領域に集束する。この集束の程度は、本実施態様の重要な特色ではない；集束の程度は、試料インターフェースを市販のサーマルサイクラーの試料ホルダーの外形および寸法に合わせたことの結果である。他の実施態様では、外形および寸法は、反応混合物へのより鋭い集束を可能にし得る。本発明のレンズは、特定の実施態様に依存して種々の形状を有し得る。例えば、レンズは、球形、切断切形、円柱状、切断円柱状、扁球形、または切断扁球形などであり得、そして任意の適切に透明な屈折材料（例えば、Hlousek，米国特許第5,037,199号; Hoppeら，米国特許第4,747,87号; Moringら，米国特許第5,23 9,360号; Hirschfield，米国特許第4,577,109号;または類似の参考文献で開示されるような材料）から構成され得る。励起光線28によって生成される蛍光は、励起光線28によって規定されるのとほぼ同じ光路にそってレンズ８によって収集され、そしてシステムの光学的分離構成要素および分析構成要素への伝達のための光ファイバ２の末端に集束され得る。さらに好ましくは、試料インターフェースはまた、励起光線および反応混合物成分の凝縮由来のシグナルの散乱および／または吸収による変動を減らすために、光の透過に使用される反応チャンバーの壁の一部を加熱するための手段を含む。図１の実施態様では、光の透過に使用される反応チャンバー（チューブ18）壁の一部は、キャップ16である。従って、発熱体12および熱伝導性プラテン14が、キャップ16を加熱するために使用される。好ましくは、発熱体12は、抵抗発熱体および温度センサーを備え、温度センサーはキャップ16の温度のプログラム制御を可能にする。キャップ16は、反応混合物の成分の凝縮点より高い温度に維持される。一般的に、キャップ16は，94℃〜110℃の範囲の温度に維持され得る。好ましくは、キャップ16は、約102℃〜約105℃の範囲の温度で維持される。なぜなら、反応混合物中の主な溶媒は、通常、水であるからである。より好ましくは、キャップ16は、103℃に維持される。好ましくは、熱サイクルを使用する実施態様では、上記のキャップ加熱構成要素は、反応混合物22の温度を循環的に制御するために使用される熱伝導性構成要素20から、熱的に隔離される。上記の構成要素に適した材料の選択は、機械工学の当業者に周知である。材料選択のための例示的な基準は、(I)熱膨張の程度（特に、熱サイクルを使用する増幅スキームの場合）、および光学的構成要素の配列へのその影響、(ii)使用される励起波長および発蛍光団発光波長における光透過特性、(iii)反応混合物の成分に関しての反応チャンバーの化学的不活性、(iv)重要な反応成分（例えば、ポリメラーゼ、標的核酸）がチャンバー壁に吸着される傾向の程度、(v)光路中の蛍光物質の最小化、などを含む。代表的には、増幅反応混合物を含むチューブは、ポリプロピレンまたは類似の材料から製造される。図１に示される試料インターフェースは、個々に使用され得るか、またはそれは、図２に図示されるように、単一の機器中の多数の同一なインターフェースの一つとして使用され得る。図示された実施態様では、ホルダー30に配置される個々の試料インターフェース31（それは、例えば、Mossaら，欧州特許出願第91311 090.4号，公開番号第0488769A2号に記載されているような、サーマルサイクラー 32と連結される熱ブロックであり得る）は、光ファイバ34によって光ファイバマルチプレクサー36に接続され、それは個々の光ファイバとボート35との間の伝達を、例えば、プログラムされたマイクロプロセッサーを介して使用者の制御下で選択的に可能にする。好ましい配置では、励起光線41は、光源52およびコントローラー54によって生成され、光線スプリッター40を通過し、そしてポート35上にレンズ38によって集束され、ここでそれは続いて光ファイバマルチプレクサー 36によって、光ファイバ34の各々の予め決定されたセットまたはサブセットに向けられる。逆に、反応チャンバー中で生成される蛍光シグナルは、レンズ８によって収集され、そして光ファイバに集束され、それは次には、おそらく光ファイバマルチプレクサーを介して、シグナルを検出手段および分析手段に伝達する。図２に戻ると、試料インターフェースによって収集された蛍光シグナルは、光ファイバマルチプレクサー36に向けられ、そこでそれは、ポート35を通して現れ、そしてレンズ38によって収集および平行化される。レンズ38は、蛍光シグナルを光線スプリッター40に向け、それは次にはシグナルをカットオフフィルター42を通して選択的に向けられ、そのことは励起光線からの光がシグナル検出構成要素に到達するのを防ぐ。光線スプリッター40は、従来の二色性ミラー、励起光線を通す開口部を有する十分に反射するミラー（例えば、米国特許第4,577,109号で開示されるようなミラー）、または類似の構成要素であり得る。カットオフフィルター42を通過した後、蛍光シグナルは、レンズ44によってスペクトル分析器に向けられ、それは蛍光シグナルをスペクトルに分離し、そしてシグナルの多数のスペクトル成分の強度を測定する。代表的には、スペクトル分析器は、蛍光シグナルを、そのスペクトル成分に分離するための手段（例えば、プリズム、回折格子など）ならびに光検出器のアレイ（例えば、ダイオードアレイ、電荷結合素子 (CCD)システム、帯域フィルターおよび光電子増倍管のアレイなど）に分けるための方法を備える。図２の好ましい実施態様では、スペクトル分析器は、回折格子46(例えば、model CP-140，Jobin-Yvon，NJ)およびCCD配列48(例えば、モデル S2135 Princeton Instrument，NJ)を備え、これはCCDコントローラー50に連結される。フルオレセインおよびテトラメチルローダミンからの蛍光シグナルを分析するのに適した例示的なCCDアレイは、500nm〜650nmのスペクトルの領域に広がる21 個の収集ビンに分配される。各ビンは、8.5nm窓を越える光を収集する。明らかに、多くの代替配置もまた、使用され得る。スペクトル分析のためのCCDアレイの例示的応用は、Kargerら，Nucleic Acids Research，19: 4955-4962(1991)に記載される。スペクトル分析器によって収集されるデータに基いて蛍光シグナルを分析することが望ましい。なぜなら、１つ以上のレポーター発蛍光団（フルオレッサー- クエンチャープローブの）および第２の発蛍光団（内部参照上の）からのシグナルの成分（そこから強度比が計算される）は、同時に、そして複数の光線スプリッター、フィルター、および光電子増倍管に基づくシステムで（例えば、誤整列によって）生じ得る波長特異的なシステムの変動の導入なしに分析され得るからである。また、スペクトル分析器は、「仮想フィルター」または光検出器のアレイから生成されるデータのプログラムされた操作の使用を可能にし、ここで複数の不連続な波長範囲は、連結されたマイクロプロセッサーを介してプログラム可能な制御下で（物理的バンドパスフィルターと類似して）サンプリングされる。この能力は、第１および第２の発蛍光団としての色素の選択における高度の柔軟性を可能にする。一般的に、検出手段および分析手段は、レポーターおよび内部参照発蛍光団によって生成されるシグナルの強度比を反映する読出しを提供する、任意の検出装置であり得る。そのような装置は、米国特許第4,577,109号および同第4,786,886 号、ならびにThe Photonics Design ＆ Applications Handbook,第39版(LaurinP ublishing Co.,Pittsfield，MA，1993)のような参考文献に例示されるように、当該分野で周知である。好ましくは、本発明のシステムはPCRをモニターするために使用されるが、それはまた、LCRのような種々の他の増幅スキームに使用され得る。PCRを実施するための説明および指示は、この主題に関する多数の文献（例えば、Innisら（上記で引用）およひMcPhersonら（上記で引用）を含む）に提供される。簡潔には、PCRにおいて２つのオリゴヌクレオチドは、DNAポリメラーゼによって触媒される一連の合成反応のためのプライマーとして使用される。これらのオリゴヌクレオチドは、代表的には異なる配列を有し、そして(I)鋳型DNAまたは標的DNAの逆鎖に存在する配列、および(ii)増幅されるDNAのセグメントに隣接する配列に相補的である。標的DNAはまず、２つのオリゴヌクレオチドおよび４つのデオキシヌクレオシド三リン酸(dNTP)の各々の大モル過剰の存在下で加熱することによって、変性される。次いで、反応混合物は、オリゴヌクレオチドをそれらの標的配列にアニールするのを可能にする温度まで冷却され、その後アニーリングされたプライマーはDNAポリメラーゼを用いて伸長される。次いで、変性、アニーリング、および伸長のサイクルは多数回（代表的には、25〜40回）繰り返される。１回の増幅の生成物は、次回の標的核酸として働くので、各連続したサイクルは、標的DNA、すなわち増幅生成物の量を本質的に２倍にする。明らかに、第１の発蛍光団は、第２の発蛍光団の代わりに別の非蛍光消光分子を有するオリゴヌクレオチドプローブに結合される、上記の関連する実施態様が使用され得る。そのような実施態様では、第２の発蛍光団は、増幅生成物と相互作用しない、実質的に任意のスペクトル分離可能な蛍光色素であり得る。上記に記載した本発明は、以下の実施例を参考にするとよりよく理解され得る。実施例は、例示のために提供され、そして本発明の限定として解釈されるべきではない。実験標的DNAの種々の出発濃度からの - アクチンをコードするDNAのPCR増幅のリアルタイムモニタリングヒト-アクチンをコードする標的DNAの296塩基対セグメントを、PCRによって、標的DNAの５×10³〜１×10⁶コピーの範囲の種々の出発量から増幅した。以下のプライマーおよびプローブを使用した：ここで「FAM」は、フルオレセインの６位炭素に結合するNHS-エステル基を、オリゴヌクレオチドの5'末端デオキシアデノシンに結合した5'アミノリン酸とFu ngら,米国特許第5,212,304号に従って反応させることによってオリゴヌクレオチドに結合したフルオレセイン分子を示し；そしてここで「TMR」は、Urdeaら,米国特許第5,093,232号によって開示されるアミノ連結剤を介して隣接したチミジンの塩基部分に結合したテトラメチルローダミン分子を示す。 PCRを、以下の成分を有する0.2mLのMicroAmpチューブ(Perkin-Elmer，Norwalk ,CT)中で実施した:10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCl、3.5mM MgCl₂、200Mの各ヌクレオシド三リン酸（米国特許第5,035,996号に従って、キャリーオーバー汚染を防ぐために、dTTPをdUTPで置換して）、300nMの各正方向プライマーおよび逆方向プライマー、0.05U/LのAmpliTaq^TM(Perkin-Elmer，Norwalk，CT)。この混合物に、５μLのRaji DNA(Applied Biosystems,Foster City,CA)を10ng/μLで、５ μLのプローブを２Ｍで、および１μLのウラシルN-グルコシラーゼを１ユニット /μLで加え、反応容量を51μLにした。加熱および冷却のサイクルを、本発明の試料インターフェース構成要素を含む試料ホルダーカバーを取り付けたモデル9600 Thermal Cycler(Perkin-Elmer，Norwalk，CT)中で実施した。以下の温度プロフィールを使用した：50℃で２分間保持；95℃で10分間保持；以下の温度を通すサイクルを40回：92℃で15秒間、54℃で15秒間、72℃で１分間；その後、 72℃で保持。図３は、上記で指示薬として使用されるフルオレセインおよびテトラメチルローダミン色素、ならびにシステム内の外部供給源による蛍光の発光スペクトルを示すデータを図示する。図４は、フルオレセイン蛍光強度およびテトラメチルローダミン蛍光強度をサイクル数の関数として示すデータを図示する。強度における高頻度の振動は、２つの色素の蛍光発光の温度依存性に影響を反映する。サイクル10〜サイクル28での両方の色素の基底線蛍光における増加は、システムに基づく変動である。図５において、同じデータ由来のフルオレセイン対テトラメチルローダミン蛍光強度比を示しており、システムに基づく変動を除去し、そして読出しシグナルにおけるゆらぎのRMS、すなわち蛍光強度の比は、測定した比率の平均の大きさの１％未満である。図６は、図に示されるように、5000標的分子〜10標的分子の範囲の量から出発した-アクチンDNAのPCRからのデータを示す。参考としての援用本出願は、本明細書中で言及されるすべての刊行物および特許を参考として援用する。

【手続補正書】【提出日】１９９９年５月７日（１９９９．５．７）【補正内容】請求の範囲１．試薬組成物であって、該組成物は、核酸増幅緩衝液、および内部参照分子を含み、該内部参照分子は、第１の発蛍光団、第２の発蛍光団、および核酸増幅条件下で増幅用ポリヌクレオチドに、配列特異的な様式でハイブリダイズしない、バックボーンコネクターを含み、ここで該バックボーンコネクターは、該第１の発蛍光団および該第２の発蛍光団と、該第１の発蛍光団から該第２の発蛍光団へのエネルギー移動を可能にするように結合している、試薬組成物。２．前記バックボーンコネクターがポリヌクレオチドである、請求項１に記載の組成物。３．前記ポリヌクレオチドが、長さ２〜25個のヌクレオチドである、請求項２に記載の組成物。４．前記ポリヌクレオチドが(dT)₈である、請求項３に記載の組成物。５．前記第１の発蛍光団が、フルオレセイン、6-カルボキシフルオレセイン、2' ,4',5',7'-テトラクロロ-4,7-ジクロロフルオレセイン、2',7'-ジメトキシ-4',5 '-6-カルボキシローダミン(JOE)、N',N',N',N'-テトラメチル-6-カルボキシローダミン(TAMRA)、および6-カルボキシ-X-ローダミン(ROX)からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。６．前記第１の発蛍光団が6-カルボキシフルオレセインである、請求項５に記載の組成物。７．前記第２の発蛍光団が、フルオレセイン、6-カルボキシフルオレセイン、2' ,4',5',7'-テトラクロロ-4,7-ジクロロフルオレセイン、2',7'-ジメトキシ-4',5 '-6-カルボキシローダミン(JOE)、N',N',N',N'-テトラメチル-6-カルボキシローダミン(TAMRA)、および6-カルボキシ-X-ローダミン(ROX)からなる群から選択される、請求項５に記載の組成物。８．前記第２の発蛍光団が6-カルボキシ-X-ローダミンである、請求項６に記載の組成物。９．核酸増幅反応における増幅用ポリヌクレオチドの増幅生成物の量を測定するための改良された方法であって、該方法が内部増幅参照分子を該増幅反応に加える工程を含み、該内部参照分子は第１の発蛍光団；第２の発蛍光団；および核酸増幅条件下で該増幅用ポリヌクレオチドにハイブリダイズしないバックボーンコネクターを含み、ここでバックボーンコネクターは、該第１の発蛍光団および該第２の発蛍光団と、該第１の発蛍光団から該第２の発蛍光団へのエネルギー移動を可能にするように結合している、改良された方法。１０．前記核酸増幅反応がリアルタイムで測定される、請求項９に記載の方法。１１．前記バックボーンコネクターがポリヌクレオチドである、請求項９に記載の方法。１２．前記ポリヌクレオチドが、長さ２〜25個のヌクレオチドである、請求項１０に記載の方法。１３．前記ポリヌクレオチドが(dT)₈である、請求項１２に記載の方法。１４．前記第１の発蛍光団が、フルオレセイン、6-カルボキシフルオレセイン、 2',4',5',7'-テトラクロロ-4,7-ジクロロフルオレセイン、2',7'-ジメトキシ-4' ,5'-6-カルボキシローダミン(JOE)、N',N',N',N'-テトラメチル-6-カルボキシローダミン(TAMRA)、および6-カルボキシ-X-ローダミン(ROX)からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。１５．前記第１の発蛍光団が6-カルボキシフルオレセインである、請求項１４に記載の方法。１６．前記第２の発蛍光団が、フルオレセイン、6-カルボキシフルオレセイン、 2',4',5',7'-テトラクロロ-4,7-ジクロロフルオレセイン、2',7'-ジメトキシ-4' ,5'-6-カルボキシローダミン(JOE)、N',N',N',N'-テトラメチル-6-カルボキシローダミン(TAMRA)、および6-カルボキシ-X-ローダミン(ROX)からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。１７．前記第２の発蛍光団が6-カルボキシ-X-ローダミンである、請求項１５に記載の方法。１８．核酸増幅反応を実施するためのキットで、該キットは、内部参照分子、ならびに、フルオレッサー-クエンチャープローブおよび熱安定性DNAポリメラーゼからなる群から選択される１つ以上の試薬を含む、キット。１９．前記試薬がフルオレッサー-クエンチャープローブである、請求項１８に記載のキット。２０．前記試薬が熱安定性DNAポリメラーゼである、請求項１８に記載のキット。２１．前記キットがフルオレッサー-クエンチャープローブをさらに含む、請求項２０に記載のキット。

Claims

【特許請求の範囲】１．試薬組成物であって、該組成物は、核酸増幅緩衝液、および内部参照分子を含み、該内部参照分予は、第１の発蛍光団、第２の発蛍光団、および核酸増幅条件下で増幅用ポリヌクレオチドに、配列特異的な様式でハイブリダイズしない、バックボーンコネクターを含み、ここで該バックボーンコネクターは、該第１の発蛍光団および該第２の発蛍光団と、該第１の発蛍光団から該第２の発蛍光団へのエネルギー移動を可能にするように結合している、試薬組成物。２．前記バックボーンコネクターがポリヌクレオチドである、請求項１に記載の組成物。３．前記ポリヌクレオチドが、長さ２〜25個のヌクレオチドである、請求項２に記載の組成物。４．前記ポリヌクレオチドが(dT)₈である、請求項３に記載の組成物。５．前記第１の発蛍光団が、フルオレセイン、6-カルボキシフルオレセイン、2' ,4',5',7'-テトラクロロ-4,7-ジクロロフルオレセイン、2',7'-ジメトキシ-4',5 '-6-カルボキシローダミン(JOE)、N',N',N',N'-テトラメチル-6-カルボキシローダミン(TAMRA)、および6-カルボキシ-X-ローダミン(ROX)からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。６．前記第１の発蛍光団が6-カルボキシフルオレセインである、請求項５に記載の組成物。７．前記第２の発蛍光団が、フルオレセイン、6-カルボキシフルオレセイン、2' ,4',5',7'-テトラクロロ-4,7-ジクロロフルオレセイン、2',7'-ジメトキシ-4',5 '-6-カルボキシローダミン(JOE)、N',N',N',N'-テトラメチル-6-カルボキシローダミン(TAMRA)、および6-カルボキシ-X-ローダミン(ROX)からなる群から選択される、請求項５に記載の組成物。８．前記第２の発蛍光団が6-カルボキシ-X-ローダミンである、請求項６に記載の組成物。９．核酸増幅反応における増幅用ポリヌクレオチドの増幅生成物の量を測定するための改良された方法であって、該方法が内部増幅参照分子を該増幅反応に加える工程を含み、該内部参照分子は第１の発蛍光団；第２の発蛍光団；および核酸増幅条件下で該増幅用ポリヌクレオチドにハイブリダイズしないバックボーンコネクターを含み、ここでバックボーンコネクターは、該第１の発蛍光団および該第２の発蛍光団と、該第１の発蛍光団から該第２の発蛍光団へのエネルギー移動を可能にするように結合している、改良された方法。１０．前記核酸増幅反応がリアルタイムで測定される、請求項９に記載の方法。１１．前記バックボーンコネクターがポリヌクレオチドである、請求項９に記載の組成物。１２．前記ポリヌクレオチドが、長さ２〜25個のヌクレオチドである、請求項１０に記載の組成物。１３．前記ポリヌクレオチドが(dT)₈である、請求項１２に記載の組成物。１４．前記第１の発蛍光団が、フルオレセイン、6-カルボキシフルオレセイン、 2',4',5',7'-テトラクロロ-4,7-ジクロロフルオレセイン、2',7'-ジメトキシ-4' ,5'-6-カルボキシローダミン(JOE)、N',N',N',N'-テトラメチル-6-カルボキシローダミン(TAMRA)、および6-カルボキシ-X-ローダミン(ROX)からなる群から選択される、請求項９に記載の組成物。１５．前記第１の発蛍光団が6-カルボキシフルオレセインである、請求項１４に記載の組成物。１６．前記第２の発蛍光団が、フルオレセイン、6-カルボキシフルオレセイン、 2',4',5',7'-テトラクロロ-4,7-ジクロロフルオレセイン、2',7'-ジメトキシ-4' ,5'-6-カルボキシローダミン(JOE)、N',N',N',N'-テトラメチル-6-カルボキシローダミン(TAMRA)、および6-カルボキシ-X-ローダミン(ROX)からなる群から選択される、請求項１４に記載の組成物。１７．前記第２の発蛍光団が6-カルボキシ-X-ローダミンである、請求項１５に記載の組成物。１８．核酸増幅反応を実施するためのキットで、該キットは、内部参照分子、ならびに、フルオレッサー-クエンチャープローブおよび熱安定性DNAポリメラーゼからなる群から選択される１つ以上の試薬を含む、キット。１９．前記試薬がフルオレッサー-クエンチャープローブである、請求項１８に記載のキット。２０．前記試薬が熱安定性DNAポリメラーゼである、請求項１８に記載のキット。２１．前記キットがフルオレッサー-クエンチャープローブをさらに含む、請求項２０に記載のキット。