JP3696624B2 - 電気泳動装置の非均一性除去のための方法および装置 - Google Patents
電気泳動装置の非均一性除去のための方法および装置 Download PDFInfo
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Description
本発明は全体として、電気泳動読取システム、より詳しくは、電気泳動システムの非均一性を除去するための方法および装置に関する。
生物工学分野では、蛍光染料が感応非同位体ラベル(標識)として決まって用いられる。これらのラベルは、悪性腫瘍からDNA配列の特定の染色体まで広範囲の細胞構造の同定および位置決定を行う。蛍光ラベル付けされたサンプルを読み取るため広範囲の装置が設計されている。
ゲル電気泳動は、蛍光染料その他マーカーと共に特定の分子およびその他の標識付けされたユニットを同定するため広く用いられる技術の1つである。この技術では、電界を用いてゲルまたは他の溶液中に標識付けユニットを移動させる。
米国特許第4,874,492号では、サンプルを電気泳動ゲルに加える前に蛍光マーカーで処理するゲル電気泳動システムが開示される。ゲルは、UVソースで照らされ、冷却した電荷結合素子(CCD)2次元ディテクタアレイによって蛍光パターンが検出される。CCDアレイは、光感受性を向上させ、ダイナミックレンジを増やすため、少なくとも−25℃まで冷却される。
米国特許第5,162,654号では、4つの発蛍光団のどれが電気泳動ゲルで蛍光を発しているかを光学的に決定するシステムが開示される。ゲルによって放射される蛍光はまず4個の別個の帯域フィルタを通過してから、4個のウェッジプリズムを通過する。このような光学的構成により、放射された蛍光がディテクタアレイの4個の分散領域に画像化される。放射ソースに励起された特定の発蛍光団を、4個の検出領域で検出された蛍光の相対強度を比較することで決定する。
米国特許第5,294,323号では、開示されるゲル電気泳動システムは縦の電気泳動プレートを利用している。レーザ光線は、電気泳動プレートの長手軸に対して垂直方向にゲルを水平に通過する。放射された蛍光は、反射パターンがレーザ光線の方向に平行になるようソリッドステート画像化センサに反射される。
米国特許第5,324,401号では、毛管電気泳動のための蛍光検出システムで、複数の毛管内での蛍光プローブの同時励起および検出を行うものが開示される。励起ソースは、光学ファイバ束を通る毛管に連結されたレーザである。毛管アレイからの蛍光がレンズを介して集束され、CCDカメラに画像化されて分析される。
分析的生化学163、446−457(1987年)に発表された「電気泳動ゲルからの蛍光の直接かつ迅速な定量化のための電子的画像化システム:臭化エチジウム染色DNAへの適用」と題するSuther land他の論文で著者らは、CCDカメラを使用する画像化システムを説明する。CCDカメラは電気泳動ゲル、クロマトグラムその他ソースから受け取った蛍光を定量化する。この論文では、システムが正確な結果を取得する能力に影響する非均一性について原因をいくつか述べている。
前述より、正確な定量的蛍光測定を可能にする改良された電気泳動装置が求められていることは明白である。
発明の概要
本発明は、電気泳動装置の非均一性を修正するための方法および装置を提供する。このような非均一性は画像化システムから生じる。これら非均一性を修正することで、電気泳動ゲルの定量的測定が可能で、電気泳動分析から得られる情報が増える。
本発明の1つの形態では、システムはルックアップテーブルを使用してレンズアセンブリから生じたサンプル画像の非均一性があればこれを修正する。このルックアップテーブルには一定範囲のアパーチャおよび倍率設定のためのレンズアセンブリの均一性プロファイルが入っている。サンプル画像を是正するため、システムプロセッサには、サンプル画像取得に用いられるアパーチャと倍率設定が与えられる。これらの設定はプロセッサによって自動的に、あるいはユーザによる入力で手動的に取得される。プロセッサがレンズ設定を受け取ると、ルックアップテーブルを使用して、対応するレンズの非均一性を決定する。ルックアップテーブルには、各レンズ設定ペアのための修正ファイルが含まれることが望ましい。サンプル画像は、該当する修正ファイル別にサンプル画像ファイルを分けることで正規化する。正規化されると、修正されたサンプル画像ファイルが後の使用のため表示あるいは格納される。
本発明の別の形態では、照明源による非均一性は、リニアアレイディテクタによりソースの一部をサンプリングすることで特定化される。ソースをサンプリングするため、ミラーまたはビームスプリッタを、例えば電気泳動装置の中央光学軸に沿って適切に位置決めする。ミラーは、ソースの非均一性を測定する時は常にステージによってサンプリング位置に置かれるのが望ましい。反射光はリニアディテクタに測定される前に拡大される。
ソースのプロセッサファイルが決定されたら、修正ファイルが関連するデータプロセッサのメモリに格納される。修正ファイルには実際のサンプル画像ファイルと同じ数のデータポイントが入っていなければならないため、システムプロセッサによって多数の補正データポイントを記入しなければならない。これら追加の補正データポイントは内挿により、ソース対称を利用して決定する。完成した修正ファイルを格納したら、サンプルの画像を取り出し、対応する画像ファイルをメモリに格納する。修正した画像ファイルを作成するには、初期サンプル画像ファイルを修正ファイルで正規化する。
本発明の別の形態では、レンズアセンブリによる非均一性は、既知の均一性の二次ソースをレンズアセンブリに通過させることで特性化する。所望なら、ソースの非均一性決定に用いたものと同じミラーを使用してレンズの非均一性を決定することができる。二次ソースは、連続ソースまたは一連のポイントソースのいずれかによるリニアソースである。前述のように、画像ファイルの正規化に用いた修正ファイルを作成・格納する。
本発明の別の形態では、レンズおよびディテクタアセンブリの非均一性は、均一蛍光を示す基準または較正標準を使用して決定する。標準の画像は、未知に用いたのと同じレンズ設定を使用して取得し、較正画像が未知に適用されるシステムの非均一性を正確に反映するようにする。較正標準の画像をダークフィールド画像と共に使用してサンプル画像を修正する。ある実施例では、較正標準はフィルタホイールに入っており、フィルタホイールはレンズアセンブリ入口に近接する。サンプル画像取得後、フィルタホイールが回転して較正標準をレンズの直前に置く。較正標準の画像を取得してからダークフィールド画像を取得する。ダークフィールド画像は、ディテクタのシャッタを閉じ、ソース光、蛍光またはその他の照明源がディテクタに到達するのを防ぐことで取得する。画像は、構成標準画像とダークフィールド画像両方を用いる単純なアルゴリズムを利用して修正する。
本発明の性質と利点は、明細書の残りの部分および図面を参照することで理解されよう。
【図面の簡単な説明】
図1は、従来技術によるゲル電気泳動装置の断面図である。
図2は、バルブの軸に垂直に測定した1つの電球の強度プロファイルである。
図3は、複数のバルブを持つソースの強度プロファイルの図である。
図4は、照明源の均一性を改善する方法を示す図である。
図5は、本発明に基づくレンズ非均一性のため画像を修正する基本ステップを概略するブロック図である。
図6は、本発明の実施例を示す図である。
図7は、レンズアパーチャと較正標準のサイズとの関係を示す図である。
図8は、光の均一性と較正標準との関係を示す図である。
図9は、較正標準と共にディフューザを利用した本発明の別の実施例を示す図である。
図10は、本発明の実施例の詳細図である。
図11は、図10に示す実施例のディテクタアセンブリ、レンズアセンブリ、フィルタホイールのクローズアップ図である。
図12は、本発明のプロセスステップを示すブロック図である。
図13は、本発明の望ましい実施例によるシステムの主なコンポーネントを示す図である。
図14は、レンズアセンブリの非均一性を決定する別の方法を示す図である。
図15は、レンズアセンブリの非均一性を決定する別の方法を示す図である。
図16は、本発明によるシステムの主なコンポーネントを示す図である。
図17は、レンズアセンブリのアパーチャおよび倍率設定を決定するために使用される方法を示す図である。
図18は、本発明の実施例を示す図である。
図19は、本発明による照明の非均一性のため画像を修正する時に用いられる主なステップを概略するブロック図である。
図20は、修正ファイル作成に用いられる内挿プロセスを示すの図である。
図21は、本発明の望ましい実施例によるシステムの主なコンポーネントを示す図である。
図22は、照明源とレンズアセンブリ両方の非均一性測定に用いることのできる本発明の別の実施例を示す図である。
図23は、レンズの非均一性測定を実行するのに必要なコンポーネントを含む本発明によるシステムを示す図である。
図24は、本発明の別の実施例により用いられる主なステップを概略するブロック図である。
実施例の説明
図1は、先行技術によるゲル電気泳動装置の断面図である。このシステムでは、ゲルプレート101が光源103によって照らされる。光源103は複数の個々の電球104から構成される。ソース103からの光は、サンプル101の特定の領域に含まれる発蛍光団または他の蛍光を発する材料に蛍光を放射させる。放射された蛍光は1個以上のレンズ107を通過してディテクタ109に画像化される。受け取った画像に基づき、サンプル101の蛍光領域を決定することが可能である。
サンプル101からの蛍光の強度には、蛍光材料の数量など追加情報が含まれるが、この情報を定量化する能力は、照明源、画像化光学およびディテクタの非均一性のためこれまで限られていた。
ディテクタの非均一性は最も容易に取り除かれる。たとえば、広範囲の強度レベルにわたってリニア応答を提供する多数のCCDアレイが利用可能である。一般に、これらアレイは画素毎に非常に均一な応答も提供するため、ディテクタから生じる非均一性を劇的に減少させる。
個々の電球105からの光強度は、電球長さの大半にわたって比較的均一である。電球の両端で、輝度レベルは強度にわずかな低下を示す。この低下は、リフレクタ、マスク、拡散フィルタ、またはその組み合わせを利用することで最小限にできる。最低の影響も、単に長い電球を使用することで最小限にできる。電球を延長することで、輝度レベルの低下する電球端部が装置のサンプリング領域を過ぎるため、電球の比較的均一な長さのみサンプルの下に置かれる。
図2は、電球の軸に垂直に測定した1つの電球105の強度プロファイルである。予想通り、電球からの距離が増加するため、強度が急速に低下する電球の真上にプロファイルのピーク201が現れる。ディップ203は、ステージ上のスクライブマークの結果である。図3は、電球105の軸に垂直に測定したソース103の強度プロファイルを示す。ピーク301は、個々の電球105の中央線上にあり、谷303は電球間の中間点を表す。ソース均一性は、電球の数を増やし、電球間の分離を減少させることでさらに改良される。
図4は、照明源の均一性を改善する別の方法の図である。この方法では、サンプル101は1つのソース401に照らされる。ソース401は図示の通り1個の電球から構成されるが、ソース401は複数の電球でも構成することができる。ソース401を電球の軸に垂直な方向403でスキャンし、中央電球部分に沿った高度な強度均一性を活用する。電球端部近くの強度低下の影響は、サンプル101の縁を過ぎて距離405だけ電球を延長することで最小限にできる。ソース401は電球均一性領域に垂直な方向にスキャンするため、スキャン速度が一定である限りサンプル101は均一に照らされる。
図5は、本発明に基づくレンズの非均一性について画像を修正する主なステップを概略するブロック図である。まず、レンズアセンブリの非均一性を測定する(ステップ501)。レンズの非均一性の決定には多くの技術を用いることができるが、以下でその一部を説明する。レンズアセンブリをアパーチャと倍率に初期セットについて特性化した後、これらの設定を変更し(ステップ503および505)、レンズを特性化する。このプロセスは、アパーチャ設定範囲と倍率設定範囲についてレンズアセンブリが特性化されるまで続く。そしてこの情報を使用してルックアップテーブルまたはマトリクスを作成する(ステップ507)。
レンズ特性化ルックアップテーブルを作成したら、このデータを修正ファイルルックアップテーブルに変換する(ステップ509)。このステップは、修正ファイル1つあたりの修正データポイント数と、サンプル画像化プロセスによるデータポイント数を1対1で対応させるために必要になることがある。レンズアセンブリの特性化に用いる技術により、修正データポイントの数は結果としてサンプルポイント数より大幅に少なくなることがある。この場合、追加修正データポイントを周知の内挿技術を用いてデータプロセッサによって満たし、レンズアセンブリの対称があればそれを利用する。
修正ファイルのルックアップテーブルの作成後、システムを使って電気泳動サンプルゲルを画像化する(ステップ511)。このとき、ユーザは未修正のサンプル画像を見るか、未修正画像のサンプルファイルを修正のため格納して後で表示することができる。サンプル画像を修正する前に、サンプル画像の取得に用いたアパーチャと倍率の設定をまず決定しなければならないが(ステップ513)、修正ファイルルックアップテーブル内で該当する修正ファイルを見つけるのにこのデータが必要なためである。この情報は、システムによって自動的に決定されるか、またはユーザが単にレンズ設定を入力することができる。
サンプル画像からレンズアセンブリの非均一性を取り除くには、該当する修正ファイルで分けることでサンプルファイルを正規化する(ステップ515)。正規化の前に、修正ファイルをまず当業で周知のスムーズ化機能を用いてスムーズ化することができる。このスムーズ化機能によって、修正ファイルのノイズ源を正規化プロセスで増幅しないようにする。最後に、修正されたサンプル画像を将来の利用のため表示(ステップ517)または格納(ステップ519)する。
レンズおよびディテクタの非均一性の影響を取り除く1つの方法は、基準または較正標準の利用である。較正中、標準がサンプルに取って代る。好適な較正標準は、ソースで照らされた時、均一に蛍光を発する蛍光ガラスまたはプラスチック片である。標準がサンプルと共に使用するラベルと同じ波長を持つ蛍光を発し、標準がレンズおよびディテクタの非均一性を正確に再現するのが望ましい。
実際には、ユーザはまず問題のサンプルI1(x,y)で表される画像を取得する。そしてサンプルが標準に置き換わり、第2が、I2(x,y)が取得される。第2画像は、フラットフィールド画像として知られる。修正された画像を取得するには、カメラのシャッタを完全に塞いで第3の露光を行う必要がある。第3画像、D0(x.y)は、ダークフィールドを表す。修正された画像、CI(x,y)は次によって表される。
CI(x,y)=〔{I1(x,y)−D0(x,y)}/I2(x,y)−D0(x,y)}〕*Mただし、Mは平均I2(x,y)に等しい。
上記の技術を使ってサンプルの正確な、ひいては定量的な画像を取得することができるが、均一な照明源を想定すると、この技術は多くの用途にとって実際的ではない。この技術では、ユーザがサンプルを変更して一連の測定を行い、1つの修正された画像を取得する必要がある。
図6は、本発明の別の実施例の図である。図1に示す先行技術のシステムのように、サンプル101からの蛍光がレンズ107によってディテクタ109に画像化される。この実施例では、ユーザが修正された画像の取得を望むなら、較正標準601をステージ603で移動する。本発明の実施例では、標準601をレンズ107の入口アパーチャに近接して置く。ステージ603は回転ステージであるのが望ましい。前の技術のように、サンプル画像、較正画像、ダークフィールド画像の3個の画像が必要である。修正された画像を取得する式は、上記のものと同じである。
レンズの非均一性を正確にマッピングするため、較正標準601はレンズのアパーチャを完全に塞がなければならない。しかしながら、標準601が前のシステムでサンプル面に置かれた標準よりレンズ107にはるかに近いため、標準601ははるかに小さくすることができる。この関係を図7に示す。集束アパーチャを点線701で示す。図示の通り、標準601はレンズに近接しているためレンズ107とほぼ同じサイズである。しかしながら、サンプル面に置かれた標準703は、レンズアパーチャを塞ぐためはるかに大きくしなければならず、製作コストと困難が増すことになる。
本発明はレンズおよびディテクタに関連する非均一性を克服するために用いることができるが、サンプル画像を定量化するには照明源が均一でなければならない。ソースが均一でないと、サンプル画像、I1(x,y)に関連する不正確性が、本発明の技術によっても完全に除去されない。照明の均一性は、複数の光源、リフレクタ、マスクまたはスキャニングライトシステムを使用して達成できる。
しかしながら、本発明の実施例の較正ステップ中は、光の均一性は必要ない。光均一性の増加は説明した較正技術の精度を増すが、標準601から光源103までの距離605を考えると、照明の均一性はこの技術の要件ではない。
図8は、光均一性と較正標準の配置との関係を示す。光源801は、光源801に近接して置かれる較正標準803を照らす。ランバートの法則に定義されるように、ソースJθの小さいインクレメンタル領域の強度は、法線方向のインクレメンタル領域の強度、Joに、表面法線から測定した角度θのコサインを乗じたものに等しい。そのため、ソース801の領域807の真上にある標準803上のポイント805で測定した強度は、領域807の強度に等しい。これとは対照的に、標準803の対向端部のポイント809で測定した強度は大きく低下する。たとえば、80度の角度θを考えると、ポイント809の強度はポイント805で測定した強度のわずか17パーセントである。そのため、ソース801が非均一である場合、較正標準803は非均一に照らされ、較正技術はレンズおよびディテクタの非均一性の関数としてのみでなく、照明の非均一性の関数となる。
対照的に、ソース801からある程度距離を置いた較正標準を使用すると、照明の非均一性は較正技術にほとんど影響を与えない。たとえば、直径2センチメートルの測定値の較正標準811がソース801から65センチメートルにあると想定すると、ポイント813と815で測定した強度の差は1パーセント未満である。そのため、較正標準をレンズ近くにソースから離して置くことで、照明の非均一性の影響は大幅に削減できる。
図9は、本発明の別の実施例の図である。この実施例は、図6に示すのと同じ要素にディフューザ901を加えている。ディフューザ901は、較正標準601とレンズ107との間に取り付ける。ディフューザ901によって、較正標準内の小さい非均一性もスムーズ化することで、システムがレンズとディテクタの非均一性のモニタのみ行うようにする。
図10は、本発明の実施例の詳細な図である。この実施例では、サンプル1001は光源1003で照らされる。ソース1003は、トレイ1007内に配置される3個の電球1005から構成される。トレイ1007は、モータ1011で制御されるプーリーおよびベルトシステム1009に乗る。サンプリング中、光トレイ1007は、ポイント1013から始めてポイント1015で終了するようサンプル1001をスキャンする。スキャン速度、ソースの強度、および介入するフィルタ1017は、サンプル1001を照らす放射強度を決定するため、サンプル1001の適切にマークされた領域の蛍光を決定することになる。スキャニングソース1003によって照明を均一にする。
サンプル1001から放射された蛍光は、レンズアセンブリ1023によってディテクタ1025に画像化される前に、アパーチャ1019またはフィルタホイール1021のフィルタ1019を通過する。この実施例では、ディテクタ1025はCCDディテクタ、望ましくは二次元アレイである。較正画像が必要な場合、フィルタホイール1021がレンズアセンブリの前に較正標準1027を置くため回転する。
較正標準1027を照明する方法にはいくつかある。まず、ソース1003からサンプル1001を通過する放射を使用することができる。ゲルサンプル1001上のパターンのため、照明強度はきわめて非均一である。しかしながら、上記に示すように、この標準は照明の非均一性に対して相対的に感度が低い。ソース1003は、通常スキャニングモードで用いるか、装置中央の静止位置に保持することができる。第2に、サンプル1001を取り除き、ソース1003をスキャニングまたは静止モードで使用することができる。第3に、別ソース1029を使用して、較正標準1027を照らすことができる。ソース1029を図示のようにサンプル面上に位置決めして、較正画像を取得する前にサンプル1001を取り除く必要がないようにするのが望ましい。実施例では、1組のソース1029を使用して標準1027を照らす、標準1027に到達する光の均一性を改善する。
図11は、ディテクタアセンブリ1025、レンズアセンブリ1023、フィルタホイール1021のクローズアップ図である。図示の通り、較正標準1027は較正測定ができる面に回転している。
図12は、本発明のプロセスステップを示すブロック図である。当初、サンプルは試験装置に置く(ステップ1201)。本発明はゲル電気泳動用途に限られていないが、これが最もよく使われる用途の1つである。この例では、サンプルはゲルで、一定の領域、構造または分子が、マーカーの励起波長で放射された時に特定の波長で蛍光を発する蛍光マーカーでラベル付けしてある。放射波長が励起波長とは異なるため、放射をフィルタの使用によるソースからと区別することができる。選択した領域からの放射は、サンプルの画像を形成するため、ディテクタに画像化される(ステップ1203)。サンプル画像を取得したら、較正標準を移動させる(ステップ1205)。レンズおよびディテクタアセンブリの非均一性を正しく測定するため、システムのアパーチャおよび倍率設定は、サンプル画像化ステップ中に使用したものから変更されていない。サンプル照明源または上述の代替源を使用して、較正画像を取得する(ステップ1207)。そしてカメラのシャッタを閉じて(ステップ1209)、ダークフィールド画像を取得する(ステップ1211)。そして、上記の補正アルゴリズムなど周知の数学的関係を使ってサンプル画像を補正する(1213)。
図13は、本発明の実施例によるシステムの主なコンポ−ネントの図である。この実施例では、中心的なシステムコンポーネントはプロセッサ1301に接続されている。プロセッサ1301は、プロセス全体を自動化することで、補正プロセスを直線的にして、ユーザエラーのリスクを最小限にできる。このシステムを使用するには、サンプル1001をまず電気泳動装置1303内に置く。そしてユーザは、システムがこれらパラメータを自動的に選択するよう設計されていない限り、システムのアパーチャと倍率を手動で設定する。実施例では、ユーザはユーザインターフェース1305を介して、サンプル1001について使用するマーカー(例:蛍光)をプロセッサ1301に入力する。この情報に基づき、プロセッサ1301は統合されたルックアップテーブルを使って適切な励起および放射設定を決定する。そして、プロセッサ1301はフィルタホイール1021の操作によって適切なフィルタを移動する。
システム操作パラメータを手動または自動で設定したら、ユーザはインターフェース1305を介してプロセッサ1301に該当する信号を送ることで実行を開始する。するとプロセッサ1301はソース1003をオンにしてサンプル1001の画像を取得する。ソース1003が図10に示すようにソースをスキャンしていると、プロセッサ1301もスキャニングモータ1011を制御することによってスキャン動作を制御する。ディテクタ1025が取得した画像は、プロセッサ1301内に常駐するメモリに格納されると共にモニタ1307に表示される。ディテクタ1025がCCDカメラである場合、データは容易にデジタルフォーマットで格納されるため、後のデータ操作が容易になる。プロセッサ1301の構成により、いくつかの動作が次に起こり得る。システムが完全に自動モードだと、システムは自動的にサンプル画像の補正プロセスを始める。このモードでは、システムのセットアップにより初期の未補正画像は、表示されることもされないこともある。初期画像を表示する利点は、画像に有益なデータが入っていないため補正技術を適用する前にサイクルを終了するということをユーザが判断できる点である。
自動モードでは、サンプル画像を取得した後、プロセッサ1301はソース1003をオフにして、較正標準を移動する。較正標準はフィルタホイール1021内にあるため、プロセッサ1301は、適切なフィルタ凹部が来るまでホイールを単に回転させる。そしてプロセッサ1301は、ソース1003または代替源1029の内、適切な照明源を起動し、フラットフィールド画像を取得する。この画像からのデータは常駐プロセッサメモリに格納される。較正標準画像が完成すると、プロセッサ1301はカメラアセンブリ1025のシャッタを閉じ、ダークフィールド画像を取得する。これら2つの追加画像を使って、プロセッサ1301はサンプル画像を補正し、モニタに補正した画像を表示する。未補正画像と補正画像およびフラットフィールドとダークフィールドの両方とも、後で取り出して使用するため格納することができる。
図14は、レンズアセンブリの非均一性を判断する別の方法の図である。サンプル面1401は、光源1403で照らされる。この実施例では、光源1403は一連の電球1405で構成されるが、この技術は他の光源に等しく適用される。通常の利用では、たとえば電気泳動ゲルなどのサンプルはサンプル面1401内にある。かかるサンプルの励起された領域からの蛍光は、レンズアセンブリ1407によってディテクタ1409に画像化される。
レンズアセンブリ1407を特性化するため、二次ソース1411を使用する。ソース1411は、例えば一連の発光ダイオード(LED)1413などのラインソースである。ソース1411は、一連の他のタイプのポイントソース、または長い電球など一列のラインソースで構成することもできる。ソース1411からの放射は、ミラー1417で反射される前にレンズ1415で拡大される。ミラー1417は部分リフレクタなので、システムの通常動作中はその場に留まることができる。ミラー1417をレンズ非均一性の測定作業専用にすることもできる。ミラー1417が専用ミラーである場合、ステージに置いて、通常のシステム動作中サンプル画像化パスから外して移動できるようにする。
ミラー1417はパス1419に沿ったソース1411からの放射を反射する。そしてこの放射がレンズアセンブリ1407からディテクタ1409まで通過する。CCDアレイで取得可能な均一なディテクタ応答(感度など)を想定し、ミラー1417、レンズ1415、およびソース1411の均一性も想定すると、ディテクタ1409によって測定される非均一性があれが、レンズアセンブリ1407によるものである。
図14に示す装置は、レンズアセンブリ1407が球対称を示すと想定するため、レンズの非均一性を1つの軸1421に沿ってのみ判断できる。レンズアセンブリ1407がこのような対称を示さない場合、他の軸に沿ってさらに非均一性測定を行わなければならない。
レンズアセンブリの非均一性を特性化する別の方法は、レンズアセンブリを取り外して電気泳動装置とは別に特性化することである。例えば図15に示すシステムでは、レンズアセンブリ1501を電気泳動装置(図示せず)から取り外し、較正ベンチ1507のソース1503とディテクタ1505との間に置く。この環境では、非常に均一なソース1503とディテクタ1505を使用できるため、高度な特性化精度が確保される。特性化したら、レンズアセンブリ1501を電気泳動装置に再度取り付ける。
図16は本発明によるシステムの主なコンポーネントの図である。この実施例で、中心となるシステムコンポーネントは、ユーザインターフェイス1603に接続されたプロセッサ1601に連結されている。プロセッサ1601は内挿および正規化プロセスをタイムリーに実行するため必要である。この実施例は、レンズアセンブリ1605の非均一性の特性化に用いる方法に関係なく使用することができる。
サンプル画像を取得するには、ソース1607をオンにして適切にマークされたサンプル1609の領域に蛍光を発させる。蛍光は、レンズアセンブリ1605によってディテクタ1611に画像化される。サンプル画像は、直ちにディスプレイモニタ1613に表示されるか、プロセッサ1601に関連するメモリ内にサンプルファイルとして格納される。
レンズの非均一性についてサンプル画像を補正するには、サンプル画像取得中に用いたレンズのアパーチャと倍率の設定をプロセッサ1601に入力しなければならない。これらの設定は、プロセッサ1601が正規化プロセス中に用いる適切な修正ファイルを判断できるようにするため必要である。画像ファイルを適切な修正ファイルで正規化した後、修正した画像ファイルをモニタ1613に表示することができる。修正した画像ファイルはまた、後に取り出して使用するためメモリ内に格納することもできる。
プロセッサ1601によってレンズ設定を取得する方法には多数ある。ユーザにとってもっともわかりやすい方法は、インターフェイス1603を使用して設定情報を手動で入力することである。第2の方法は、レンズ設定をプロセッサ1601によって自動的に決定することである。この実施例では、レンズ1605には1個以上の設定センサ1615が含まれる。センサ1615は、ライン1617によってプロセッサ1601に連結される。センサ1615は、機械的あるいは電気光学的で、周知の技術を採用している。
図17は、1つの較正済み光源を利用してレンズ107のアパーチャおよび倍率設定を決定する別の技術の図である。光源は発光ダイオード(LED)または容易に較正できる他のソース形式でよい。ソースは位置1701か、静止したフィールド外の位置1703に置くことができる。ソースを場所1701のようなイメージャの視野内に置く場合は、取り外し可能でなければならない。たとえば、ステージ1705を使ってソースを動かすことができる。
この方法を使ってレンズ設定を決定するには、較正済みソースを配置してオンにする。問題のサンプルの画像取得に用いたのと同じ設定を使用してソースの画像を取得する。倍率設定は、較正済みソースの画像サイズを見て決定するが、アパーチャ設定はソースの強度で決定する。
図18は、本発明の別の実施例の図である。サンプル面1801が光源1803で照らされる。この実施例では、光源1803は一連の電球1805から構成されるが、本発明は他の光源にも等しく適用可能である。通常の利用では、たとえば電気泳動ゲルなどのサンプルは、サンプル面1801内にある。かかるサンプルの励起された領域からの蛍光は、レンズアセンブリ1807によってディテクタ1809に画像化される。ディテクタ1809は二次元CCDアレイであるのが望ましい。
照明源1803から生じる非均一性を取り除くためには、ミラー1811を使ってソースの一部をサンプリングする。本発明の1実施例では、ミラー1811を部分リフレクタでコーティングし、ソース1803からの光の一部がレンズ1807とディテクタ1809に達するようにする。この実施例では、ソース1803からの光の第2の部分がパス1813に沿って反射される。光のわずかな部分のみミラー1811によりパス1813に沿って反射されると想定すると、この実施例の主な利点の1つは、ミラー1811をシステムの通常動作中に取り外す必要がない点となる。しかしながら、この構成では、ミラー1811が非均一性を導入するため、補正プロセスではこれも考慮しなければならない。代替実施例では、ミラー1811をステージ(図示せず)に連結する。通常動作中、ステージはミラー1811をライトパスから外し、プレーン1801のサンプルから画像化レンズアセンブリ1807へのライトパスを妨害しないようにする。光源1803の非均一性を判断するため、ステージはミラー1811を図18に示すようなサンプリング位置に動かす。
照明源1803の非均一性を判断するため、ミラー1811がレンズ1815を介してパス1813沿ってソース1803の一部を反射する。レンズ1815は光をリニアディテクタアレイ1817に集束させる。ディテクタ1817はリニアCCDアレイであるのが望ましい。しかしながら、他の形式のインラインディテクタアレイを使用することができる。さらに、アレイ1817が連続している必要はない。それより、アレイ1817を一連のポイントディテクタと、測定済みポイントから内挿したポイントディテクタ間の均一性プロファイルから構成することができる。
ミラー1811、レンズ1815、およびディテクタ1817の寸法および位置は、ソース1803の対称によって決まる。たとえば、図18に示すようなソースは、個々の主要軸に沿って延長した電球1805の照明均一性のため、軸1819に沿って比較的均一になると予測できる。対照的に、ソース1803は、軸1821に沿って、図3に示すものと似た照明プロファイルを持つと予想できる。そのため、図示のように軸1821に沿ってソース1803のプロファイルを測定することで、ソース全体の非均一性を判断できる。
ソース非均一性を判断したら、サンプルの画像を補正できる。図19は、本発明を使用して画像を補正する主なステップを概略するブロック図である。まず、ソースのプロファイルを上記に説明した技術を使って測定しなければならない(ステップ1901)。プロファイルを決定したら、修正ファイルをシステム画像プロセッサに関連するメモリ内に格納する(ステップ1903)。
修正ファイルには、サンプル画像化プロセスによるポイント数と同じ数の修正データポイントが入っていなければならない。修正データポイントの数は一般にサンプルポイントの数より大幅に少ないため、修正データポイントはプロセッサによって記入しなければならない。記入された修正データポイントは、ソースの対称とディテクタ1817の画素数をいずれも考慮する。図20は、内挿プロセスを示す。マトリクス2001は、修正データポイントの11x11のマトリクスによって表され、これによって121個のサンプルデータポイントのサンプル画像を再現する。軸1819に沿って均一で軸1821に沿って非均一な図18に示すようなソースを想定すると、修正データポイントの大半をプロセッサによって記入することができる。図示の例では、列2005の修正データポイント2003が本発明を使って測定されている。列2005の修正データポイント2007は、内挿によって記入される。軸1819に沿ったソースの均一性を考えると、残りの列2009は単に列2005の再現である。
ソースプロファイルを測定したら、サンプル画像を取得し(ステップ1905)、格納する(ステップ1907)。画像を正規化する前に、実施例では、修正ファイルがまず当業で周知のようなスムーズ化機能を使ってスムーズ化される(ステップ1909)。このスムーズ化機能によって、修正済みサンプル画像を不良とするような修正ファイルのノイズ源があれば正規化プロセスによって増幅しないようにする。最後に、修正されたサンプル画像ファイルを実現するには、サンプルファイルを修正ファイル(あるいはステップ1909を適用する場合はスムーズ化された修正ファイル)で分割することで正規化する(ステップ1911)。修正されたサンプル画像ファイルは、後の使用のため表示(ステップ1913)あるいは格納(ステップ1915)することができる。
図21は、本発明の別の実施例れによるシステムの主なコンポーネントの図である。この実施例では、中心となるシステムコンポーネントは、ユーザインターフェイス2102に接続されたプロセッサ2101に接続される。内挿/正規化プロセスをタイムリーに実行するためプロセッサ2101が必要だが、これによってプロセスの多くを自動化することもできる。使用中、照明源のプロファイリング前または後に、サンプル画像を取得し、格納することができる。さらに、ソースが短期間は比較的コンスタントであるため、各サンプルランでソースをプロファイリングする必要はない。しかしながら、各サンプルランでのソースのプロファイリングによって補正精度が向上する。実施例では、ソースは定期的にのみプロファリングされ、電球の経年による変化などの変化があったか否かを判断するため、新しいプロファイルが最後のプロファイルと比較される。
サンプル画像をソースプロファイルより前に取得すると想定すると、サンプル2103はまず電気泳動装置2105内に入れられる。この実施例では、ソースプロファイルミラー2107をリトラクタブルステージ2109に取り付ける。サンプルラン中、ステージ2109が引き込まれ、ミラー2107が位置2111に来る。
サンプル画像を取得するには、ソース2113をオンにしてサンプル2103の適切にマークされた領域に蛍光を発させる。蛍光はレンズアセンブリ2115によってディテクタ2117に画像化される。サンプル画像は、プロセッサ2101に関連するメモリ内にサンプルファイルとして格納される。希望するなら、修正前にサンプル画像をモニタ2119に表示することができる。
ソースプロファイルを取得するには、サンプル2103を装置2105から取り出し、ミラー2107をステージ2109で動かす。ソース2113をオンにして、ソースプロファイルをレンズ2123でディテクタアレイ2121に画像化する。必要に応じて、ソース2103の対称により、追加ソースファイルを取得することができる。たとえば、ミラー2107、レンズ2123およびディテクタ2121を第2軸に沿って複製することで、第1に垂直な軸に沿って第2のソースプロファイルを取得することができる。単数または複数のソースプロファイルを取得すれば、プロセッサ2101は、修正ファイルと、希望するならスムーズ化した修正ファイルを作ることができる。そしてこのデータを使用して上述のように画像を正規化する。
本発明の別の実施例では、ソースプロファイリングミラーを使ってレンズアセンブリをプロファイリングすることができる。この実施例を図22に示す。この実施例を、ソースおよびレンズの非均一性について修正されたサンプル画像を取得するため、前に説明した実施例と使用することができる。ソースが均一ソースであるなら、この実施例を別個にしようしてレンズアセンブリのみの非均一性を補正することができる。ソースは、スキャニングソース、リフレクタおよび/またはマスクなど広範囲な技術を使って均一にできる。
レンズアセンブリ1807による非均一性を取り除くには、二次ソース2201を使用する。ソース2201は、一連の発光ダイオード(LED)2203などラインソースである。ソース2201はまた、一連の他タイプのポイントソースまたは長い電球のような1つのラインソースから構成することもできる。ソース2201からの放射は、ミラー1811が反射する前にレンズ2205で拡大される。前の実施例のように、ミラー1811は部分リフレクタであるため、システムの通常動作中、その場に留まることができる。ミラー1811を、レンズおよび/または照明源の非均一性の測定作業専用にすることもできる。ミラー1817が専用ミラーである場合、ステージに置いて、通常のシステム動作中サンプル画像化パスから外して移動できるようにする。
ミラー1811は、パス2207に沿ってソース2201からの放射を反射する。すると放射はレンズアセンブリ1807を通ってディテクタ1809まで通過する。CCDアレイで取得可能な均一なディテクタ応答(感度など)を想定し、ミラー1811、レンズ2205、およびソース2201の均一性も想定すると、ディテクタ1809によって測定される非均一性はレンズアセンブリ1807によるものである。
図22に示す装置は、レンズアセンブリ1807が球対称を示すと想定するため、レンズの非均一性を1つの軸2209に沿ってのみ判断できる。レンズアセンブリ1807がこのような対称を示さない場合、他の軸に沿ってさらに非均一性測定を行わなければならない。
レンズの非均一性が判断されたら、図19に概略するのと同じステップに従ってサンプル画像を補正することができる。唯一の相違は、ソースのプロファイルを測定する代わりに、ステップ1901ではレンズアセンブリ1807のプロファイルを測定している点である。修正ファイルの作成とその後、修正ファイルをサンプルファイルの正規化に使用するなどの残りのステップは前述と同じである。
図23は本発明によるシステムの図で、レンズの非均一性測定の実行に必要なコンポーネントを含む。この図は図21に示すものと同一だが、ソース2201とレンズ2205を加えている。この実施例では、ソース2201をプロセッサ2101に接続し、レンズの非均一性測定を自動化できるようにしている。
図24は、本発明の別の実施例を従って用いられる主なステップを概略するブロック図である。この実施例では、ソースのプロファイルをまず上述のシステムを使って決定する(ステップ2401)。ソースプロファイルが決定したら、二次ソースのプロファイルを変更して、実際ソースの測定されたプロファイルを模すことができる(ステップ2403)。このステップでは、ソース2201を個々に制御可能な一連のポイントソース2203で構成する必要がある。ポイントソース2203は予め較正されプロセッサ2101によって制御されるのが望ましい。ソース2201は、ソース2403と同じプロファイルを提供するため調整されているので、格納された修正ファイルは、照明源2403の非均一性とレンズアセンブリ2407の非均一性を両方考慮する。前の実施例同様、修正ファイルはサンプル画像化プロセスによるデータポイント数と同じ修正データポイント数が入っていなければならない。そのため、修正ファイルには、測定されていないが、標準内挿機能を使用してプロセッサ2101によって計算された修正データポイントが多数入っている。
修正プロセッサファイルを測定して適切な修正データファイルを格納した後、サンプル画像を取得し(ステップ2409)、格納し(ステップ2411)、正規化する(ステップ2413)。前の実施例同様、必要に応じて、サンプル画像の正規化に用いる前に、修正データファイルにスムーズ化機能を適用することができる。最後に、修正されたサンプルファイルは後の使用のため格納するか(ステップ2415)、直ちに表示する(ステップ2417)。
当業者にとっては理解されるように、本発明はその精神や本質的特性から逸脱することなく他の特定の形式で具現化することができる。たとえば、本発明は特定の励起および放射波長に限定されない。そのため、可視波長で蛍光を発するUV励起マーカーを使用することができる。また、レンズの非均一性特性化の他の技術を使用することができる。従って、本書の開示および説明は図示のためのもので、以下の特許請求の範囲に記載された発明の範囲を限定しない。
Claims (12)
- 電気泳動ゲルを保持するためのプラットホームと、
前記電気泳動ゲルを照らすための光源と、
前記電気泳動ゲルをディテクタに画像化するための第1のアパーチャ設定と第1の倍率設定に設定されたレンズアセンブリであって、前記電気泳動ゲルの前記画像は少なくとも1つのラベルの付いた領域を含み、前記ラベルのついた領域は、前記光源に照射されたとき蛍光を発し、前記ディテクタは前記電気泳動ゲルの前記画像に対応する出力信号を生成するものである、複数のアパーチャ設定および複数の倍率設定が可能であるレンズアセンブリと、
前記ディテクタに連結され、前記ディテクタ出力信号を画像ファイルとして格納するプロセッサと、
前記第1アパーチャ設定と前記第1の倍率を入力するための前記プロセッサに連結された入力源と、
前記プロセッサに連結され、かつ前記複数のアパーチャ設定および前記複数の倍率設定に対応し、複数の修正ファイルとして前記プロセッサに格納される複数のレンズアセンブリ非均一性プロファイルを含むルックアップテーブルと、
前記プロセッサに格納されるとともに、前記プロセッサが前記ルックアップテーブルから選択され、かつ前記第1アパーチャ設定および前記第1倍率設定に対応する修正ファイルで前記画像ファイルを正規化することにより前記修正された画像を生成する、修正された画像ファイルと、
を備えたことを特徴とする電気泳動システム。 - 前記ディテクタCCDディテクタアレイである、請求の範囲第1項記載の電気泳動システム。
- 前記修正された画像ファイルを表示するための前記プロセッサに連結されたディスプレイモニタを備える、請求の範囲第1項記載の電気泳動システム。
- 前記入力源がユーザインターフェースである、請求の範囲第1項記載の電気泳動システム。
- 前記入力源がレンズアセンブリのアパーチャ設定およびレンズアセンブリの倍率設定センサを備え、前記アパーチャ設定センサは、選択したアパーチャ設定に対応する第1のセンサ信号を前記プロセッサに送信し、前記倍率設定センサは、選択した倍率設定に対応する第2のセンサ信号を前記プロセッサに送信する請求の範囲第1項記載の電気泳動システム。
- 前記入力源はさらに第2の光源を備え、前記第2の光源は較正されたソースで、前記第2の光源は、前記レンズアセンブリによって前記ディテクタに画像化されて第1強度の第1拡大画像を形成し、前記プロセッサは、前記拡大画像のサイズに基づき前記第1倍率設定を決定し、前記プロセッサは前記第1強度に基づき前記第1アパーチャ設定を決定する、請求の範囲第1項記載の電気泳動システム。
- 前記光源は実質的に均一な照明で前記電気泳動ゲルを照らす請求の範囲第1項記載の電気泳動システム。
- 電気泳動ゲルの画像からレンズアセンブリの非均一性を取り除く方法であって、
前記電気泳動ゲルを光源で照らすことで、前記照らされたゲルの少なくとも1つのラベル付き領域が蛍光を発し、
レンズアセンブリのための複数のアパーチャ設定から第1アパーチャ設定を選択し、
前記レンズアセンブリのための複数の倍率設定から第1倍率設定を選択し、
前記照らされた電気泳動ゲルを前記レンズアセンブリでディテクタに画像化し、
前記照らされた電気泳動ゲルの前記画像に対応する第1信号をプロセッサに出力し、
前記第1出力信号を前記プロセッサに連結されたメモリに画像ファイルとして格納し、
前記第1アパーチャ設定を前記プロセッサに通信し、
前記第1倍率設定を前記プロセッサに通信し、
前記複数のアパーチャ設定および前記複数の倍率設定に対応する複数の修正ファイルの入ったルックアップテーブルから前記第1アパーチャ設定および前記第1倍率設定に対応する適切な修正ファイルを決定し、
前記適切な修正ファイルで前記画像ファイルを正規化することで修正された画像ファイルを生成する、
各ステップを備えたことを特徴とする方法。 - 前記修正された画像ファイルを前記メモリに格納するステップを備えた請求の範囲第8項記載の方法。
- 前記修正された画像ファイルをディスプレイモニタに表示するステップを備えた請求の範囲第8項記載の方法。
- 前記通信ステップは、前記プロセッサに連結されたユーザインターフェースで実行される請求の範囲第8項記載の方法。
- 前記通信ステップは、
較正された第2ソースを前記ディテクタに画像化し、
前記画像化された較正済みソースの強度を測定し、
前記強度から前記第1アパーチャ設定を決定し、
前記画像化された較正済みソースのサイズを測定し、
前記サイズから前記第1倍率設定を決定する、
請求の範囲第8項記載の方法。
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