DE4218721C2 - Kapillarelektrophorese-Gerät - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Kapillarelektrophorese-Gerät mit mindestens einer Kapillare und Puffer-Reservoirs, die ggf. mit geeigneten Puffern gefüllt sind, einer Hochspannungsquel­ le, einem Detektionssystem und ggf. einem Computer zur Steue­ rung des Geräts und/oder zur Auswertung von Messungen.

Die Kapillarelektrophorese hat in den letzten Jahren eine immer größere Bedeutung als Trenn- und Analysemethode er­ langt. Dies ist vor allem darauf zurückzuführen, daß die Bestimmungen weitgehend automatisiert und geeignete Kapilla­ ren zur Verfügung gestellt werden konnten.

Bei der Kapillarelektrophorese tauchen die beiden Enden einer mit einem geeigneten Puffer gefüllten Kapillare in zwei ge­ trennte Puffer-Reservoirs. Die zwei Elektroden einer Hoch­ spannungsquelle sind ebenfalls in jeweils eines der beiden Puffer-Reservoirs geführt. Nach Anlegen der Hochspannung wandern die zu detektierenden Spezies im elektrischen Feld durch die Kapillare. Die Ladung oder das Ladung/Masse-Ver­ hältnis der einzelnen Spezies bestimmt dabei ihre Wanderungs­ geschwindigkeit. Ein Detektionssystem, das am Austrittsende der Kapillare angeordnet ist, liefert ein auswertbares Sig­ nal, das der Menge der detektierten Spezies proportional ist. Ein ggf. vorhandener Computer kann den Verlauf der Messung steuern und die erhaltenen Signale auswerten.

In der Veröffentlichung von Alfredo E. Bruno et al. in Anal. Chem. 1991, 63, 2689-2697 wird zur Detektion der Brechzahl­ änderung in einer Kapillare eine einzelne Photodiode verwen­ det. Dementsprechend ist keine ortsauflösende Beobachtung möglich.

Bei der US-PS 4,927,265 ist eine Messung nur bei Substanzen möglich, die eine Absorption oder Fluoreszenz zeigen.

Die Erfindung stellt sich die Aufgabe, die bisher zur Verfü­ gung stehenden Detektionsverfahren zu verbessern. Insbeson­ dere sollen beliebige Spezies nachweisbar sein, die einer kapillarelektrophoretischen Bestimmung zugänglich sind, und es soll eine wellenlängen- bzw. ortsauflösende Messung ermög­ licht werden.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Kapillarelektrophorese- Gerät der eingangs erwähnten Art, bei dem das Detektions­ system eine interferometrische Meßeinrichtung umfaßt, die mindestens einen ortsauflösenden optischen Detektor, vorzugs­ weise eine Photodiodenzeile wie bspw. ein Diodenarray auf­ weist.

Die interferometrische Meßeinrichtung kann bei dem Kapillar­ elektrophorese-Gerät dazu dienen, Änderungen der Brechzahl in lichtdurchlässigen, insbesondere runden Kapillaren zu messen. Bei einem solchen Detektor ist die komplexe Dielektrizitäts­ konstante die Meßgröße, deren Änderung eine Verschiebung der winkelabhängigen Interferenzextremwerte zur Folge hat. Bisher wurde diese Veränderung durch Messung der Intensität bei einer Wellenlänge in der Flanke eines Extremwertes beobach­ tet. Durch die Verwendung einer Diodenzeile kann jetzt ein ganzer Extremwert beobachtet und ausgewertet werden. Dabei ergeben sich eine Vielzahl von Vorteilen. Eine ortsaufgelöste Messung der Intensitätsverteilung über einen beliebig wählba­ ren Winkelbereich wird ermöglicht. Während der Messung müssen keine Teile der Meßanordnung mechanisch bewegt werden. Dadurch entfällt eine nachträgliche Justierung der Meßanordnung, da ein neuer "Nullpunkt" ohne mechanische Bewegung festgelegt werden kann. Durch die trägheitslose Messung ist eine sehr schnelle Meßabfolge möglich. Die Lage eines frei auswählbaren Extremwerts kann sehr genau bestimmt werden, da alle Meßdio­ den dieses Extremwertes in den Auswertealgorithmus einbezo­ gen werden können. Aufgrund der Tatsache, daß nicht die Intensität bei einer Wellenlänge des Extremwertes, sondern die Winkellage des Extremwertes detektiert wird, ist keine Referenzbildung notwendig, die durch Intensitätsschwankungen der Lichtquelle erforderlich werden kann. Aus dem gleichen Grund kann eine Stabilisierung der Lichtquelle entfallen. Dadurch können als Lichtquelle nicht nur Laser sondern auch Xenonlampen mit einem geeigneten Interferenzfilter oder Quecksilberniederdrucklampen mit einem geeigneten Bandfilter als Lichtquelle verwendet werden. Auch die Kohärenzlänge dieser Lichtquellen ist für die Erzeugung von Interferenzer­ scheinungen ausreichend. Durch Auswertung zweier Extremwerte ist auch eine Absolutwertbestimmung der Brechzahl möglich.

Es ist bevorzugt, wenn das Gerät mit Hilfe eines Computers, insbesondere eines Mikrocomputers gesteuert wird. Dieser Mikrocomputer kann gleichzeitig zur Auswertung der Messungen dienen. Ein computergesteuertes Kapillarelektrophorese-Gerät nach der Erfindung hat den Vorteil, daß ein einmal einge­ stellter Ablauf der Bestimmung routinemäßig immer wieder wiederholt werden kann. Auch ein bestimmter Ablauf verschie­ dener Messungen kann vorprogrammiert werden. Dies führt dazu, daß mit Hilfe des Geräts elektrophoretische Messungen bspw. über Nacht unter reproduzierbaren Bedingungen durchgeführt werden können. Zu diesem Zweck kann das Gerät ggf. mit einem geeigneten Probenwechsler ausgerüstet sein.

In Weiterbildung kann die interferometrische Meßeinrichtung zur Fokussierung des auszuwertenden Lichts mindestens eine Spiegelanordnung aufweisen. Durch die damit verbundene Weg­ verlängerung wird die Winkelauflösung erhöht. Bei entspre­ chender Spiegelanordnung läßt sich der Detektor in kleiner kompakter Bauform konstruieren.

Zusätzlich zur interferometrischen Meßeinrichtung kann das Detektionssystem Einrichtungen zur Messung der Lumineszenz und/oder der Absorption aufweisen. Für die Lumineszenzmessung kommt insbesondere die Messung der Fluoreszenz in Frage. Bei entsprechendem Aufbau des Detektionssystems läßt sich Absorp­ tion, Lumineszenz und Brechzahländerung gleichzeitig erfas­ sen. Auf diese Weise kann ggf. eine direkte Identifizierung einer oder mehrerer Spezies erfolgen. Ist bspw. in einem Probenvolumen eine von mehreren Spezies fluoreszierend, so läßt sich bei gleichzeitiger Bestimmung der Brechzahländerung und der Fluoreszenz einer der bei der Brechzahlmessung erhal­ tenen Peaks direkt der fluoreszierenden Substanz zuordnen. Auf diese Weise können die Vorteile der einzelnen Nachweis­ methoden gleichzeitig in Kombination ausgenutzt werden. Eine Speicherung der dabei erhaltenen Meßwerte in der Computer- Matrix für Vergleiche ist möglich.

Weiter kann das Gerät geeignete Optiken zur Fokussierung von Lichtstrahlen, wie bspw. der auf die Kapillare einfallenden und/oder von dieser ausgehenden Lichtstrahlen aufweisen.

Schließlich kann es vorteilhaft sein, wenn im einfallenden Lichtstrahl ein Polarisator vorgesehen ist. Auf diese Weise kann der Effekt des Zirkulardichroismus bei chiralen Substan­ zen ausgenutzt werden. Eine Messung ist dann unter verschie­ denen Polarisationsrichtungen möglich. In diesen Fällen ist in dem auszuwertenden Lichtweg, insbesondere bei einer Meß­ einrichtung für die Absorption ein Analysator vorgesehen. Weiterhin enthält das Detektionssystem ggf. übliche Bauteile wie Strahlteiler (halbdurchlässige Spiegel), Referenzdetekto­ ren für die Absorption, geeignete Abbildungsoptiken, Detekto­ ren für die Lumineszenz und für die Absorption und derglei­ chen.

Bei sämtlichen von der Erfindung umfaßten Kapillarelektropho­ rese-Geräten können die üblichen Kapillaren eingesetzt wer­ den. Diese Kapillaren können aus organischen Polymeren, wie bspw. Teflon bestehen. Glaskapillaren werden insbesondere bei Anwendung von optischen Nachweismethoden verwendet. Dabei ist Quarzglas als Grundmaterial besonders geeignet. Üblicher­ weise ist die Quarzkapillare auf der Außenseite mit Polyimid, einem temperaturbeständigen Kunststoff ummantelt. Diese Ummantelung ist lediglich an der Detektionsstelle nicht vorhanden. Auf der Innenwand sind die Kapillaren zweckmäßig mit einer Schicht wie bspw. einer Siliconschicht versehen, die die Trennleistung wesentlich verbessert. An der Außen­ seite und an der Innenseite bereits beschichtete Quarzglas­ kapillaren können fertig gekauft werden.

Der Innendurchmesser der Kapillaren beträgt vorzugsweise zwischen 5 µm und 2 mm. Die Länge üblicherweise verwendeter Kapillaren reicht von 5 bis 250 cm. Bei Geräten nach der Erfindung können zum Erreichen gleicher oder verbesserter Trennleistungen kürzere Kapillaren als bisher üblich einge­ setzt werden. Übliche Längen betragen bei der Erfindung 5 bis 50 cm. Auch an dieser Stelle zeigen sich die Vorteile der Erfindung.

Die Erfindung ist aber nicht auf die Verwendung von Quarz­ glaskapillaren beschränkt. Auch Polymerenkapillaren, wie bspw. Teflonkapillaren können verwendet werden.

Es ist zweckmäßig, wenn das Kapillarelektrophorese-Gerät eine Thermostatisiereinrichtung enthält. Dabei sind insbesondere die den Puffer oder die Probenlösung enthaltenden Teile des Geräts, also die Kapillare selbst und die Puffer-Reservoirs, thermostatisiert. Auf diese Weise lassen sich genaue, repro­ duzierbare Bestimmungen durchführen. Je nach verwendetem Puf­ fer wird die Temperatur bspw. zwischen Raumtemperatur und einer Temperatur von 80°C eingestellt. Diese Temperaturgren­ zen stellen aber keine zwingenden Werte dar. Es ist vorteil­ haft, wenn die Genauigkeit der Temperatureinstellung +/- 0,1°C, insbesondere +/- 0,01°C beträgt.

Prinzipiell können sämtliche Thermostatisiermethoden verwen­ det werden. So ist bspw. die Verwendung eines Ölbades mög­ lich. Bevorzugt ist es aber, wenn die Thermostatisierung ohne Verwendung einer Thermostatisierflüssigkeit erfolgt. Insbe­ sondere kann die Thermostatisierung durch Wärmeaustausch über eine Wärmeleitpaste, bspw. eine Schwermetalloxidpaste bewirkt werden. Eine weitere bevorzugte Möglichkeit liegt vor, wenn die Thermostatisierung mit Peltier-Elementen erfolgt. Mit solchen Elementen können die Kapillare und ggf. die Puffer- Reservoirs gekühlt oder beheizt werden.

Üblicherweise befinden sich die Kapillare und die Puffer- Reservoirs in einer flachen Kassette, in die die Kapillare mit unterschiedlichen Längen und Durchmessern aufgezogen werden kann. Auf diese Weise lassen sich die Kapillare und die Puffer-Reservoirs im Gerät einfach austauschen. Bei Verwendung einer solchen Kassette wird die gesamte Kassette flüssigkeitsfrei, insbesondere mit den Peltier-Elementen gekühlt oder beheizt. In diesen Fällen kann die Thermostati­ sierung durch Wärmeleitpaste und Peltier-Elemente kombiniert sein. Dann ist die Kapillare mit Wärmeleitmaterial umhüllt und/oder in der Kassette in das Wärmeleitmaterial eingebet­ tet. Die gesamte Kassette wird von außen angelegten Peltier- Elementen auf konstante Temperatur gebracht und gehalten.

Sämtliche bei der Kapillarelektrophorese üblichen Puffer können nach der Erfindung verwendet werden. Es handelt sich dabei um die klassischen Puffersubstanzen, die aus der Chemie und Biochemie bekannt sind, sowie um Polyelektrolyte und Gele, bei denen der elektrokinetische Fluß bspw. über die Viskosität gezielt gesteuert werden kann.

Auch das bei der Erfindung verwendete Hochspannungsteil ist bei der Kapillarelektrophorese bekannt und erzeugt Spannungen im Bereich von 1 bis 100 kV, insbesondere 1 bis 30 KV, wobei die fließenden Ströme üblicherweise bei 1 bis 1500 µA liegen.

Das erfindungsgemäße Kapillarelektrophorese-Gerät ist zur Trennung und zur Analyse ionischer und/oder nicht ionischer Verbindungen und Spezies anwendbar. Im Prinzip können alle Substanzen nachgewiesen werden, die im elektrischen Feld wandern oder durch geeignete Maßnahmen, wie bspw. Derivati­ sierung, zum Wandern gebracht werden können. Als Beispiele seien hier anorganische und organische Ionen, Zucker, Tenside usw. genannt. Vorzugsweise ist das Kapillarelektrophorese- Gerät zur Trennung und zur Analyse von biochemischen Spezies, insbesondere Biomakromolekülen, insbesondere von Aminosäuren, Peptiden und Proteinen geeignet. Diese und andere biochemi­ sche Spezies können in kleinen Mengen sowohl qualitativ als auch quantitativ nachgewiesen und bestimmt werden.

Es lassen sich alle aus der konventionellen Elektrophorese bekannten und auf die Kapillarelektrophorese übertragbaren Trennmechanismen durchführen. Diese Trennmechanismen sind dem Fachmann bekannt. Als Beispiele seien hier die Zonenelektro­ phorese, Zonenelektrophorese in Kombination mit Elektroendos­ mose (EEO), isoelektrische Fokussierung (IEF), micellare elektrokinetische Chromatographie, Isotachophorese und Poly­ acrylamid-Gel-Elektrophorese genannt.

Weiter betrifft die Erfindung die Verwendung der beanspruch­ ten Meßeinrichtung. Die Meßeinrichtung weist mindestens einen ortsauflösenden optischen Detektor, vorzugsweise eine Photo­ diodenzeile auf. Die Meßeinrichtung dient vorzugsweise zum Einsatz in der Chromatographie und dabei insbesondere zur Detektion von Brechzahländerungen in lichtdurchlässigen Ka­ pillaren. Dabei können die Brechzahländerungen bei kapillar­ elektrophoretischen Bestimmungen über die an der Kapillare hervorgerufenen Interferenzerscheinungen bestimmt werden.

Die beschriebenen Merkmale und weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von bevorzug­ ten Ausführungsformen in Verbindung mit den Unteransprüchen. Hierbei können die einzelnen Merkmale jeweils für sich oder zu mehreren in Kombination miteinander verwirklicht sein.

Die Zeichnung zeigt:

Fig. 1 den schematischen Aufbau eines Detektions­ systems nach der Erfindung.

In dem in Fig. 1 dargestellten Detektionssystem sind gleich­ zeitig Meßeinrichtungen zur interferometrischen Bestimmung der Brechzahländerung, zur Bestimmung der Lumineszenz und zur Bestimmung der Absorption vorhanden. Der Strahlengang ist schematisch durch gestrichelte Linien dargestellt. Von einer Lichtquelle 1 abgestrahltes Licht tritt durch einen halb­ durchlässigen Spiegel 2 hindurch und wird über eine geeignete Abbildungsoptik 3 auf die Kapillare 4 geführt. Das vom halb­ durchlässigen Spiegel 2 reflektierte Licht wird auf einen De­ tektor 5 zur Referenzmessung für die Absorption geführt. Im Strahlengang zwischen halbdurchlässigem Spiegel 2 und Kapil­ lare 4 befindet sich ggf. ein Polarisator 6 für die Messung des Zirkulardichroismus. Das von der Kapillare 4 austretende Licht wird inferometrisch, in Lumineszenz und in Absorption gemessen. Zur Lumineszenz-, insbesondere Fluoreszenzmessung wird das Licht über eine geeignete Abbildungsoptik 7 auf einen Lumineszenz-Detektor 8 geführt. Zur Absorptionsmessung wird das Licht über eine Abbildungsoptik 9 auf einen Absorp­ tionsdetektor 10 geführt. Insbesondere im Strahl zwischen Kapillare 4 und Absorptionsdetektor 10 befindet sich ggf. ein Analysator 11. Zur interferometrischen Messung wird das Licht über Spiegel 12 auf eine Diodenzeile 13 (Diodenarray) zur Bestimmung der Brechzahländerung geführt. Mit dem beschriebe­ nen Aufbau lassen sich die in der Beschreibung geschilderten Vorteile, die auf den Aufbau des Detektionssystems zurückzu­ führen sind, erhalten.

Claims (13)

1. Kapillarelektrophorese-Gerät mit mindestens

• - einer Kapillare und Puffer-Reservoirs, die ggf. mit geeigneten Puffern gefüllt sind,
• - einer Hochspannungsquelle,
• - einem Detektionssystem,
• - ggf. einem Computer zur Steuerung des Geräts und/oder zur Auswertung von Messungen, dadurch gekennzeichnet, daß das Detektionssystem eine interferometrische Meßeinrichtung umfaßt, die mindestens einen ortsauflösenden optischen Detektor aufweist.

2. Gerät nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Detektor eine Photodiodenzeile ist.

3. Gerät nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Meßeinrichtung mindestens eine Spie­ gelanordnung zur Positionierung der auszuwertenden Lichtstrahlen aufweist.

4. Gerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Detektionssystem Einrichtungen zur zusätzlichen Detektion von Lumineszenz, insbesondere Fluoreszenz, und/oder von Absorption aufweist.

5. Gerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine Optik zur Fokussierung der ein- und/oder ausfallenden Lichtstrahlen vorgesehen ist.

6. Gerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß im Strahlengang des einfallenden Lichtstrahls ein Polarisator und im Strahlengang des auszuwertenden Lichtstrahls ein Analysator vorgesehen ist.

7. Gerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Kapillare aus Quarzglas herge­ stellt ist.

8. Gerät nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Innenwand und/oder Außenwand der Kapillare beschichtet ist.

9. Gerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Länge der Kapillare zwischen 5 und 250 cm, insbesondere zwischen 5 und 50 cm beträgt.

10. Gerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Kapillare und die Puffer-Reser­ voirs mit einer Thermostatisierung versehen sind.

11. Gerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Thermostatisierung frei von Thermostatisierflüssigkeit ist.

12. Gerät nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß zur Kühlung oder Beheizung Peltier-Elemente vorge­ sehen sind.

13. Verwendung einer interferometrischen Meßeinrichtung, bei der zur Auswertung der Interferenzerscheinungen mindes­ tens ein ortsauflösender optischer Detektor, vorzugs­ weise eine Photodiodenzeile vorgesehen ist, zur Messung der Änderung des Brechungsindex in einer Kapillare.