DE4244825C2 - Verfahren zur Durchführung einer kapillarelektrophoretischen Bestimmung - Google Patents
Verfahren zur Durchführung einer kapillarelektrophoretischen BestimmungInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung einer
kapillarelektrophoretischen Bestimmung, bei dem mindestens
eines der beiden Enden der Kapillare mit Hilfe einer Pumpe,
insbesondere einer Spritzenpumpe, mit Druck beaufschlagbar
ist.
Die Kapillarelektrophorese hat in den letzten Jahren eine
immer größere Bedeutung als Trenn- und Analysemethode er
langt. Dies ist vor allem darauf zurückzuführen, daß die Be
stimmungen weitgehend automatisiert und geeignete Kapillaren
zur Verfügung gestellt werden konnten.
Bei der Kapillarelektrophorese tauchen die beiden Enden einer
mit einem geeigneten Puffer gefüllten Kapillare in zwei ge
trennte Puffer-Reservoirs. Die zwei Elektroden einer Hoch
spannungsquelle sind ebenfalls in jeweils eines der beiden
Puffer-Reservoirs geführt. Nach Anlegen der Hochspannung
wandern die zu detektierenden Spezies im elektrischen Feld
durch die Kapillare. Die Ladung oder das Ladung/Masse-Ver
hältnis der einzelnen Spezies bestimmt dabei ihre Wanderungs
geschwindigkeit. Ein Detektionssystem, das am Austrittsende
der Kapillare angeordnet ist, liefert ein auswertbares Sig
nal, das der Menge der detektierten Spezies proportional ist.
Ein ggf. vorhandener Computer kann den Verlauf der Messung
steuern und die erhaltenen Signale auswerten.
In der EP-A2-475 533 ist ein Verfahren und ein Gerät zur
Einbringung einer Probe in eine Kapillare unter Verwendung
einer Spritzenpumpe beschrieben. Die Frage der Verfahrensfüh
rung nach dem Einbringen der Probe ist in dieser Druckschrift
im einzelnen nicht beansprucht oder offenbart.
Die Erfindung stellt sich die Aufgabe, die Variationsmöglich
keiten bei einer kapillarelektrophoretischen Bestimmung zu
erhöhen. Insbesondere sollen dabei die Trennleistung und die
Empfindlichkeit verbessert werden.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren mit den Merkma
len des Anspruchs 1. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den
Unteransprüchen 2 bis 8 beschrieben. Der Inhalt sämtlicher
Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt dieser Be
schreibung gemacht.
Es kann ein Mikrodosiersystem für die Erzeugung insbesondere
geringer Druckunterschiede und/oder zur Förderung insbeson
dere kleiner Volumina vorgesehen sein. Durch das Mikrodosier
system ist ein direktes Aufbringen oder Einbringen kleiner
und kleinster Probenvolumina in die Kapillare möglich. Die
erhaltenen schmalen Startzonen bilden die Grundlage für ge
naue, reproduzierbare Bestimmungen. Durch das Mikrodosier
system kann der Puffer in einfacher Weise in die Kapillare
eingebracht und aus dieser entfernt werden. Ein einfaches
Spülen, Regenerieren und Äquilibrieren der Kapillare ist mög
lich. Während des Verlaufs der Bestimmung können nach der Er
findung auf die beiden Seiten der Kapillare wahlweise ver
schiedene Druckdifferenzen aufgebracht werden, die die Be
stimmung beschleunigen, verlangsamen oder abbrechen können.
Dies wird später noch näher erläutert. Damit werden Trenn
leistung und Empfindlichkeit entscheidend verbessert. Es
können verschiedene Spezies gezielt einzeln oder in Gruppen
an der Detektionsstelle vorbeigeführt werden. Die Empfind
lichkeit und Reproduzierbarkeit der Bestimmung wird dadurch
wesentlich verbessert.
Das genannte Mikrodosiersystem enthält vorzugsweise mindes
tens eine Pumpe und mindestens einen Druckteiler. Bei der
Pumpe kann es sich um eine Spritzenpumpe handeln. Der Druck
teiler kann in Form eines Ausgleichsgefäßes vorliegen. Durch
die Kombination Pumpe - Druckteiler lassen sich die bspw.
durch den Kolbenvorschub in der Pumpe erzeugten Drucke auf
die bei der Kapillarelektrophorese vorteilhaften Werte redu
zieren. Weiter kann das Mikrodosiersystem übliche Ventile
aufweisen.
Es ist vorteilhaft, wenn das Mikrodosiersystem so ausgelegt
ist, daß minimale Druckunterschiede von 0,01 bis 1000, insbe
sondere 250 mbar erzeugt werden können. Die Pumpe kann auch
in der Lage sein, größere Druckunterschiede bis 5 bar oder
mehr zu erzeugen, was bspw. dann von Vorteil ist, wenn die
Kapillare gespült wird. Je nach verwendetem Puffersystem
können die aufgebrachten Drucke verschiedenen Verdrängungsvo
lumina entsprechen. Die (Verdrängungs)Volumina liegen zwi
schen 0,01 und 5000 µl, insbesondere zwischen 0,01 und 10 µl.
Mit dem Mikrodosiersystem ist es möglich, Flüsse unterhalb
des µl/min-Bereichs zu fördern. Üblicherweise förderbare
Flüsse (aus einem Vorratsgefäß in die Kapillare oder inner
halb der Kapillare) liegen zwischen 0,1 nl/min und 10 µl/min,
wobei ein Bereich zwischen 0,1 nl/min und 150 nl/min bevor
zugt ist. Es sind sogar Flüsse im Picoliter/min-Bereich er
reichbar.
Zweckmäßig wird der Kolben der (Mikro)Pumpe mit einem
Schrittmotor bewegt, um die Volumina in definierter Menge zu
fördern. Dabei können insbesondere 0,1 Nanoliter bis 1 Mikro
liter pro Schritt des Schrittmotors gefördert werden.
Es ist bevorzugt, wenn ein das erfindungsgemäße Verfahren
durchführendes Gerät mit Hilfe eines Computers, insbesondere
eines Mikrocomputers, gesteuert wird. Dieser Mikrocomputer
kann gleichzeitig zur Auswertung der Messungen dienen. Ein
computergesteuertes Kapillarelektrophorese-Gerät hat den
Vorteil, daß ein einmal eingestellter Ablauf der Bestimmung
routinemäßig immer wieder wiederholt werden kann. Auch ein
bestimmter Ablauf verschiedener Messungen kann vorprogram
miert werden. Dies führt dazu, daß mit Hilfe des Geräts
elektrophoretische Messungen bspw. über Nacht unter reprodu
zierbaren Bedingungen durchgeführt werden können. Zu diesem
Zweck kann das Gerät ggf. mit einem geeigneten Probenwechsler
ausgerüstet sein.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es vorteilhaft, wenn
die Probe, d. h. das Probenvolumen, mit Hilfe des Mikrodosier
systems direkt in die Kapillare eingebracht wird. Auf diese
Weise können kleine und kleinste Probenmengen zuverlässig
auf die Kapillare aufgebracht und damit schmale Startzonen
gewährleistet werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann so durchgeführt werden,
daß ein Überdruck in elektrokinetischer Fließrichtung aufge
bracht wird. Dieser Druck kann zwischen 0,1 und einigen
Hundert mbar oder mehr betragen. Auf diese Weise kann eine
kapillarelektrophoretische Bestimmung beschleunigt oder
abgebrochen werden, so daß die Gesamtzeit der Bestimmung
verringert wird. Es ist ebenfalls möglich die Bestimmung zu
verlangsamen oder abzubrechen, indem ein Überdruck in Gegen
richtung zur elektrokinetischen Fließrichtung aufgebracht
wird. Auch hier liegen die Druckwerte im bereits angegebenen
Bereich. Außerdem ist es in vorteilhafter Weise möglich,
einem ggf. vorhandenen, beispielsweise paraboloiden Strö
mungsprofil in elektrokinetischer Fließrichtung ein entspre
chendes "umgekehrtes" Druckprofil in entgegengesetzter Rich
tung zu überlagern. Auf diese Weise können die Banden der
einzelnen Spezies zusammengezogen und damit die Genauigkeit
der Bestimmung erhöht werden. Die bereits geschilderten Vor
teile durch Aufbringen eines Druckes in Fließrichtung oder
entgegensetzt der Fließrichtung können auch durch einmaliges
oder mehrmaliges Umpolen der Hochspannung während der Bestim
mung ergänzt werden.
Selbstverständlich können die verschiedenen Maßnahmen mitein
ander kombiniert werden, so daß je nach geplanter Bestimmung
ein optimales Ergebnis mit der geforderten Trennleistung er
reicht werden kann. So kann die Messung beliebig verlangsamt
und beschleunigt werden, um bestimmte Spezies entweder ein
zeln oder in Gruppen langsam oder schnell definiert an der
Detektionsstelle vorbeizuführen. Damit lassen sich Trennung
und Analyse der Spezies genau und reproduzierbar durchfüh
ren. So lassen sich bspw. Anionen und Kationen gleichzeitig
in einer Messung bestimmen. Beispielsweise kann die eigent
lich von der Nachweisstelle wegwandernde Ionenart durch An
legen eines entgegengesetzten Druckes aufgehalten und in
Richtung auf die Detektionsstelle in Bewegung gesetzt werden.
In solchen Fällen wird die Trennung durch das angelegte elek
trische Feld und das Vorbeiführen an der Detektionsstelle
durch den aufgebrachten Druckunterschied bewirkt.
Bei dem beschriebenen Verfahren erfolgt eine Verbesserung von
Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Bestimmung über die
Variation eines Druckes der auf eines der beiden Enden der
Kapillare aufgebracht wird. Bei bisher bekannten kapillar
elektrophoretischen Verfahren war eine Variation des verwen
deten Puffers als Ansatzpunkt für solche Verbesserungen be
kannt.
Die beschriebenen Merkmale und weitere Merkmale der Erfindung
ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von bevorzug
ten Ausführungsformen in Verbindung mit den Unteransprüchen.
Hierbei können die einzelnen Merkmale jeweils für sich oder
zu mehreren in Kombination miteinander verwirklicht sein.
Die Zeichnungen zeigen:
Fig. 1 den schematischen Aufbau eines Detektions
systems nach der Erfindung,
Fig. 2 die Schnittansicht einer Pumpe wie sie in
einem beschriebenen Mikrodosiersystem verwen
det wird, und
Fig. 3 die Darstellung von Detektionskurven, wie sie
bei Beispielmessungen erhalten werden.
In dem in Fig. 1 dargestellten Detektionssystem sind gleich
zeitig Meßeinrichtungen zur interferometrischen Bestimmung
der Brechzahländerung, zur Bestimmung der Lumineszenz und zur
Bestimmung der Absorption vorhanden. Der Strahlengang ist
schematisch durch gestrichelte Linien dargestellt. Von einer
Lichtquelle 1 abgestrahltes Licht tritt durch einen halb
durchlässigen Spiegel 2 hindurch und wird über eine geeignete
Abbildungsoptik 3 auf die Kapillare 4 geführt. Das vom halb
durchlässigen Spiegel 2 reflektierte Licht wird auf einen De
tektor 5 zur Referenzmessung für die Absorption geführt. Im
Strahlengang zwischen halbdurchlässigem Spiegel 2 und Kapil
lare 4 befindet sich ggf. ein Polarisator 6 für die Messung
des Zirkulardichroismus. Das von der Kapillare 4 austretende
Licht wird inferometrisch, in Lumineszenz und in Absorption
gemessen. Zur Lumineszenz-, insbesondere Fluoreszenzmessung
wird das Licht über eine geeignete Abbildungsoptik 7 auf
einen Lumineszenz-Detektor 8 geführt. Zur Absorptionsmessung
wird das Licht über eine Abbildungsoptik 9 auf einen Absorp
tionsdetektor 10 geführt. Insbesondere im Strahl zwischen
Kapillare 4 und Absorptionsdetektor 10 befindet sich ggf. ein
Analysator 11. Zur interferometrischen Messung wird das Licht
über Spiegel 12 auf eine Diodenzeile 13 (Diodenarray) zur Be
stimmung der Brechzahländerung geführt. Mit dem beschriebenen
Aufbau lassen sich die in der Beschreibung geschilderten Vor
teile, die auf den Aufbau des Detektionssystems zurückzufüh
ren sind, erhalten.
In Fig. 2 ist die Schnittzeichnung einer Mikropumpe darge
stellt, wie sie bei der Erfindung verwendet werden kann. Die
Pumpe besitzt einen im Prinzip bekannten Aufbau, wobei sie
jedoch so konstruiert ist, daß die bei der Kapillarelektro
phorese erforderlichen geringen Druckunterschiede aufgebaut
werden können.
Die Pumpe besitzt einen Kolben 21, der über eine Spindel 22
von einem in Fig. 2 nicht dargestellten Schrittmotor bewegt
wird. Zur Stabilisierung sind Führungsstäbe 23 vorgesehen.
Zur Abdichtung dienen Dichtungen 24. An der Austrittsseite
der Pumpe sind Aufnahmen 25 vorgesehen, die mit geeigneten
Ventilen (nicht dargestellt) verbunden werden können. Über
diese Ventile können die Aufnahmen mit Ausgleichsgefäßen und
den Puffer-Reservoirs verbunden sein. So können bspw. zwei
der drei in Fig. 2 dargestellten Aufnahmen 25 über zwei Ven
tile mit zwei Ausgleichsgefäßen, die eine unterschiedliche
Größe besitzen können, verbunden sein. Die dritte Aufnahme 25
ist mit den Puffer-Reservoirs verbunden. Zweckmäßig ist diese
Aufnahme 25 mit beiden Puffer-Reservoirs verbindbar, so daß
beide Seiten der Kapillare (getrennt oder gleichzeitig) be
aufschlagt werden können. Die Verbindung mit beiden Reser
voirs wird über eine Verzweigung erreicht, wobei sich in den
beiden Zuleitungen zu den Puffer-Reservoirs jeweils mindes
tens ein Ventil befindet, um die beiden Seiten der Kapillare
getrennt mit Druck beaufschlagen zu können. Dadurch lassen
sich die bereits beschriebenen Verfahrensweisen auf einfache
Weise realisieren.
Ein Kapillarelektrophorese-Gerät gemäß der Erfindung weist
eine Kapillare von 75 µm × 40 cm effektiver Länge sowie zwei
Puffer-Reservoirs auf. Die Kapillare und die Puffer-Reser
voirs sind mit Borsäure-Puffer (45 mmol/l) gefüllt, der mit
Kaliumhydroxid auf einen pH-Wert von 8 eingestellt ist. In
die Puffer-Reservoirs tauchen zwei Elektroden, die mit einer
Hochspannungsquelle verbunden sind. Während der folgenden
Messung wird eine Hochspannung von 25 kV angelegt. Weiter
weist das Gerät ein Detektionssystem auf, das u. a. zur Be
stimmung der Fluoreszenz geeignet ist. Bei der Messung wurde
die Fluoreszenz bei Wellenlängen von 360 und 450 nm bestimmt.
Ein Computer diente zur Steuerung des Geräts und zur Auswer
tung der Messungen.
Ein Gemisch der Aminosäuren Lysin, Glycin und Glutaminsäure
wurde auf der Anodenseite der Kapillare entweder mit dem be
schriebenen Mikrodosiersystem oder durch elektrokinetische
Beladung auf die Kapillare aufgebracht. Durch die angelegte
Hochspannung wurden die Aminosäuren voneinander getrennt und
an der Detektionsstelle durch eine Fluoreszenzmessung nachge
wiesen.
In Fig. 3 sind die Meßkurven dargestellt, die bei Anlegen
verschiedener Drucke erhalten werden. Dabei bedeuten positive
Druckwerte ein Anlegen des Druckes an der Kathodenseite der
Kapillare, negative Druckwerte ein Anlegen des Druckes an der
Anodenseite der Kapillare. Es ist deutlich zu erkennen, daß
durch Variation des Druckes die Auftrennung der Aminosäuren
beeinflußt werden kann. Wichtig ist, nicht nur eine Auftren
nung der einzelnen Peaks, sondern auch möglichst scharfe
Peaks für die quantitative Bestimmung zu erhalten. So bringt
bspw. gemäß Fig. 3 die Messung bei einem Druck von +100 mbar
das am besten auswertbare Meßergebnis. Bei anderen Trennungen
können andere Druckwerte oder eine andere Verfahrensführung
vorteilhaft sein. Ist einmal ein "optimaler" Verlauf der Mes
sung bekannt, so kann dieser Ablauf im Computer gespeichert
und bei späteren Bestimmungen immer wieder abgerufen werden.
Claims (8)
1. Verfahren zur Durchführung einer kapillarelektrophoreti
schen Bestimmung, bei dem mindestens eines der beiden
Enden der Kapillare mit Hilfe einer Pumpe, insbesondere
einer Spritzenpumpe, mit Druck beaufschlagbar ist, da
durch gekennzeichnet, daß die Bestimmung durch Aufgabe
des Druckes beschleunigt, verlangsamt oder abgebrochen
wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
beide Enden der Kapillare mit Druck beaufschlagbar sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich
net, daß ein Druck in elektrokinetischer Fließrichtung
aufgegeben, insbesondere die Bestimmung dadurch be
schleunigt oder abgebrochen wird.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da
durch gekennzeichnet, daß ein Druck in Gegenrichtung
zur elektrokinetischen Fließrichtung aufgegeben, insbe
sondere die Bestimmung dadurch verlangsamt oder unter
brochen bzw. abgebrochen wird.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da
durch gekennzeichnet, daß ein Druck zwischen 0,1 und
einigen Hundert mbar aufgegeben wird.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da
durch gekennzeichnet, daß bei der Bestimmung ein Strö
mungsprofil durch entgegengesetzte Überlagerung eines
entsprechenden Profils kompensiert wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß
ein paraboloides Strömungsprofil aufgebaut wird.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da
durch gekennzeichnet, daß während der Bestimmung die
angelegte Spannung mindestens einmal umgepolt wird.
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