DE4244825C2 - Verfahren zur Durchführung einer kapillarelektrophoretischen Bestimmung - Google Patents

Verfahren zur Durchführung einer kapillarelektrophoretischen Bestimmung

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung einer kapillarelektrophoretischen Bestimmung, bei dem mindestens eines der beiden Enden der Kapillare mit Hilfe einer Pumpe, insbesondere einer Spritzenpumpe, mit Druck beaufschlagbar ist.
Die Kapillarelektrophorese hat in den letzten Jahren eine immer größere Bedeutung als Trenn- und Analysemethode er­ langt. Dies ist vor allem darauf zurückzuführen, daß die Be­ stimmungen weitgehend automatisiert und geeignete Kapillaren zur Verfügung gestellt werden konnten.
Bei der Kapillarelektrophorese tauchen die beiden Enden einer mit einem geeigneten Puffer gefüllten Kapillare in zwei ge­ trennte Puffer-Reservoirs. Die zwei Elektroden einer Hoch­ spannungsquelle sind ebenfalls in jeweils eines der beiden Puffer-Reservoirs geführt. Nach Anlegen der Hochspannung wandern die zu detektierenden Spezies im elektrischen Feld durch die Kapillare. Die Ladung oder das Ladung/Masse-Ver­ hältnis der einzelnen Spezies bestimmt dabei ihre Wanderungs­ geschwindigkeit. Ein Detektionssystem, das am Austrittsende der Kapillare angeordnet ist, liefert ein auswertbares Sig­ nal, das der Menge der detektierten Spezies proportional ist. Ein ggf. vorhandener Computer kann den Verlauf der Messung steuern und die erhaltenen Signale auswerten.
In der EP-A2-475 533 ist ein Verfahren und ein Gerät zur Einbringung einer Probe in eine Kapillare unter Verwendung einer Spritzenpumpe beschrieben. Die Frage der Verfahrensfüh­ rung nach dem Einbringen der Probe ist in dieser Druckschrift im einzelnen nicht beansprucht oder offenbart.
Die Erfindung stellt sich die Aufgabe, die Variationsmöglich­ keiten bei einer kapillarelektrophoretischen Bestimmung zu erhöhen. Insbesondere sollen dabei die Trennleistung und die Empfindlichkeit verbessert werden.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren mit den Merkma­ len des Anspruchs 1. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen 2 bis 8 beschrieben. Der Inhalt sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt dieser Be­ schreibung gemacht.
Es kann ein Mikrodosiersystem für die Erzeugung insbesondere geringer Druckunterschiede und/oder zur Förderung insbeson­ dere kleiner Volumina vorgesehen sein. Durch das Mikrodosier­ system ist ein direktes Aufbringen oder Einbringen kleiner und kleinster Probenvolumina in die Kapillare möglich. Die erhaltenen schmalen Startzonen bilden die Grundlage für ge­ naue, reproduzierbare Bestimmungen. Durch das Mikrodosier­ system kann der Puffer in einfacher Weise in die Kapillare eingebracht und aus dieser entfernt werden. Ein einfaches Spülen, Regenerieren und Äquilibrieren der Kapillare ist mög­ lich. Während des Verlaufs der Bestimmung können nach der Er­ findung auf die beiden Seiten der Kapillare wahlweise ver­ schiedene Druckdifferenzen aufgebracht werden, die die Be­ stimmung beschleunigen, verlangsamen oder abbrechen können. Dies wird später noch näher erläutert. Damit werden Trenn­ leistung und Empfindlichkeit entscheidend verbessert. Es können verschiedene Spezies gezielt einzeln oder in Gruppen an der Detektionsstelle vorbeigeführt werden. Die Empfind­ lichkeit und Reproduzierbarkeit der Bestimmung wird dadurch wesentlich verbessert.
Das genannte Mikrodosiersystem enthält vorzugsweise mindes­ tens eine Pumpe und mindestens einen Druckteiler. Bei der Pumpe kann es sich um eine Spritzenpumpe handeln. Der Druck­ teiler kann in Form eines Ausgleichsgefäßes vorliegen. Durch die Kombination Pumpe - Druckteiler lassen sich die bspw. durch den Kolbenvorschub in der Pumpe erzeugten Drucke auf die bei der Kapillarelektrophorese vorteilhaften Werte redu­ zieren. Weiter kann das Mikrodosiersystem übliche Ventile aufweisen.
Es ist vorteilhaft, wenn das Mikrodosiersystem so ausgelegt ist, daß minimale Druckunterschiede von 0,01 bis 1000, insbe­ sondere 250 mbar erzeugt werden können. Die Pumpe kann auch in der Lage sein, größere Druckunterschiede bis 5 bar oder mehr zu erzeugen, was bspw. dann von Vorteil ist, wenn die Kapillare gespült wird. Je nach verwendetem Puffersystem können die aufgebrachten Drucke verschiedenen Verdrängungsvo­ lumina entsprechen. Die (Verdrängungs)Volumina liegen zwi­ schen 0,01 und 5000 µl, insbesondere zwischen 0,01 und 10 µl. Mit dem Mikrodosiersystem ist es möglich, Flüsse unterhalb des µl/min-Bereichs zu fördern. Üblicherweise förderbare Flüsse (aus einem Vorratsgefäß in die Kapillare oder inner­ halb der Kapillare) liegen zwischen 0,1 nl/min und 10 µl/min, wobei ein Bereich zwischen 0,1 nl/min und 150 nl/min bevor­ zugt ist. Es sind sogar Flüsse im Picoliter/min-Bereich er­ reichbar.
Zweckmäßig wird der Kolben der (Mikro)Pumpe mit einem Schrittmotor bewegt, um die Volumina in definierter Menge zu fördern. Dabei können insbesondere 0,1 Nanoliter bis 1 Mikro­ liter pro Schritt des Schrittmotors gefördert werden.
Es ist bevorzugt, wenn ein das erfindungsgemäße Verfahren durchführendes Gerät mit Hilfe eines Computers, insbesondere eines Mikrocomputers, gesteuert wird. Dieser Mikrocomputer kann gleichzeitig zur Auswertung der Messungen dienen. Ein computergesteuertes Kapillarelektrophorese-Gerät hat den Vorteil, daß ein einmal eingestellter Ablauf der Bestimmung routinemäßig immer wieder wiederholt werden kann. Auch ein bestimmter Ablauf verschiedener Messungen kann vorprogram­ miert werden. Dies führt dazu, daß mit Hilfe des Geräts elektrophoretische Messungen bspw. über Nacht unter reprodu­ zierbaren Bedingungen durchgeführt werden können. Zu diesem Zweck kann das Gerät ggf. mit einem geeigneten Probenwechsler ausgerüstet sein.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es vorteilhaft, wenn die Probe, d. h. das Probenvolumen, mit Hilfe des Mikrodosier­ systems direkt in die Kapillare eingebracht wird. Auf diese Weise können kleine und kleinste Probenmengen zuverlässig auf die Kapillare aufgebracht und damit schmale Startzonen gewährleistet werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann so durchgeführt werden, daß ein Überdruck in elektrokinetischer Fließrichtung aufge­ bracht wird. Dieser Druck kann zwischen 0,1 und einigen Hundert mbar oder mehr betragen. Auf diese Weise kann eine kapillarelektrophoretische Bestimmung beschleunigt oder abgebrochen werden, so daß die Gesamtzeit der Bestimmung verringert wird. Es ist ebenfalls möglich die Bestimmung zu verlangsamen oder abzubrechen, indem ein Überdruck in Gegen­ richtung zur elektrokinetischen Fließrichtung aufgebracht wird. Auch hier liegen die Druckwerte im bereits angegebenen Bereich. Außerdem ist es in vorteilhafter Weise möglich, einem ggf. vorhandenen, beispielsweise paraboloiden Strö­ mungsprofil in elektrokinetischer Fließrichtung ein entspre­ chendes "umgekehrtes" Druckprofil in entgegengesetzter Rich­ tung zu überlagern. Auf diese Weise können die Banden der einzelnen Spezies zusammengezogen und damit die Genauigkeit der Bestimmung erhöht werden. Die bereits geschilderten Vor­ teile durch Aufbringen eines Druckes in Fließrichtung oder entgegensetzt der Fließrichtung können auch durch einmaliges oder mehrmaliges Umpolen der Hochspannung während der Bestim­ mung ergänzt werden.
Selbstverständlich können die verschiedenen Maßnahmen mitein­ ander kombiniert werden, so daß je nach geplanter Bestimmung ein optimales Ergebnis mit der geforderten Trennleistung er­ reicht werden kann. So kann die Messung beliebig verlangsamt und beschleunigt werden, um bestimmte Spezies entweder ein­ zeln oder in Gruppen langsam oder schnell definiert an der Detektionsstelle vorbeizuführen. Damit lassen sich Trennung und Analyse der Spezies genau und reproduzierbar durchfüh­ ren. So lassen sich bspw. Anionen und Kationen gleichzeitig in einer Messung bestimmen. Beispielsweise kann die eigent­ lich von der Nachweisstelle wegwandernde Ionenart durch An­ legen eines entgegengesetzten Druckes aufgehalten und in Richtung auf die Detektionsstelle in Bewegung gesetzt werden. In solchen Fällen wird die Trennung durch das angelegte elek­ trische Feld und das Vorbeiführen an der Detektionsstelle durch den aufgebrachten Druckunterschied bewirkt.
Bei dem beschriebenen Verfahren erfolgt eine Verbesserung von Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Bestimmung über die Variation eines Druckes der auf eines der beiden Enden der Kapillare aufgebracht wird. Bei bisher bekannten kapillar­ elektrophoretischen Verfahren war eine Variation des verwen­ deten Puffers als Ansatzpunkt für solche Verbesserungen be­ kannt.
Die beschriebenen Merkmale und weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von bevorzug­ ten Ausführungsformen in Verbindung mit den Unteransprüchen. Hierbei können die einzelnen Merkmale jeweils für sich oder zu mehreren in Kombination miteinander verwirklicht sein.
Die Zeichnungen zeigen:
Fig. 1 den schematischen Aufbau eines Detektions­ systems nach der Erfindung,
Fig. 2 die Schnittansicht einer Pumpe wie sie in einem beschriebenen Mikrodosiersystem verwen­ det wird, und
Fig. 3 die Darstellung von Detektionskurven, wie sie bei Beispielmessungen erhalten werden.
In dem in Fig. 1 dargestellten Detektionssystem sind gleich­ zeitig Meßeinrichtungen zur interferometrischen Bestimmung der Brechzahländerung, zur Bestimmung der Lumineszenz und zur Bestimmung der Absorption vorhanden. Der Strahlengang ist schematisch durch gestrichelte Linien dargestellt. Von einer Lichtquelle 1 abgestrahltes Licht tritt durch einen halb­ durchlässigen Spiegel 2 hindurch und wird über eine geeignete Abbildungsoptik 3 auf die Kapillare 4 geführt. Das vom halb­ durchlässigen Spiegel 2 reflektierte Licht wird auf einen De­ tektor 5 zur Referenzmessung für die Absorption geführt. Im Strahlengang zwischen halbdurchlässigem Spiegel 2 und Kapil­ lare 4 befindet sich ggf. ein Polarisator 6 für die Messung des Zirkulardichroismus. Das von der Kapillare 4 austretende Licht wird inferometrisch, in Lumineszenz und in Absorption gemessen. Zur Lumineszenz-, insbesondere Fluoreszenzmessung wird das Licht über eine geeignete Abbildungsoptik 7 auf einen Lumineszenz-Detektor 8 geführt. Zur Absorptionsmessung wird das Licht über eine Abbildungsoptik 9 auf einen Absorp­ tionsdetektor 10 geführt. Insbesondere im Strahl zwischen Kapillare 4 und Absorptionsdetektor 10 befindet sich ggf. ein Analysator 11. Zur interferometrischen Messung wird das Licht über Spiegel 12 auf eine Diodenzeile 13 (Diodenarray) zur Be­ stimmung der Brechzahländerung geführt. Mit dem beschriebenen Aufbau lassen sich die in der Beschreibung geschilderten Vor­ teile, die auf den Aufbau des Detektionssystems zurückzufüh­ ren sind, erhalten.
In Fig. 2 ist die Schnittzeichnung einer Mikropumpe darge­ stellt, wie sie bei der Erfindung verwendet werden kann. Die Pumpe besitzt einen im Prinzip bekannten Aufbau, wobei sie jedoch so konstruiert ist, daß die bei der Kapillarelektro­ phorese erforderlichen geringen Druckunterschiede aufgebaut werden können.
Die Pumpe besitzt einen Kolben 21, der über eine Spindel 22 von einem in Fig. 2 nicht dargestellten Schrittmotor bewegt wird. Zur Stabilisierung sind Führungsstäbe 23 vorgesehen. Zur Abdichtung dienen Dichtungen 24. An der Austrittsseite der Pumpe sind Aufnahmen 25 vorgesehen, die mit geeigneten Ventilen (nicht dargestellt) verbunden werden können. Über diese Ventile können die Aufnahmen mit Ausgleichsgefäßen und den Puffer-Reservoirs verbunden sein. So können bspw. zwei der drei in Fig. 2 dargestellten Aufnahmen 25 über zwei Ven­ tile mit zwei Ausgleichsgefäßen, die eine unterschiedliche Größe besitzen können, verbunden sein. Die dritte Aufnahme 25 ist mit den Puffer-Reservoirs verbunden. Zweckmäßig ist diese Aufnahme 25 mit beiden Puffer-Reservoirs verbindbar, so daß beide Seiten der Kapillare (getrennt oder gleichzeitig) be­ aufschlagt werden können. Die Verbindung mit beiden Reser­ voirs wird über eine Verzweigung erreicht, wobei sich in den beiden Zuleitungen zu den Puffer-Reservoirs jeweils mindes­ tens ein Ventil befindet, um die beiden Seiten der Kapillare getrennt mit Druck beaufschlagen zu können. Dadurch lassen sich die bereits beschriebenen Verfahrensweisen auf einfache Weise realisieren.
Beispiel
Ein Kapillarelektrophorese-Gerät gemäß der Erfindung weist eine Kapillare von 75 µm × 40 cm effektiver Länge sowie zwei Puffer-Reservoirs auf. Die Kapillare und die Puffer-Reser­ voirs sind mit Borsäure-Puffer (45 mmol/l) gefüllt, der mit Kaliumhydroxid auf einen pH-Wert von 8 eingestellt ist. In die Puffer-Reservoirs tauchen zwei Elektroden, die mit einer Hochspannungsquelle verbunden sind. Während der folgenden Messung wird eine Hochspannung von 25 kV angelegt. Weiter weist das Gerät ein Detektionssystem auf, das u. a. zur Be­ stimmung der Fluoreszenz geeignet ist. Bei der Messung wurde die Fluoreszenz bei Wellenlängen von 360 und 450 nm bestimmt. Ein Computer diente zur Steuerung des Geräts und zur Auswer­ tung der Messungen.
Ein Gemisch der Aminosäuren Lysin, Glycin und Glutaminsäure wurde auf der Anodenseite der Kapillare entweder mit dem be­ schriebenen Mikrodosiersystem oder durch elektrokinetische Beladung auf die Kapillare aufgebracht. Durch die angelegte Hochspannung wurden die Aminosäuren voneinander getrennt und an der Detektionsstelle durch eine Fluoreszenzmessung nachge­ wiesen.
In Fig. 3 sind die Meßkurven dargestellt, die bei Anlegen verschiedener Drucke erhalten werden. Dabei bedeuten positive Druckwerte ein Anlegen des Druckes an der Kathodenseite der Kapillare, negative Druckwerte ein Anlegen des Druckes an der Anodenseite der Kapillare. Es ist deutlich zu erkennen, daß durch Variation des Druckes die Auftrennung der Aminosäuren beeinflußt werden kann. Wichtig ist, nicht nur eine Auftren­ nung der einzelnen Peaks, sondern auch möglichst scharfe Peaks für die quantitative Bestimmung zu erhalten. So bringt bspw. gemäß Fig. 3 die Messung bei einem Druck von +100 mbar das am besten auswertbare Meßergebnis. Bei anderen Trennungen können andere Druckwerte oder eine andere Verfahrensführung vorteilhaft sein. Ist einmal ein "optimaler" Verlauf der Mes­ sung bekannt, so kann dieser Ablauf im Computer gespeichert und bei späteren Bestimmungen immer wieder abgerufen werden.

Claims (8)

1. Verfahren zur Durchführung einer kapillarelektrophoreti­ schen Bestimmung, bei dem mindestens eines der beiden Enden der Kapillare mit Hilfe einer Pumpe, insbesondere einer Spritzenpumpe, mit Druck beaufschlagbar ist, da­ durch gekennzeichnet, daß die Bestimmung durch Aufgabe des Druckes beschleunigt, verlangsamt oder abgebrochen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß beide Enden der Kapillare mit Druck beaufschlagbar sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich­ net, daß ein Druck in elektrokinetischer Fließrichtung aufgegeben, insbesondere die Bestimmung dadurch be­ schleunigt oder abgebrochen wird.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da­ durch gekennzeichnet, daß ein Druck in Gegenrichtung zur elektrokinetischen Fließrichtung aufgegeben, insbe­ sondere die Bestimmung dadurch verlangsamt oder unter­ brochen bzw. abgebrochen wird.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da­ durch gekennzeichnet, daß ein Druck zwischen 0,1 und einigen Hundert mbar aufgegeben wird.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da­ durch gekennzeichnet, daß bei der Bestimmung ein Strö­ mungsprofil durch entgegengesetzte Überlagerung eines entsprechenden Profils kompensiert wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß ein paraboloides Strömungsprofil aufgebaut wird.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da­ durch gekennzeichnet, daß während der Bestimmung die angelegte Spannung mindestens einmal umgepolt wird.
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