DE19612877C1 - Totalreflexions-Meßzelle zur Untersuchung von einer auf einem ATR-Kristall adsorbierten Materialschicht - Google Patents

Description

Beschreibung

Es ist bekannt, daß stark absorbierende Materialien, statt durchleuchtet zu werden, besser auf ihre Absorptionseigenschaften hin untersucht werden können, wenn sie in engem Kontakt mit einem für das Meßlicht transparenten Körper (im Folgenden als ATR-Kristall bezeichnet) stehen, in dessen Inneren der Meßstrahl durch Totalreflexion zwischen glatten Oberflächen weitergeleitet wird (Harrick, N.J., 1967, "Internal reflection spectroscopy", Harrick Scientific Corporation, 88 Broadway, Box 1288, Ossining, New York 19562). Bei jedem Oberflächenkontakt erfolgt teilweise Meßlichtabsorption durch die zu untersuchende, auf den ATR- Kristall adsorbierte Materialschicht. Wegen der bei Totalreflexion gewährleisteten geringen Eindringtiefe des Meßstrahls in die Probenschicht ist eine geringe Absorption gewährleistet, so daß es nicht wie bei der sonst üblichen direkten Durchleuchtung zur völligen Löschung des Meßlichts kommt. Entsprechend ist im Falle fluoreszenzspektroskopischer Anwendungen das Anregungslicht auf die Grenzschicht zwischen Kristall und Lösungsvolumen beschränkbar. Das aufgrund des größeren Abstandes von der ATR-Kristalloberfläche nicht vom Meßlicht erfaßte Probenvolumen wird im folgenden als spektroskopisches Totvolumen bezeichnet.

In Kombination mit Oberflächenmodifikationen der ATR-Kristalloberfläche können gelöste Substanzen aufgrund ihrer spezifischen Reaktionen in einer definierten Materialschicht im Kontaktbereich zwischen Kristall und Lösung optisch detektiert werden (Yang, L. and Saavedra, S.S., 1995, Anal. Chem. Vol. 67, S. 1307-1314). Bei Messungen im Infrarot kann aus der Absorption der in die Materialschicht einwandernden Substanz auf ihr Verhalten in der Materialschicht geschlossen werden (Tóth, K. et al., 1988, Fresenius Z. Anal. Chem. Vol. 331, S. 448-453).

Ursprünglich für physikalische Fragestellungen entwickelt, wird diese Meßmethode zunehmend auf biologische Materialien angewandt (z. B. Tamm, L.K. and Tatulian, S.A., 1993, Biochemistry Vol. 32, S. 7720-7726). Insbesondere bei Infrarotabsorptionsmessungen wirkt das für den Erhalt der Funktion vieler Biomoleküle nötige Wasser als starker Absorber, so daß auch hier die Durchleuchtung mit Infrarotstrahlung problematisch ist. Verschiedene Methoden sind beschrieben worden, um Biomoleküle effektiv an ATR-Kristalle zu adsorbieren und dann mit wäßrigen Lösungen zu überschichten, die den biologischen Erfordernissen entsprechend zusammengesetzt sind (Blodget, K.B., and Langmuir, I., 1937, Phys. Rev. Vol. 51, S. 964-982; Kopp, F. et al., 1975, Biophys. Struct. Mech. Vol. 1, S. 75-96; Frey, S., and Tamm, L.K., 1991, Biophys. J. Vol. 60, S. 922-930; Kalb, E. et al., 1992, Biochim. Biophys. Acta Vol. 1103, S. 307-316). Solche Systeme sind besonders geeignet, die Bindung von spezifischen Liganden, wie Hormonen oder Antigenen an ihre jeweiligen, an der ATR-Kristalloberfläche adsorbierten Rezeptoren zu charakterisieren.

Da die Effizienz der ATR-Meßtechnik auf der spezifischen Anreicherung einer gelösten Stoffkomponente in der am ATR-Kristall adsorbierten Materialschicht beruht, sind Methoden beschrieben, die eine Konzentrationssteigerung der zu detektierenden Substanzen an der ATR-Kristalloberfläche bewirken. Dies kann durch thermische Gradienten an der ATR-Kristalloberfläche erreicht werden, wobei zusätzlich die Filterwirkung einer zwischen Lösung und ATR-Kristall eingesetzten Membran definierter Porengröße zur molekularen Selektivität beitragen kann (DE 41 24 920 A1). Höhere Spezifität der zwischen Lösung und ATR-Kristalloberfläche erfolgenden Wechselwirkung wird durch Kopplung von spezifischen Antikörpern an oberflächenbehandelte ATR-Kristalle erreicht (EP 0202 021 A2).

Die an die ATR-Kristalloberfläche adsorbierten Materialschichten weisen meist extrem hohe mechanische Empfindlichkeiten auf. Dies ist besonders bei Biomolekülen der Fall. Die in der Regel interessierende Assoziation dieser Moleküle mit definierten Komponenten aus der überschichteten Lösung kann daher meist nur durch einmalige Zugabe der bindenden Substanz spektroskopisch untersucht werden. Ein Spülen oder Überströmen für kontinuierliche Stoffaustausche oder Stoffentfernungen verursacht in den meisten Fällen so starke Schädigungen der Biomolekülschicht, daß keine verläßlichen Spektren erhalten werden. Für die Datenaufnahme sind jedoch Wiederholungen des spektroskopisch verfolgten Bindungsvorganges erforderlich, was beim gegebenen Stand der Technik die Wiederholung aller Einzelschritte (Kristallsäuberung, Neubeschichtung, Thermostatisierung, u. a.) nötig macht. Dies ist mit hohem Zeit- und Materialaufwand verbunden.

Die beim Stand der Technik gegebene Spezifität der Anreicherung einer zu detektierenden gelösten Substanz in der adsorbierten Materialschicht ist ebenfalls nicht immer befriedigend, da selbst bei der Verwendung von Antikörpern Überlagerungen mit unspezifischen Bindungsreaktionen bei Messung von Vielkomponentensystemen auftreten können.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Totalreflexionsmeßzelle anzugeben, die den Nachweis und die spektroskopische Charakterisierung von Substanzen an der ATR-Kristalloberfläche ermöglicht und eine Modulation der Konzentration gelöster Stoffe entsprechend ihrer elektrischen Nettoladung ohne mechanische Eingriffe erlaubt. Diese Aufgabe wird durch eine Totalreflexions-Meßzelle mit den Merkmalen des Patentanspruches 1 gelöst. Weiterbildungen sind Gegenstand der Unteransprüche.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung bietet die Möglichkeit der Erzeugung eines elektrolytischen Stroms gelöster Substanzen in der Totalreflexions-Meßzelle. Makroskopische Strömungen treten hierbei nicht auf, so daß die ATR- Kristallbeschichtung keiner mechanischen Belastung ausgesetzt ist. Wiederholung der spektroskopisch verfolgten Bindung an die Oberflächenschicht des ATR-Kristalls ist durch einfache Stromumkehrungen möglich und kann während der Messung erfolgen, da kein mechanischer Eingriff in das System nötig ist. Insbesondere läßt sich dieser Vorgang automatisieren.

Das freie Diffusionsvolumen der aus der Lösung an den beschichteten ATR- Kristall bindenden Moleküle ist durch die nahe der ATR-Kristalloberfläche angebrachte Dialysemembran stark reduziert, so daß die eingesetzten, oft aufwendig synthetisierten Substanzmengen klein gehalten werden können. Die verwandte Dialysemembran bietet eine wirkungsvolle mechanische Abschirmung der ATR- Kristalloberfläche, so daß unter Erhalt des diffusiven Lösungsmittelkontaktes zum ATR-Kristall jenseits der Membran schneller Lösungsmittelwechsel und Überströmung ohne mechanische Schädigung der zu untersuchenden Materialschicht möglich ist.

Die bei zahlreichen Substanzen in wäßriger Lösung gegebene elektrische Nettoladung wird dabei ausgenutzt, um durch kontrollierte elektrolytische Ströme die Substanzen in der Lösung zu transportieren. Dazu wird eine Kompartimentierung des Lösungsvolumens über dem ATR-Kristall in drei strömungsmechanisch getrennte Flüssigkeitsräume erzeugt. Durch halbdurchlässige Membranen (Dialysemembranen) stehen die Lösungsvolumina jedoch in elektrisch leitendem Kontakt. Diese Ausführungsweise der Totalreflexions-Meßzelle gewährleistet eine einfache Handhabung, indem alle beteiligten Lösungsräume unabhängig voneinander über Schlauchverbindungen zugänglich sind, ohne daß ein Öffnen oder sonstige mechanische Eingriffe nötig sind. Insbesondere ist damit Lösungsmittelaustausch während einer Absorptionsmessung störungsfrei durchführbar.

Ein Ausführungsbeispiel der Totalreflexions-Meßzelle ist in den Zeichnungen dargestellt. Dabei zeigt:

Abb. 1a die Aufsicht auf den Einsatz T, der zur Aufspannung einer Dialysemembran M₀ über der ATR-Kristalloberfläche dient und eine zentrale Aussparung für den Elektrodenraum E₃ besitzt,

Abb. 1b einen Plexiglasrahmen R mit beidseitigen Aussparungen für die Elektroden E₁ und E₂, sowie einer zentralen Aussparung für den Einsatz T, Bohrungen in den vier Ecken zur Verschraubung mit der ATR-Kristallhalterung, zwei zentrale Bohrungen zur Verschraubung mit einem zweiten Rahmen (wie in Abb. 2) und durch Pfeile gekennzeichnete Flüssigkeitszuläufe,

Abb. 2 einen Längsschnitt durch die ATR-Meßzelle.

Bei der Totalreflexions-Meßzelle wird eine Kompartimentierung in strömungsmechanisch getrennte Flüssigkeitsräume durch die Anordnung von zwei, aus einem durchsichtigen Nichtleiter (z. B. Plexiglas) gefertigten Rahmen R sowie einem Einsatz T erreicht (Abb. 1). Die Rahmen (R₁ und R₂) werden wie in Abb. 2 gezeigt miteinander verschraubt, wobei die am Rand liegenden Hohlräume jeweils durch Zwischenlegen der Dialysemembranen M₁ und M₂ getrennt bleiben. In den mittleren, von beiden Rahmen gebildeten Hohlraum wird der Einsatz T geschoben. Hierbei wird die Dialysemembran M₀ so um T gelegt, daß sie die Unterseite von T überspannt und beim Einschieben zwischen den Rahmen R₁ und R₂ sowie dem Einsatz T festgeklemmt wird. Die auf diese Weise fest miteinander verbundenen Teile werden oben mit einem Deckel D versehen und durch die an den vier Ecken angebrachten Bohrungen mit der Halterung des ATR-Kristalls verschraubt. Dabei liegt die Plexiglaseinheit auf Gummiauflagen A über dem ATR-Kristall. Die Halterung ist der Übersichtlichkeit halber nicht dargestellt, aber die durch sie fixierte relative Lage des ATR-Kristalls K und der darunterliegenden Spiegel S₁, S₂, S₃, S₄ ist gezeigt. Bei der Verschraubung bildet sich ein Zwischenraum zwischen M₀ und der ATR-Kristalloberfläche, dessen Größe durch die Gummiauflagen A bestimmt ist. Alle Hohlräume werden über Schlauchzuleitungen (Pfeile) mit Flüssigkeit gefüllt. Der Probenraum V₀ steht in unmittelbarem Kontakt mit der Materialschicht (gepunktet) auf der ATR-Kristalloberfläche und enthält die zu testende Lösung von Liganden. Über die Dialysemembran M₀ von definierter molekularer Porengröße steht V₀ in diffusivem, jedoch nicht strömungsmechanischem Kontakt mit dem Lösungsvolumen V₃. In das Lösungsvolumen V₃ taucht die Elektrode E₃. Über zwei weitere Dialysemembranen M₁ und M₂ hat V₀ ebenso diffusiven Kontakt zu den Lösungsvolumina V₁ und V₂, die untereinander nicht diffusiv verbunden sind. V₁ und V₂ sind über die Elektroden E₁ und E₂ mit einer Hochspannungsquelle verbunden und liegen gegenüber E₃ auf identischem Potential. Die Aufteilung auf zwei elektrisch identische Elektrodenräume V₁ und V₂ dient lediglich der Vergrößerung der effektiven Elektrodenoberfläche und des diffusiven Kontaktes zu V₀. Beides trägt zur Beschleunigung des Ladungstransportes bei. Durch Spannungsgabe wird ein elektrolytischer Strom negativ geladener Ionen von V₁ und V₂ nach V₃ erzeugt, der durch V₀ und alle Dialysemembranen hindurch fließt. Für Moleküle, die aufgrund ihrer Größe nicht die Dialysemembranen durchdringen können, kommt es innerhalb von V₀ zu einem Strom aus dem spektroskopischen Totvolumen unterhalb M₁ und M₂ in den Bereich unterhalb M₀. Damit werden also die zu untersuchenden Substanzen in die Nachbarschaft der adsorbierten Materialschicht auf der ATR-Kristalloberfläche gebracht. Ihr Effekt in der Materialschicht kann durch die Änderung der Meßstrahlintensität bei Reflexion an der Kristalloberfläche untersucht werden.

Vorteilhafterweise besitzt die Totalreflexions-Meßzelle eine Kühlvorrichtung, die aus Sicherheitsgründen ohne metallische Kontakte für den Wärmetransport und Flüssigkeitskreisläufe auskommt. Dadurch wird zusätzlich eine gegenüber herkömmlichen Anordnungen platzsparendere Konstruktion erzielt.

Bezugszeichenliste

A: Gummiauflagen zur Abdichtung gegen die Kristallhalterung;
E₁, E₂, E₃: Platinelektroden; G: Gaszuführung für Kristallkühlung;
K: Kristall mit trapezoidalem Querschnitt, auf dessen Oberfläche die Materialschicht adsorbiert ist (gepunktet) und in dessen Innern der Meßstrahl (gestrichelt) reflektiert wird;
M₀, M₁, M₂: Dialysemembranen; R₁, R₂: Plexiglasrahmen wie in Abb. 1;
S₁, S₂, S₃, S₄: Spiegel zur Einkoppelung des Meßlichts in den Kristall;
T: Plexiglaseinsatz wie in Abb. 1; V₀: Probenraum;
V₁, V₂: äquivalente Elektrodenräume für die Elektroden E₁ und E₂;
V₃: Elektrodenraum für Elektrode E₃; Pfeile bedeuten, sofern nicht anders gekennzeichnet, Flüssigkeitszu- und -abläufe.

Claims (3)

1. Totalreflexions-Meßzelle zur spektroskopischen Untersuchung von einer auf einem ATR-Kristall adsorbierten Materialschicht, die sich im Kontakt mit einer zu untersuchenden Flüssigkeitsprobe befindet, dadurch gekennzeichnet, daß die zu untersuchende Flüssigkeitsprobe in einem Probenraum (V₀) über Dialysemembranen (M₀, M₁, M₂) mit flüssigkeitsgefüllten Elektrodenräumen (V₁, V₂, V₃) verbunden ist, wobei in den Elektrodenräumen (V₁, V₂, V₃) Elektroden (E₁, E₂, E₃) zur Erzeugung eines elektrolytischen Stroms durch die Dialysemembranen (M₀, M₁, M₂) angeordnet sind.

2. Totalreflexions-Meßzelle nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die adsorbierte Materialschicht horizontal in der Meßzelle auf dem ATR-Kristall (K) angeordnet ist, wobei die Elektrodenanordnung (E₁, E₂, E₃) ein elektrophoretisches Ein- und Auswandern von in der zu untersuchenden Flüssigkeitsprobe gelösten, elektrisch geladenen Substanzen in die adsorbierte Materialschicht erlaubt, und wobei die Elektrodenräume (V₁, V₂, V₃) über zu- und abführende Verbindungen spülbar sind.

3. Totalreflexions-Meßzelle nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Thermostatisierung durch Stickstoffgas über eine Gaszuführung (G) aus einem Flüssigstickstoffreservoire vorhanden ist.