DE19612877C1 - Totalreflexions-Meßzelle zur Untersuchung von einer auf einem ATR-Kristall adsorbierten Materialschicht - Google Patents
Totalreflexions-Meßzelle zur Untersuchung von einer auf einem ATR-Kristall adsorbierten MaterialschichtInfo
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Description
Es ist bekannt, daß stark absorbierende Materialien, statt durchleuchtet zu
werden, besser auf ihre Absorptionseigenschaften hin untersucht werden können,
wenn sie in engem Kontakt mit einem für das Meßlicht transparenten Körper (im
Folgenden als ATR-Kristall bezeichnet) stehen, in dessen Inneren der Meßstrahl
durch Totalreflexion zwischen glatten Oberflächen weitergeleitet wird (Harrick,
N.J., 1967, "Internal reflection spectroscopy", Harrick Scientific Corporation, 88
Broadway, Box 1288, Ossining, New York 19562). Bei jedem Oberflächenkontakt
erfolgt teilweise Meßlichtabsorption durch die zu untersuchende, auf den ATR-
Kristall adsorbierte Materialschicht. Wegen der bei Totalreflexion gewährleisteten
geringen Eindringtiefe des Meßstrahls in die Probenschicht ist eine geringe
Absorption gewährleistet, so daß es nicht wie bei der sonst üblichen direkten
Durchleuchtung zur völligen Löschung des Meßlichts kommt. Entsprechend ist im
Falle fluoreszenzspektroskopischer Anwendungen das Anregungslicht auf die
Grenzschicht zwischen Kristall und Lösungsvolumen beschränkbar. Das aufgrund
des größeren Abstandes von der ATR-Kristalloberfläche nicht vom Meßlicht erfaßte
Probenvolumen wird im folgenden als spektroskopisches Totvolumen bezeichnet.
In Kombination mit Oberflächenmodifikationen der ATR-Kristalloberfläche
können gelöste Substanzen aufgrund ihrer spezifischen Reaktionen in einer
definierten Materialschicht im Kontaktbereich zwischen Kristall und Lösung optisch
detektiert werden (Yang, L. and Saavedra, S.S., 1995, Anal. Chem. Vol. 67, S. 1307-1314).
Bei Messungen im Infrarot kann aus der Absorption der in die Materialschicht
einwandernden Substanz auf ihr Verhalten in der Materialschicht geschlossen
werden (Tóth, K. et al., 1988, Fresenius Z. Anal. Chem. Vol. 331, S. 448-453).
Ursprünglich für physikalische Fragestellungen entwickelt, wird diese
Meßmethode zunehmend auf biologische Materialien angewandt (z. B. Tamm, L.K.
and Tatulian, S.A., 1993, Biochemistry Vol. 32, S. 7720-7726). Insbesondere bei
Infrarotabsorptionsmessungen wirkt das für den Erhalt der Funktion vieler
Biomoleküle nötige Wasser als starker Absorber, so daß auch hier die
Durchleuchtung mit Infrarotstrahlung problematisch ist. Verschiedene Methoden
sind beschrieben worden, um Biomoleküle effektiv an ATR-Kristalle zu adsorbieren
und dann mit wäßrigen Lösungen zu überschichten, die den biologischen
Erfordernissen entsprechend zusammengesetzt sind (Blodget, K.B., and Langmuir, I.,
1937, Phys. Rev. Vol. 51, S. 964-982; Kopp, F. et al., 1975, Biophys. Struct. Mech.
Vol. 1, S. 75-96; Frey, S., and Tamm, L.K., 1991, Biophys. J. Vol. 60, S. 922-930;
Kalb, E. et al., 1992, Biochim. Biophys. Acta Vol. 1103, S. 307-316). Solche
Systeme sind besonders geeignet, die Bindung von spezifischen Liganden, wie
Hormonen oder Antigenen an ihre jeweiligen, an der ATR-Kristalloberfläche
adsorbierten Rezeptoren zu charakterisieren.
Da die Effizienz der ATR-Meßtechnik auf der spezifischen Anreicherung
einer gelösten Stoffkomponente in der am ATR-Kristall adsorbierten Materialschicht
beruht, sind Methoden beschrieben, die eine Konzentrationssteigerung der zu
detektierenden Substanzen an der ATR-Kristalloberfläche bewirken. Dies kann durch
thermische Gradienten an der ATR-Kristalloberfläche erreicht werden, wobei
zusätzlich die Filterwirkung einer zwischen Lösung und ATR-Kristall eingesetzten
Membran definierter Porengröße zur molekularen Selektivität beitragen kann (DE 41 24 920 A1).
Höhere Spezifität der zwischen Lösung und ATR-Kristalloberfläche
erfolgenden Wechselwirkung wird durch Kopplung von spezifischen Antikörpern
an oberflächenbehandelte ATR-Kristalle erreicht (EP 0202 021 A2).
Die an die ATR-Kristalloberfläche adsorbierten Materialschichten weisen
meist extrem hohe mechanische Empfindlichkeiten auf. Dies ist besonders bei
Biomolekülen der Fall. Die in der Regel interessierende Assoziation dieser Moleküle
mit definierten Komponenten aus der überschichteten Lösung kann daher meist nur
durch einmalige Zugabe der bindenden Substanz spektroskopisch untersucht werden.
Ein Spülen oder Überströmen für kontinuierliche Stoffaustausche oder
Stoffentfernungen verursacht in den meisten Fällen so starke Schädigungen der
Biomolekülschicht, daß keine verläßlichen Spektren erhalten werden. Für die
Datenaufnahme sind jedoch Wiederholungen des spektroskopisch verfolgten
Bindungsvorganges erforderlich, was beim gegebenen Stand der Technik die
Wiederholung aller Einzelschritte (Kristallsäuberung, Neubeschichtung,
Thermostatisierung, u. a.) nötig macht. Dies ist mit hohem Zeit- und Materialaufwand
verbunden.
Die beim Stand der Technik gegebene Spezifität der Anreicherung einer zu
detektierenden gelösten Substanz in der adsorbierten Materialschicht ist ebenfalls
nicht immer befriedigend, da selbst bei der Verwendung von Antikörpern
Überlagerungen mit unspezifischen Bindungsreaktionen bei Messung von
Vielkomponentensystemen auftreten können.
Der Erfindung liegt die Aufgabe
zugrunde, eine Totalreflexionsmeßzelle anzugeben, die den Nachweis und die
spektroskopische Charakterisierung von Substanzen an der ATR-Kristalloberfläche
ermöglicht und eine Modulation der Konzentration gelöster Stoffe entsprechend ihrer
elektrischen Nettoladung ohne mechanische Eingriffe erlaubt. Diese Aufgabe wird
durch eine Totalreflexions-Meßzelle mit den Merkmalen des Patentanspruches 1
gelöst. Weiterbildungen sind Gegenstand der Unteransprüche.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung bietet die Möglichkeit der Erzeugung
eines elektrolytischen Stroms gelöster Substanzen in der Totalreflexions-Meßzelle.
Makroskopische Strömungen treten hierbei nicht auf, so daß die ATR-
Kristallbeschichtung keiner mechanischen Belastung ausgesetzt ist. Wiederholung
der spektroskopisch verfolgten Bindung an die Oberflächenschicht des ATR-Kristalls
ist durch einfache Stromumkehrungen möglich und kann während der Messung
erfolgen, da kein mechanischer Eingriff in das System nötig ist. Insbesondere läßt
sich dieser Vorgang automatisieren.
Das freie Diffusionsvolumen der aus der Lösung an den beschichteten ATR-
Kristall bindenden Moleküle ist durch die nahe der ATR-Kristalloberfläche
angebrachte Dialysemembran stark reduziert, so daß die eingesetzten, oft aufwendig
synthetisierten Substanzmengen klein gehalten werden können. Die verwandte
Dialysemembran bietet eine wirkungsvolle mechanische Abschirmung der ATR-
Kristalloberfläche, so daß unter Erhalt des diffusiven Lösungsmittelkontaktes zum
ATR-Kristall jenseits der Membran schneller Lösungsmittelwechsel und
Überströmung ohne mechanische Schädigung der zu untersuchenden Materialschicht
möglich ist.
Die bei zahlreichen Substanzen in wäßriger Lösung gegebene elektrische
Nettoladung wird dabei ausgenutzt, um durch kontrollierte elektrolytische Ströme die
Substanzen in der Lösung zu transportieren. Dazu wird eine Kompartimentierung des
Lösungsvolumens über dem ATR-Kristall in drei strömungsmechanisch getrennte
Flüssigkeitsräume erzeugt. Durch halbdurchlässige Membranen (Dialysemembranen)
stehen die Lösungsvolumina jedoch in elektrisch leitendem Kontakt. Diese
Ausführungsweise der Totalreflexions-Meßzelle gewährleistet eine einfache
Handhabung, indem alle beteiligten Lösungsräume unabhängig voneinander über
Schlauchverbindungen zugänglich sind, ohne daß ein Öffnen oder sonstige
mechanische Eingriffe nötig sind. Insbesondere ist damit Lösungsmittelaustausch
während einer Absorptionsmessung störungsfrei durchführbar.
Ein Ausführungsbeispiel der Totalreflexions-Meßzelle ist in den
Zeichnungen dargestellt. Dabei zeigt:
Abb. 1a die Aufsicht auf den Einsatz T, der zur Aufspannung einer
Dialysemembran M₀ über der ATR-Kristalloberfläche dient und eine zentrale
Aussparung für den Elektrodenraum E₃ besitzt,
Abb. 1b einen Plexiglasrahmen R mit beidseitigen Aussparungen für die
Elektroden E₁ und E₂, sowie einer zentralen Aussparung für den Einsatz T,
Bohrungen in den vier Ecken zur Verschraubung mit der ATR-Kristallhalterung,
zwei zentrale Bohrungen zur Verschraubung mit einem zweiten Rahmen (wie in
Abb. 2) und durch Pfeile gekennzeichnete Flüssigkeitszuläufe,
Abb. 2 einen Längsschnitt durch die ATR-Meßzelle.
Bei der Totalreflexions-Meßzelle wird eine Kompartimentierung in
strömungsmechanisch getrennte Flüssigkeitsräume durch die Anordnung von zwei,
aus einem durchsichtigen Nichtleiter (z. B. Plexiglas) gefertigten Rahmen R sowie
einem Einsatz T erreicht (Abb. 1). Die Rahmen (R₁ und R₂) werden wie in Abb. 2
gezeigt miteinander verschraubt, wobei die am Rand liegenden Hohlräume jeweils
durch Zwischenlegen der Dialysemembranen M₁ und M₂ getrennt bleiben. In den
mittleren, von beiden Rahmen gebildeten Hohlraum wird der Einsatz T geschoben.
Hierbei wird die Dialysemembran M₀ so um T gelegt, daß sie die Unterseite von T
überspannt und beim Einschieben zwischen den Rahmen R₁ und R₂ sowie dem
Einsatz T festgeklemmt wird. Die auf diese Weise fest miteinander verbundenen
Teile werden oben mit einem Deckel D versehen und durch die an den vier Ecken
angebrachten Bohrungen mit der Halterung des ATR-Kristalls verschraubt. Dabei
liegt die Plexiglaseinheit auf Gummiauflagen A über dem ATR-Kristall. Die
Halterung ist der Übersichtlichkeit halber nicht dargestellt, aber die durch sie fixierte
relative Lage des ATR-Kristalls K und der darunterliegenden Spiegel S₁, S₂, S₃, S₄
ist gezeigt. Bei der Verschraubung bildet sich ein Zwischenraum zwischen M₀ und
der ATR-Kristalloberfläche, dessen Größe durch die Gummiauflagen A bestimmt ist.
Alle Hohlräume werden über Schlauchzuleitungen (Pfeile) mit Flüssigkeit gefüllt. Der
Probenraum V₀ steht in unmittelbarem Kontakt mit der Materialschicht
(gepunktet) auf der ATR-Kristalloberfläche und enthält die zu testende Lösung von
Liganden. Über die Dialysemembran M₀ von definierter molekularer Porengröße
steht V₀ in diffusivem, jedoch nicht strömungsmechanischem Kontakt mit dem
Lösungsvolumen V₃. In das Lösungsvolumen V₃ taucht die Elektrode E₃. Über zwei
weitere Dialysemembranen M₁ und M₂ hat V₀ ebenso diffusiven Kontakt zu den
Lösungsvolumina V₁ und V₂, die untereinander nicht diffusiv verbunden sind. V₁
und V₂ sind über die Elektroden E₁ und E₂ mit einer Hochspannungsquelle
verbunden und liegen gegenüber E₃ auf identischem Potential. Die Aufteilung auf
zwei elektrisch identische Elektrodenräume V₁ und V₂ dient lediglich der
Vergrößerung der effektiven Elektrodenoberfläche und des diffusiven Kontaktes zu
V₀. Beides trägt zur Beschleunigung des Ladungstransportes bei. Durch
Spannungsgabe wird ein elektrolytischer Strom negativ geladener Ionen von V₁ und
V₂ nach V₃ erzeugt, der durch V₀ und alle Dialysemembranen hindurch fließt. Für
Moleküle, die aufgrund ihrer Größe nicht die Dialysemembranen durchdringen
können, kommt es innerhalb von V₀ zu einem Strom aus dem spektroskopischen
Totvolumen unterhalb M₁ und M₂ in den Bereich unterhalb M₀. Damit werden also
die zu untersuchenden Substanzen in die Nachbarschaft der adsorbierten
Materialschicht auf der ATR-Kristalloberfläche gebracht. Ihr Effekt in der
Materialschicht kann durch die Änderung der Meßstrahlintensität bei Reflexion an
der Kristalloberfläche untersucht werden.
Vorteilhafterweise besitzt die Totalreflexions-Meßzelle eine
Kühlvorrichtung, die aus Sicherheitsgründen ohne metallische Kontakte für den
Wärmetransport und Flüssigkeitskreisläufe auskommt. Dadurch wird zusätzlich eine
gegenüber herkömmlichen Anordnungen platzsparendere Konstruktion erzielt.
Bezugszeichenliste
A: Gummiauflagen zur Abdichtung gegen die Kristallhalterung;
E₁, E₂, E₃: Platinelektroden; G: Gaszuführung für Kristallkühlung;
K: Kristall mit trapezoidalem Querschnitt, auf dessen Oberfläche die Materialschicht adsorbiert ist (gepunktet) und in dessen Innern der Meßstrahl (gestrichelt) reflektiert wird;
M₀, M₁, M₂: Dialysemembranen; R₁, R₂: Plexiglasrahmen wie in Abb. 1;
S₁, S₂, S₃, S₄: Spiegel zur Einkoppelung des Meßlichts in den Kristall;
T: Plexiglaseinsatz wie in Abb. 1; V₀: Probenraum;
V₁, V₂: äquivalente Elektrodenräume für die Elektroden E₁ und E₂;
V₃: Elektrodenraum für Elektrode E₃; Pfeile bedeuten, sofern nicht anders gekennzeichnet, Flüssigkeitszu- und -abläufe.
E₁, E₂, E₃: Platinelektroden; G: Gaszuführung für Kristallkühlung;
K: Kristall mit trapezoidalem Querschnitt, auf dessen Oberfläche die Materialschicht adsorbiert ist (gepunktet) und in dessen Innern der Meßstrahl (gestrichelt) reflektiert wird;
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S₁, S₂, S₃, S₄: Spiegel zur Einkoppelung des Meßlichts in den Kristall;
T: Plexiglaseinsatz wie in Abb. 1; V₀: Probenraum;
V₁, V₂: äquivalente Elektrodenräume für die Elektroden E₁ und E₂;
V₃: Elektrodenraum für Elektrode E₃; Pfeile bedeuten, sofern nicht anders gekennzeichnet, Flüssigkeitszu- und -abläufe.
Claims (3)
1. Totalreflexions-Meßzelle zur spektroskopischen Untersuchung von einer auf
einem ATR-Kristall adsorbierten Materialschicht, die sich im Kontakt mit einer zu
untersuchenden Flüssigkeitsprobe befindet,
dadurch gekennzeichnet,
daß die zu untersuchende Flüssigkeitsprobe in einem Probenraum (V₀) über
Dialysemembranen (M₀, M₁, M₂) mit flüssigkeitsgefüllten Elektrodenräumen
(V₁, V₂, V₃) verbunden ist, wobei in den Elektrodenräumen (V₁, V₂, V₃) Elektroden
(E₁, E₂, E₃) zur Erzeugung eines elektrolytischen Stroms durch die Dialysemembranen
(M₀, M₁, M₂) angeordnet sind.
2. Totalreflexions-Meßzelle nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß die adsorbierte Materialschicht horizontal in der Meßzelle auf dem ATR-Kristall
(K) angeordnet ist, wobei die Elektrodenanordnung (E₁, E₂, E₃) ein
elektrophoretisches Ein- und Auswandern von in der zu untersuchenden
Flüssigkeitsprobe gelösten, elektrisch geladenen Substanzen in die adsorbierte
Materialschicht erlaubt, und wobei die Elektrodenräume (V₁, V₂, V₃) über zu- und
abführende Verbindungen spülbar sind.
3. Totalreflexions-Meßzelle nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß eine Thermostatisierung durch Stickstoffgas über eine Gaszuführung (G) aus
einem Flüssigstickstoffreservoire vorhanden ist.
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