DE69429055T2

DE69429055T2 - Methode und apparat zur chromatographischen analyse

Info

Publication number: DE69429055T2
Application number: DE69429055T
Authority: DE
Inventors: K. Dasgupta
Original assignee: Dionex Corp
Current assignee: Dionex Corp
Priority date: 1993-03-30
Filing date: 1994-03-07
Publication date: 2002-03-21
Anticipated expiration: 2014-03-08
Also published as: JPH07507879A; JP3190678B2; WO1994023290A1; EP0646239B1; EP0646239A4; US5316630A; DE69429055D1; EP0646239A1

Description

BEREICH DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Normieren von Chromatogrammen, die in Chromatographiesystemen erhalten werden. Die vorliegende Erfindung kann insbesondere in Kapillarelektrophorese-Systemen zweckmäßig sein.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Kapillarelektrophorese (CE) ist eine Elektrophoresetechnik die Kapillaren mit kleiner Bohrung verwendet. Die CE stellt Verfahren zum Trennen von Ionenarten einschließlich Makromolekülen bereit. Der wirkungsgrad der CE kann relativ hoch sein, d. h. mehr als 400.000 theoretische Platten, und wird deshalb hinsichtlich vieler verschiedener Anwendungen untersucht.
Ein typisches CE-System hat ein Quarzkapillarrohr mit einem Durchmesser von 50 bis 10 um, das mit einem geeigneten elektrisch leitenden Puffer gefüllt ist. Das Auslaßende der Kapillaren ist in einen Speicher eingetaucht, der den Puffer und eine Elektrode enthält. In das Einlaßende der Kapillaren wird eine die interessierenden Ionen enthaltende Probe eingeführt. Anschließend wird der Einlaß in einem anderen Speicher angeordnet, der den Puffer und einen weitere Elektrode enthält. Da bei der CE eine Kapillare mit kleinem Durchmesser verwendet wird, kann eine relativ hohe Spannung angelegt werden, ohne in der Kapillaren thermische Gradienten zu erzeugen. Die Elektroden sind deshalb mit einer Energiequelle verbunden, die in der Lage ist, &supmin;30 kV pro 100 cm Kapillare zu liefern. Zwischen den beiden Elektroden wird eine Detektor angeordnet, der das Erfassen verschiedener Ionenarten ermöglicht, die in der Kapillare wandern. Ein derart positionierter Detektor wird häufig als Detektor an der Säule bezeichnet. Gewöhnlich wird an dem Detektor ein Integrator befestigt, so daß die Peakflächen gemessen werden können.
Die Bewegung der interessierenden Ionen der Probe wird durch zwei Faktoren gesteuert, nämlich die elektrophoretische Geschwindigkeit und die elektroosmotische Strömungsgeschwindigkeit. Die gesamte Migrationsgeschwindigkeit ist die Vektorsumme dieser beiden Terme.
Die elektrophoretische Migration ist die Migration des Probenions zu der entgegengesetzt geladenen Elektrode unter dem Einfluß des elektrischen Feldes. Die elektrophoretische Mobilität irgend eines speziellen Ions ist die elektrophoretische Geschwindigkeit pro Feldstärkeneinheit.
Die elektroosmotische Strömung (EOF) ist die Massenströmung des Puffers in der Kapillaren. Der EOF ergibt sich aufgrund der Ladung der Innenfläche der Kapillaren, die Kontakt mit dem bewegliche Gegenionen enthaltenden Puffer steht. Beispielsweise hat eine unmodifizierte Quarz-Kapillarenoberfläche Silanol (Si-OH)-Gruppen, die negativ geladen sind (Si-O&spplus;), wenn der pH-Wert des Puffers größer als etwa 2 ist, und die negativ geladen sind (Si-OH&sub2;+), wenn der ph-Wert weniger als etwa 2 beträgt. Alternativ können hydrophobe Kationen an der Innenfläche der Kapillaren adsorbiert werden, um bei höheren pH-Werten eine positiv geladene Oberfläche zu erhalten.
Wenn die Oberfläche negativ geladen ist, wandern die bewegliche Kationen, beispielsweise Natriumionen (Na&submin;) unter dem Einfluß des elektrischen Feldes und ziehen das Hauptlösungsmittel im Prozess mit sich. Die Richtung der elektroosmotischen Strömung verläuft deshalb von der positiven zur negativen Elektrode, wenn die Oberfläche negativ geladen ist.
Wenn die Oberfläche positiv geladen ist, wandern die beweglichen Gegenionen der positiv geladenen Oberfläche, beispielsweise Biphosphationen (HPO&sub4;²&supmin;) unter dem Einfluß des elektrischen Feldes und ziehen in dem Prozess das Hauptlösungsmittel mit sich. Die Richtung der elektroosmotischen Strömung verläuft deshalb von der negativen zur positiven Elektrode, wenn die Oberfläche positiv geladen ist.
Wenn die Oberfläche nicht geladen ist, gibt es keine elektroosmotische Strömung. Jegliche Bewegung von Analytionen erfolgt allein aufgrund der elektrophoretischen Mobilität.
Abhängig von der Ladung der interessierenden Ionen, von der Art und der Größe der Kapillarenoberflächenladung sowie von der Polarität der angelegten Spannung kann die Elektroosmose die elektrophoretische Bewegung erhöhen, ihr entgegenwirken, oder sogar übersteigen. Da sich zu bestimmende Probenkomponenten vom Einlaßende der Kapillaren zum Detektor bewegen, der sich nahe am Auslaßende der Kapillaren befindet, ist es wesentlich, daß sie sich in der gewünschten Richtung bewegen. Da die gesamte Migrationsgeschwindigkeit der Probe die Vektorsumme der elektrophoretischen Geschwindigkeit und der elektroosmotischen Strömungsgeschwindigkeit ist, ist es jedoch möglich, daß die Ladung der Probe derart beschaffen ist, daß sie sich von der Auslaßelektrode bei Fehlen einer elektroosmotischen Strömung wegbewegen würde. Unter diesen Bedingungen muß die elektroosmotische Strömungsgeschwindigkeit der Hauptlösung größer sein als die elektrophoretische Mobilität des Analyten.
Der in dem CE-Sytem verwendete Detektor ist von besonderer Bedeutung und die Art des verwendeten Detektors hängt gewöhnlich von den Eigenschaften der der Analyse unterliegenden Verbindungen ab. Z. Zt. gibt es eine Anzahl unterschiedlicher bei der CE verwendeten Detektoranordnungen. Zu ihnen gehören die direkte und die indirekte photometrische Messung, die direkte und indirekte Fluoreszenzmessung sowie die unterdrückte und nicht unterdrückte photometrische Messung. Andere verwendbare Messarten sind Massenspektrometrie, Radiometrie oder andere elektrochemische Verfahren, wie die Amperometrie. Diese Verfahren können entweder an der Säule oder am Ende der Säule eingesetzt werden, d. h. an irgendeinem Punkt nach der Auslaßelektrode.
Während die meisten interessierenden organischen Moleküle eine beträchtliche Ultraviolett-Absorption anzeigen, so daß eine direkte photometrische Messung praktisch ist, ist dies bei vielen anorganischen Ionen oder aliphatischen Karboxylsäuren nicht der Fall, die eine sehr niedrige optische Absorption anzeigen. In diesen Fällen kann deshalb eine indirekte photometrische oder Fluoreszenzmessung verwendet werden. Die indirekte fluorometrische Messung ist beispielsweise in Gross et al., Anal. Chem. 62: 427-431 (1990); Bachmann et al., Journal of Chrom. 626: 259-265 (1992) und bei Gross et al., Journal of Chrom. 480: 169-178 (1989) beschrieben. Die indirekte photometrische Messung ist bei Foret et al., Journal of Chrom. 470: 299-308 (1989), bei Foret et al., Electrophoresis 11: 780- 783 (1990) und Henshall et al., Journal of Chrom. 608: 413-419 (1992) beschrieben. Da die elektrische Mobilität eine spezifische Eigenschaft aller Ionen ist, kann zusätzlich die auf der Leitfähigkeit basierende Messung ein für viele Einsätze der CE gewünschtes Verfahren sein.
Die Leitfähigkeitsdetektoren sind jedoch nichtselektive Masseeigenschafts-Detektoren. Das Signal entsteht aus der Differenz des äquivalenten Leitvermögens oder der Mobilität der Ladungsträger-Elektrolytionen und der Analytionen. Bei der CE führt eine große Differenz der Mobilität des Trägerelektrolytions und des Analytions zu einer übermäßigen Peak- Schweifbildung/Frontbildung, was bedeutet, daß es praktische Einschränkungen bei der Wahl des Elutionsmittelions gibt. Dieser Konflikt zwischen optimaler Empfindlichkeit und Trennwirkungsgrad stellt die ultimate Begrenzung der nicht unterdrückten Leitfähigkeitsmessung der CE dar.
Die Elektrolytunterdrückung oder die Nach-Rücklauf-Änderung des Elektrolytpuffers derart, daß das Hintergrund-"Geräusch" des Puffers nimmt, wurde für die Ionenchromatographie (siehe beispielsweise US-A-3,897,213; 3,920,397; 3,925,019; 3,956,559; 4,474,664; 4,751,004; 4,459,357 und 4,999,098) und neuerdings auch für die CE (US-Sn. 07/771,336 und 07/771,597, eingereicht am 4. Oktober 1991) untersucht. Auf diese Systeme wird als "unterdrückte" Systeme Bezug genommen.
Bei Verwendung der konduktometrischen Messung sind Aspekte des Elektropherogramms aus einem CE-Durchlauf verschieden von einem optisch gemessenen CE-Durchlauf. Diese Erscheinungen sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Ein Problem bei der CE besteht darin, daß sich das in die Kapillare eingeführte Probenvolumen ändern kann. Die Proben lassen sich nicht leicht auf die Säule durch ein Ventil mit festgelegtem Volumen injizieren. Dies kann auch bei anderen Chromatographiesystemen ein Problem sein, obwohl viele Systeme ein Ventil mit festgelegtem Volumen verwenden. Statt dessen werden bei der CE die Proben in die Kapillare auf mehrere Arten eingeführt. Typische Injektionsarten für die CE sind die Druckbeaufschlagung einer die zu vermessende Probe oder die Referenzprobe haltenden Phiole über eine festgelegte Zeitlänge (Druckinjekton) oder das Anlegen eines elektrischen Feldes über eine festgelegte Zeitlänge (elektrostatische Injektion). Die CE-Probeninjektionsverfahren basieren somit auf der Injektionszeit. Dies bedeutet, daß geringe Variabilitäten der Zeit, der Probenviskosität, des Drucks oder der hydrostatischen Höhe zu Variabilitäten des injizierten Provbenvolumens führen können. Dies kann einen schwerwiegenden Einfluß auf die Migrationszeit und die Größe der Peaks haben.
Außerdem können diese potentiellen Variabilitäten die Quantifizierung der Probenpeaks schwierig machen. Die Quantifizierung erfordert, daß das injizierte Volumen der zu vermessenden Probe und das injizierte Volumen der Referenzprobe im wesentlichen genau gleich sind und daß jedes Volumenen genau bekannt ist, um Differenzen der injizierten Volumina zu kompensieren.
Ein weiteres Problem bei der CE und bei anderen Systemen, die auf dem elektroosmotischen Strom beruhen, besteht darin, daß es schwierig ist, die elektroosmotische Strömungsgeschwindigkeit zu bestimmen und irgendwelche Änderungen bei diesem Durchsatz zu messen. Beispielsweise kann bei der CE die elektroosmotische Strömungsgeschwindigkeit in einer Kapillaren aus reinem Quarz von dem Material beeinflußt werden, das an der Wand bei der vorhergehenden Injizierung absorbiert wurde, was den Durchsatz ändern kann. Ähnlich kann der Durchsatz bei verschiedenen Kapillaren aufgrund einer Vielzahl von Faktoren unterschiedlich sein. Die elektroosmotische Strömungsgeschwindigkeit ändert sich auch als Folge einer Änderung der angelegten Spannung. Da die Strömungsgeschwindigkeit die Migrationszeiten der Analytpeaks beeinflußt, d. h. die gesamte Migrationsgeschwindigkeit des Analyten, kann das ein ernsthaftes Problem sein. Dies erlangt erhöhte Bedeutung, wenn ein Integrator verwendet wird, da die Integration zeitabhängig ist. So kann eine Verringerung des Durchsatzes bei einem Probendurchlauf zu einer Erhöhung der Peakfläche und umgekehrt führen.
Mit diesen beiden Begrenzungen befaßt sich die vorliegende Erfindung.
Die Patent Abstracts of Japan, vol. 10, no. 12, 1986 und JP-A- 60 169 764 beschreiben ein chromatographisches Verfahren zur Erzielung der Konzentration eines Ions aus dem Quotienten W/V, wenn W die Menge eines jeden Ions und V die Injektionsmenge einer Referenzlösung sind. W wird aus der proportionalen Beziehung zwischen jeder Ionenmenge und einem Peakflächenwert bestimmt. V wird durch die proportionale Beziehung zwischen der Injektionsmenge und einer wasserspezifischen Peakfläche bestimmt. Dieses Dokument offenbart eine Normierung von Variablitäten zwischen Chromatogrammen von Chromatographiedurchläufen einer Referenzprobe und einer zu vermessenden Probe nicht.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Beobachtung, daß, wenn bestimmte Meßarten bei der CE und anderen Arten der Chromatographie verwendet werden, ein "wasserspezifischer Peak" in dem Detektorhintergrund auftritt, da das der injizierten Probe zugeordnete Wasser durch den Detektor wandert. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren der Normierung oder Standardisierung von zwei oder mehreren Chromotographie- oder CE-Durchläufen durch Verwendung der Information, die in dem wasserspezifischen Peak enthalten ist.
Wasserspezifische Peaks sind in bestimmten Chromatographiesystemen bekannt, obwohl ihre Bedeutung niemals realisiert wurde. Beispielsweise beschreibt J. Stillian, Liquid Chromatography, September 1985, einen verbesserten Kompressor für die Ionenchromatographie, wobei in den Figuren typische wasserspezifische Peaks zu sehen sind und Fig. 2 den Einfluß des wasserspezifischen Peaks auf die Quantifizierung bei hoher Empfindlichkeit zeigt. Diese Systeme können Borat-/ oder Karbonat-Eluationsmittel verwenden und die wassersapezifischen Peaks sind im allgemeinen wertlos, da sowohl der Durchsatz als auch das Injektionsvolumen bekannt sind. Wasserspezifische Peaks wurden auch in der Kapillarelektrophorese aufgezeigt, siehe beispielsweise Foret et al., J. Chrom. 470: 299-308 (1989). Gelegentlich kann der wasserspezifische Peak von Nachteil sein, weil er mit einer genauen Quantifizierung früh eluierender Peaks interferiert. Beispielsweise wurde berichtet, daß der wasserspezifische Peak die Analyse von früh eluierenden Peaks beeinträchtigt, siehe P. R. Haddad et al., Ion Chromatography: Principles and Applications, Elsevier Science Publishing Co., Seite 263 (1990), D. T. Gjerde und I. S. Fritz, Ion Chromatography, Alfred Huthig Verlag, Seite 127 (1987) sowie E. L. Johnson, Ion Chromatographie, Marcel Dekker Inc., J. G. Tarter, Ed. Seite 5-6 (1987).
Der wasserspezifische Peak ist das Ergebnis einer Probe, die in ein Chromatographie-System aufgegeben wird, wenn das Probenverdünnungsmittel eine Zusammensetzung hat, die sich von der Zusammensetzung des Systembetriebspuffers unterscheidet. Wenn ein Detektor verwendet wird, der in der Lage ist, diese Differenz zwischen dem Probenverdünnungsmittel und dem Systembetriebspuffer zu messen, führt der Durchgang des Probenverdünnungsmittels durch den Detektor zu einer Änderung des Detektorausgangssignals. Häufig ist das Probenverdünnungsmittel so beschaffen, daß seine Eigenschaften "geringer" sind als die Eigenschaften des Systembetriebspuffers. Bei der konduktormetrischen Messung werden beispielsweise ionische Proben in Wasser verdünnt, wobei das Wasser weniger leitend als der Systembetriebspuffer ist. Dies ergibt einen "wasserspezifischen Peak", wenn das Probenverdünnungsmittel Wasser durch den Detektor hindurchgeht. Bei der indirekten photometrischen Messung hat das Wasser der Probe ein geringeres Absorptionsvermögen als der Systembetriebspuffer, der üblicherweise ein hohes Absorptionsvermögen hat. Daraus ergibt sich aus dem Durchgang des Wassers durch die Detektorzelle ein Ansprechen des Detektors, das gewöhnlich negativ ist. Das gleiche gilt für die indirekte Fluoreszenzmessung. Bei der direkten photometrischen Messung oder Fluoreszenzmessung ist häufig auch dann, wenn der Betriebspuffer ein niedriges Absorptionsvermögen oder eine geringe Fluoreszenz bei den gewählten Messbedingungen hat, sein Absorptionsvermögen dennoch größer als das des Probenverdünnungsmittels, so daß ein wasserspezifischer Peak erzeugt wird. Es ist auch möglich, daß das Probenverdünnungsmittel ein größeres Absorptionsvermögen oder eine größere Fluoreszenz als der Betriebspuffer hat. In diesem Fall wird ein wasserspezifischer Peak erzeugt.
Bei der Kapillarelektrophorese befinden sich die Probenionen oder andere Verbindungen häufig in Wasser. Da das Wasser in dem Probenvolumen nicht ionisiert ist, bewegt es sich die Kapillare hinab mit der gleichen Geschwindigkeit wie die Elektrolytmasse als Folge der elektroosmotischen Strömung. Das zu der Probe gehörende Wasser hat eine geringere Leitfähigkeit als die Elektrolytmasse und verursacht eine Einsekung des Detektorausgangssignals, wenn es durch die Leitfähigkeitszelle hindurchgeht.
Die Erfindung beruht auf der Ermittlung, daß die in dem wasserspezifischen Peak enthaltenen Information für die Standardisierung und Normierung der Chromatographiedurchläufe und insbesondere von CE-Durchläufen besonders nützlich ist. Die Anmelder haben festgestellt, daß es eine Beziehung zwischen einer Fläche des wasserspezifischen Peaks und einem Durchlauf einer Referenzprobe der Fläche des wasserspezifischen Peaks und einem Durchlauf einer zu vermessenden Probe gibt, so daß ein Vergleich dieser beiden Flächen die Korrelierung der Konzentration der Referenzprobe mit der Konzentration der zu vermessenden Probe erlaubt. Diese Beziehung kann auf mehr als eine Art ermittelt werden.
Insbesondere ist die Fläche des wasserspezifischen Peaks eine direkte Messung des injizierten Volumens der zu vermessenden Probe welches das Wasser enthält. In verschiedenen Chromatographiesystemen und insbesondere bei CE-Systemen ist die elektroosmotosche Strömung eine "plug"-Strömung. Somit ist die Breite des wasserspezifischen Peaks oder seine Fläche erforderlichenfalls korrigiert bezüglich irgendwelcher Änderungen in der elektroosmotischen Strömung ein direktes Maß des Volumens der injizierten Probe, die das Wasser enthält. Dies ermöglicht einen Vergleich und eine Quantifizierung der zu vermessenden Probe mit der Referenzprobe, was bisher schwierig war. Dadurch wird die Genauigkeit der Quantifizierung in bestimmten Chromatographiesystemen insbesondere in CE-Systemen beträchtlich verbessert.
Deshalb gehört zur vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Normieren der Injektionsvolumenvariabilitäten von Chromatogrammen von Durchläufen von Referenzproben und Durchläufen von zu vermessenden Proben. Zunächst wird ein Chromatogramm einer Referenzprobe oder eines Satzes von Referenzproben bekannter Konzentration erzeugt. Dann wird wenigstens ein Chromatogramm eines Chromatographiedurchlaufs einer interessierenden zu vermessenden Probe oder von interessierenden zu vermessenden Proben erzeugt. Es wird die Fläche des wasserspezifischen Peaks für den Referenzprobendurchlauf bestimmt, vorzugsweise durch Verwendung eines an dem Detektor befestigten Integrators. Ferner wird die Fläche der Referenzprobenpeaks oder des Referenzprobenpeak bestimmt. Dann läuft die Probe durch und es werden die Fläche des wasserspezifischen Peaks des Probendurchlaufs und die Fläche der Peaks der zu vermessenden Proben bestimmt. Anschließend werden die Peakflächen des wasserspezifischen Peaks der zu vermessenden Probe und der Probenkomponenten unter Verwendung der Gleichung normiert:
Normierte Peakfläche = (gemessene Peakfläche).
Flächewdstd/FlächewdProbe)
wobei die Flächewdstd die Fläche des wasserspezifischen Peaks des Referenzprobendurchlaufs und die FlächewdProbe die Fläche des wasserspezifischen Peaks des Durchlaufs der zu vermessenden Probe ist. Diese Berechnung wird für jeden Peak der zu vermessenden Probe sowie für den wasserspezifischen Peak des Durchlaufs der zu vermessenden Probe durchgeführt. Die zu vermessenden Proben können dann unter Verwendung der Gleichung quantifiziert werden:
Konzentration der zu vermessenden Probe = (normierte Peakfläche der zu vermessenden Probe)·(Konzentration der Referenzprobe/Peakfläche der Referenzprobe).
Dies erlaubt eine genaue Bestimmung der Konzentration einer zu vermessenden Probe. Auf diese Weise können der Durchlauf der Referenzprobe und der Durchlauf/die Durchläufe der zu vermessenden Proben für einen sinnvollen Vergleich standarisiert oder normiert werden.
Die Technik kann auch verwendet werden, wenn man beispielsweise absichtlich ein höheres Probenvolumen verwendet, um eine bessere Empfindlichkeit bezüglich der Kalibrierungen zu erhalten. Es ist nicht erforderlich, bei Verwendung des neuen Probenvolumens erneut zu eichen oder vorher das injizierte Volumen zu wissen. Es werden die gleichen oben gezeigten Gleichungen angewendet und es kann die genaue Analytkonzentration bestimmt werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung beruht auf der Verwendung des wasserspezifischen Peaks als Mittel zur Bestimmung der Strömungsgeschwindigkeit des Systembetriebspuffers in einem CE- oder Chromatographiesystem. Die Anmelder haben festgestellt, daß das Intervall zwischen dem Anfang des Durchlaufs und des Auftretens des wasserspezifischen Peaks für die Bestimmung der Strömungsgeschwindigkeit des Systembetriebspuffers zweckmäßig ist. Insbesondere haben die Anmelder festgestellt, daß die Beziehung zwischen der Migrationszeit des wasserspezifischen Peaks des Durchlaufs der Referenzprobe und die Migrationszeit des wasserspezifischen Peaks des Durchlaufs der zu vermessenden Probe jegliche Änderungen der Strömungsgeschwindigkeit des Systembetriebspuffers zwischen den beiden Durchläufen bestimmt. Somit kann diese Beziehung verwendet werden, um die Mobilität der Referenzproben mit der Mobilität der zu vermessenden Proben zu korrelieren.
Diese Beziehung zwischen der Migrationszeit des wasserspezifischen Peaks des Durchlaufs der Referenzprobe und des wasserspezifischen Peaks des Durchlaufs der zu vermessenden Probe ist besonders in CE-Systemen nützlich. Diese Beziehung erlaubt die Bestimmung jeglicher Änderungen der elektroosmotischen Strömungsgeschwindigkeit zwischen den beiden Durchläufen auf eine Vielzahl von Arten, von denen einige nachstehend erläutert werden.
Wie vorstehend erwähnt, kann sich die elektroosmotische Strömungsgeschwindigkeit bei der CE als Folge von auf der Oberfläche der Kapillaren angesammeltem absorbierten Material, des Einführens einer neuen Kapillare oder einer an der Kapillaren befestigten Membran oder einer Änderung der angelegten Spannung ändern. Diese Änderungen können zu einer Änderung der Migrationszeit der zu vermessenden Proben oder der Referenzproben führen. Durch Berechnen des Zeitintervalls zwischen dem Injizieren der zu vermessenden Probe und dem Auftreten des wasserspezifischen Peaks kann die Strömungsgeschwindigkeit für eine Kapillare mit bekannten Volumen bestimmt werden. Wenn einmal die elektroosmotische Strömungsgeschwindigkeit bekannt ist, kann die elektrophoretische Migrationsgeschwindigkeit für individuelle Referenzproben und Analyten berechnet werden, die für den Analyten oder die Referenzprobe charakteristisch und unabhängig von der elektroosmotischen Strömungsgeschwindigkeit, der Kapillarenlänge oder der angelegten Spannung ist. Da die elektrophoretische Migrationsgeschwindigkeit eine Schlüsselidentifizierungseigenschaft der Analytpeaks ist, ist die Fähigkeit, die elektrophoretische Migrationsgeschwindigkeit durch die Bestimmung der elektroosmotischen Strömungsgeschwindigkeit genau zu berechnen, signifikant.
Bei einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden die Chromatogramme folgendermaßen normiert. Zunächst wird ein Chromatogramm unter Verwendung eines Detektors erzeugt, der in der Lage ist, eine Änderung des Detektorausgangssignals als Folge einer Differenz zwischen dem Probenverdünnungsmittel und dem Systembetriebspuffer zu berichten. Dieses Chromatogramm ergibt sich aus einem Chromatographiedurchlauf wenigstens einer Referenzprobe bekannter Konzentration. Dann wird wenigstens ein Chromatogramm eines Chromatographiedurchlaufs einer interessierenden zu vermessenden Probe oder von interessierenden zu vermessenden Proben unter Verwendung des gleichen Detektors erzeugt. Es werden die Migrationszeiten des wasserspezifischen Peaks bei dem Durchlauf der Referenzprobe und der zu vermessenden Probe sowie die Migrationszeiten der Referenzproben und der zu vermessenden Proben bestimmt. Dann wird die normierte Migrationszeit nach der Gleichung berechnet: Normierte Migrationszeit = (gemessene Migrationszeit)·(Migrationszeitwdstd/MigrationszeitwdProbe), wobei die Migrationszeitwdstd die Migrationszeit des wasserspezifischen Peaks bei dem Durchlauf der Referenzprobe und die MigrationszeitwdProbe die Migrationszeit des wasserspezifischen Peaks des Durchlaufs der zu vermessenden Probe ist. Anschließend können die Peaks der zu vermessenden Proben über die normierte Retentionszeit identifiziert werden, indem die normierten Migrationszeiten der zu vermessenden Proben mit den normierten Migrationszeiten der Referenzproben korreliert werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Elektropherogramme aus der CE folgenderweise normiert. Zunächst wird ein Elektropherogramm eines CE-Durchlaufs wenigstens einer Referenzprobe mit bekannter Konzentration erzeugt. Dann wird wenigstens ein Elektropherogramm eines CE-Durchlaufs einer interessierenden Probe oder von interessierenden Proben erzeugt. Es werden die Migrationszeiten des wasserspezifischen Peaks der Durchläufe der Referenzprobe und der zu vermessenden Probe sowie die Migrationszeit der Referenzproben und der zu vermessenden Proben bestimmt. Dann wird die elektrophoretische Mobilität der Referenzproben der zu vermessenden Proben nach der folgenden Gleichung berechnet:
Uep = L² (l/ts - l/tw)/V
wobei Uep die elektrophoretische Mobilität, L die Kapillarenlänge, V die angelegte Spannung, tw die Migrationszeit des wasserspezifischen Peaks und ts die Migrationszeit der zu vermessenden Probe sind. Dann werden die Peaks der zu vermessenden Proben über die elektrophoretische Mobilität durch Korrilieren der elektrophoretischen Mobilität der zu vermessenden Proben mit der elektrophoretischen Mobilität der Referenzproben identifiziert.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Normierung von Variabilitäten beschrieben, die Änderungen in der elektroosmotischen Strömungsgeschwindigkeit der Puffermasse der konduktometrischen CE in Systemen zugeordnet sind, wobei die Spannung und die Kapillare zwischen dem Referenzprobendurchlauf und den Durchläufen der zu vermessenden Proben nicht geändert werden In diesen Systemen kann der elektrophoretische Index jeder Referenzprobe und jeder zu vermessenden Probe, der der elektrophoretischen Mobilität ähnlich ist, verglichen oder korreliert werden.
Bei diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden, wie vorstehend erläutert, die Migrationszeiten der wasserspezifischen Peaks bei den Durchläufen der Referenzprobe und der zu vermessenden Probe bestimmt. Dann wird der elektrophoretische Index nach der Gleichung berechnet:
E = l/ts - l/tw
wobei E der elektrophoretische Index, tw die Migrationszeit des wasserspezifischen Peaks und ts die Migrationszeit der zu vermessenden Probe sind. Die Peaks der zu vermessenden Probe können dann über den elektrophoretischen Index identifiziert werden, indem der elektrophoretische Index der zu vermessenden Proben mit dem elektrophoretischen Index der Referenzproben korreliert oder verglichen wird. Auf diese Weise können die Variabilitäten des elektroosmotischen Durchsatzes normiert und sinnvolle Vergleiche zwischen den Referenzproben und den zu vermessenden Proben angestellt werden.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt die lineare Beziehung zwischen der Fläche des wasserspezifischen Peaks und der Fläche des Analytpeaks, wobei Extrapolationsergebnisse in einem gemeinsamen Schnittpunkt innerhalb eines experimentellen Fehlers sich am besten an Geraden anpassen.
Fig. 2 zeigt ein Referenzproben-Elektropherogramm für die unterdrückten konduktometrischen CE-Durchläufe von Beispiel 1.
Fig. 3 zeigt ein Referenzproben-Elektropherogramm für eine CE bei indirekter photometrischer Messung.

Definitionen

Der Ausdruck "Chromatographie" oder entsprechende Äquivalente schließen eine Anzahl unterschiedlicher Chromatographieverfahren ein. Zur Chromatographie kann beispielsweise die Ionenaustauschchromatographie, die Ionenausschlußchromatographie, die Normalphasen-Flüssigkeitschromatographie, die Flüssigkeitschromatographie mit umgekehrter Phase (HPLC), die Kapillarelektrophorese (CE), die Chromatofokussierung und die mizellare elektrokinetische Kapillarchromatographie (MECC) gehören.
Der Ausdruck "konduktometrische Kapillarelektrophorese oder entsprechende Äquivalente bezieht sich auf jedes Kapillarelektrophoresesystem, welches einen Leitfähigkeitsmesser als Verfahren der Peakmessung verwendet. Durch die Definition sind sowohl unterdrückte als nicht unterdrückte CE-Systeme eingeschlossen.
Unter dem Ausdruck "Chromatogramme" oder entsprechenden Äquivalenten sind die zeitabhängigen Aufzeichnungen eines Chromatographiedurchlaufs, d. h. die zeitabhängige Aufzeichnung der Detektormessung mit Peaks, die sich aus Änderungen des Detektorausgangssignals ergeben, wenn die zu vermessenden Proben durch die Messzelle hindurchgehen. Der Ausdruck wird unter Berücksichtigung des Messverfahrens verwendet. Der Ausdruck umfaßt Elektrophergramme, die für CE-Durchläufe spezifisch sind. Elektropherogramme schließen CE-Durchläufe ein, die eine Leitfähigkeitsmessung verwenden, die sich aus Änderungen in der Leitfähigkeit der zu vermessenden Probe ergeben, wenn sie durch den Leitfähigkeitsmesser hindurchgehen. Diese Peaks sind das Ergebnis einer Differenz in der Leitfähigkeit und des sich ergebenden Detektoransprechens.
Die Peaks eines Chromatgramms oder eines Elektropherogramms können negativ oder positiv sein. Beispielsweise kann im Falle eines Elektropherogramms eines konduktometrischen CE-Durchlaufs ein Peak in dem Sinn negativ sein, dass er als Ergebnis des Durchlaufs der zu vermessenden Probe durch den Detektor weniger leitend als die Elektrolytmasse (wie im Falle der wasserspezifischen Peaks) ist. Die Peaks können auch positiv sein, wenn die durch den Leitfähigkeitsmesser hindurchgehende zu vermessende Probe stärker leitend als die Elektrolytmasse (wie im Falle eines Proben- oder Analytpeaks) ist.
Unter dem Ausdruck "wasserspezifische Peaks" oder entsprechender Äquivalente ist der negative Peak zu verstehen, der sich aus dem Durchgang des Wassers oder des Probenelektrolyten ergibt, in das bzw. in den die zu vermessende Probe auf dem CE-System durch den Leitfähigkeitsmesser hindurch injiziert wurde.
Unter dem Ausdruck "zu vermessende Probe" oder "Analyt" oder "Probenverbindungen" oder entsprechenden Äquivalenten ist jede Verbindung zu verstehen, die auf einem chromatographischen System zum Zwecke der Analyse durchlaufen kann. Es kann eine Verbindung sein, deren Identität unbekannt ist, oder es kann eine Verbindung sein, deren Konzentration unbekannt ist, oder beides. Es kann sich um ein Ion, ein Protein, um anorganische oder organische Moleküle, um Nukleinsäuren und andere Stoffe handeln. Natürlich ist die Verwendung dieser Worte im Singular oder Plural nicht beschränkend und darf die Auslegung der vorliegenden Erfindung und der Ansprüche nicht einschränken. Unter dem Ausdruck "Referenzprobe" oder entsprechenden Äquivalenten ist eine Verbindung zu verstehen, die auf einem konduktometrischen CE-System durchläuft und deren Identität und Konzentration bekannt ist. Die Verwendung des Worts "Referenzprobe" im Singular oder Plural ist natürlich nicht beschränkend und darf die Auslegung der vorliegenden Erfindung und der Ansprüche nicht einschränken.
Unter dem Ausdruck "Bestimmen der Fläche des wasserspezifischen Peaks von Proben" oder entsprechenden Äquivalenten ist jede Messung zu verstehen, die zur Bestimmung oder Approximierung der Fläche unter der Kurve eines Peaks auf einem Elektropherogramm verwendet wird. Man kann die ganze Fläche des Peaks entweder integrieren oder die Peakfläche durch Verwendung der Breite des Peaks an seiner Basislinie approximieren. Häufig wird dafür ein Standardintegrator verwendet, den es in vielen im Handel befindlichen Versionen gibt. Als relative Messung der Fläche unter der Kurve können jedoch auch andere Verfahren verwendet werden, beispielsweise das körperliche Ausschneiden des Peaks und das Wiegen des Papiers oder das Ausmessen der Breite des Peaks an seiner Basislinie von Hand.
Der wasserspezifische Peak ist gewöhnlich ein negativer Peak, was sich durch das Ansprechen des unteren Detektors auf das Wasser aus der Probeninjektion von der Elektrolymasse ergibt, während die Peaks der zu vermessenden Probe gewöhnlich positive Peaks sind, was sich aus einem erhöhten Detektoransprechen gegenüber der Elektrolytmasse ergibt. Die Richtung des Peaks ist für die Bestimmung der Fläche nicht von Bedeutung.
Unter dem Ausdruck "Normierung oder Standardisierung von Variabilitäten zwischen Elektropherogrammen" oder entsprechenden Äquivalenten ist der Prozess zu verstehen, durch welchen Differenzen oder Änderungen auf dem Durchlaufweg der zu vermessenden Proben oder Referenzproben korrigiert werden können. Dadurch werden Durchläufe der zu vermessenden Probe und Durchläufe der Referenzprobe normiert, wenn die Versuchsparameter identisch oder nahezu identisch sind. In der Verwendung bei der vorliegenden Erfindung bedeutet Normierung insbesondere die Korrektur oder Justierung der Änderungen in dem Probeninjektionsvolumen und der elektroosmotischen Strömungsgeschwindigkeit, so daß die EOF und das Probeninjektionsvolumen des Referenzdurchlaufs und die EOF und das Probeninjektionsvolumen des Durchlaufs der zu vermessenden Probe im wesentlichen gleich sind. Dies resultiert in der entsprechenden Normierung der Peaks der zu vermessenden Proben.
Unter dem Ausdruck "Systembetriebspuffer" oder ähnlicher Äquivalente ist der Hauptpuffer der Chromatographiesystems zu verstehen. Dabei handelt es sich um den Puffer, der konstant in die Säule oder Kapillare eingeführt wird. Der Betriebspuffer wird aufgrund einer Vielzahl von Parametern gewählt, zu denen die Verträglichkeit mit der zu vermessenden Probe, mit der Säule oder Kapillare von dem zu verwendenden Messverfahren gehören. Es kann ein Elektrolyt sein, was insbesondere bei der konduktometrischen CE der Fall ist. Es kann sich um einen Puffer handeln, der Fluoreszenzanzeiger enthält oder ein hohes Absorbtionsvermögen in Fällen der indirekten Fluoreszenzmessung bzw. der indirekten photometrischen Messung hat.

INS EINZELNDE GEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren der Standardisierung und Normierung von Chromatogrammen und insbesondere von Elektropherogrammen der CE. Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Normierung von Variabilitäten, die in Chromatogrammen zwischen CE-Durchläufen von Referenzproben und zu vermessenden Proben vorhanden sind.
Bei einer Ausführung bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Normierung von Variabilitäten, die den Differenzen in den Injektionsvolumina von zu vermessenden Proben zugeordnet sind. Dabei wird eine Referenzprobe injiziert und die Fläche des wasserspezifischen Peaks und der Referenzprobe bestimmt. Dann wird eine zu vermessende Probe injiziert und die Fläche des wasserspezifischen Peaks und der zu vermessenden Probe wird bestimmt. Die Peakfläche des Peaks der zu vermessenden Probe wird durch Verwendung der Gleichung normiert:
(1): Normierte Peakfläche = (gemessene Peakfläche)· Flächewdstd/FlächewdProbe)
wobei
die Flächewdstd die Fläche des wasserspezifischen Peaks im Durchlauf der Referenzprobe und die FlächewdProbe die Fläche des wasserspezifischen Peaks beim Durchlauf der zu vermessenden Probe ist. Wenn die normierten Peakflächen berechnet sind, werden die Konzentrationen der zu vermessenden Proben unter Verwendung der Gleichung berechnet:
(2) Konzentration der zu vermessenden Probe = (Normierte Peakfläche der zu vermessenden Probe)·(Referenzprobenkonzentration/Referenzprobenpeakfläche).
Die Konzentration der zu vermessenden Probe liegt somit in Einheiten der Referenzprobenkonzentration vor.
Bei einer anderen bevorzugten Ausgestaltung bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Normierung von Variablitäten, die den Differenzen in der Strömungsgeschwindigkeit des Systembetriebspuffers zugeordnet sind. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf Variabilitäten, die in der elektroosmotischen Strömung der Elektrolytmasse in der Kapillare der CE zugeordnet sind. Diese Differenzen ergeben sich unter anderem aufgrund einer Änderung oder Variabilität der Kapillaren, des an der Wand der Kapillaren absorbierten Materials oder aufgrund von Änderungen in der angelegten Spannung. neben anderen Dingen. Dies ist auch von Bedeutung, wenn ein Integrator bei der Flächenbestimmung der Peaks verwendet wird, da die Integration zeitabhängig ist und eine Änderung im Durchsatz eine Änderung der Fläche ergeben kann.
Variabilitäten der elektroosmotischen Strömungsgeschwindigkeit können auf mehrere Weisen unter Verwendung der folgenden Variablen und Gleichungen korrigiert werden.
Da das Wasser in dem Volumen der zu vermessenden Probe (oder in dem Volumen der Referenzprobe) noch ionisiert ist, bewegt es sich in der Kapillaren abwärts mit der gleichen Geschwindigkeit wie der Elektrolytmasse als Folge der elektroosmotischen Strömung. Dies wird in Gleichung (3) ausgedrückt zu
(3) Veo = L/tw
wobei Veo = die elektroosmotische Strömungsgeschwindigkeit in cm/s, L = die Länge der Kapillaren in cm und tw die Migrationszeit des wasserspezifischen Peaks in s sind.
Die gesamte Migrationsgeschwindigkeit ist die Vektorsumme der elektroosmotischen Strömungsgeschwindigkeit und der elektrophoretischen Geschwindigkeit, die in (4) ausgedrückt ist
(4) Vtot = Veo + Vep
wobei
Vtot = die gesamte Migrationsgeschwindigkeit in cm/s,
vep = die elektrophoretische Nettogeschwindigkeit in cm/s und
veo = die elektroosmotische Strömungsgeschwindigkeit in cm/s sind.
Zu vermerken ist, daß Vep entweder positiv oder negativ sein kann, was davon abhängt, ob das Ion der zu vermessenden Probe elektophoretisch zu der Auslaßelektrode hin oder von ihr weg wandert.
Eine Kombination von (3) und (4) ergibt (5)
(5) Vtot = L/tw + Vep
Vtot kann auch dadurch berechnet werden, daß die gesamte Migrationslänge durch die beobachtete Migrationszeit geteilt wird,
(6) vtot = L/ts
wobei
ts = die beobachtete Migrationszeit für das Ion der zu vermessenden Probe in s ist.
Kombiniert man (5) und (6) so ergibt sich (7)
(7) Vep = L(1/ts - 1/tw)
Eine Unordnung ergibt (8)
(8) Vep/L = 1/ts - 1/tw
Wenn L nicht geändert wird, kann der elektrophoretische Index Vep/L oder E, nämlich die elektrophoretische Geschwindigkeit pro Längeneinheit, als Identifizierungsindex verwendet werden, der von Veo unabhängig ist.
(9) E = 1/ts - 1/tw
wobei
E = Vep/L der elektrophoretische Index ist.
Wenn jedoch entweder die Länge der Kapillaren oder die Spannung zwischen den Kalibrierbedingungen und den Bedingungen für die zu vermessenden Proben geändert wird, nutzt man die elektrophoretische Mobilität. Die elektrophoretische Mobilität ist die elektrophoretische Geschwindigkeit pro Feldstärkeneinheit,
(10) Uep = Vep/(V/L) = VepL/V
wobei
uep = die elektrophoretische Mobilität cm²/Vs und
V = die gesamte angelegte Spannung in Volt ist.
Kombiniert man (8) und (9) so ergibt sich (10)
(10) uep = L² (1/ts - 1/tw)/V
Dadurch kann die elektrophoretische Mobilität uep aus den beobachteten Werten von ts und tw und den Werten L und V, die bekannt sind, berechnet werden.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren zum Normieren von Variabilitäten beschrieben, die den Änderungen der Strömungsgeschwindigkeit des Systembetriebspuffers in den Chromatographiesystem zugeordnet sind.
Bei einer bevorzugten Ausführung ist der als Migrationszeit eines speziellen Peaks gewählte Wert das Minimum oder Maximum des Peaks, was davon abhängt, ob der Peak negativ oder positiv ist. D. h., daß für die Bestimmung der Migrationszeit eines wasserspezifischen Peaks die Minima des Leitfähigkeitspeaks als Migrationszeit gewählt wird. Für den Peak einer zu vermessenden Probe oder einer Referenzprobe werden die Maxima des Leitfähigkeitspeaks gewählt. Alternative Ausführungen können den Anfang des Peaks oder das Ende des Peaks verwenden, solange der gleiche Parameter konsistent verwendet wird.
Bei einer bevorzugten Ausführung sind die zu vermessende Probe und die Referenzprobe 100% wässrig. Bei alternativen Ausführungen sind die zu vermessende Probe und die Referenzprobe der Zusammensetzung gleich, wenn ein anderes Lösungsmittel vorhanden ist.
Bei einer bevorzugten Ausführung kann die vorliegende Erfindung für die Erzeugung einer Referenzproben-Kalibrierkurve verwendet werden. Es werden Mehrfachinjektionen von Referenzproben bei unterschiedlichen Konzentrationen gemacht. Indem man einen Durchlauf als Bezugsgröße benutzt, werden die beobachteten Flächenansprechungen aus allen anderen Injektionen der Referenzproben normiert oder korreliert zur Verwendung der vorstehenden Techniken. Dann wird die normierte Peakfläche als Funktion der Konzentration aufgetragen. Dies ist eine Mehrpunktkalibrierung unter Verwendung des wasserspezifischen Peaks für Korrekturen in irgendeiner Änderung während der Kalibrierung.
Die vorliegende Erfindung findet Verwendung in jedem Chromatographiesystem, welches einen Detektor verwendet, der in der Lage ist, eine Änderung des Detektorausgangssignals als Folge einer Differenz zwischen dem Verdünnungsmittel einer zu vermessenden Probe und dem Systembetriebspuffer zu berichten. In einer bevorzugten Ausführung ist die Messung eine Leitfähigkeitsmessung, eine unterdrückte Leitfähigkeitsmessung, eine direkte oder indirekte photometrische Messung oder eine direkte oder indirekte Fluoreszenzmessung.
Aufgrund der Beschreibung der speziellen bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Verfahren zum Normieren und Stadardisierung von CE-Elektropherogrammen und aufgrund der ins Einzelne gehenden Angabe, wie diese Verfahren verwendet werden können, sowie durch Aufzeigen der erfolgreichen Normierung ovn CE- Elektropherogrammen, genügt die vorliegende Offenbarung, um den Fachmann in die Lage zu versetzen, dieses Wissen zur Erzeugung der Entdresultate durch äquivalente Einrichtungen zu verwenden, die insgesamt verfügbare Techniken bewnutzen.
Die folgenden Beispiele dienen dazu, die Art und Weise vollständiger zu beschreiben, in der die vorstehend beschriebene Erfindung genutzt wird, die zur Darlegung der besten Arten, die für die Ausführung verschiedener Aspekte der Erfindung in Betracht kommen. Natürlich dienen diese Beispiele in keiner Weise dazu, den wahren Umfang dieser Erfindung zu begrenzen, sondern werden nur zu erläuternden Zwecken aufgeführt.

BEISPIELE

Beispiel 1: Korrektur des elektroosmotischen Durchsatzes in einem unterdrückten konduktometrischen CE-System.

Das nachstehend beschriebene System ist im wesentlichen das gleiche, wie es in der US-Anmeldung offenbart ist.
Kapillare: 75 um Innendurchmesser, 60 cm Länge, Quarzglas
Elektrolyt: 2 mm Natriumborat
Spannung: 0.24 kV positiv
Injektion: Hydrostatisch -- 30 mm 10 s
Supressorregenerat: 0.10 mM Schwefelsäure
Zur Erstellung von Fig. 2, die ein Referenzproben-CE-Elektropherogramm ist, wurden 10 uM jeder der folgenden Verbindungen injiziert:
1. Karbonat
2. Chlorit
3. Fluorid
4. Phosphat
5. Chlorat
6. Perchlorat
7. Nitrat
8. Nitrit
9. Sulfat
10. Chlorid
11. Bromid
12. Chromat
Für die weitere Untersuchung wurden wegen ihrer guten Auflösung als nächstes die Peaks 5 bis 8 gewählt, die dem Chlorat, dem Perchlorat, dem Nitrat und dem Nitrit entsprechen. Jeder der Durchläufe für die zu vermessenden Probe benutzt die gleichen Bedingungen, wie sie oben angegeben sind. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. TABELLE 1 Tabelle der Rohdaten und der nach den wasserspezifischen Peaks korrigierten Daten aus dem unterdrückten CE-System
Mtwd ist die Migrationszeit für den wasserspezifischen Peak, Mt1 bis Mt4 stellen die Migrationszeit für die Peaks 5 bis 8 dar. Mt1corr bis Mt4corr stellen die berechnete elektrophoretische Geschwindigkeit vep dar, wobei vep = L (1/ts - 1/tw). U1 bis U4 ist die elektrophoretische Mobilität, uep = vepL/V. Der RSD für Mt für Rohdaten war beträchtlich größer als der RSD für Mt corr, was den Normierungseffekt der Berechnung für Änderungen im EO-Strom anzeigt. Auch die Referenzprobenabweichung U1 bis U4 lag gut innerhalb der Differenz zwischen den elektrophoretischen Mobilitäten, so daß uep zur Identifizierung der Verbindungen verwendet werden kann.

Beispiel 2: Korrektur des elektroosmotischen Durchsatzes in einem CE-System unter Verwendung der indirekten photometrischen Messung.

Kapillare: 1 bis 3 75 um Innendurchmesser, 50 cm Länge, Quarzglas
Elektrolyt: 5.0 mM Kaliumhydrogenphthalat, 0,5 mM Tetradecyl- Trimethyl-Ammoniumbromid (TTAB), 2.0 mM Natriumborat, pH 5,9
Spannung: 15 kV negativ
Injektion: Unter dem Einfluß der Schwerkraft, 100 mm für 2 s
Supressorregenerat: 10 mN Schwefelsäure.
Es werden drei verschiedene Kapillaren verwendet. In dem Referenzprobendurchlauf werden zwei Referenzproben verwendet, 2 ppm Fluorid und 15 ppm Phospat. Wie in Tabelle 2 gezeigt ist, sind Mt1 und Mt2 die Retentiofiszeiten für die Referenzproben. Mt1 corr und und Mt2 corr stellen die berechneten elektrophoretischen Geschwindigkeit vep dar, wobei vep = L (1/ts - 1/tw). U1 und U2 sind die elektrophoretische Mobilität, wobei Uep = vep·L/V. Wie die Daten in Tabelle 2 zeigen, ermöglicht dieses Vefahren die Standardisierung auch, wenn unterschiedliche Kapillare verwendet werden. TABELLE 2 Tabelle der Rohdaten und der nach dem wasserspezifischen Peak korrigierten Daten aus dem indirekten photometrischen CE-System

Beispiel 3: Korrelieren des Probenvolumens mit dem Volumen des wasserspezifischen Peaks.

Es läuft das System von Beispiel 1 mit der Ausnahme, daß das injizierte Volumen der zu vermessenden Probe absichtlich geändert wurde. Bei dem Durchlauf werden vier getrennte Analytpeaks verwendet, nämlich Iodat, Fluorid, Chlorat und Nitrat. Die Aufzeichnung der Fläche des wasserspezifischen Peaks über der Aufzeichnung des Analytpeaks ist in Fig. 1 zu sehen. Dieses Beispiel veranschaulicht die Korrelierung der Größe oder Fläche des wasserspezifischen Peaks mit der Größe oder Fläche der Peaks der zu vermessenden Proben.

Beispiel 4: Korrektur der Probeninjektionsvolumina

Ein Chromatographiesystem oder ein CE-System kann einen Durchlauf haben, wie er in den Beispielen 1 und 2 beschrieben ist, oder ein anderes übliches Chromatographiesystem benutzen, solange das System die Erzeugung eines Chromatogramms oder eines Elektropherogramms ermöglicht. Der verwendete Detektor ist vorzugsweise funtkionsmäßig mit einem Integrator oder einer anderen Datensammelvorrichtung verbunden, was jedoch nicht notwendig ist.
Die Konzentration der Analytpeaks kann wie folgt berechnet werden. Zuerst erfolgt ein Durchlauf einer Referenzprobe oder eines Satzes von Referenzproben, ansachließend wenigstens ein Durfchlauf von zu vermessenden Proben mit unbekannter Konzentration. Dann wird die normierte Peakfläche des ersten Peaks der zu vermessenden Probe nach der Gleichung berechnet: Normierte Peakfläche = (gemessene Peakfläche)·(Flächewd std/FlächewdProbe). Anschließend wird die Probenkonzentration unter Verwendung der Gleichung berechnet Konzentration der zu vermessenden Probe = (Normierte Peakfläche der zu vermessenden Probe)·(Referenzprobenkonzentration/Referenzproben-Peakfläche).
Dies kann für so viele Peaks der zu vermessenden Probe wie erforderlich wiederholt werden.
Alternativ kann die Peakbreite des wasserspezifischen Peaks an der Basislinie in Sekunden für Korrektur der Vermessungsproben-Peak-Konzentration verwendet werden.

Claims

1. Verfahren zum Normieren von Variabilitäten zwischen Chromatogrammen von Chromatographiedurchläufen, wobei die Variabilitäten der Injektion der zu vermessenden Proben zugeordnet sind und sich aus den Differenzen im Injektionsvolumen der zu vermessenden Proben ergeben, die die Chromatogramme der zu vermessenden Proben ändern, mit den Schritten

(1) Erzeugen eines Chromatogramms wenigstens einer Referenzprobe mit bekannter Konzentration und wenigstens eines Chromatogramms für eine zu vermessende Probe mit unbekannter Konzentration, wobei die Chromatogramme unter Verwendung eines Meßverfahrens erzeugt werden, das zu einer Änderung des Detektorausgangssignals als Folge einer Differenz zwischen dem Verdünnungsmittel der zu vermessenden Probe und dem Systembetriebspuffer führt,

(2) Bestimmen der Fläche unter dem wasserspezifischen Peak, den Peaks der Referenzproben und den Peaks der zu vermessenden Proben für jedes Chromatogramm

und

(3) Verwenden der Beziehung zwischen der Fläche unter dem wasserspezifischen Peak des Durchlaufs der Referenzprobe und der Fläche unter dem wasserspezifischen Peak des Durchlaufs der zu vermessenden Probe zur Korrelierung der Konzentration der zu vermessenden Probe mit der Konzentration der Referenzprobe.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem die Änderung des Detektorausgangssignals sich aus einer Differenz zwischen dem Probenlösungsmittel und dem Elektrolyten des Systembetriebspuffers ergibt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, bei welchem das Meßverfahren aus der konduktometrischen Messung, der unterdrückten konduktometrischen Messung, der direkten oder indirekten photometrischen Messung und der direkten oder indirekten Fluoreszenzmessung ausgewählt wird.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei welchem die Chromatogramme Kapillarelektrophorese-Elektropherogramme sind.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei welchem zu Schritt (3) gehören

(a) Berechnen der normierten Peakflächen für die Peaks der zu vermessenden Proben und für den wasserspezifischen Peak des Durchlaufs der zu vermessenden Probe nach der Gleichung normierte Peakfläche = (gemessene Peakfläche)· (Flächewdstd/FlachewdProbe), wobei die Flächewdstd die Fläche unter dem wasserspezifischen Peak des Durchlaufs der Referenzprobe und die FlächewdProbe die Fläche unter dem wasserspezifischen Peak des Durchlaufs der zu vermessenden Probe sind, und

(b) Bestimmen der Konzentration der zu vermessenden Probe nach der Gleichung Konzentration der zu vermessenden Probe = (normierte Peakfläche der zu vermessenden Probe)·(Konzentration der Referenzprobe/Peakfläche der Referenzprobe).

6. Verfahren nach Anspruch 5, bei welchem die Variabilitäten sich ferner aus Änderungen der Strömungsgeschwindigkeit des Systemelektrolyten ergeben und das Verfahren weiterhin die Schritte aufweist:

(4) Bestimmen einer Migrationszeit des wasserspezifischen Peaks der Referenzproben und der zu vermessenden Proben in den Durchläufen der Referenzproben und der zu vermessenden Proben,

(5) Berechnen von normierten Peakmigrationszeiten nach der Gleichung

Normierte Migrationszeit = (gemessene Migrationszeit)·(Migrationszeitwdstd/Migrationszeitwd Probe),

wobei

die Migrationszeitwdstd die Migrationszeit des wasserspezifischen Peaks in dem Durchlauf der Referenzproben und die MigrationszeitwdProbe die Migrationszeit des wasserspezifischen Peaks in dem Durchlauf der zu vermessenden Proben sind, und

(6) Identifizieren von Peaks der zu vermessenden Proben durch normierte Migrationszeit über die Korrelierung der normierten Migrationszeiten der zu vermessenden Proben mit den normierten Migrationszeiten der Referenzproben.

7. Verfahren nach Anspruch 5, bei welchem die Variabilitäten sich weiterhin aus Änderungen der elektroosmotischen Strömungsgeschwindigkeit der Kapillarelektrophorese ergeben, wobei das Verfahren weiterhin die Schritte aufweist

(4) Bestimmen der Migrationszeit des wasserspezifischen Peaks der Referenzproben und der zu vermessenden Proben in den Durchläufen der Referenzproben und der zu vermessenden Proben,

(5) Berechnen der elektrophoretischen Mobilität einer jeden der Referenzproben und der zu vermessenden Proben nach der Gleichung

Uep = L² (l/ts - l/tw)/V

wobei Uep die elektrophoretische Mobilität, L die Kapillarenlänge, V die angelegte Spannung, tw die Migrationszeit des wasserspezifischen Peaks und ts die Migrationszeit der zu vermessenden Probe sind und

(6) Identifizieren von Peaks der zu vermessenden Proben durch elektrophoretische Mobilität über die Korrelierung der elektrophoretischen Mobilität der zu vermessenden Proben mit der elektrophoretischen Mobilität der Referenzproben.

8. Verfahren nach Anspruch 5, bei welchem die angelegte Spannung und die Kapillare zwischen den Durchläufen der Referenzproben und den Durchläufen der zu vermessenden Proben nicht geändert wurden, wobei das Verfahren weiterhin die Schritte aufweist

(4) Bestimmen der Migrationszeit des wasserspezifischen Peaks der Referenzproben und der zu vermessenden Proben in den Durchläufen der Referenzproben und den Durchläufen der zu vermessenden Proben,

(5) Berechnen des elektrophoretischen Index bei jeder Referenzprobe und jeder zu vermessenden Probe nach der Gleichung

E = l/ts - l/tw

wobei E der elektrophoretische Index, tw die Migrationzeit des wasserspezifischen Peaks und ts die Migrationszeit der zu vermessenden Probe sind, und

(6) Identifizieren von Peaks der zu vermessenden Proben durch den elektrophoretischen Index über die Korrelierung des elektrophoretischen Index der zu vermessenden Proben mit dem elektrophoretischen Index der Referenzproben.

9. Vorrichtung zum Normieren und Standardisieren von Variabilitäten zwischen Chromatogrammen von Chromatographiedurchläufen von Referenzproben und zu vermessenden Proben, wobei die Variabilitäten der Injektion der zu vermessenden Proben zugeordnet sind und sich aus Differenzen in dem Injektionsvolumen der zu vermessenden Proben ergeben, die die Chromatogramme der zu vermessenden Proben ändern,

(1) mit einer Chromatographie-Trenneinrichtung zum Trennen von Mischungen (Verbindungen) der zu vermessenden Proben,

(2) mit einer Detektoreinrichtung zum Erzeugen eines Chromatogramms mit Peaks, wobei die Detektoreinrichtung in der Lage ist, eine Änderung des Detektorausgangssignals als Folge einer Differenz zwischen dem Verdünnungsmittel der zu vermessenden Probe und dem Systembetriebspuffer anzugeben,

(3) mit einer Integriereinrichtung, die funktionsmäßig mit der Detektoreinrichtung zum Berechnen einer Fläche unter dem wasserspezifischen Peak, unter den Peaks der zu vermessenden Proben und unter den Peaks der Referenzproben, die den Chromatogrammen zugeordnet sind, gekoppelt ist, und

(4) mit einer Analyseeinrichtung, die funktionsmäßig mit der Integrationseinrichtung gekoppelt und für ein Bestimmen einer Beziehung zwischen der berechneten Fläche unter dem wasserspezifischen Peak des Durchlaufs der Referenzproben und der berechneten Fläche unter dem wasserspezifischen Peak des Durchlaufs der zu vermessenden Proben so angeordnet ist, daß die Konzentration der zu vermessenden Probe mit der Konzentration der Referenzprobe korreliert werden kann.

10. Vorrichtung nach Anspruch 9, bei welcher die Detektoreinrichtung aus der konduktometrischen Messung, der unterdrückten konduktometrischen Messung, der direkten oder indirekten photometrischen Messung und der direkten oder indirekten Fluoreszenzmessung ausgewählt ist.

11. Vorrichtung nach Anspruch 9 oder Anspruch 10, bei welcher die Analyseeinrichtung

(a) eine Einrichtung zum Berechnen der normierten Peakflächen der Peaks der zu vermessenden Proben und des wasserspezifischen Peaks des Durchlaufs der zu vermessenden Probe nach der Gleichung

Normierte Peakfläche = (gemessene Peakfläche)· (Flächewdstd/FlächewdProbe),

wobei

die Flächewdstd die Fläche des wasserspezifischen Peaks des Durchlaufs der Referenzproben und die FlächewdProbe die Fläche unter dem wasserspezifischen Peak des Durchlaufs der zu vermessenden Proben sind und

(b) eine Einrichtung zum Bestimmen der Konzentration der zu vermessenden Proben nach der Gleichung aufweist

Konzentration der zu vermessenden Probe = (normierte Peakfläche der zu vermessenden Probe)·(Konzentration der Referenzprobe/Peakfläche der Referenzprobe).

12. Vorrichtung nach Anspruch 9 oder Anspruch 10, bei welcher die Analyseeinrichtung

(a) eine Einrichtung zum Berechnen der normierten Migrationszeiten der Peaks der zu vermessenden Proben und des wasserspezifischen Peaks des Durchlaufs der zu vermessenden Probe nach der Gleichung

Normierte Migrationszeit = (gemessene Migrationszeit)(Migrationszeitwdstd/MigrationszeitwdProbe aufweist, wobei

die Migrationszeitwdstd die Migrationszeit des wasserspezifischen Peaks des Durchlaufs der Referenzprobe und die MigrationszeitwdProbe die Migrationszeit des wasserspezifischen Peaks des Durchlaufs der zu vermessenden Proben sind.

13. Vorrichtung nach Anspruch 9 oder Anspruch 10, bei welcher die Analyseeinrichtung eine Einrichtung zum Berechnen des elektrophoretischen Index jeder Referenzprobe und jeder zu vermessenden Probe nach der Gleichung

E = l/ts - l/tw

aufweist, wobei E der elektrophoretische Index, tw die Migrationszeit des wasserspezifischen Peaks und ts die Migrationszeit der zu vermessenden Probe sind.

14. Vorrichtung nach Anspruch 9 oder Anspruch 10, bei welcher die Variabilitäten sich weiterhin aus Änderungen der elektroosmotischen Strömungsgeschwindigkeit ergeben, wobei die Vorrichtung weiterhin

(5) eine Zeiteinrichtung zum Bestimmen der Migrationszeit der wasserspezifischen Peaks, der Peaks der Referenzproben und der Peaks der zu vermessenden Proben sowie

(6) eine Analyseeinrichtung aufweist, die funktionsmäßig mit der Zeiteinrichtung zum Bestimmen einer Beziehung zwischen der elektrophoretischen Mobilität der Peaks der Referenzproben und der elektrophoretischen Mobilität der Peaks der zu vermessenden Proben basierend auf einer Beziehung der Migrationszeit des wasserspezifischen Peaks des Durchlaufs der Referenzproben und der Migrationszeit des wasserspezifischen Peaks des Durchlaufs der zu vermessenden Proben gekoppelt ist.

15. Vorrichtung nach Anspruch 14, bei welcher die Analyseeinrichtung (6)

(A) eine Einrichtung zum Berechnen normierter Peakflächen der Peaks der zu vermessenden Proben nach der Gleichung

Normierte Peakfläche = (gemessene Peakfläche)· (Flächewdstd/FlächewdProbe)

wobei

die Flächewdstd die Fläche des wasserspezifischen Peaks des Durchlaufs der Referenzprobe und die FlächewdProbe die Fläche des wasserspezifischen Peaks des Durchlaufs der zu vermessenden Probe sind,

(B) eine Einrichtung zum Bestimmen der Konzentration der zu vermessenden Probe nach der Gleichung Konzentration der zu vermessenden Probe = (normierte Peakfläche der zu vermessenden Probe)·(Konzentration der Referenzprobe/Peakfläche der Referenzprobe) und

(C) eine Einrichtung zur Berechnung der elektrophoretischen Mobilität der Referenzproben und der zu vermessenden Proben nach der Gleichung

Uep = L&sub2; (l/ts - l/tw)V

aufweist, wobei Uep die elektrophoretische Mobilität, L die Kapillarenlänge, V die angelegte Spannung, tw die Migrationszeit des wasserspezifischen Peaks und ts die Migrationszeit der zu vermessenden Probe sind.