JPH07507879A - クロマトグラフィー分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ■＝印加電圧、 ｊ＝＝ウォーター・ディップの泳動時間、ｂ＝試料の泳動時間、 である； によって算出する工程と、 （４）試料の電気泳動度を標準液の電気泳動度と相関させることにより、電気泳 動度によって試料のピークを確認する工程とを、含むことを特徴とする方法。

１０、前記検知方法は、電気伝導度検知、抑制電気伝導度検知、直接又は間接光 度検知、並びに直接又は間接蛍光検知からなる群から選択されることを特徴とす る請求項９記載の方法。

及び標準液の泳動時間における相違に帰着する規準化方法において、（１１少な くとも一つの標準液の電気泳動図、及び関心のある試料の少なくとも一つの電気 泳動図を作成する工程であって、前記電気泳動図は、試料希釈剤とシステムの電 解質との間の相違の結果として検知器出力における変化に帰着する検知方法を利 用して作成される工程と、（２）標準液試験及び試料試験におけるウォーター・ ディップ、標準液及び試料の泳動時間を測定する工程と、 （３）を気泳動指数を、式： ％式％ ｉ＝＝ウォーター・ディップの泳動時間、ｔ８＝試料の泳動時間 である。

によって算出する工程と、 （４）試料の電気泳動指数を標準液の電気泳動指数と相関させることにより、電 気泳動指数によって試料のピークを確認する工程とを、含むことを特徴とする方 法。

１２、前記検知手段は、電気伝導度検知、抑制電気伝導度検知、直接又は間接光 度検知、並びに直接又は間接蛍光検知からなる群から選択されることを特徴とす る請求項１１記載の方法。

１３、請求項４に記載の方法であって、（り標準液試験及び試料試験におけるウ ォーター・ディップ、標準液及び試料の泳動時間を測定する工程と、 （２）標準液及び試料各々の電気泳動度を、式：％式％） Ｌ＝細管の長さ、 ■＝印加電圧、 ｔ、＝ウォーター・ディップの泳動時間、１、＝試料の泳動時間、 である； によって算出する工程と、 （３）試料の電気泳動度を標準液の電気泳動度と相関させることにより、電気泳 動度によって試料のピークを確認する工程とを、更に含むことを特徴とする方法 。

＋４．前記検知手段は、電気伝導度検知、抑制電気伝導度検知、直接又は間接蛍 光検知、並びに直接又は間接光度検知からなる群から選択されることを特徴とす る請求項１３記載の方法。

１５、印加電圧及び細管が変更されない請求項４記載の方法であって、ｆｌｌ　 標準液試験及び試料試験におけるウォーター・ディップ、標準液及び試料の泳動 時間を測定する工程と、 ＋２１　Ｋ気泳動指数を、式： ％式％ ｔ、＝ウォーター・ディップの泳動時間、１、＝試料の泳動時間 である： によって算出する工程と、 （３）試料の電気泳動指数を標準液の電気泳動指数と相関させることにより、電 気泳動指数によって試料のピークを確認する工程とを、更に含むことを特徴とす る方法。

１６、標準液クロマトグラフィー試験及び試料クロマトグラフィー試験のクロマ トグラム間の変動性の規準化及び標準化のための装置であって、前記変動性は試 料の注入に関連し、前記変動性は試料のクロマトグラムを変化させる試料注入容 積の相違によって生じる装置において、（１１試料化合物を分離するためのクロ マトグラフィー分離手段と、（２）ピークを有するクロマトグラムを作成するた めの検知手段であって、試料希釈剤とシステムを流れる緩衝液との間の相違の結 果として、検知器出力における変化を報知することができる検知手段と、（３） 前記クロマトグラムに関連するウォーター・ディップ・ピーク、試料ピーク及び 標準液ピークの面積を算出するための、検知手段に実行可能に接続された積分手 段と、 （４）前記試料の濃度を前記標準液の濃度と相関させることができるよう、前記 標準液試験のウォーター・ディップの前記算出した面積と前記試料試験のウォー ター・ディップの前記算出された面積との間の関係を決定するための、前記積分 手段に実行可能に接続された分析手段とを、備えていることを特徴とする装ａ １７、前記検知手段は、電気伝導度検知、抑制電気伝導度検知、直接又は間接光 度検知、並びに直接又は間接蛍光検知からなる群から選択されることを特徴とす る請求項１６記載の方法。

１８、請求項１６に記載の装置であって、前記分析手段は、＋１１　試料ピーク 及び試料試験のウォーター・ディップの補正ピーク面積を、式：補正ピーク面積 ＝（測定ピーク面積）（面ＷＩｗｄ　ｓｔｄ／面積ｗｄ　ｓａｍｐｌｅ）ここで 、 面積ｗｄ　５ｔｄ＝標準液試験のウォーター・ディップの面積、面積ｗｄ　ｓａ ｍｐｌｅ＝試料試験のウォーター・ディップの面積である； によって算出するための手段と、 （２）試料の濃度を、式： 試料濃度＝（試料の補正ピーク面積）（標準液濃度／標準液のピーク面積）によ って決定するための手段とを、 含んでいることを特徴とする装置。

１９、請求項１６に記載の装置であって、前記分析手段は、（１＋　試料ピーク 及び試料試験のウォーター・ディップの補正ピーク泳動時間を、式： 泳動時間ｗｄ　５ｔｄ＝標準液試験のウォーター・ディップの泳動時間、泳動時 間ｗｄ　ｓａｍｐｌｅ＝試料試験のウォーター・ディップの泳動時間である： によって算出するための手段を、 含んでいることを特徴とする装置。

浸透流動速度の変化によって生じる装置において、（１）試料化合物を分離する ための細管電気泳動分離手段と、（２）ピークを育する電気泳動図を作成するた めの検知手段であって、試料希釈剤とシステムを流れる緩衝液との間の相違の結 果として、検知器出力における変化を報知することができる検知手段と、（３） 前記電気泳動図に関連するウォーター・ディップ・ピーク、標準液ピーク及び試 料ピークの泳動時間を測定するための、前記検知手段に実行可能に接続された時 間測定手段と、 （４）前記試料ピークの電気泳動度を、標準液試験のウォーター・ディップの泳 動時間及び試料試験のウォーター・ディップの泳動時間と相関させるための、前 記時間測定手段に実行可能に接続された分析手段とを、備えていることを特徴と する装置。

２１、請求項２０に記載の装置であって、前記分析手段は、標準液及び試料各々 の　−電気泳動度を、式： ％式％） Ｌ＝細管の長さ、 ■＝印加電圧、 １、＝ウォーター・ディップの泳動時間、１、＝試料の泳動時間、 である： によって算出するための手段を含んでいることを特徴とする装りｎ、前記検知手 段は、電気伝導度検知、抑制電気伝導度検知、直接又は間接光度検知、並びに直 接又は間接蛍光検知からなる群から選択されることを特徴とする請求項２０記載 の方法。

２３、請求項１６に記載の装置であって、前記分析手段は、電気泳動指数を、式 ：％式％ １、＝ウォーター・ディップの泳動時間、ｔａ＝試料の泳動時間 である： によって算出する手段を含んでいることを特徴とする装置。

２４、前記変動性は、電気浸透流動速度の変化によっても生じる請求項１６記載 の装置であって、 （１）ウォーター・ディップ・ピーク、標準液ピーク及び試料ピークの泳動時間 を測定するための時間測定手段と、 （２）標準液試験のウォーター・ディップの泳動時間と試料試験のウォーター・ ディップの泳動時間との関係に基づき、標準液ピークの電気泳動度と試料ピーク の電気泳動度との間の関係を決定するための、前記時間測定手段に実行可能に接 続された分析手段とを、 備えていることを特徴とする装置。

２５、請求項２４に記載の装置であって、前記分析手段は、（１１試料ピーク及 び試料試験のウォーター・ディップの補正ピーク面積を、式：補正ピーク面積＝ （測定ピーク面積）（面積ｗｄ　ｓｔｄ／面＠ｖｔｄ　ｓａｍｐｌｅ）ここで、 面積ｗｄ　５ｔａ＝標準液試験のウォーター・ディップの面積、面積ｗｄ　ｓａ ｍｐｌｅ＝試料試験のウォーター・ディップの面積である： によって算出するための手段と、 （２）試料の濃度を、式： 試料濃度＝（試料の補正ピーク面積）（標準液濃度／標準液のピーク面積）によ って決定するための手段と、 （３１ｅｌｆ！準液及び試料各々の電気泳動度を、式：％式％） し＝細管の長さ、 ■＝印加電圧、 ｔ、＝ウォーター・ディップの泳動時間、ｉ、＝試料の泳動時間、 である： によって算出するための手段とを、 含んでいることを特徴とする装置。

２６、前記検知手段は、電気伝導度検知、抑制電気伝導度検知、間接光度検知、 及び間接蛍光検知からなる群から選択されることを特徴とする請求項２５記載の 方法。

明細書 クロマトグラフィー分析法 発明の分野 本発明は、クロマトグラフィー・システムで得られたクロマトグラムの標準化方 法に関する。本発明は、細管電気泳動システムにおいて特に有用である。

発明の背景 細管電気泳動（ＣＥ）は、内径の小さな細管を利用する電気泳動技術である。Ｃ Ｅは、巨大分子を含むイオン種の分離方法を提供するものである。ＣＢの効率は 、比較的高く、即ち４００．０００理論段を越えることができるため、多くのい ろいろな用途が探求されている。

典型的なＣＥシステムは、適当な導電性の緩衝液を満たした５０〜１００μｍの 内径の珪素毛細管を含んでいる。細管の出口端は、緩衝液及び電極を収容した貯 液槽に浸漬されている。関心のあるイオンを含む試料を、細管の入口端に導入し た後、人口端を、緩衝液及び他の電極を収容した他の貯液槽に入れる。ＣＢに小 さな直径の細管が用いられるため、細管内に熱勾配が生じることなしに比較的高 い印加電圧を用いることができるため、電極は、１００ｃｍの細管あたり〜３０ ｋＶを送電することのできる給電ケーブルに接続される。細管内を泳動する種々 のイオン種の検知かできるよう、検知器が、二つの！極の間に配置されている。

そのように配置された検知器を、しばしばオン・カラム検知器と称する。ピーク の面積を測定することができるよう、検知器には、積分器が取り付けられている のが典型的である。

関心のある試料イオンの移動は、二つの要因：１を気泳動速度及び電気浸透流動 速度によって制御される。総合泳動速度は、これら二つの成分のベクトル和であ る。

電気泳動は、電場の影響下に逆符号に帯電した！極に向かう試料イオンの泳動で ある。あらゆる特定のイオンの電気泳動移動度は、単位電場強度あたりの電気泳 動速度である。

電気浸透流動（ＥＯＦ）は、細管内の緩衝液のバルク・フローである。ＥＯＦは 、可動な対イオンを含む緩衝液と接触している細管の内面の電荷に起因するもの である。例えば、未変性珪素細管表面は、緩衝液のｐｏが約２よりも高い場合に は負に帯ｔ（Ｓｉ−００し、ｐＨが約２よりも低い場合には正に帯ｔ’Ｗ（Ｓｉ −ＯＴｏつするシラノール（Ｓｉ−０）１）を有している。その池、より高いｐ Ｈで正に帯電した表面を得るため、疎水性カチオンを細管の内面に吸着させるこ ともできる。

表面が負に帯電していると、可動な対イオス例えば、ナトリウムイオン（Ｎａつ は、電場の影響下に泳動し、それらとともにプロセス・ドラッグ内をバルク溶剤 か泳動する。そのため、電気浸透流動の方向は、表面が負に帯電している場合に は、正から負の電極へと向かう。

表面か正に帯電していると、可動な対イオン、例えば、パイフォスフェートイオ ン（ＨＰＯ，”−）は、電場の影響下に泳動し、それらとともにプロセス・ドラ ッグ内をバルク溶剤が泳動する。そのため、電気浸透流動の方向は、表面が正に 帯電している場合には、負から正の電極へと向かう。

表面が帯電していない場合には、電気浸透流動は無く、被分析（ａｎａｌｙｔｅ ）イオンのあらゆる運動は、電気泳動移動度のみに起因する。

そのため、関心のあるイオンの電荷、細管表面の帯電の性質と程度、並びに印・ 加電圧の極性により、電気浸透は、電気泳動運動を増大させることも、中和する ことも、又はそれを越えることさえもできる。測定する試料成分が、細管の入口 端から細管の出口端の近くに配置された検知器へと進行しなければならないので 、それらの成分は、所望の方向に移動することが必要である。しかしながら、試 料の総合泳動速度は、電気泳動速度と電気浸透流動速度とのベクトル和であるた め、電気浸透流動の不存在下に試料が出口ｔｔｉから隔たる方に移動するような 試料の電荷があり得る。これらの条件下では、バルク溶液の電気浸透流動速度は 、被分析物の電気泳動移動度よりも大きいはずである。

ＣＥシステムに用いる検知器は、非常に重要であり、用いる検知器の種類は、通 常、分析下にある化合物の特性による。現在、ＣＢに利用されている多くの異な る検知器構成かある。これらの構成には、抑制及び非抑制電気伝導度検知のほか 、直接及び間接光度検知、直接及び間接蛍光検知がある。利用することのできる 他の種類の検知は、質量分析、放射分析及び他の電気化学的方法、例えば電流測 定である。これらの方法は、オン・カラム又はエンド・カラム、即ち出口電極よ りも後のある時点で用いることができる。

関心のあるほとんどの育種分子が、直接光度検知が実用的であるような相当な紫 外線吸収を示すが、非常に低い光吸収を示す多くの無機イオン又は脂肪族カルボ ン酸の場合には、この限りでない。そのため、これらの場合には、間接の光度又 は蛍光検知を利用するのがよい。例えば、間接蛍光検知が、Ｇｒｏｓｓ　ｅｔ　 ａｔ、。

Ａｎａｌ、Ｃｈｅｍ−６２：４２７−４３１（１９９０）；　Ｂａｃｔｙｔａｎ ｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｎ＋A６２６：２５９− ２６５（１９９２）　；及びＧｒｏｓｓ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊｏｊｒｎａｌ　ｏ ｆ　Ｃｈｒｏｍ、　４８０：１６９−１７８（１９８９）にL載さ れている。間接光度検知が、Ｐｏｒｅｔ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏ ｆ　Ｃｈｒｏｍ、　４７０：２９９−３０８（１９８９）；　Ｆｏｒｅｔ　ｅｔ 　ａｌ、、εＩｅｃｔｒａｐｈｏｒｅｓｒｓ　＋１ニア８Ｏ−７８３（１９９０ ）；及び’Ｈｅｎ５ｈａ撃戟@ｅｔ ａｌ、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｍ、　６０８：４１３−４１９（１９ ９２）に記載されている。加えて、電気移動度は、全てのイオンの固有の特性な ので、電気伝導度に基づく検知は、ＣＢの使用の多くに望ましい方法である。

しかしながら、電気伝導度検知器は、非選択性の内部特性検知器である。信号は 、電荷担体電解質イオンと被分析イオンとの当量導電率又は移動度の差から発生 する。ＣＢでは、電荷担体電解質イオンと被分析イオンとの移動度における大き な差は、過剰なピークのテーリング／フロンティングにつながり、このことは、 溶離剤イオンの選択に対する実用上の制限があることを意味する。最適な感度と 分離効率との間のこの矛盾は、ＣＢにおける非抑制電気伝導度の決定的な制限を 意味する。

電解質抑制、即ち緩衝液のバックグラウンド［ノイズ」が減少するような電解質 緩衝液の実施後の変化が、イオン・クロマトグラフィーに関して（例えば、米国 特許第３．８９７．２１３号、第３．９２０．３９７号、第３．９２５．０１９ 号、第３．９５６．５５９号、第４、４７４．６６４号、第４．７５１．００４ 号、第４．４５９．３５７号及び第４．９９９．０９８号参照）、並びに最近で はＣＥに関して（１９９１年ｌＯ月４日に出願され、参照することにより本明細 書に組み込まれている米国特許出願事０７／７７１．３３６号及び０７／７７１ ．５９７号参照）探求されてきた。これらのシステムは、「抑制」システムと称 する。

電気伝導度検知を利用する場合には、ＣＥ試験による電気泳動図の特徴は、光学 的に検知されたＣＥ試験のものとは異なっている。これらの現象は、本発明の主 題である。

ＣＥに関する一つの問題は、細管に導入する試料の容量が変化することがあるこ とであり、試料は、定量弁によってカラムに注入するのが容易でない。これは、 他のクロマトグラフィー・システムにおいても、多くのシステムが定量弁を実際 用いているが、問題である。これに代えて、ＣＢにおいて、試料は幾つかの態様 で細管に導入される。ＣＢに関する典型的な注入法は、試料又は標準液の入った バイアルを所定の長さの時間加圧すること（圧力注入）、又は電場を所定の長さ の時間印加すること（静電注入）である。このように、ＣＢ試料注入法は、注入 の時間に基づいている。このことは、時間、試料の粘度、圧力又は静水圧の高さ の小さな変動性が、注入された試料の容量に変動性に帰着することを意味する。

このことは、泳動時間及びピークのサイズに対して強い影響を育することがある 。

更に、これらの潜在的変動性は、試料ピークの定量化を困難にすることがある。

定量化は、試料の注入容量と標準液の注入容量とがほぼ正確に同じであること、 又は各々の容量が、注入容量の差を補正できるよう正確に分っていることを要す 度を測定することが困難であり、この速度の如何なる変化も検知するのが困難な ことである。例えば、ＣＥにおいて、裸の珪素細管内の電気浸透流動速度は、先 の注入により壁に吸着された流速を変化させる物質によって影響されることがあ る。

同様に、異なる細管の流速は、種々の要因によって異なることがある。電気浸透 流動速度は、印加電圧の変化の結果として変化することもある。流速は、被分析 物のピークの泳動時間、即ち、被分析物の総合泳動速度に影響を及ぼすので、こ のことは、深刻な問題である。このことは、積分器を用いる場合に、重要度が増 すが、それは、積分器は、時間に依存するため、試料試験に関する流速の低下が ピーク面積の増加に帰着し、逆のことも言えるからである。

これら二つの制限は、本発明によって取り組まれている。

発明の概要 本発明は、ＣＥ及び他の種類のクロマトグラフィーに成る種の検知が利用された 場合、注入した試料と混在する水が検知器を通って泳動する際、検知器のバック グラウンドに［ウォーター・ディップ（ｗａｔｅｒ　ｄｉｐ）Ｊが生じることを 観察することに基づいている。本発明は、ウォーター・ディップに含まれる情報 を用いることにより、２以上のクロマトグラフィー又はＣＥを基準化又は標準化 する方法を指向している。

つす−ター・ディップは、その重要性が認識されることはなかったが、成るり′ ロマトグラフィー・システムにおいては周知である。例えば、５ｔｉｌｌｉａｎ 、　Ｊ、。

Ｌｊｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、　Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　１９８ ５．は、イオン・クロマトグラフィー用の改良された抑制器を記載しており、典 型的なウォーター・ディップを図面に見ることができる。図２は、高感度での定 量化に対するウォーター・ディップの妨害を示している。これらのシステムは、 ホウ酸塩又は炭酸塩溶離剤を用いることができ、流速及び注入容量が分るので、 ウォーター・ディップは、概して重要ではない。細管電気泳動においても、ウォ ーター・ディップが示されている。例えば、Ｆｏｒｅｔ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、 　ＣｈｒｏｌＴｌ、４７０：２９９−３０８　（１９８９）を参照されたい。時 折、ウォーター・ディップは、早期に溶出するピークの正確な定量化を妨げるた め、悩みの種であることがある。例えば、ウォーター・ディップは、早期に溶出 するピークの分析を阻害することが報告されている。Ｈａｄｄａｄ、　Ｐ、Ｒ， ｅｔ　ａｌ、、　ｔｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌ ｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎｃ ｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃ潤Bｐａｇｅ ２６３　（１９９０）；　Ｇｊｅｒｄｅ、　Ｄ、Ｔ、　ａｎｄ　Ｆｒ１ｔｚ、　 Ｊ、Ｓ、、Ｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、　Ａｌ■窒■■ Ｈｕｔｈｉｇ　Ｖｅｒｌａｇ、　ｐａｇｅ　１２７．　（１９８７）　Ｊｏｈｏ ｎｓｏｎ、、　Ｅ、Ｌ、　：　ｒａｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ窒≠垂■凵B ＩＡａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ　Ｉｎｃ、、　Ｔａｒｔｅｒ、　Ｊ、Ｇ、　Ｅｄ 、、　ｐａｇｅ　５−６　（１９８７）を参照されたい。

ウォーター・ディップは、試料の希釈剤が、システムを流れる緩衝液の組成と異 なる組成を有している場合に、試料をクロマトグラフィー・システムに導入した 結果である。試料の希釈剤と、システムを流れる緩衝液との間のこの差異を検知 することのできる検知器を用いた場合には、試料希釈剤が検知器を通過すると、 検知器の出力が変化することになる。試料希釈剤は、その特性が、システムを流 れる緩衝液の特性よりも「低い」ことが多い。例えば、電気伝導度検知では、イ オン性試料を水で希釈すると、この水は、システムを流れる緩衝液よりも導電性 が低い。このことが、試料希釈水が検知器を通過する際に、「ウォーター・ディ ップ」に帰着する。間接光度検知では、試料の水は、システムを流れる緩衝液よ りも低い吸光度を有しており、この緩衝液は、吸光度が高いものであるのが典型 的である。そのため、水か検知器のセルを通過することによる検知器の反応は、 負であるのが典型的である。蛍光検知に関しても、同様である。直接光度検知又 蛍光性を存するが、それでもなお、その吸光度は、試料希釈剤の吸光度よりも大 きく、ウォーター・ディップが発生することが多い。試料希釈剤が、流れる緩衝 液よりも大きな吸光度又は蛍光性を存することもあり得るが、この場合には、水 のピークが生じる。

細管電気泳動では、試料のイオン又は他の化合物は、水中に存在していることが 多い。試料全体中の水はイオン化していないので、この水は、電気浸透流動の結 果として、バルク電解質と同じ速度で細管を移動する。試料と混在する水は、バ ルク電解質よりも低い導電率を有し、水が電気伝導度測定セルを通過する際に、 検知器の出力にディップを生じさせる。。

本発明は、ウォーター・ディップに含まれた情報は、クロマトグラフィー試験、 そして特に、細管電気泳動試験の標準化（ｓｔａｎｄａｒｉｚａｔｉｏｎ）及び 規準化（ｎｏｒｍａｒｉｚａＨｏｎ）に非常に育用であるという発見に基づくも のである。本出願人は、標準液試験のウォーター・ディップの面積と、試料試験 のウォーター・ディップの面積との間には、これら二つの面積の比較が、標準液 濃度と試料濃度との相関関係をもたらすという関係があることを発見したのであ る。この関係は、−以上の方法で決定することができる。

特に、ウォーター・ディップの面積は、水を含む注入試料の容積の直接の尺度で ある。種々のクロマトグラフィー・システム、そして特に細管電気泳動システム では、電気浸透流動は、「プラグ」流動の性質のものである。そのため、電気浸 透流動の変化に対する必要な補正をしたウォーター・ディップの巾、又はウォー ター・ディップの面積は、水を含む注入試料の容積の直接の尺度である。このこ とは、以前は困難であった試料の標準液に対する比較及び定量化を可能にするも 。このことは、ある種のクロマトグラフィー・システム、そして特に細管電気泳 動システムにおける定量化の精度を著しく向上させるものである。

したがって、本発明には、標準液試験及び試料試験のクロマトグラムの注入物容 積変動性の規準化方法が含まれる。先ず、既知濃度の一つの標準液又は一群の標 準液のクロマトグラムを作成する。次いで、関心のある一つ又は複数の試料のク ロマトグラフィー試験の少なくとも一つのクロマトグラムを作成する。標準液試 験に関するウォーター・ディップの面積を、好ましくは検知器に取り付けた積分 器を使用することによって、測定する。標準液のピーク（単数又は複数）の面積 も測定する。次いで、試料を流し、試料試験のウォーター・ディップの面積、及 び試料のピークの面積を測定する。次いで、試料のウォーター・ディップ及び試 料の成分のピーク面積を以下の式を用いて補正する。

補正ピーク面積＝（測定ピーク面積）（面積ｗｄ　ｓｔｄ／面積ｗｄ　ｓａｍｐ ｌｅ）ここで、面ｈｄ　ｓｔｄは、標準液試験のウォーター・ディップの面積で あり、面積ｗｄ　ｓａｍｐｌｅは、試料試験のウォーター・ディップの面積であ る。この計算は、試料試験のウォーター・ディップのピークだけでなく、各試料 ピークについても行なう。しかる後、式： 試料濃度＝（試料の補正ピーク面積）（標準液濃度／標準液のピーク面積）を用 いて、試料を定量化することができる。

これは、試料の濃度の正確な測定を可能にするものである。このようにして、標 準液試及び験試料試験は、重要な比較のための標準化又は規準化をすることがで きる。

このテクニックは、例えば、検定（ｃａｔ　１ｂｒａｔｉｏｎ）に関してより良 好な感度を得るため、より大きな試料容積を意図して用いる場合にも用いること ができる。新たな試料容積を用いて再検定をする必要も、注入容積を前駆て知る 必要もない。

上記と同じ方程式を適用して、正確な被分析物の濃度を決定することができる。

本発明の他の特徴には、細管電気泳動システム又はクロマトグラフィー・システ ムにおけるシステムを流れる緩衝液の流速決定手段として、ウォーター・ディッ プを用いることが含まれる。本出願人は、試験の開始とウォーター・ディップの 出現との間の間隔が、システムを流れる緩衝液の流速の決定に有用であることを 発見したのである。具体的には、本出願人は、標準液試験ウォーター・ディップ の泳動時間と、試料試験ウォーター・ディップの泳動時間との間の関係は、二つ の試験間のシステムを流れる緩衝液の流速のあらゆる変化を決定することを発見 したのである。そのため、この関係は、標準液の移動度を試料の移動度と相関さ せるのに用いることができる。

標準液試験のウォーター・ディップの泳動時間と、試料試験のウォーター・ディ ップの泳動時間との間のこの関係は、細管電気泳動システムに特に有用である。

この関係は、多くの方法で、二つの試験間の電気浸透流動速度のあらゆる変化を 決定することを可能にするものであり、それらのうちの幾つかを以下に概略的に 述べる。

先に概略的に述べたように、細管電気泳動における、電気浸透流動速度は、細管 の表面に吸着された物質の堆積、新しい細管又は細管に取り付けられた膜の導入 の結果として、或いは、印加電圧の変化の結果として変化することがある。これ らの変化は、試料又は標準液の泳動時間の変化に帰着することがある。試料の注 入とウォーター・ディップの出現との間の時間間隔を検定することにより、容積 が既知の細管に関する流動速度を決定することができる。電気浸透流動速度が分 ったら、個々の標準液及び被分析物に関して電気泳動速度を算出することができ 、電気泳動速度は、被分析物又は標準液に特徴的なものであり、電気浸透流動速 度、細管の長さ又は印加電圧とは独立である。電気泳動速度は、被分析物ピーク の重要な確認特徴であるため、電気浸透流動速度の決定を通じて電気泳動速度を 正確に計算できることは、重要である。

本発明の一つの特徴においては、クロマトグラムは、以下の方法で規準化される 。先ず、試料希釈剤とシステムを流れる緩衝液との相違の結果として、検知器出 力において変化を報知することのできる検知器を利用して、クロマトグラムを作 成する。このクロマトグラムは、濃度が既知の少なくとも一つの標準液のクロマ トグラフィー試験のものである。次いで、関心のある一以上の試料のクロマトグ ラフィー試験の少なくとも一つのクロマトグラフを、同じ検知器を用いて作成す る。標準液及び試料の泳動時間の他、標準液試験及び試料試験におけるウォータ ー・ディップの泳動時間も測定する。しかる後、以下の式により、補正泳動時間 を算出する。

補正泳動時間＝（測定した泳動時間）（泳動時間ｗｄ　ｓｔｄ／泳動時間ｗｄ　 ｓａｍｐｌｅ）ここで、泳動時間ｗｄｓｔｄは、標準液試験におけるウォーター ・ディップの泳動時間であり、泳動時間ｗｄ　ｓａｍｐｌｅは、試料試験におけ るウォーター・ディップの泳動時間である。次いで、試料の補正泳動時間を標準 液の補正泳動時間と相関させることにより、補正保持時間によって試料のピーク を確認することができる。

本発明の他の特徴においては、細管電気泳動による電気泳動図が、以下の方法で 規準化される。先ず、濃度が既知の少なくとも一つの標準液の細管電気泳動の電 気泳動図を作成する。次いで、関心のある一以上の試料の細管電気泳動試験の少 なくとも一つの電気泳動図を作成する。標準液及び試料の泳動時間の他、標準液 試験及び試料試験におけるウォーター・ディップの泳動時間も測定する。しかる 後、標準液及び試料各々の電気泳動度（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ　ｎｏ ｂｉｌｉｔｙ）を、以下の式により算出する。

ｕ−＊＝Ｌ”（１／ｌ、−１／ｌ、）／Ｖここで、 Ｕ、、＝電気泳動度、 し＝細管の長さ、 ■＝印加電圧、 １＝＝ウオーター・ディップの泳動時間、１、＝試料の泳動時間、 である。

次いで、試料の電気泳動度を標準液の電気泳動度と相関させることにより、電気 泳動度によって試料のピークを確認する。

本発明の他の特徴においては、標準液試験と試料試験との間で、電圧及び細管に 変化がないシステムにおける電気伝導分析細管電気泳動のバルク緩衝液の電気浸 透流動速度の変化に関連する変動性の規準化のための方法が説明される。これら のシステムで、標準液及び試料各々の電気泳動指数（１気泳動度と類似のもので ある）を比較すること又は相関させることができる。

本発明のこの特徴においては、上記のように、標準液試験及び試料試験における ウォーター・ディップの泳動時間を決定する。次いて、電気泳動指数を、以下の 式により算出する。

Ｅ−電気原指数、 １＝＝ウオーター・ディップの泳動時間、ｊ、＝試料の泳動時間、 である。

次いで、試料の電気泳動指数を標準液の電気泳動指数と相関させるか又は比較す ることにより、電気泳動指数によって試料のピークを確認することができる。こ のようにして、電気浸透流動速度の変動性を、規準化し、標準液と試料との間で 重要な比較をすることができる。

図面の簡単な説明 図１は、ウォーター・ディップの面積と、被分析物のピーク面積との間の直線関 係を表わしている。これらの最良適合線に関して、外挿が、実験誤差範囲内で、 これらの線の共通の交点に帰着することに注目されたい。

図２は、実施例１の抑制電気伝導度測定細管電気泳動試験の標準液電気泳動図を 表わしている。

図３は、間接光度検知法を用いた細管電気泳動の標準液電気泳動図を表わしてい る。

定義 本明細書における「クロマトグラフィー」の８５又はその均等表現には、多数の 異なるクロマトグラフィー法が含まれる。クロマトグラフィーには、例えば、イ オン交換クロマトグラフィー、イオン排除クロマトグラフィー、順相液体クロマ トグラフィー、逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ｌ （ＰＬＣ）、細管電気泳動（ＣＢ）、等電点クロマトグラフィー、及びミセル電 動細管クロマトグラフィー（ＭＥＣＣ）がある。

本明細書における［ＩＥ気伝導度測定細管電気泳動Ｊの語又はその均等表現は、 ピーク検知の方法として導電率計を利用するあらゆる細管電気泳動システムを意 味する。定義には、抑制及び非抑制の細管電気泳動システムの何れもが含まれる 。

本明細書における［クロマトグラム」の語又はその均等表現は、試料が検知セル を通過する際の検知器出力の変化によって生じたピークを有するクロマトグラフ ィー試験のタイムトレース、即ち、検知測定のタイムトレースを意味する。この 語は、検知の方法によらず用いられる。この語は、電気泳動図を含むものであリ 、電気泳動図は、細管電気泳動試験に特有のものである。電気泳動図には、導電 率検知を利用し、試料が導電率計を通過する際の導電率の変化によって生じたピ ークを育する細管電気泳動試験が含まれる。これらのピークは、導電率の違い及 びそれにより生じた検知器の応答の結果である。

クロマトグラム又は電気泳動図のピークは、負のこともあれば、正のこともある 。例えば、電気伝導度測定ＣＥ試験の電気泳動図の場合には、（ウォーター・デ ィップの場合のように）、検知器を通過する試料がバルク電解質よりも導電性が 低いことによってピークが生じたという意味で、ピークが負のことがあり得る。

ピークは、（試料又は被分析物のピークの場合のように）導電率計を通過する試 料がバルク電解質よりも導電性である場合には、正のこともあり得る。

本明細書におけるｒウォーター・ディップＪの語又はその均等表現は、導電率計 を通じて試料をＣＥシステムに注入した場合の水又は試料電解質の通過によって 生じた負のピークを意味する。

本明細書における「試料」又は「被分析物」又は「試料化合物」の語或いはその 均等表現は、分析の目的でクロマトグラフィー・システムに流すことのできるあ らゆる化合物を意味する。斯かる化合物は、何であるのかが未知の化合物、又は 濃度が未知の既知化合物、又は何れもが未知の化合物でよい。斯かる化合物は、 イオン、蛋白質、無機及び有機分子、核酸、その他の物質でよい。これらの語の 、単数形又は複数形の使用は決定的なものではなく、本発明及び請求項の解釈を 限定すべきものでないことが理解されよう。

本明細書における「標準液」の語又はその均等表現は、電気伝導度測定ＣＥシス テムに流す化合物であって、何であるのかも濃度も既知のものを意味する。「標 準液」の語の単数形又は複数形の使用は決定的なものでなく、本発明及び請求項 の解釈を限定すべきものでないことが理解されよう。

本明細書における「ウォーター・ディップ又は試料の面積の決定」の語又はその 均等表現は、電気泳動図のピーク曲線下の面積を決定又は近似するために用いる あらゆる測定を意味する。ピークの面積全体を積分してもよく、ベースラインで のピークの巾を用いてピーク面積を近似してもよい。最も一般的には、この測定 は、多くの市販の品種のある標準的な積分器を使用することによって行なわれる 。しかしながら、他の方法、例えば、ピークを物理的に切り取って紙の重量を計 ること、又はベースラインにおけるピークの巾を手で測定することも、曲線下面 積の比較測定として用いることができる。

ウォーター・ディップは、試料の注入による水のバルク電解質よりも低い検知器 の応答によって生じた負のピークであるのが一般的であるのに対し、試料のピー クは、バルク電解質よりも高い検知器の応答によって生じた正のピークであるの が一般的である。ピークの方向は、面積の決定には無関係である。

できる方法を意味する。そのため、試料試験又は標準液試験は、実験パラメータ が同じ又はほぼ同じである場合に規準化される。本発明で用いる場合には、規準 おける変化についての補正又は調整を意味する。これは、対応する試料ピークの 補正に帰着する。

本明細書における「システムを流れる緩衝液Ｊの語又はその均等表現は、クロマ トグラフィー・システムのバルク緩衝液を意味する。これは、一定してカラム又 は細管に導入される緩衝液のことである。流れる緩衝液は、試料との相容性、カ ラム又は細管との相容性、及び利用する検知方法を含む種々のパラメータに基づ き選択される。この緩衝液は、電気伝導度測定ＣＢの場合に特に、電解質である のがよい。この緩衝液は、間接蛍光検知及び間接光度検知の場合に、それぞれ、 蛍光標識及び吸光係数を有する緩衝液であるのがよい。

発明の詳細な記述 本発明は、クロマトグラム、そして特にＣＥの電気泳動図の標準化及び規準化の ための方法に関する。本発明は、標準液ＣＥ試験と試料叩試験との間のクロマト グラムに存在する変動性の規準化を可能にするものである。

一実施態様において、本発明は、試料の注入容積の違いに関連する変動性の規準 化に関する。標準液を注入し、ウォーター・ディップの面積及び標準液のピーク 面積を測定する。次いで、試料を注入し、ウォーター・ディップの面積及び試料 のピーク面積を測定する。試料ピークのピーク面積を、以下の式を用いて補正す る。

（１）：補正ピーク面積＝（測定ピーク面積）（面積ｗｄ　ｓｔｄ／面積ｗｄ　 ｓａｍｐｌｅ）ここで、面積ｗｄ　ｓｔｄは、標準液試験のウォーター・ディッ プの面積であり、面積ｗｄ　ｓａｍｐｌｅは、試料試験のウォーター・ディップ の面積である。

補正ピーク面積を算出した後、以下の式を用いて試料の濃度を算出する。

（２）：試料濃度＝（試料の補正ピーク面積）（標準液濃度／標準液のピーク面 積）したがって、試料濃度は、標準液濃度の単位で表わされる。

他の好ましい実施態様では、本発明は、システムを流れる緩衝液の流速の違いに 関連する変動性の規準化に関する。特に、本発明は、ＣＢの細管内のバルク電解 質の電気浸透流動に関連する変動性に関する。これらの違いは、なかでも、細管 の変化又は変動性、細管の壁に吸着された物質、印加電圧の変化に起因する。こ のことは、面積測定に積分器を用いる場合にも重要である。積分は時間に従属し 、流速の変化が面積の変化に帰着するためである。

以下の変数及び方程式を用いて、電気浸透流動の変動性を、幾つかの方法で補正 することができる。試料全体中の水はイオン化していないので、この水は、電気 浸透流動の結果として、バルク電解質と同じ速度で細管を移動する。これは、方 程式（３）で表わされる。

ｖ＊−＝Ｃｍ／秒で表わす電気浸透流動速度、Ｌ＝ｃｍで表わす細管の長さ、 １、＝秒で表わすウォーター・ディップの泳動時間である。

総合泳動速度は、（４）で表わす電気浸透流動速度と電気泳動速度とのベクトル 和である。

（４１：　ｖ＋、＋＝ｖ、、＋ｖ、ｐ ここで、 ｖｌ。＋＝ｃｍ／秒で表わす総合泳動速度、Ｖ、。＝ｃｍ／秒で表わす正味電気 泳動速度、ｖ＊ｔ＝ｃｍ／秒で表わす電気浸透流動速度である。

Ｌｐは、試料イオンが出口電極（ｏｕｔｌｅｔ　ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）の方へ電 気泳動するか又は出口電極から離れる方へ電気泳動するかによって、符号が正の こともあれば負のこともあることに留意されたい。

（３）と（４）とを組み合わせて、（５）が得られる。

（５）　：　Ｖｌ＃ｌ＝Ｌ／ｌ−＋Ｖａ＃Ｖ、。、は、総合泳動長さを、観測泳 動時間で除算することによっても算出することができる＝（６）。

ｔ６＝秒で表わす試料イオンの観測泳動時間である。

（５）と（６）とを組み合わせて、（７）が得られる。

（７１：　Ｖ、、＝Ｌ（１／ｌ、−１／ｌ、）再整理すると、（８）が得られる 。

（８１：　ｖ、、／Ｌ＝１／ｌ、−１／ｌ。

Ｌか変化しない場合には、単位長さあたりの電気泳動速度である電気泳動指数Ｖ 、、／Ｌ又はＥを、Ｖｅｏに従属しない識別指数として用いることができる。

（９１：　Ｅ＝ｌ／ｌ、−１／ｌ。

ここで、 Ｅ＝ｖ、ｔ４．＝電気泳動指数 である。

しかしながら、細管の長さ又は電圧の何れかが、検量線作成条件と試料の場合の 条件との間で変化する場合には、電気泳動度を用いる。電気泳動度は、単位電場 強度あたりの電気泳動速度である二〇〔。

ＱＯＩ　：　Ｌｌ＊５＝Ｖｅ＊／　（Ｖ／い＝ｖ−ｅＬ／Ｖここで、 （１，、＝（Ｉｌｌ／ｌｌ／ポルトわす電気泳動度、■＝ボルトで表わす総印加 電圧 である。

（８）と（９）とを組み合わせて、叫か得られる。

α（１：　ｕ、、＝Ｌ”（１／ｌ、−１／ｌ、）／Ｖこのようにして、観測値で あるｔｓ及び【Ｗ、並びに既知であるし及び■の値から、電気泳動度を算出する ことができる。

他の実施態様では、クロマトグラフィー・システムにおけるシステムを流れる緩 衝液の流速の変化に関連する変動性の規準化のための方法が説明される。

好ましい実施態様では、あらゆる個々のピークの泳動時間として選択した値は、 ピークが負であるか又は正であるかによって、ピークの最小値又は最大値である 。

即ち、ウォーター・ディップのピークの泳動時間の測定に関しては、電気伝導度 ピークの最小値を、泳動時間として選択する。試料又は標準液のピークに関して は、電気伝導度ピークの最大値を選択する。別の実施態様では、同じパラメータ を一貫して用いる限り、ピークの始まり又はピークの終わりを用いてもよい。

好ましい実施態様では、試料及び標準液は、１００％水性である。別の実施態様 では、他の溶剤が存在する場合には、試料及び標準物質は組成が同じである。

好ましい実施態様では、本発明を、標準液検量線の作成に用いることができる。

複数の異なるａ度の標準液の注入を行なう。−１の試験を対照と１．て用い、他 の全ての標準液の注入による観測面積の応答を、上記のテクニックを用いて補正 又は修正する。次いで、補正したピーク面積を、濃度の関数としてプロットする 。

これは、検定の間のあらゆる変化の補正のためのウォーター・ディップを用いる 複数点検量線作成である。

本発明は、試料希釈剤とシステムを流れる緩衝液との間の相違の結果として、検 知器出力において変化を報知することのできる検知器を利用するあらゆるクロマ トグラフィー・システムにおける用途を提供するものである。好ましい実施態様 では、検知は、電気伝導度検知、抑制電気伝導度検知、直接又は間接光度検知、 或いは、直接又は間接蛍光検知である。

本発明て用いられるＣＥＫ気泳動図の規準化及び標準化のための特定の方法を説 明し、これらの方法をどのように利用することができるかを詳細に述べ、ＣＥＫ 気泳動図の成功した規準化を示したが、この開示は、当業者がこの知識を用いて 、一般的に利用することのできる技術を用いる均等手段により目指す結果を得る ことができるのに充分なものである。

以下の実施例は、上述の発明の用い方をより充分に説明し、しかも、本発明の種 々の特徴を実施することを意図した最良の形聾を述べる役割をするものである。

これらの実施例は、本発明の真の範囲を決して限定するものではなく、例示の目 的で示したものであることが理解されよう。

実施例 実施例１：抑制電気伝導度測定ＣＥシステムにおける電気浸透流動速度の補正以 下に説明するシステムは、米国特許出願第ｘｘｘ、ｘｘｘ号に開示されたものと ほぼ同様のものである。

細管、内径７５μ、長さ６０ｃｍの溶融シリカ電解質：２ｍｍのホウ酸ナトリウ ム 電圧：正、２４ＫＶ 注入：静水圧（ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｃ）−３０ｍｍ、　１０秒抑制器再生剤＝ ＩＯ嘘の硫酸 標準液ＣＥ電気泳動図を表わす図２を作成するため、以下の化合物各々を１０蘭 注入した７ １、炭酸塩 ２、亜塩素酸塩 ３、弗化物 ４、リン酸塩 ５、塩素酸塩 ６、過塩素酸塩 ７、硝酸塩 ８　亜硝酸塩 ９、硫酸塩 １０、塩化物 １１、臭化物 １２、クロム酸塩 次いで、塩素酸塩、過塩素酸塩、硝酸塩及び亜硝酸塩に対応するピーク５〜８を 、それらが良く分解されたので、更に検討するよう選択した。各々の試料試験は 、上記と同じ条件を使用した。結果を表１に示す。

表１ 抑制ＣＥシステムからの生データ及びウォーター・ディップ補正データの表試料 　Ｍｔ　ｗｄ　Ｍｔｌ　Ｍｔ２　Ｍｔ３　Ｍｔ４標準液試験　２．４８０　７． ５７０　８．４８０　１０．１２０　１１．０００試験１　２．４６０　７．４ ８０　８．３８０　９．９７０　１０．８５０試験２　２．４９０　７．４７０ 　８．３８０　！０．０３０　１０．９５０Ｂ３　２．５００　７．７７０　８ ．７５０　１０．５００　１１．４７０試験４　２．４８０　？、８００　８． ７７０　＋０．５４０　１１．４７０試験５　２．４９０　７．７３０　８．６ ９０　１０．３９０　１１．３４０試験６　２．４８０　７．７５０　８．７０ ０　１０．４２０　１１．３７０試験７　２．５００　７．９００　８．９００ 　１０．６７０　１１．６７０６８　２．４８０　７．８３０　８．８５０　１ ０．６５０　１１．６３０試験９　２．４８０　７．９５０　９．０２０　１０ ．’９２０　１２．０００試験１０　３．０２０　＋５．２７０　１８．９８０ 　２３．５３０試験１１　２．５２０　８．０５０　９．１８０　１１．２８０ 　１２．５２０試験１２　２．５８０　８．９７０　１０．３７０　１３．２０ ０　１５．０００試験１３　２．６７０　９．８８０　１１．５００　１４．６ ３０　１６．６００試験１４　２．６７０　９．９２０　＋１．５７０　１４． ９３０　１７．２００試験１５　２．８８０　１４．３２０　１８．０８０　２ ３．８００平均　２．５７０　８．９８０　１０．４１０　１２．８５０　１２ ．５１０標準偏差　０．６＋３　２．４０３　３．３２９　４．５０１　２．＋ ３０ＲＳＤ　６．３２４　２６．７６３　３１．９８２　３５．０２７　１７． ０２４表１（続葉） ｌｉｔ＞補　ＭＬ２補　ＭＬ３補　ＭＬ４補−１３，５５６−１４，２６５−１ ５，２２１−１５，６１６−１３゜６４１　−１４．３５９　−１５．３１０　 −１５．７１７−１３．３８７　−１４．１１４　−１５．０９５　−１５．５ １４−１３．５６５　−１４．２８６　−１５．２３８　−１５．６４１−１３ ．７５１　−１４．４６０　−１５．４１７　−１５．８０２−１３．６１２　 −１４．３２７　−１５．２６８　−１５．６７１−１３．７１０　−１４．４ １４　−１５．３６３　−１５．７６４−１３．６７１　−１４．３８２　−１ ５．３１４　−１５．７１６−１３．７７６　−１４．５１２　−１５．４６６ 　−１５．８６２−１３．８７２　−１４．６１８　−１５．５８３　−１５． ９９５−１３．２８２　−１３．９２２　−１４．４３１−１３．６３０　−１ ４．３９５　−１５．４０９　−１５．８４８−１３．８０６　−１４．５５８ 　−１５．５９２　−１６．０４７−１３．６６６　−１４．３７９　−１５． ３０９　−１５．７１５−１３．６８６　−１４．４０５　−１５．３７８　− １５．８２０−１３．８６９　−１４．５９６　−１５．２６０−１３．６５５ 　−１４．３７４　−１５．２９１　−１５．７６６０．１５８　０．１７６　 ０．２６３　０．１４４−１．１５９　−１．２２７　−１．７１９　−０．９ １３表１（続葉） ｕｔ　０２　０３　０４ −１．０８５Ｂ−０６−１，１４１Ｂ−０６−１，２１８Ｂ−０６−１，２４９ Ｂ−０６−１，０９１２−０６−１，１４９２−０６−１，２２５８−０６−１ ，２５７Ｂ−０６−１，０７１Ｅ−０６−１，１２９Ｅ−０６−１，２０８Ｂ− ０６−１，２４１Ｂ−０６−１，０８５２−０６−１，１４３Ｂ−０６−１，２ １９８−０６−１，２５１Ｂ−０６−１，１００Ｂ−０６−１，１５″７Ｆニー ０６　−１．２３３Ｂ−０６−１，２６４８−０６−１，０８９Ｂ−０６−１， １４６２−０６−１，２２１Ｂ−０６−１，２５４１１！−０６−１，０９７Ｅ −０６−１，１５３Ｅ−０６−１，２２９１１ｉ−０６−１，２６１８−０６− １，０９４Ｂ−０６−１，１５１６−０６−１，２２５Ｂ−０６−１，２５７Ｂ −０６−１，１０２Ｂ−０６−１，１６１８−０６−１，２３７Ｂ−０６−１， ２６９８−０６−１，１１０ε−０６−１，１６９ε−０６−１，２４７Ｅ−０ ６−１，２８０Ｅ−０６−１，０６３Ｅ−０６−１，１１４８−０６−１，１５ ５Ｂ−０６泳動時ｒＩＡ：長過−１，０９０Ｂ−０６−１，１５２Ｂ−０６−１ ，２３３Ｅ−０６−１，２６８Ｂ−０６−１，１０４Ｅ−０６−１，１６５Ｂ− ０６−１，２４７Ｅ！−０６−１，２８４Ｂ−０６−１，０９３Ｂ−０６−１， １５０Ｅ−０６−１，２２５８−０６−１，２５７［Ｅ−０６−１，０９５Ｅ− ０６−１，１５２８−０６−１，２３０１１ニー０６　−１．２６６Ｅ−０６− １，１１０Ｅ−０６−１，１６８２−０６−１，２２１Ｂ−０６泳動時間：長過 −１，０９２Ｂ−０６−１，１５０Ｂ−０６−１，２２３８−０６−１，２６１ Ｂ−０６１，２６６Ｅ−０８１，４１０Ｅ−０８２，１０３Ｂ−０８１，１５１ Ｅ！−０８−１，１５９−１，２２７−１，７１９−０，９１３Ｍｔ　ｗｄは、 ウォーター・ディップの泳動時間、Ｍｔｌ−ＭＬ４は、ピーク５〜８の泳動時間 を示す。Ｍｔｌ補〜Ｍｔ４補は、算出した電気泳動速度ｖ１．を示し、ｖ−ｐ＝ Ｌ（１／ｌ、−１／ｌ、）である。０１−０４は、電気泳動度であり、Ｕ−ｓ＝ ＶｅｐＬハである。生データに関するＭｔのＲＳＤは、４補のＲＳＤよりもはる かに大きく、電気浸透流動の変化に関する計算の規準化効果を示している。更に 、Ｕ１〜Ｕ４の標準偏差は、電気泳動度間の差異の範囲内に充分大るものであり 、そのため、Ｕ、、を化合物の確認に用いることができる。

実施例２：間接光度検知を利用したＣＢシステムにおける電気浸透流動速度の補 正 細管：　Ｎｏ、　１−Ｎｏ、　３、内径πμ、長さ５０ｃｍの溶融シリカ電解質 ：５．Ｏｄのフタル酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　ａｃｉｄ　ｐｈｔｈａｌ ａｔｅ）、０．５ｍＭのテトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＴＴ ＡＢ）、２Ｊ−のホウ酸ナトリウム、ｐＨ５，９ 電圧：負、１５ＫＶ 注入：自重、１００ｍｍ、２秒 抑制器再生剤＝ｌＯ州の硫酸 三種類の異なる細管を利用した。二種類の標準液、２ｐｐｍの弗化物及び１５ｐ ｐｎ＋のリン酸塩、を標準液試験に利用した。表２に示すように、Ｍｔｌ及ＵＭ ｔ２は、標準液の保持時間である。Ｍｔｌ補及ｒＪＭｔ２補は、算出した電気泳 動速度Ｙｅｓを示し、Ｌｍ＝Ｌ（１／ｌ、　−ｌ／ｌｖ）である。Ｕｌ及びＵ２ は、電気泳動度であり、［１−ｓ＝ｖ−ｔＬ／Ｖである。表２のデータによって 示すように、ことができる。この方法は、異なる細管を用いる場合にも標準化を 可能にするものである。

表２ 間接光度測定Ｃεシステムからの生データ及びウォーターげイップ補正データの 表 試料　細管　ＭＬ　ｗｄ　Ｍｔｌ　Ｍｔ２標準液試験　１　８．１００　２．８ ３０　３．６８０試験１　１　８．０７０　２．８３０　３．６８０試験２　１ 　８．０２０　２．８３０　３．６７０試験３　２　ｇ、０９０　２．８５０　 ３．７００試験４　２　８．０５０　２．８５０　３．６９０試験５　２　８． ０１０　２．８４０　３．６９０試験６　３　８．３５０　２．９３０　３．８ １０試験７　３　８．４９０　２．８８０　３．７５０試験８　３　８．１３０ 　２．８７０　３．７２０平均　ＮＡ　８．１５０　２．８６０　３．７１０標 準偏差　ＮＡ　Ｏ，１６４０，０３３０，０４５ＲＳＤ　ＮＡ　２．０１１　１ ．１４６　１．２０５表２（統葉） Ｍｔｌ補　Ｍｔ２補　０１　０２ １１．４９５　７．４１４　９．１９６Ｅ−０７５，９３１１１ニー０７１１． ４７２　７．３９１　９．１７８８−０７　５．９１３Ｂ−０７１１，４３３７ ，３９０９，１４７Ｅ−０７５，９１２Ｂ−０７１１，３６３７，３３３９，０ ９１Ｅ−０７５，８６６Ｂ−０７１１，３３３７，３３９９，０６６Ｅ−０７５ ，８７１Ｅ−０７１１，３６３７，３０８９，０９１６−０７５，８４６Ｅ−０ ７１１，０７７７，１３５８，８６１Ｂ−０７５，７０８Ｅ−０７１１，４７２ ７，４４４９，１７７Ｅ−０７５，９５５Ｂ−０７１１，２７２７，２９＋　９ ．０１７Ｅ−０７５，８３３Ｅ−０７１１，３６４７，３３８９，０９２Ｅ−０ ７５，８７１Ｂ−０７０，１３＋　０．０９１　１．０４８Ｅ−０８７，３０８ Ｂ−０７１、＋５３　１．２４５　１．１５３　１．２４５実施例３：ウォータ ー・ディップの容積を用いた試料容積の補正注入試料容積を意図的に変えたこと を除き、実施例１のシステムを稼働させた。

これは、四つの別個の被分析物、即ち、ヨウ素酸塩、弗化物、塩素酸塩及び硝酸 塩のピークを用いた試験であった。ウォーター・ディップの面積のプロットに対 する被分析物ピークのプロットが、図１にある。

この実施例は、ウォーター・ディップの大きさ又は面積と試料ピークの大きさ又 は面積との相関を実証するものである。

実施例４：試料注入容積の補正 システムが、クロマトグラム又は電気泳動図を作成することができる限り、実施 例１及び２で説明したように又は一般的なりロマトグラフィー・システムを用い て、クロマトグラフィー・システム又はＣＥシステムを稼働させることができる 。

用いる検知器は、積分器又は他のデータ収集装置に実行可能に接続されているの が好ましいが、これは必ずしも必要ではない。

被分析物ピークの濃度を以下のように算出することができる。先ず、既知濃度の 標準液又は一群の標準液を試験する、次いで、未知濃度の試料の少なくとも一度 の試験を行なう。次いで、最初の試料ピークの補正ピーク面積を、以下の方程式 によって算出する。

補正ピーク面積＝（測定ピーク面積）（面’１ｗｄ　ｓｔｄ／１ｆｆｉ積ｗｄ　 ｓａｍｐｌｅ）次いで、以下の式を用いて試料の濃度を算出する。

試料濃度＝（試料の補正ピーク面積）（標準液濃度／標準液のピーク面積）この 手続を、必要な数の試料ピークに対して繰り返せばよい。

その他、秒で表わすベースラインにおけるウォーター・ディップのピーク巾を、 試料ピーク濃度を補正するのに用いることができる。

フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号ＧＯＩＮ　３０／２６ 　Ａ　９４０７−２ＪＩ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．標準液クロマトグラフィー試験及び試料クロマトグラフィー試験のクロマト グラム間の変動性を規準化する方法であって、前記変動性は試料の注入に関連し 、前記変動性は試料のクロマトグラムを変化させる試料注入容積の相違によって 生じる規準化方法において、 （１）少なくとも一つの既知濃度の標準液のクロマトグラム、及び未知濃度の試 料に関する少なくとも一つのクロマトグラムを作成する工程であって、前記クロ マトグラムは、試料希釈剤とシステムを流れる緩衝液との間の相違の結果として 検知器出力における変化に帰着する検知方法を利用して作成される工程と、 （２）前記クロマトグラム各々に関し、ウォーター・ディップピーク、標準液ピ ーク及び試料ピークを測定する工程と、（３）試料の濃度を機準液の濃度と相関 させるため、標準液試験のウォーター・ディップの面積と、試料試験のウォータ ー・ディップの面積との間の関係を用いる工程とを、 含むことを特徴とする方法。 ２．前記検知方法は、電気伝導度検知、抑制電気伝導度検知、直接又は間接光度 検知、並びに直接又は間接蛍光検知からなる群から選択されることを特徴とする 請求項１記載の方法。 ３．前記クロマトグラムは、細管電気泳動の電気泳動図であることを特徴とする 請求項１記載の方法。 ４．標準液クロマトグラフィー試験及び試料クロマトグラフィー試験のクロマト グラム間の変動性を規準化する方法であって、前記変動性は試料の注入に関連し 、前記変動性は試料のクロマトグラムを変化させる試料注入容積の相違によって 生じる規準化方法において、 （１）少なくとも一つの既知濃度の標準液のクロマトグラム、及び未知濃度の試 料に関する少なくとも一つのクロマトグラムを作成する工程であって、前記クロ マトグラムは、試料希釈剤とシステムの電解質との間の相違の結果として検知器 出力における変化に帰着する検知方法を利用して作成される工程と、（２）前記 クロマトグラム各々に関し、ウォーター・ディップピーク、標準液ピーク及び試 料ピークを測定する工程と、（３）前記試料ピーク及び前記試料試験のウォータ ー・ディップの補正ピーク面積を、式： 補正ピーク面積＝（測定ピーク面積）（面積ｗｄ　ｓｔｄ／面積ｗｄ　ｓｃｍｐ ｌｅ）ここで、 面積ｗｄ　ｓｔｄ＝標準液試験のウォーター・ディップの面積、面積ｗｄ　ｓａ ｍｐｌｅ＝試料試験のウォーター・ディップの面積である； によって算出する工程と、 （４）試料の濃度を、式： 試料濃度＝（試料の補正ピーク面積）（標準液濃度／標準液のピーク面積）によ って決定する工程とを、 含むことを特徴とする請求項１記載の方法。 ５．前記検知方法は、電気伝導度検知、抑制電気伝導度検知、直接又は間接光度 検知、並びに直接又は間接蛍光検知からなる群から選択されることを特徴とする 請求項４記載の方法。 ６．前記クロマトグラムは、細管電気泳動の電気泳動図であることを特徴とする 請求項４記載の方法。 ７．標準液クロマトグラフィー試験及び試料クロマトグラフィー試験のクロマト グラム圏の変動性を規準化する方法であって、前記変動性はシステムの電解質の 流速の変化に関連し、前記変動性は試料の泳動時間及び標準液の泳動時間におけ る相違によって生じる規準化方法において、（１）少なくとも一つの標準液のク ロマトグラム、及び関心のある試料の少なくとも一つのクロマトグラムを作成す る工程であって、前記クロマトグラムは、試料希釈剤とシステムを流れる緩衝液 との間の相違の結果として検知器出力における変化に帰着する検知方法を利用し て作成される工程と、（２）標準液試験及び試料試験におけるウォーター・ディ ップ、標準液及び試料の泳動時間を測定する工程と、 （３）補正ピーク泳動時間を、式： 補正泳動時間＝（測定泳動時間）（泳動時間吋ｗｄ　ｓｔｄ／泳動時間ｗｄ　ｓ ａｍｐｌｅ）ここで、 泳動時間ｗｄ　ｓｔｄ＝標準液試験のウォーター・ディップの泳動時間、泳動時 間ｗｄ　ｓａｍｐｌｅ＝試料試験のウォーター・ディップの泳動時間である； によって算出する工程と、 （４）試料の補正泳動時間を標準液の補正泳動時間と相関させることにより、補 正保持時間によって試料のピークを確認する工程とを、含むことを特徴とする方 法。 ８．前記検知手段は、電気伝導度検知、抑制電気伝導度検知、直接又は間接光度 検知、並びに直接又は間接蛍光検知からなる群から選択されることを特徴とする 請求項７記載の方法。 ９．標準液細管電気泳動試験及び試料細管電気泳動試験の電気泳動図間の変動性 を規準化する方法であって、前記変動性は細管電気泳動の電気浸透流動速度の変 化に関連し、前記変動性は試料の泳動時間及び標準液の泳動時間における相違に 帰着する規準化方法において、 （１）少なくとも一つの標準液の電気泳動図、及び関心のある試料の少なくとも 一つの電気泳動図を作成する工程であって、前記電気泳動図は、試料希釈剤とシ ステムの電解質との間の椙違の結果として検知器出力における変化に帰着する検 知方法を利用して作成される工程と、（２）標準液試験及び試料試験におけるウ ォーター・ディップ、標準液及び試料の泳動時間を測定する工程と、 （３）標準液及び試料各々の電気泳動度を、式：▲数式、化学式、表等がありま す▲ ここで、 ｕ■■＝電気泳動度、 Ｌ＝細管の長さ、 Ｖ＝印加電圧、 ｔｗ＝ウォーター・ディップの泳動時間、ｔｓ＝試料の泳動時間、 である； によって算出する工程と、 （４）試料の電気泳動度を標準液の電気泳動度と相関させることにより、電気泳 動度によって試料のピークを確認する工程とを、含むことを特徴とする方法。 １０．前記検知方法は、電気伝導度検知、抑制電気伝導度検知、直接又は間接光 度検知、並びに直接又は間接蛍光検知からなる群から選択されることを特徴とす る請求項９記載の方法。 １１．印加電圧及び細管が変更されない標準液細管電気泳動試験及び試料細管電 気泳動試験の電気泳動図間の変動性を規準化する方法であって、前記変動性は細 管電気泳動の電気浸透流動速度の変化に関連し、前記変動性は試料の泳動時間及 び標準液の泳動時間における相違に帰着する規準化方法において、（１）少なく とも一つの標準液の電気泳動図、及び関心のある試料の少なくとも一つの電気泳 動図を作成する工程であって、前記電気泳動図は、試料希釈剤とシステムの電解 質との間の相違の結果として検知器出力における変化に帰着する検知方法を利用 して作成される工程と、（２）標準液試験及び試料試験におけるウォーター・デ ィップ、標準液及び試料の泳動時間を測定する工程と、 （３）電気泳動指数を、式： Ｅ＝ｌ／ｔｎ−ｌ／ｔｗ ここで、 Ｅ＝電気泳指数、 ｔｗ＝ウォーター・ディップの泳動時間、ｔｓ＝試料の泳動時間 である； によって算出する工程と、 （４）試料の電気泳動指数を標準液の電気泳動指数と相関させることにより、電 気泳動指数によって試料のピークを確認する工程とを、含むことを特徴とする方 法。 １２．前記検知手段は、電気伝導度検知、抑制電気伝導度検知、直接又は間接光 度検知、並びに直接又は間接蛍光検知からなる群から選択されることを特徴とす る請求項１１記載の方法。 １３．請求項４に記載の方法であって、（１）標準液試験及び試料試験における ウォーター・ディップ、標準液及び試料の泳動博聞を測定する工程と、 （２）標準液及び試料各々の電気泳動度を、式：Ｕ■■＝Ｌ２（ｌ／ｔｎ−ｌ／ ｔｗ）／Ｖここで、 ｕ■■＝電気泳動度、 Ｌ＝細管の長さ、 Ｖ＝印加電圧、 ｔｗ＝ウォーター・ディップの泳動時間、ｔｓ＝試料の泳動時間、 である； によって算出する工程と、 （３）試料の電気泳動度を標準液の電気泳動度と相関させることにより、電気泳 動度によって試料のピークを確認する工程とを、更に含むことを特徴とする方法 。 １４．前記検知手段は、電気伝導度検知、抑制電気伝導度検知、直接又は間接蛍 光検知、並びに直接又は間接光度検知からなる群から選択されることを特徴とす る請求項１３記載の方法。 １５．印加電圧及び細管が変更されない請求項４記載の方法であって、（１）標 準液試験及び試料試験におけるウォーター・ディップ、標準液及び試料の泳動時 間を測定する工程と、 （２）電気泳動指数を、式： Ｅ＝ｌ／ｔｎ−ｌ／ｔｗ ここで、 Ｅ＝電気泳指数、 ｔｗ＝ウォーター・ディップの泳動時間、ｔｓ＝試料の泳動博聞 である； によって算出する工程と、 （３）試料の電気泳動指数を標準液の電気泳動指数と相関させることにより、電 気泳動指数によって試料のピークを確認する工程とを、更に含むことを特徴とす る方法。 １６．標準液クロマトグラフィー試験及び試料クロマトグラフィー試験のクロマ トグラム間の変動性の規準化及び標準化のための装置であって、前記変動性は試 料の注入に関連し、前記変動性は試料のクロマトグラムを変化させる試料注入容 積の相違によって生じる装置において、（１）試料化合物を分離するためのクロ マトグラフィー分離手段と、（２）ピークを有するクロマトグラムを作成するた めの検知手段であって、試料希釈剤とシステムを流れる緩衝液との間の相違の結 果として、検知器出力における変化を報知することができる検知手段と、（３） 前記クロマトグラムに関連するウォーター・ディップ・ピーク、試料ピーク及び 標準液ピークの面積を算出するための、検知手段に実行可能に接続された積分手 段と、 （４）前記試料の濃度を前記標準液の濃度と相関させることができるよう、前記 標準液試験のウォーター・ディップの前記算出した面積と前記試料試験のウォー ター・ディップの前記算出された面積との間の関係を決定するための、前記積分 手段に実行可能に接続された分析手段とを、備えていることを特徴とする装置。 １７．前記検知手段は、電気伝導度検知、抑制電気伝導度検知、直接又は間接光 度検知、並びに直接又は間接蛍光検知からなる群から選択されることを特徴とす る請求項１６記載の方法。 １８．請求項１６に記載の装置であって、前記分析手段は、（１）試料ピーク及 び試料試験のウォーター・ディップの補正ピーク面積を、式：補正ピーク面積＝ （測定ピーク面積）（面積ｗｄ　ｓｔｄ／面積ｗｄ　ｓａｍｐｌｅ）ここで、 面積ｗｄ　ｓｔｄ＝標準液試験のウォーター・ディップの面積、面積ｗｄ　ｓａ ｍｐｌｅ＝試料試験のウォーター・ディップの面積である； によって算出するための手段と、 （２）試料の濃度を、式： 試料濃度＝（試料の補正ピーク面積）（標準液濃度／標準液のピーク面積）によ って決定するための手段とを、 含んでいることを特徴とする装置。 １９．請求項１６に記載の装置であって、前記分析手段は、（１）試料ピーク及 び試料試験のウォーター・ディップの補正ピーク泳動時間を、式： 補正泳動時間＝（測定泳動時間）（泳動時間ｗｄｄ　ｓｔｄ／泳動時間ｗｄ　ｓ ａｍｐｌｅ）ここで、 泳動時間ｗｄ　ｓｔｄ＝標準液試験のウォーター・ディップの泳動時間、泳動時 間ｗｄ　ｓａｍｐｌｅ＝試料試験のウォーター・ディップの泳動時間である； によって算出するための手段を、 含んでいることを特徴とする装置。 ２０．標準液細管電気泳動試験及び試料細管電気泳動試験の電気泳動図間の変動 性の規準化及び標準化のための装置であって、前記変動性は細管電気泳動の電気 浸透流動速度の変化によって生じる装置において、（１）試料化合物を分離する ための細管電気泳動分離手段と、（２）ピークを有する電気泳動図を作成するた めの検知手段であって、試料希釈剤とシステムを流れる緩衝液との間の相違の結 果として、検知器出力における変化を報知することができる検知手段と、（３） 前記電気泳動図に関連するウォーター・ディップ・ピーク、標準液ピーク及び試 料ピークの泳動時間を測定するための、前記検知手段に実行可能に接続された時 間測定手段と、 （４）前記試料ピークの電気泳動度を、標準液試験のウォーター・ディップの泳 動時間及び試料試験のウォーター・ディップの泳動時間と相関させるための、前 記時間測定手段に実行可能に接続された分析手段とを、備えていることを特徴と する装置。 ２１．請求項２０に記載の装置であって、前記分析手段は、標準液及び試料各々 の電気泳動度を、式： Ｕ■ｐ＝Ｌ２（ｌ／ｔｎ−ｌ／ｔｗ）／Ｖここで、 ｕ■ｐ＝電気泳動度、 Ｌ＝細管の長さ、 Ｖ＝印加電圧、 ｔｗ＝ウォーター・ディップの泳動時間、ｔｓ＝試料の泳動時間、 である； によって算出するための手段を含んでいることを特徴とする装置。 ２２．前記検知手段は、電気伝導度検知、抑制電気伝導度検知、直接又は間接光 度検知、並びに直接又は間接蛍光検知からなる群から選択されることを特徴とす る請求項２０記載の方法。 ２３．請求項１６に記載の装置であって、前記分析手段は、電気泳動指数を、式 ：Ｅ＝ｌ／ｔｎ−ｌ／ｔｗ ここで、 Ｅ＝電気泳指数、 ｔｗ＝ウォーター・ディップの泳動時間、ｔｓ＝試料の泳動時間 である； によって算出する手段を含んでいることを特徴とする装置。 ２４．前記変動性は、電気浸透流動速度の変化によっても生じる請求項１６記載 の装置であって、 （１）ウォーター・ディップ・ピーク、標準液ピーク及び試料ピークの泳動時間 を測定するための時間測定手段と、 （２）標準液試験のウォーター・ディップの泳動時間と試料試験のウォーター・ ディップの泳動時間との関係に基づき、標準液ピークの電気泳動度と試料ピーク の電気泳動度との間の関係を決定するための、前記時間測定手段に実行可能に接 続された分析手段とを、 備えていることを特徴とする装置。 ２５．請求項２４に記載の装置であって、前記分析手段は、（１）試料ピーク及 び試料試験のウォーター・ディップの補正ピーク面積を、式：補正ピーク面積＝ （測定ピーク面積）（面積間ｗｄ　ｓｔｄ／面積ｗｄ　ｓａｍｐｌｅ）ここで、 面積ｗｄ　ｓｔｄ＝標準液試験のウォーター・ディップの面積、面積ｗｄ　ｓａ ｍｐｌｅ試料試験のウォーター・ディップの面積である； によって算出するための手段と、 （２）試料の濃度を、式： 試料濃度＝（試料の補正ピーク面積）（標準液濃度／標準液のピーク面積）によ って決定するための手段と、 （３）標準液及び試料各々の電気泳動度を、式：Ｕ■ｐ＝Ｌ２（ｌ／ｔｎ−ｌ） ／Ｖ ここで、 ｕ■ｐ＝電気泳動度、 Ｌ＝細管の長さ、 Ｖ＝印加電圧、 ｔｗ＝ウォーター・ディップの泳動時間、ｔｓ＝試料の泳動時間、 である； によって算出するための手段とを、 含んでいることを特徴とする装置。 ２６．前記検知手段は、電気伝導度検知、抑制電気伝導度検知、間接光度検知、 及び間接蛍光検知からなる群から選択されることを特徴とする請求項２５記載の 方法。