DE69218643T2

DE69218643T2 - Elektrokinetische Trennung mit verbreiterter Eingangsmischungskapillare

Info

Publication number: DE69218643T2
Application number: DE69218643T
Authority: DE
Inventors: Donald J Rose
Original assignee: Hewlett Packard Co
Current assignee: HP Inc
Priority date: 1991-02-01
Filing date: 1992-01-21
Publication date: 1997-07-10
Anticipated expiration: 2012-01-22
Also published as: EP0497488B1; DE69218643D1; JPH04318445A; EP0497488A2; EP0497488A3; US5180479A

Description

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf analytische Systeme und insbesondere auf chemische Analysegeräte, bei denen Probenkomponenten durch differentielle Wanderungsraten durch eine Kapillare mit schmaler Bohrung getrennt werden. Ein Hauptziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, sowohl eine Hochauflösungskomponententrennung als auch eine Hochempfindlichkeitserfassung von getrennten Komponenten von Proteinen und vergleichbaren komplexen Spezies zu schaffen.
Fortschritte in der Piezotechnologie vertrauten zu einem großen Teil auf Techniken zur chemischen Analyse. Die Biotechnologie schaffte Techniken zum Herstellen von Lebens-unterstützenden Medikamenten und anderen Produkten, welche andernfalls Mangelware wären, wenn auf natürliche Quellen vertraut werden müßte. Zusätzlich befinden sich vollständig neue medizinische Produkte in der Entwicklung, welche bisher nicht behandelbare Krankheiten aufhalten und heilen können. Die Biotechnologie verspricht neue Produkte für die Landwirtschaft, welche die sich ausbreitende Weltbevölkerung ernähren werden, und welche die Fähigkeit von hungeranfälligen Ländern steigern werden, um sich selbst zu unterhalten.
Die chemische Analyse der Proteine, die in biologischen Proben zu finden sind, betrifft im allgemeinen die Trennung der Proben in Komponenten zur Identifikation und Quantifizierung. Die Kapillarzonenelektrophorese (CZE; CZE = Capillary Zone Electrophoresis) ist eine einer Klasse von Verfahren, bei denen die unterschiedlichen Komponenten in einer Kapillare mit kleiner Bohrung mit jeweiligen unterschiedlichen Raten bewegt werden, derart, daß die Komponenten in getrennte Zonen aufgeteilt werden. Die getrennten Zonen können innerhalb der Kapillare oder außerhalb der Kapillare untersucht werden, indem es zugelassen wird, daß die Komponenten aus der Kapillare für eine sequentielle Erfassung austreten können.
Bei der CZE wird eine Probe an einem Eingangsende einer sich longitudinal erstreckenden Kapillare eingeführt und zu einem Ausgangsende bewegt, und zwar unter dem Einfluß eines elektrischen Feldes. Dieser Einfluß kombiniert zwei elektrokinetische Effekte: den elektroosmotischen Fluß und die elektrophoretische Wanderung.
Der elektroosmotische Fluß resultiert aus einer Ladungsansammlung an der kapillaren Oberfläche aufgrund einer vorzugsweisen Adsorption von Anionen aus der Elektrolytlösung, die die Kapillarenbohrung füllt. Die negative Ladung der Anionen zieht eine dünne Schicht von beweglichen positiv geladenenen Elektrolytionen an, die sich neben der inneren Oberfläche ansammeln. Die dünne Schicht von mobilen positiv geladenen Elektrolytionen wird zu der negativen Elektrode hin gezogen, wodurch der Hauptteil der Probe mit denselben zusammen gezogen wird. Somit resultiert der elektroosmotische Fluß in einem Durchschnittsfluß von Probenkomponenten von der positiven Elektrode zu der negativen Elektrode.
Diesem elektroosmotischen Fluß ist die elektrophoretische Wanderung überlagert, welche eine bekannte Bewegung geladener Partikel in einem elektrischen Feld ist. Die Elektrolytlösung wirkt als das Medium, das es erlaubt, daß sich das elektrische Feld durch die Kapillare zwischen den Elektroden erstreckt. Positiv geladene Moleküle werden zu der negativen Elektrode hin angezogen, derart, daß sie schneller als der Durchschnittsfluß fließen, der durch den elektroosmotischen Fluß bestimmt ist. Negativ geladene Moleküle werden zu der positiven Elektrode hin angezogen. Für die negativ geladenen Partikel wirkt der elektrophoretische Fluß der Komponenten dem im allgemeinen größeren elektroosmotischen Fluß der Komponenten entgegen. Das Resultat besteht darin, daß negativ geladene Partikel zu der negativen Elektrode hin fließen, jedoch viel langsamer als der Durchschnittsfluß.
Als Ergebnis des kombinierten elektrophoretischen und elektroosmotischen Flusses bewegt sich jede Probenkomponente durch die Kapillartrennsäule mit einer Rate, die von ihrer Spezies-spezifischen Ladung abhängt. Aufgrund der differentiellen Flußraten trennen sich die Komponenten nach einer ausreichend langen Wanderung durch die Trennkapillare. Ein geeignet ausgewählter und angeordneter Detektor kann diese Zonen seriell erfassen, während sie vorbei laufen. Komponenten können durch die Erfassungszeit identifiziert und durch die entsprechende Erfassungsspitzenhöhe und/oder den -Bereich quantifiziert werden. In manchen Fällen können die Bänder in getrennten Behältern für ein getrenntes Identifikations- und/oder Quantifizierungsverfahren gesammelt werden.
Es existieren mehrere Typen von Detektoren, die verwendet werden, um Proteine in Kapillartrennungssystemen zu erfassen. Ultraviolettabsorbanz- (UV-) Detektoren sind die am meisten verbreitetsten. Zusätzlich wurden Chemilumineszenz-, Brechungsindex- und Leitfähigkeitsdetektoren verwendet. Alle diese Verfahren weisen nicht die Empfindlichkeit auf, die nötig ist, um viele Spitzen zu erfassen, die bei der CZE- Proteinanalyse erhalten werden.
Die hohe Empfindlichkeit wird benötigt, da die Menge der gesamten Probe begrenzt ist, und da der Detektor in der Lage sein muß, Komponenten zu erfassen, die nur einen Bruchteil der gesamten Probe ausmachen. Begrenzungen der Probenmenge kommen von der Anforderung, daß die Probe im Elektrolyt gelöst sein muß, und daß die Konzentration der Probe niedrig genug sein muß, um eine Störung des elektrischen Felds zu vermeiden, welche zu einer Verzerrung der getrennten Komponentenzonen führen würde. Die Probenmenge ist durch den Bohrungsdurchmesser der Kapillare weiter begrenzt, und auch durch die Notwendigkeit des Begrenzens der Probe zu Anfang auf eine relativ kurze longitudinale Ausdehnung. Die anfängliche Probenausdehnung legt die minimale Zonenbreite und somit die Fähigkeit des Detektors fest, ähnlich geladene Probenkomponenten aufzulösen.
Der Detektor muß in der Lage sein, kleine Mengen der Komponente in jeder Probenzone zu erfassen. Ein UV-Erfassungssystem, das vor niedrige Konzentrationen und einen kurzen Beleuchtungsweg durch eine Kapillare gestellt wird, ergibt typischerweise ein schlechtes Signal/Rausch-Verhältnis. Weitere Erfassungsverfahren sind ähnlich begrenzt. Obwohl die CZE somit beim Trennen von Proteinkomponenten wirksam ist, ist es schwierig gewesen, einen ausreichend empfindlichen Detektor zum Identifizieren und Quantifizieren der getrennten Komponenten zu finden.
Die Fluoreszenzerfassung wurde in Verbindung mit der Flüssigchromatographie (LC; LC = Liquid Chromatography) angewendet, welche eine Klasse alternativer Komponententrenntechniken ist. Bei der Flüssigchromatographie führt eine flüssige mobile Phase Komponenten durch eine Kapillare mit unterschiedlichen Raten, die auf die Aufteilung der Komponenten zwischen der mobilen Phase und einer festen Phase bezogen sind. Zonen bilden sich somit als Funktion von Aufteilungsverhältnissen. Die Zonen können beleuchtet werden, und die resultierende Fluoreszenz kann erfaßt werden. Wenig Proteine können mit ausreichender Empfindlichkeit unter Verwendung ihrer intrinsischen Fluoreszenz erfaßt werden. Etikettierreagenzien können jedoch verwendet werden, um die Proteinfluoreszenz zu steigern. Ein Hauptvorteil der Verwendung der Fluoreszenzerfassung besteht darin, daß die erhöhte Empfindlichkeit, die durch kleine Probenmengen erforderlich ist, unter Verwendung einer sehr intensiven Beleuchtung erreicht werden kann. Somit verspricht eine Fluoreszenzerfassung, die mit Etikettierreagenzien verwendet wird, daß die Fähigkeit zur Identifikation und Quantifizierung von Probenkomponenten verbessert wird.
Ungünstigerweise ist die Flüssigchromatographie nicht gut für eine hochauflösende Trennung von Proteinen geeignet. Obwohl sich Aufteilungsverhältnisse unter Komponenten unterscheiden, sind die Moleküle jeder Komponente zu jedem Zeitpunkt zwischen der mobilen Phase und der festen Phase getrennt und bewegen sich somit mit unterschiedlichen Raten zueinander. Trotz Mittelungseffekten über der Länge der Kapillare wird durch die Aufteilung eine ausreichende Zonenverbreiterung eingeführt, um eine hochauflösende Trennung von Proteinkomponenten zu verhindern. Da die einzige Quelle der Zonenverbreiterung die longitudinale Diffusion ist, stellt die CZE eine etwa zehnfache Verbesserung bei einer Zonenbreiten-begrenzten Auflösung gegenüber der Flüssigchromatographie dar.
Die Fluoreszenzerfassung von Proteinen wird im allgemeinen in Verbindung mit der CZE aus einer Anzahl von Gründen verwendet. Wie es oben gezeigt wurde, können wenig Proteine mit ausreichender Empfindlichkeit erfaßt werden, wenn ihre intrinsische Fluoreszenz verwendet wird. Eine Fluoreszenzetikettierung vor der Trennung ist mit der CZE nicht kompatibel, da sie bewirkt, daß Moleküle der gleichen Spezies unterschiedliche Ladungen haben. Somit trennt sich eine Komponente in mehrere Spitzen, was die Erfassungen praktisch nicht interpretierbar macht. Ferner werden die Empfindlichkeitsprobleme verschärft, da jede Spitze nur einen Bruchteil einer Probenkomponente darstellt.
Eine Etikettierung nach der Trennung betrifft die Einführung eines fluorogenen Etikettierungsreagenz nach der Trennung und vor der Erfassung. Die Mischung vor der Trennung ist in Van Vliet u.a., "Post-Column Reaction Detection for Open- Tubular Liquid Chromatography Using Laser-Induced Fluorescence", Journal of Liquid Chromatography, Bd. 363, S. 187-198, 1986, beschrieben. Dieser Artikel offenbart die Verwendung eines Y-Verbinders zum Einführen eines Reagenz in den Ausfluß einer Trennkapillare. Ein Problem bei dem Y-Verbinder ist die unvermeidbare Turbulenz, die auftritt, wenn sich die Ströme in einem spitzen Winkel vereinigen. Die Turbulenz rührt den Probenstrom und verbreitert die Komponentenzonen ernsthaft. Diese Verbreiterung kann in einem Niedrigauflösungssystem tolerierbar sein, jedoch nicht in einem Hochauflösungs-CZE-System.
Die Mischung nach der Trennung wird ebenfalls von Weber u.a. in "Peroxyoxalate Chemiluminescence Detection with Capillary Liquid Chromatography" in Analytical Chemistry, Bd. 59, S. 1452-1457, 1987, angesprochen. Weber u.a. offenbaren die Verwendung eines Teflon-Schlauchs, um die getrennten Probenkomponenten, die aus einer Flüssigchromatographiekapillare, die mit Silikapartikeln gepackt ist, in das Innere einer Mischkapillare zu fördern. Ein ringformiger Zwischenraum zwischen dem Teflon-Schlauch und der Mischkapillare wird verwendet, um das Chemilumineszenzreagenz koaxial mit der Probe einzuführen, die aus dem schmäleren (0,2 mm) Teflon- Schlauch austritt und in die Mischkapillare (0,63 mm) eintritt. Die Turbulenz ist minimiert, da der Reagenzfluß schnell genug ist, um einen Ummantelungsfluß zu definieren, der die Probe begrenzt.
Eine Hauptbegrenzung des Lösungsansatzes von Weber u.a. besteht darin, daß die Chemilumineszenz bei der Proteinkomponentenerfassung nicht allgemein verwendet werden kann. Viele Proteine können Chemilumineszenzreagenzien nicht aktivieren. Ferner schafft der Lösungsansatz nicht die erforderliche Empfindlichkeit für diese Proteine, die die Reagenzien aktivieren.
Ein weiteres Problem bei dem Lösungsansatz von Weber u.a. besteht darin, daß der Ummantelungsfluß bewirkt, daß das Mischen langsam auftritt. Ein ausreichendes Mischen des Chemilumineszenzreagenz mit Probenkomponenten erfordert somit ein relativ langes Mischintervall und ein relativ großes Mischvolumen, was in einer wesentlichen Zonenverbreiterung resultiert. Diese Zonenverbreiterung beeinträchtigt die Auflösung wesentlich. Obwohl diese Zonenverbreiterung bei dem offenbarten Flüssigchromatographiesystem mit relativ niedriger Auflösung, tolerierbar sein kann, würde es die Vorteile eines Hochauflösungs-CZE-Systems zunichte machen.
Ein weiterer Lösungsansatz besteht darin, das Ausflußende der Trennkapillare zu verschmälern, derart, daß dasselbe in das Eingangsende der Mischkapillare passen könnte. Wenn eine zugespitzte Trennkapillare in eine Mischkapillare mit konstanter Bohrungsgröße eingepaßt wird, wird ein ringförmiger Zwischenraum zwischen den Kapillaren erzeugt. Das Fluoreszenzetikettierungsreagenz kann dann durch den ringförmigen Zwischenraum eingeführt werden. Dieser Lösungsansatz weist jedoch Begrenzungen auf. Für eine optimale Passung weist die Mischkapillare einen Innenbohrungsdurchmesser auf, der größer als der Innenbohrungsdurchmesser der Trennkapillare ist. Wenn die Probe aus der kleineren Bohrung austritt und in die größere Bohrung eintritt, breitet sich die Probe aus, was zu verbreiterten Probenzonenbreiten führt.
Bezüglich noch eines anderen Lösungsansatzes beschreibt die EP-A-0367591 ein CZE-System mit folgenden Merkmalen:
einer Probenwegeinrichtung, die einen sich longitudinal erstreckenden Probenweg definiert, wobei die Probenwegeinrichtung einen Kapillartrennabschnitt, einen Kapillarmischabschnitt und einen Erfassungsabschnitt aufweist, die seriell entlang des Probenwegs angeordnet sind, wobei der Trennabschnitt ein Probeneingabeende aufweist;
einer Probeneinführungseinrichtung zum Einführen einer Probe mit mehreren Komponenten in den Trennabschnitt an dem Probeneingabeende;
einer Erfassungseinrichtung zum Erfassen der Anwesenheit irgendeiner der Probenkomponenten innerhalb des Erfassungsabschnitts, vorausgesetzt, daß eine der Probenkomponenten ausreichend mit einem vorbestimmten Erfassungsfluid gemischt ist;
einer elektrischen Feldeinrichtung zum Bewegen der Probenkomponenten innerhalb des Trennungsabschnitts zu dem Mischabschnitt durch den Mischabschnitt und dann in den Erfassungsabschnitt, wobei die elektrische Feldeinrichtung eine Elektrodeneinrichtung zum Anlegen eines elektrischen Felds entlang des Probenwegs aufweist; und
einer Fluideinführungseinrichtung zum Einführen des Erfassungsfluids in den Mischabschnitt, derart, daß sich das Erfassungsfluid mit den Probenkomponenten mischt, derart, daß das Erfassungsfluid und die Probenkomponenten ausreichend gemischt werden, bevor sie sich in den Erfassungsabschnitt bewegen, derart, daß die Erfassungseinrichtung die Anwesenheit irgendeiner der Probenkomponenten erfassen kann, und wobei der Mischabschnitt eine innere Oberflächeneinrichtung aufweist, wobei die elektrische Feldeinrichtung elektrische Feldlinien neben der inneren Oberflächeneinrichtung aufweist, wobei die Erfassungsfluideinführungseinrichtung eine Oberflächenladungsdiskontinuität in der inneren Oberflächeneinrichtung auferlegt, und wobei die Diskontinuität eine maximale Ausdehnung entlang des Probenwegs von höchsten 100 µm aufweist.
Weitere Lösungsansätze betrafen das Einführen von Fluoreszenzetikettierungsreagenzien durch Öffnungen in Kapillarwänden. Bei einem CZE-Trennsystem kann eine Öffnung oder eine andere Inhomogenität in den Kapillaren, die den Probenweg definieren, Feldstzrungen bewirken, welche den elektroosmotischen und den anderen elektrokinetischen Effekt stören können. Diese Störungen bewirken zumindest eine Zonenverbreiterung, dieselben können jedoch sogar teilweise oder vollständig die elektrokinetische Bewegung von Probenkomponenten beeinträchtigen.
Zusammengefaßt liefert die CZE eine Trenntechnik, welche die Auflösung bietet, die für die Analyse von komplexen Proteinen erforderlich ist, es existiert jedoch keine ausreichend empfindliche, kompatible Erfassungstechnik. Die Fluoreszenzerfassung liefert einen wünschenswerten Pegel an Empfindlichkeit, die erforderliche Etikettierung ist jedoch in dem CZE-Zusammenhang nicht ausführbar gewesen. Es wird ein System bentigt, das die Auflösungsleistung der CZE mit der Erfassungsempfindlichkeit kombiniert, die mit Fluoreszenzetikettierten Proteinen erhältlich ist.
Die vorliegende Erfindung schafft ein chemisches Analysesystem zum Analysieren einer Probe, die mehrere Komponenten enthält, wobei das System folgende Merkmale aufweist:
eine Probenwegeinrichtung zum Definieren eines sich longitudinal erstreckenden Probenwegs, wobei die Probenwegeinrichtung eine Trennkapillare mit einem Eingabeende und einem Ausgabeende aufweist, wobei die Probenwegeinrichtung eine Mischkapillare mit einem Eingabeende und einem Mischabschnitt aufweist, wobei die Probenwegeinrichtung einen Erfassungsabschnitt aufweist, der nach dem Mischabschnitt positioniert ist, wobei das Eingabeende der Mischkapillare radial bezüglich des Rests der Mischkapillare vergrößert ist, derart, daß der Innendurchmesser des Eingabeendes der Mischkapillare größer als der Außendurchmesser des Ausgabeendes der Trennkapillare ist, wobei das Ausgabeende der Trennkapillare das Eingabeende der Mischkapillare überlappt, um einen ringförmigen Zwischenraum zwischen denselben zu definieren;
eine Probenbewegungseinrichtung zum Bewegen der mehreren Komponenten mit jeweiligen Raten durch die Trennkapillare und durch den Mischabschnitt und in den Erfassungsabschnitt;
eine Erfassungseinrichtung zum Erfassen der mehreren Komponenten in dem Erfassungsabschnitt, vorausgesetzt, daß die mehreren Komponenten mit einem Erfassungsfluid gemischt sind; und
eine Erfassungsfluideinführungseinrichtung zum Einführen des Erfassungsfluids in den Mischabschnitt über den ringförmigen Zwischenraum, derart, daß sich das Erfassungsfluid mit den mehreren Komponenten mischt.
Vorzugsweise sind eine Leistungsversorgung und zugeordnete Elektroden angeordnet, um ein elektrisches Feld durch die Trennungs- und Misch-Kapillare zu liefern. Die Probeneinführungseinrichtung ist vorgesehen, um eine Probe in die Trennkapillare einzuführen. Ein Behälter mit einer Probenlösung kann beispielsweise vorgesehen sein. Der Eingang der Trennkapillare kann in die Probenlösung eingeführt werden. Ein elektrisches Feld, das entlang der Trennungs- und der Misch-Kapillare angelegt ist, kann verwendet werden, um die Probenlösung in das Eingabeende der Trennkapillare zu drängen. Anschließend kann das Eingabeende der Trennkapillare in einen Elektrolyt eingeführt werden. An diesem Punkt wird keine Probe mehr eingeführt, sondern die bereits eingeführte Probe beginnt damit, zu wandern und sich in ihre Komponenten zu trennen.
Ein geeigneter Detektor, der strömungsmäßig hinter dem Mischabschnitt angeordnet ist, kann verwendet werden, um Probenspitzen zu erfassen. Bei einer bevorzugten Realisierung der vorliegenden Erfindung wird ein nicht-fluoreszierendes fluorogenes Reagenz mit den Komponentenspitzen gemischt, die aus der Trennkapillare eluieren. In diesem Fall kann ein Fluoreszenzdetektor mit einer intensiven Ultraviolettlichtquelle und mit einem Photomultipliziererdetektor verwendet werden.
Das Ausgabeende der Trennkapillare kann zugespitzt sein, um besser an die Form des Eingabeendes der Mischkapillare angepaßt zu sein, derart, daß das Mischen schnell und mit minimalen Turbulenzen auftritt. Durch Minimieren der Turbulenzen und durch Schaffen eines schnellen Mischens wird die Zonenverbreiterung minimiert. Eine starke Beleuchtung kann die Fluoreszenz steigern und somit das kleine Probenvolumen einer Trennkapillare mit kleinem Durchmesser kompensieren. Das Hintergrundrauschen wird minimiert, indem ein fluorogenes Reagenz verwendet wird, das keine Fluoreszenz erzeugt, es sei denn, daß es mit Probenkomponenten kombiniert wird.
Die Einstein-Gleichung für die Diffusion, d.h. = (2dt)1/2 stellt praktische Grenzen der Durchmesser der Trenn- und der Misch-Kapillare dar, welche für eine ausreichend schnelle Diffusionsmischung erforderlich sind. Der Innendurchmesser des Mischabschnitts der Mischkapillare sollte 100 µm nicht überschreiten, während der maximale Innendurchmesser der Trennkapillare 25 µm nicht überschreiten sollte, derart, daß die Mischzeiten auf etwa eine Sekunde begrenzt sind. Vorzugsweise weist die Trennkapillare eine konstante Bohrungsgröße auf. Ebenfalls vorzugsweise ist die Bohrungsgröße der Mischkapillare mit Ausnahme des Eingabeendes konstant und etwa die gleiche wie oder etwas größer als die der Trennkapillare.
Ein Bohrungsdurchmesser von 100 µm oder weniger erlaubt es, daß der elektroosmotische Fluß gleichmäßig über den kapillaren Querschnitt wirkt, und derselbe minimiert eine Konvektions-induzierte Zonenverbreiterung. Durchmesser kleiner als 100 µm können einen größeren elektrischen Widerstand zwischen den Elektroden 104 und 120 schaffen. Der größere Widerstand erlaubt eine größere Spannung für einen gegebenen Strom. Eine höhere Spannung ist wünschenswert, da sie eine schnellere Wanderung einführt. Eine schnellere Wanderung resultiert in einer kleineren Zonenverbreiterung aufgrund der Diffusion (welche Zeit-bezogen ist) ohne daß ein Kompromiß bezüglich der Spitzentrennung eingegangen werden muß. Es ist notwendig, den Strom zu begrenzen, um ein Sieden des Elektrolyts zu vermeiden.
Die vorliegende Erfindung schafft Hochauflösungs-Trenntechniken, wie z.B. die chemische Zonenelektrophorese. Der Reagenzeinführungslösungsansatz minimiert die Bandverbreiterung aufgrund der Mischung. Ferner kann der Bohrungsdurchmesser für den größten Teil der Länge der Mischkapillare der gleiche wie der der Trennkapillare sein, wodurch ein Probenausbreiten aufgrund von Bohrungsgrößendifferenzen vermieden wird. Die Empfindlichkeit wird maximiert, indem ein fluorogenes Reagenz verwendet wird, derart, daß die Detektorempfindlichkeit einfach durch Erhöhen der Detektorbeleuchtungsintensität gesteigert werden kann. Das Grundrauschen kann minimiert werden, indem ein nicht-fluoreszierendes Reagenz ausgewählt wird, derart, daß das Reagenz nur zu den Fluoreszenzerfassungssignalen beiträgt, wenn es mit Probenkomponenten kombiniert ist. Diese und weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der nachfolgenden Beschreibung bezugnehmend auf die folgenden Zeichnungen offensichtlich.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine schematische Ansicht eines Kapillarzonenelektrophoresesystem gemäß der vorliegenden Erfindung.
Fig. 2A ist eine schematische Schnittansicht eines Mischübergangs des Systems von Fig. 1.
Fig. 2B ist eine Querschnittsansicht des Mischübergangs von Fig. 2A.
Fig. 3 ist eine schematische Darstellung von überlappenden Enden einer Trennkapillare und einer Mischkapillare in dem Mischübergang von Fig. 2A.
Fig. 4 ist eine schematische Schnittansicht eines alternativen Mischübergangs gemäß der vorliegenden Erfindung.
Fig. 5A bis 5E sind schematische Zeichnungen von alternativen Eingabeenden von Mischkapillaren gemäß der vorliegenden Erfindung.

Beschreibung der bevorzuaten Ausführungsbeispiele

Ein Kapillarzonenelektrophorese- (CZE-) System 100 umfaßt eine Leistungsversorgung 102, eine erste positive Elektrode 104, einen ersten Elektrolytbehälter 106, der eine Elektrolytlösung 108 enthält, eine Trennkapillare 110, ein Misch- T-Glied 112, eine Mischkapillare 114, einen Fluoreszenzdetektor 116, einen zweiten Elektrolytbehälter 118, der ebenfalls einen Elektrolyten 108 enthält, und eine Masseelektrode 120. Die Trennkapillare 110, das Misch-T-Glied 112 und die Mischkapillare 114 bilden eine Probenwegeinrichtung 121, die einen Probenweg 122 definiert.
Der Elektrolyt 108, welcher den meisten Teil der Trennkapillare 110 und der Mischkapillare 114 füllt, dient als Medium für das elektrische Feld, das sich entlang des Probenwegs 121 zwischen den Elektroden 104 und 120 erstreckt. Der gleiche Elektrolyt wird als Lösungsmittelträger für die zu analysierende biologische Probe verwendet. Ein Probenbehälter 123 mit einer in demselben eingefügten zweiten positiven Elektrode 124 enthält eine Probenlösung 126. Ein Reagenzbehälter 128 enthält ein Orthophthaldialdehyd- (OPA-) Reagenz 130, das entlang einer Reagenzkapillare 132 zu dem Misch-T- Glied 112 gerichtet wird, um sich mit dem Ausfluß der Trennkapillare 110 innerhalb der Mischkapillare 114 zu mischen. Der Reagenzfluß kann gesteuert werden, indem die Höhe des Reagenzbehälters 128 bezüglich des Misch-T-Glieds 122 eingestellt wird.
Die Probenlösung 126 kann über das Eingabeende 134 in die Trennkapillare 110 eingeführt werden. Das Eingabeende 134 wird zuerst in dem Probenbehälter 134 plaziert, während ein Ausgabeende 135 der Mischkapillare 112 in dem zweiten Elektrolytbehälter 118 ist. Die Leistungsversorgung 102 errichtet ein elektrisches Feld von der positiven Elektrode 124 durch die Trenn- und die Mischkapillare 110 und 114 zu der Masseelektrode 120. Sobald der Elektrolyt strömungsmäßig zu der Masseelektrode 120 durch den elektroosmotischen Fluß gezogen wird, wird die Probenlösung 126 in die Trennkapillare 110 an ihrem Eingabeende 134 gezogen. Die Leistungsversorgung 102 wird an dem Ende des Zeitintervalls ausgeschaltet, das erforderlich ist, um die geeignete Menge einer Probenlösung 126 einzuführen, welche typischerweise etwa 2 Nanoliter beträgt.
Das Eingabeende 134 der Trennkapillare 110 wird dann in den ersten Elektrolytbehälter 108 eingeführt, um die in Fig. 1 gezeigte Konfiguration zu erreichen. Die Leistungsversorgung 102 errichtet wieder ein elektrisches Feld, das einen elektroosmotischen Fluß induziert. Diesem Fluß überlagern sind relative elektrophoretische Wanderungsraten, die von den Größen und Vorzeichen der Molekularladungen abhängen. Das Resultat besteht darin, daß sich jede Probenkomponente mit einer charakteristischen Rate durch die Trennkapillare 110 in die Mischkapillare 114 bewegt, und daß jede zu einer jeweiligen Zeit an dem Fluoreszenzdetektor 116 vorbei läuft.
Der Fluoreszenzdetektor 116 beleuchtet etikettierte Probenkomponenten innerhalb der Mischkapillare 114 unter Verwendung eines gut fokussierten hochintensiven Ultraviolettlichts, wie z.B. Licht aus einer Quecksilber-Xenon-Bogenlampe oder von einem Ultraviolettlaser. Der Detektor 116 umfaßt eine Photomultipliziererröhre, welche die resultierende Fluoreszenzintensität in einen Photostrom umwandelt, der verwendet wird, um ein Intensitätausgangssignal als Funktion der Zeit zu erhalten.
Die Etikettierung nach der Trennung wird an dem Übergang 200 durchgeführt, der in Fig. 2A detailliert dargestellt ist. Das Misch-T-Glied 112 aus rostfreiem Stahl weist zwei serielle Tore 238 und 240 und ein orthogonales Tor 242 auf. Die Trennkapillare 110 wird durch eine erste Zwinge 244 getragen, in der sich dieselbe durch das erste serielle Tor 238 erstreckt, während die Mischkapillare 114 durch eine zweite Zwinge 246 getragen wird, in der sie sich durch das zweite serielle Tor 240 erstreckt. Die Reagenzkapillare 132 erstreckt sich durch das orthogonale Tor 242, in der sie durch eine dritte Zwinge 248 befestigt ist. Die Zwingen 244, 246 und 248 werden durch jeweilige Abdeckungen 245, 247, 249 an ihrem Platz gehalten.
Die Quarzglas-Reagenzkapillare 132 weist einen Innendurchmesser von 200 µm, einen Außendurchmesser von 325 µm und eine Länge von 70 cm auf. Wenn die Richtung des Probenflusses genommen wird, um eine longitudinale Stromabwärtsrichtung zu definieren, dann erstreckt sich gemäß der vorliegenden Erfindung die Trennkapillare 110 in die Mischkapillare 114, derart, daß sich die zwei longitudinal überlappen, wodurch eine Überlappungsregion 250 definiert wird, und wobei sie sich vorzugsweise konzentrisch überlappen. Die Überlappungsregion 250 umfaßt ein zugespitztes Ausgabeende 251 der Trennkapillare 110 und ein aufgeweitetes Eingabeende 253 der Mischkapillare 114.
In der Überlappungsregion 250 ist ein ringförmiger Zwischenraum 252 zwischen dem Trennausgabeende 250 und dem Mischeingabeende 253 definiert, wie es im Querschnitt in Fig. 28 gezeigt ist. Der ringförmige Zwischenraum 252 liefert eine fluidmäßige Kommunikation zwischen der Reagenzkapillare 132 und einem Mischabschnitt 254, der in Fig. 2A gezeigt ist, der Mischkapillare 114 neben dem Ausgabeende 251 der Trennkapillare 110. Dies ermöglicht es, daß sich das fluorogene Reagenz 130 mit dem Trennkapillaren-Ausfluß nach der Probenkomponententrennung mischt. Nach einer ausreichenden Mischung können die Probenbeleuchtung und die Fluoreszenzerfassung durch ein Fenster 259 eines Erfassungsabschnitts 258, der strömungsmäßig hinter dem Mischabschnitt 254 positioniert ist, auftreten.
Die koaxiale Schnittstelle zwischen dem Trennungsausgabeende 251 und dem Mischeingabeende 253 ist in Fig. 3 detaillierter gezeigt. Die Trennkapillare 110 umfaßt eine mittlere Elektrophoresekapillarbohrung 360, welche einen Durchmesser von 25 µm aufweist, und eine Quarzglaswand 362, die sich von dem Durchmesser von 25 µm bis zu einem Außendurchmesser von 125 µm radial erstreckt. Die Trennkapillarwand 362 ist mit einer Schutzpolyimidkunststoffbeschichtung 364 beschichtet, welche sich bis zu einem äußersten Durchmesser von 150 µm erstreckt. Die Beschichtung 364 wurde von dem freiliegenden Abschnitt 366 an und neben dem Trennungsausgabeende 251 entfernt. Das Ausgabeende 251 ist zu einem Außendurchmesser von 30 µm zugespitzt, welcher etwas größer als der konstante Innendurchmesser der Trennkapillare 110 ist.
Die Trennkapillare 110 wurde gebildet, indem eine kommerziell verfügbare Kapillarröhre mit den Abmessungen der Trennkapillarröhre 110 modifiziert wurde. Die Modifikation beginnt damit, die Beschichtung in dem Bereich zu entfernen, welcher der freiliegende Abschnitt 366 wird, und indem dann ein Ende 251 in einem umgerührten Bad von konzentrierter (48%) Fluorwasserstoffsäure geätzt wird. Während des Ätzens wird Wasser durch die Trennkapillare 110 zu der Ätzlösung gezwungen, um eine Innenätzung zu vermeiden.
Die Mischkapillare 114 weist eine Bohrung 370 auf, die neben dem Eingabeende 253 aufgeweitet ist. Die Mischkapillare 114 weist einen Innendurchmesser von 150 µm an dem Eingabeende und 25 µm an dem Ausflußende auf. Eine Wand 372, die die Bohrung 370 der Silika-Mischkapillare 114 definiert, weist einen Außendurchmesser von 120 µm über dem Großteil der kapillaren Länge auf, wobei ein maximaler Durchmesser von 250 µm an dem vergrößerten Eingabeende 253 erreicht wird. Die Mischkapillare 114 wurde durch Modifizieren einer kommerziell verfügbaren Kapillarröhre mit den Abmessungen der Mischkapillare 114, wie es in Fig. 3 gezeigt ist, modifiziert, wobei die Kunststoffbeschichtung 374 an ihrem Platz ist. Die Modifikation beginnt mit dem Entfernen der Beschichtung in dem Abschnitt, der das Eingabeende 253 wird. Die Kapillare wird an einem Ende abgedichtet, wobei eine Spritze verwendet wird, um dieselbe bis zu mehreren Atmosphären unter Druck zu setzen.
Ein Abschnitt der Kapillare wird erwärmt, derart, daß der Abschnitt durch den Innendruck radial aufgeweitet wird. Die Kapillare wird über einer Gasflamme gedreht, um sicherzustellen, daß die Aufweitung um den Umfang der Kapillare herum gleichmäßig ist. Die Aufweitung definiert eine Verdickung oder Zelle entlang der Länge der Kapillare. Die Aufweitungszeit ist gesteuert, derart, daß die Verdickung den Durchmesser besitzt, der für das Eingabeende der Mischkapillare 114 erwünscht ist. Die Verdickung wird dann mit einem Quarztrennwerkzeug geschnitten. Das resultierende aufgeweitete Ende der Kapillare wird dann mit einem Trommelwerkzeug geglättet, wodurch die Mischkapillare 114 vollendet wird.
Alternativ kann eine Miniatur-Glasdrehbank, wie sie in der EP-A-0386925 beschrieben ist, verwendet werden. Die Glasdrehbank trägt die Kapillare an beiden Enden und dreht die Kapillare unter einem CO&sub2;-Laser. Auf eine sorgfältig zeitlich gesteuerte Art und Weise wobbelt der Laser über die Fläche, die das Eingabeende für die Mischkapillare wird. Dies bewirkt es, daß sich die Bohrung erweitert. Wie oben wird die resultierende Zelle dann mit einem Quarztrennwerkzeug geschnitten, wonach das resultierende vergrößerte Ende der Kapillare mit einem Trommelwerkzeug geglättet wird.
Quarzglas wird für alle drei Kapillaren 110, 114 und 132 aufgrund seiner Flexibilität, seiner Transparenz und seiner elektrischen Isolation verwendet. Das Erfassungsfenster 259 kann durch Wegbrennen eines Abschnitts von 1 bis 2 cm der Polyimidbeschichtung 374 von dem Erfassungsabschnitt 258 gebildet werden.
Fig. 4 ist eine schematische Darstellung eines alternativen Mischübergangs 400, der in das Trennsystem 100 eingebaut werden kann, wobei das Mischen der fluorogenen Reagenz mit dem Probenstrom dargestellt ist. Der Übergang 400 unterscheidet sich von dem Übergang 200 von Fig. 2A in der Form des vergrößerten Eingabeendes der Mischkapillare. Der Übergang 400 umfaßt eine Mischkapillare 402 mit einem radial vergrößerten Eingabeende 404 und einem Mischabschnitt 406. Statt der Aufweitung, welche monoton zu dem Eingabeende zunimmt, erreicht das Eingabeende 404 schnell einen Maximaldurchmesser, welcher für eine begrenzte longitudinale Ausdehnung an diesem Eingabeende 404 beibehalten wird.
Der Probenstrom 408 geht durch die Trennkapillare 410. Das fluorogene Reagenz 412 tritt aus der Reagenzkapillare 132 aus, welche orthogonal bezüglich der Kapillare 410 und bezüglich der Richtung des Flusses des Probenstroms 408 positioniert ist. Durch die Diffusion tritt das fluorogene Reagenz 402 über einen ringförmigen Zwischenraum 414 zwischen der Trennausgabe 416 und der Mischeingabe 404 in die Mischkapillare 402 ein. Das Reagenz 402 reagiert mit dem Probenstrom 408 in dem Mischabschnitt 406. Die Ergebnisse der Reaktion sind etikettierte Komponenten, die durch den Fluoreszenzdetektor 116 von Fig. 1 erfaßt werden können.
Die Fig. 5A bis 5E zeigen verschiedene Formen vergrößerter Bohrungen und aufgeweiteter Bohrungen von Mischkapillarien, die durch die vorliegende Erfindung geschaffen worden sind. Abhängig von den relativen Abmessungen der Trennkapillare und des Eingabeendes der Mischkapillare kann das Ausgabeende der Trennkapillare nicht-zugespitzt gelassen werden.
Die Auswahl der Etikettierungsreagenzien ist durch die Anforderungen der Kompatibilität mit dem ausgewählten Trennverfahren begrenzt. Die meisten fluorogenen Etiketten sind selbst fluoreszent und fügen dem Detektorausgangssignal somit eine oder mehrere Spitzen hinzu. Um die Störfluoreszenz zu vermeiden, muß das Reagenz vollständig reagiert werden, oder eine überschüssige Reagenz muß entfernt werden, bevor die Erfassung stattfindet. Diese beiden Alternativen sind sehr problematisch. Es wird bevorzugt, fluorogene Etikettierungsreagenzen zu verwenden, die, wie OPA, selbst nicht fluoreszent sind, bis sie mit Primäraminfunktionen von Proteinmolekülen reagieren.
Die vorliegende Erfindung schafft eine Mischung nach der Trennung ("Post-Trennungsmischung"), die mit den folgenden alternativen elektrokinetischen Trenntechniken kompatibel ist. Die Kapillar-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese verwendet eine elektrophoretische Wanderung durch eine Gelmatrix. Eine isoelektrische Fokussierung der Kapillare verteilt die Probenkomponenten durch einen isoelektrischen Punkt in einem pH-Gradienten, der über der Länge einer Kapillare gebildet ist. Die Isotachophorese verteilt Probenkomponenten durch die isoelektrische Mobilität. Die Mizellar-Elektrokinese-Kapillarchromatographie ist eine Form einer Chromatographie, welche eine "feste" Phase verwendet, die einem elektroosmotischen Fluß unterworfen ist.
Bei dem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird nach der Trennung ein fluorogenes Etikettierungsreagenz hinzugefügt. Die vorliegende Erfindung umfaßt weitere Erfassungsverfahren und somit die Einführung von Erfassungsfluiden, die für diese Erfassungsverfahren angepaßt sind. Die Massenspektrometrie kann beispielsweise verwendet werden, um getrennte Komponenten zu analysieren. Die vorliegende Erfindung kann verwendet werden, um ein Erfassungsfluid, insbesondere ein Trägerfluid einzuführen, um getrennte Komponenten in ein Massenspektrometer zu bewegen. Diese und weitere Variationen und Modifikationen der beschriebenen Ausführungsbeispiele werden von der vorliegenden Erfindung geschaffen, wobei der Bereich derselben lediglich durch die folgenden Ansprüche begrenzt ist.

Claims

1. Ein chemisches Analysesystem (100) zum Analysieren einer Probe, die mehrere Komponenten enthält, wobei das System folgende Merkmale aufweist:

eine Probenwegeinrichtung zum Definieren eines sich longitudinal erstreckenden Probenwegs (122), wobei die Probenwegeinrichtung eine Trennkapillare (110) mit einem Eingabeende (134) und einem Ausgabeende (251) aufweist, wobei die Probenwegeinrichtung eine Mischkapillare (114) mit einem Eingabeende (375) und einem Mischabschnitt (254) aufweist, wobei die Probenwegeinrichtung einen Erfassungsabschnitt (258), der nach dem Mischabschnitt positioniert ist, aufweist, wobei das Eingabeende (375) der Mischkapillare (114) bezüglich des Rests der Mischkapillare (114) radial vergrößert ist, derart, daß der Innendurchmesser des Eingabeendes (375) der Mischkapillare größer als der Außendurchmesser des Ausgabeendes (251) der Trennkapillare (110) ist, wobei das Ausgabeende (251) der Trennkapillare (110) das Eingabeende (375) der Mischkapillare (114) überlappt, um einen ringförmigen Zwischenraum (252) zwischen denselben zu bilden;

eine Probenbewegungseinrichtung zum Bewegen der mehreren Komponenten mit jeweiligen Raten durch die Trennkapillare (110) und durch den Mischabschnitt (254) und in den Erfassungsabschnitt (258);

eine Erfassungseinrichtung (116) zum Erfassen der mehreren Komponenten in dem Erfassungsabschnitt (258), vorausgesetzt, daß die mehreren Komponenten mit einem Erfassungsfluid (130) gemischt sind; und

eine Erfassungsfluideinführungseinrichtung (132) zum Einführen des Erfassungsfluids in den Mischabschnitt (254) über den ringförmigen Zwischenraum (252), derart, daß sich das Erfassungsfluid (130) mit den mehreren Komponenten mischt.

2. Ein chemisches Analysesystem gemäß Anspruch 1, bei dem das Ausgabeende (251) der Trennkapillare (110), das Eingabeende (375) der Mischkapillare (114) und die Erfassungsfluideinführungseinrichtung (132) durch ein Koppelelement (112) miteinander verbunden sind.

3. Ein chemisches Analysesystem gemäß Anspruch 1 oder 2, bei dem Ausgabeende (251) der Trennkapillare (110) bezüglich des Rests der Trennkapillare (110) verschmälert ist.

4. Ein chemisches Analysesystem gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, bei dem die Probenbewegungseinrichtung eine Elektrodeneinrichtung (120, 124) zum Errichten eines elektrischen Felds zum Bewegen der mehreren Komponenten mit jeweiligen Raten durch die Trennkapillare (110) und durch den Mischabschnitt (254) und in den Erfassungsabschnitt (258) aufweist.

5. Ein chemisches Analysesystem gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem der Mischabschnitt (254) der Mischkapillare (114) eine konstante Bohrungsgröße von 100 µm oder weniger aufweist.

6. Ein chemisches Analysesystem gemäß Anspruch 5, bei dem die konstante Bohrungsgröße des Mischabschnitts (254) etwa gleich groß wie die Bohrungsgröße der Trennkapillare (110) ist.

7. Ein chemisches Analysesystem gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Erfassungseinrichtung (116) eine Fluoreszenzerfassungseinrichtung zum Erfassen von fluoreszenten etikettierten Probenkomponenten aufweist, die durch eine Reaktion zwischen einem fluorogenen Reagenz in dem Erfassungsfluid (13) und den Probenkomponenten erzeugt worden sind, die aus dem Ausgabeende (251) der Trennkapillare (110) austreten.