DE69124305T2

DE69124305T2 - Funkenstrecke zwischen zwei kapillaren elektroden zur fluoreszenzfeststellung bei der kapillarelektrophorese

Info

Publication number: DE69124305T2
Application number: DE69124305T
Authority: DE
Inventors: Stephen Moring
Original assignee: Perkin Elmer Corp
Current assignee: Applied Biosystems Inc
Priority date: 1990-02-28
Filing date: 1991-02-27
Publication date: 1997-06-12
Anticipated expiration: 2011-02-28
Also published as: EP0469146A4; EP0469146A1; WO1991013346A1; EP0469146B1; US5110431A; DE69124305D1

Description

In den Figuren bezeichnet die erste Ziffer einer Bezugszahl die erste Figur, in der das mit der Bezugszahl bezeichnete Element vorgestellt wird.

Hintergrund der Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich allgemein auf Kapillarelektrophorese und genauer auf die Verwendung einer Kapillare mit einer Lücke, durch die elektrische Feldlinien verlaufen, die Probenfluß enthalten und die Zonenverbreiterung gelöster Stoffe minimieren sollen.
In Fig. 1 ist ein Apparat für elektrophoretische Separationen und Elektrochromatographie dargestellt. Eine erste Pufferlösung ist in einem Behälter, z.B. einem Becher 13, enthalten und eine zweite Pufferlösung ist in einem zweiten Behälter, z.B. einem Becher 14, enthalten. Das Eingangsende 19 einer Kapillare 15 wird in den Becher 13 getaucht, und das Ausgangsende 110 der Kapillare 15 wird in den Becher 14 getaucht. Eine Spannungsquelle 16 mit einer Hochspannungselektrode 17, die in die erste Pufferlösung getaucht wird, und einer Masseelektrode 18, die in die zweite Pufferlösung getaucht wird, erzeugen zwischen diesen Lösungen eine Spannungsdifferenz im Bereich von 5-30 kV. Diese Spannungsdifferenz erzeugt einen Strom durch die Kapillare 15 im Bereich von 1-150 µA. Die Kapillare 15 hat einen Innendurchmesser im Bereich von 2-200 µm und eine Länge, die üblicherweise im Bereich von 5 cm bis 2 m liegt. Obwohl der übliche Bereich für Kapillarendurchmesser 2-200 µm ist, können auch andere Durchmesser verwendet werden.
In Fig. 2 ist ein kleiner Ausschnitt der Kapillare 15 detaillierter dargestellt. Der innere Hohlraum 20 der Kapillare 15 ist mit einer leitenden Flüssigkeit gefüllt, die als "Trägerelektrolyt" bezeichnet wird. Die Innenfläche der Wand 21 der Kapillare 15 besteht aus Silan- und Siliziumdioxidgruppen 22 (die in dieser Ausführung negativ sind, für andere Trägerelektrolyte und Wände 21 jedoch positiv sein können), wobei sie einen Überschuß positiv geladener Ionen 23 im Körper 24 des Trägerelektrolyts nahe der Wand abgibt. Die Spannungsquelle 16 erzeugt ein elektrisches Feld , das den positiv geladenen Flüssigkeitskörper 24 zur Kathode der Spannungsquelle 16 treibt. Zusätzlich werden positiv geladene Partikel zur Kathode und negativ geladene Partikel, z.B. Partikel 25, zur Anode der Spannungsquelle 16 getrieben. Probe wird in die Kapillare 15 gefüllt, indem ein Vakuum an das Ausgangsende 110 der Kapillare angelegt wird oder indem das Eingangsende der Kapillare in ein Fläschchen getaucht wird, das die Probe enthält, und kurz das elektrische Feld eingeschaltet wird, um einen Teil der Probe in die Kapillare zu ziehen. Das Eingangsende 19 der Kapillare wird dann wieder in den Becher 13 eingeführt, und das elektrische Feld wird eingeschaltet, um Probenionen aus dem Becher 13 durch die Kapillare 15 zu ziehen.
Viele biologische Moleküle sind amphoterisch, so daß der pH-Wert des Trägerelektrolyts so gewählt werden kann, daß das Ladungsvorzeichen bei ausgewählten Probenbestandteilen gesteuert wird. Aufgrund dieser Fähigkeit, die Ladung von Probenbestandteilen zu steuern, kann eine Separation der Probenbestandteile durch Steuerung der Ladung der Probenbestandteile erzielt werden. Da jedoch biologische Moleküle stärker in Größe und Form als in Ladung variieren, ist es für die Separation biologischer Moleküle vorteilhaft, den inneren Hohlraum 20 der Kapillare 15 mit einem Gel zu füllen, dessen Porengröße so gewählt wird, daß ausgewählte Bestandteile der Probe als primärer Separationsmodus separiert werden.
Die Erfassung der Probenbestandteile kann durch mehrere unterschiedliche Apparaturen erreicht werden, z.B. UV- Absorption, Fluoreszenz, Brechungszahl, Leitfähigkeit oder elektrochemische Erfassung. Dies wird üblicherweise entweder durch Messung im Elektrolyt erzielt, während er sich in der Kapillare 15 befindet oder wenn er aus den Ausgangsende 110 der Kapillare 15 austritt. Die Erfassung der Flüssigkeit in der Kapillare wird allgemein bevorzugt, da die Erfassungszelle 111 ein Teil der Kapillare und daher leicht zu realisieren ist und eine Zonenverbreiterung gelöster Stoffe verhindert, die üblicherweise erfolgt, wenn die Probe aus dem Ausgangsende 110 austritt.
Für UV-Absorptionsmessungen wird ein UV-Strahl durch ein kapillares Röhrchen 15 auf einen Fotodetektor gerichtet, um Absorptionsspektren der Probe aufzuzeichnen. Die Kapillare 15 hat üblicherweise eine Schutzbeschichtung aus Polyamid, die im Bereich der Erfassungszelle 111 abgeschmolzen wird, so daß sie nicht mit der Lichtübertragung durch die Kapillare interferiert. Allgemein ist eine Kapillare nur ein Röhrchen, das üblicherweise einen Innendurchmesser von 1-700 Micron und einen Außendurchmesser von 0,16 cm hat.
Um das Verhältnis zwischen Signal und Störung einer Messung zu maximieren, ist es wichtig, daß im wesentlichen das gesamte UV-Licht durch den Elektrolyt geht. Dafür ist es erforderlich, daß der UV-Lichtstrahl auf der Kapillare 15 zentriert wird und daß der Durchmesser des Strahls kleiner ist als die Innenbohrung der Kapillare 15. Aufgrund des kleinen Durchmessers der Kapillare ist eine Präzisionsausrichtung des UV-Strahls erforderlich. Da die Wand der Kapillare gekrümmt und viel dicker ist als die Innenbohrung der Kapillare, kann eine geringe Fehlausrichtung den Strahl ablenken, wobei diese Fehlausrichtung verstärkt wird. Dies kann zu einem so deutlichen Bruch des Strahls führen, daß er außerhalb des Elektrolytstroms vorbeigeht.
Zur Fluoreszenzerfassung wird eine fluoreszierende Markierung an den Probenmolekülen befestigt. Die Markierung kann vor oder nach der elektrophoretischen Separation der Bestandteile befestigt werden. Da die Markierung jedoch den Ladungszustand ihrer Befestigungsstelle verändern kann, wobei sie die elektrophoretische Separation beeinflußt, wird sie vorzugsweise nach der Separation befestigt, so daß sie nicht mit dem Separationsvorgang interferiert. Dies ist besonders wichtig für Proben, die mehrere Markierungsbefestigungsstellen haben. Außerdem zersetzen sich einige Markierungen, z.B. O-Phthaldialdehyd (OPA), das zur Markierung von Aminogruppen verwendet wird, mit einer Geschwindigkeit, die von der Aminosäure abhängt. Daher ist es vorteilhaft, die Probe erst kurz vor ihrem Eintritt in die Erfassungszelle 111 zu markieren.
Ein hinter der Kapillare angeordneter Reaktionsapparat, der für die Einführung der fluoreszierenden Markierung unmittelbar vor dem Fluoreszenzdetektor geeignet ist, wird im Artikel von Donald J. Rose und James W. Jorgenson mit dem Titel Post-Capillary Fluorescence Detector In Capillary Zone Electrophoresis Using o-Phthaldialdehyde, Journal of Chromatography, 447 (1988), S. 117- 131, vorgestellt. Dieser Reaktionsapparat ist in Fig. 3 dargestellt, und ein Testsystem, in das dieser Reaktionsapparat eingebaut ist, ist in Fig. 4 dargestellt.
Dieser Reaktionsapparat 30 hat die Form eines T 41 mit einem Satz von drei Zwingen 31-33, die das Ausgangsende 110 der Kapillare 15, ein Eingangsende 34 einer Reaktionskapillare 35 bzw. ein Ende 36 einer Reagenzkapillare 37 aufnehmen.
Für eine hohe Auflösung ist es wichtig, daß die Zonen des gelösten Probenstoffs so schmal wie möglich sind. Um eine Verbreiterung dieser Zonen zu vermeiden, ist der Außendurchmesser De der Elektrophoresekapillare 15 kleiner als der Innendurchmesser dr der Reaktionskapillare 35, so daß die Kapillare 15 in einem geringen Abstand in die Kapillare 35 eingeführt werden kann. Aufgrund der kleinen Kapillarendurchmesser ist für diese Einführung die Verwendung eines Mikroskops erforderlich. Ein Behälter 42 mit Markierungsreagenz befindet sich in einer Höhe Δh über den Behältern 13 und 14, so daß durch den hydrostatischen Druck Markierungsreagenz in das Ende 34 der Reaktionskapillare 35 gedrückt wird.
In einer alternativen Ausführung wird das Ausgangsende 110 der elektrophoretischen Kapillare 15 in ein Ätzmittel getaucht, um ihren Außendurchmesser zu verkleinern. Dies geschieht, um die Zonenverbreiterung zu vermindern, die durch den Turbulenzfluß von Reagenz hinter dem stumpfen Ausgangsende der elektrophoretischen Kapillare 15 verursacht wird. Die Notwendigkeit, ein Mikroskop zu verwenden, um dieses Ende in die Reaktionskapillare 35 einzuführen, die erforderliche Zeit, um das Ausgangsende sorgfältig abzuätzen, sowie die Zerbrechlichkeit dieses abgeätzten Endes erhöhen die Herstellungs- und Zusammenbauzeit dieses Reaktionsapparats erheblich.
Im Artikel von Stephen L. Pentoney, Jr., Xiaohua Huang, Dean S. Burgi und Richard N. Zare, On-Line Connector for microcolumns: Application to the on-Column O-Phthaldialdehyde Derivatization of Amino Acids Separated by Capillary Zone Electrophoresis, Anal. Chem., S. 2625-2629, Bd. 60 (1988), wird ein Mikrosäulenverbindungsstück vorgestellt, bei dem ein Laser verwendet wird, um zwei ausgerichtete Löcher durch gegenuberliegende Seiten einer Kapillare mit einem Durchmesser von 75 µm herzustellen. Zwei Kapillaren mit kleinerem Durchmesser werden in diese Löcher eingeführt. Die Chemikalien fließen in die Kapillaren mit kleinerem Durchmesser, so daß der Fluß der Kapillarzonenelektrophorese (CZE) in den Kapillaren mit 75 µm Durchmesser derivatisiert wird, beispielsweise um an den durch CZE separierten Chemikalien eine fluoreszierende Markierung zu befestigen.
Wie in diesem Artikel dargestellt wird, ist es wünschenswert, eine Apparatur vorzusehen, bei der ein CZE- Strom anderen Chemikalien ausgesetzt wird, um ohne Herabsetzung der Auflösung der Bestandteil-(Spitzen-)Zonen im CZE-Strom zu derivatisieren. Leider sind diese Verbindungsstücke beide relativ teuer und zeitaufwendig herzustellen, da die zerbrechlichen Bestandteile der Verbindungsstücke unter einem Mikroskop ausgerichtet und zusammengesetzt werden müssen.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ist eine Ausführung vorgesehen, bei der ein Verfahren zur Kopplung von Flüssigkeit aus einem Ausgangsende einer ersten elektrophoretischen Kapillare in ein Eingangsende einer zweiten elektrophoretischen Kapillare folgende Schritte aufweist:
(a) Einführen des Ausgangsendes der ersten Kapillare in ein erstes Ende eines ersten Kanals, der sich durch einen Funkenstreckenreaktionsapparat erstreckt, und Befestigung dieser Kapillare am Funkenstreckenreaktionsapparat mit einem ersten Fitting;
(b) Einführen des Eingangsendes der zweiten Kapillare in eine zweites Ende des ersten Kanals und Befestigung dieser Kapillare am Funkenstreckenreaktionsapparat mit einem zweiten Fitting, wobei der erste und der zweite Fitting jeweils so angeordnet sind, daß ihre Kapillaren im wesentlichen kollinear am Ausgangsende der ersten Kapillare und dem Eingangsende der zweiten Kapillare ausgerichtet sind, wobei jede dieser Kapillaren so weit in den Reaktionsapparat eingeführt wird, daß das Ausgangsende der ersten Kapillare vom Eingangsende der zweiten Kapillare durch die Lücke getrennt wird und sich diese Kapillaren nicht überlagern;
(c) Eintauchen dieser beiden Enden und der Lücke zwischen ihnen in einen ersten Puffer; sowie
(d) Herstellung einer Spannungsdifferenz ungleich Null zwischen Flüssigkeit im Ausgangsende der ersten Kapillare und Flüssigkeit in Eingangsende der zweiten Kapillare, so daß elektrische Feldlinien erzeugt werden, die vom Ausgangsende der ersten Kapillare zum Eingangsende der zweiten Kapillare verlaufen, wobei die Verbreiterung der Probenbestandteilszone während der Passage durch die Lücke geringer ist als wenn die Spannungsdifferenz Null wäre.
Eine zweite Ausführung ist ebenfalls vorgesehen, worin ein Funkenstreckenreaktionsapparat eine erste Kapillare und eine zweite Kapillare koppelt, so daß das Ausgangsende der ersten Kapillare im wesentlichen mit dem Eingangsende der zweiten Kapillare kollinear ist, wobei der Funkenstreckenreaktionsapparat folgendes aufweist:
einen Körper mit einem ersten Kanal durch diesen zwischen einem ersten Fitting und einem zweiten Fitting;
das Ausgangsende der ersten Kapillare, das in das erste Ende des ersten Kanals eingeführt und mit dem ersten Fitting in einer ersten Position festgeklemmt wird;
das Eingangsende der zweiten Kapillare, das in das zweite Ende des ersten Kanals eingeführt und mit dem zweiten Fitting in einer zweiten Position festgeklemmt wird, so daß das Ausgangsende und das Eingangsende im wesentlichen kollinear ausgerichtet sind, wobei diese Kapillaren jeweils so weit in diesen Kanal eingeführt werden, daß diese beiden Enden durch eine Lücke voneinander getrennt sind; sowie
eine Spannungsquelle, die Flüssigkeit in der ersten und zweiten Kapillare so koppeln kann, daß eine Spannungsdifferenz zwischen dem Ausgangsende der ersten Kapillare und dem Eingangsende der zweiten Kapillare erzeugt wird.
In Übereinstimmung mit den abgebildeten bevorzugten Ausführungen wird ein Funkenstreckenreaktionsapparat vorgestellt, der besonders für das Mischen von Reagenzpuffern in der Kapillare mit elektrophoretischer und mizellarer chromatographischer Separation nützlich ist. Dieser Reaktionsapparat sieht eine zweckmäßige Verbindung von zwei Kapillaren vor, die durch eine puffergefüllte Lücke voneinander getrennt sind. Dieser Reaktionsapparat ermöglicht ein Mischen des Reagenzes über die Lücke ohne deutliche Streuung oder Herabsetzung der elektrophoretischen und mizellaren Separation. Er ermöglicht auch zwei unterschiedliche Funktionstypen von Kapillaren, z.B. offene röhrenförmige, beschichtete Kapillaren und gelgefüllte Kapillaren, wodurch die Separationsfähigkeiten der beiden Prozeßtypen nacheinander auf eine bestimmte Probe angewandt werden können.
In diesem Reaktionsapparat wird ein Ausgangsende einer ersten Kapillare Ende an Ende im wesentlichen kollinear mit einem Eingangsende einer zweiten Kapillare ausgerichtet, wobei diese beiden Enden durch eine kleine Lücke voneinander getrennt sind. Die Teile dieser beiden Kapillaren an dieser Verbindungsstelle werden in einen Puffer getaucht, der Reagenzien liefern kann, die mit der elektrophoretischen oder mizellaren Separation vermischt werden.
Die Durchflußgeschwindigkeiten in den beiden Kapillaren können so gesteuert werden, daß eine bestimmte Flüssigkeitsmenge in die zweite Kapillare gezogen wird. Die Steuerung der Durchflußgeschwindigkeit kann durch Steuerung einer Anzahl von Parametern erzielt werden, z.B. der Innendurchmesser der Kapillaren, des Druckabfalls durch jede Kapillare, der Beschichtungen auf den Innenflächen der Kapillaren, dem Vorhandensein eines Füllmaterials in einer oder beiden Kapillaren und potentiellen Gefälle und Länge jeder Kapillare. Im Gegensatz dazu wird bei der Kapillarzonenelektrophorese der Fluß F∞ primär durch die angelegte Spannung, die Ionenstärke des Puffers, die Viskosität des Puffers und den Bereich der Innenfläche der Kapillarenwand bestimmt.
Die Reagenzien können so ausgewählt werden, daß eine fluoreszierende Markierung an den Probenbestandteilen befestigt wird, so daß eine Fluoreszenzerfassung der Bestandteile ermöglicht wird. Daß diese Reaktion in der Kapillare erfolgt, ist aus mehreren Gründen vorteilhaft. Die Probenbestandteile können unmittelbar vor dem Fluoreszenzdetektor markiert werden, so daß zwischen der Befestigung der Markierung und der Durchführung der Fluoreszenzmessung nicht genug Zeit bleibt, daß die Markierung verfallen kann, bevor sie den Detektor erreicht. Außerdem kann die Anwesenheit der Markierung den elektrophoretischen oder mizellaren Separationsprozeß deutlich beeinflussen. Daher ist es vorteilhaft, die Strecke, welche die markierte Probe zurücklegt, bevor sie den Detektor erreicht, zu minimieren.
Für elektrophoretische Separationen wird eine Spannungsdifferenz V&sub1; zwischen dem Puffer am Eingangsende der ersten der beiden Kapillaren und dem Puffer am Ausgangsende der zweiten dieser beiden Kapillaren angelegt. Diese Spannungsdifferenz erzeugt in beiden Kapillaren eine elektrophoretische Ionenbewegung, die genutzt werden kann, um Bestandteile einer Probe, die in das Eingangsende der ersten Kapillare gegeben wird, elektrophoretisch zu separieren.
Die puffergefüllte Lücke kann auch als Teil einer verbesserten Apparatur verwendet werden, um Probenflüssigkeit bei der Extinktions- und Fluoreszenzerfassung einem Lichtstrahl auszusetzen. Im Fall der Extinktionserfassung richtet eine erste optische Faser Licht durch diese Lücke auf eine zweite optische Faser, die Licht auf einen Fotodetektor richtet. Bei der Fluoreszenzerfassung verhindert der Durchgang von Licht durch die puffergefüllte Lücke die Streuung von Licht durch Oberflächen einer probengefüllten Kapillare, wie nach dem bisherigen Stand der Technik üblich ist. Durch Eliminierung dieser Streuungsquelle verringert diese Apparatur die Hintergrundstörung, wodurch das Verhältnis von Signal zu Störung für solche Messungen deutlich verbessert wird.
Empirische Ergebnisse zeigen, daß die Lücke die Probenbestandteilzonen nicht deutlich verbreitert. Es wird angenommen, daß die elektrischen Feldlinien vom Ausgangsende der ersten Kapillare zum Eingangsende der zweiten Kapillare den radialen Probenfluß in der Lücke erzwingen und die Verbreiterung der Zonen gelöster Stoffe beim Passieren der Lücke im wesentlichen eliminieren.
Diese und andere Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der nachfolgenden detaillierten Beschreibung deutlich, in der eine bevorzugte Ausführung unter Bezugnahme auf die Abbildungen beschrieben wird. Die detaillierte Beschreibung soll die vorliegende Erfindung verdeutlichen, jedoch nicht beschränken.

Beschreibung der Figuren

Fig. 1 stellt einen konventionellen Apparat zur elektrophoretischen Separationschromatographie dar.
Fig. 2 stellt einen Querschnitt der Kapillare im Apparat aus Fig. 1 detaillierter dar.
Fig. 3 stellt einen T-förmigen Reaktionsapparat der bisherigen Technik dar, bei dem sich eine erste Kapillare in die zweite Kapillare erstreckt.
Fig. 4 zeigt die Verwendung des Reaktionsapparats aus Fig. 3 in einem elektrophoretischen Separationsapparat.
Fig. 5 stellt einen Funkenstreckenreaktionsapparat zwischen Kapillaren dar, der besonders bei der Kapillarelektrophorese und mizellaren elektrokinetischen Chromatographie nützlich ist.
Fig. 6 stellt einen Kapillarzonenelektrophoreseapparat dar, in dem der Reaktionsapparat aus Fig. 5 verwendet wird.
Fig. 7 stellt die Verwendung dieses Reaktionsapparats zur optischen Erfassung durch die Lücke zwischen den Kapillaren dar.
Fig. 8 stellt die Mitführung von Flüssigkeitsbad dar, wenn die erste Kapillare eine geringere elektroosmotische Durchflußgeschwindigkeit F∞1 hat als die elektroosmotische Durchflußgeschwindigkeit F∞2 in der zweiten Kapillare.
Fig. 9 stellt die elektrischen Feld- und Flüssigkeitsflußlinien durch die Lücke im Reaktionsapparat aus Fig. 5 dar.
Fig. 10A stellt die elektrophoretischen Daten für den Fall einer einzelnen elektrophoretischen Kapillare mit einem Innendurchmesser von 50 Micron dar.
Fig. 10B stellt die elektrophoretischen Daten für den Fall derselben Kapillare dar, nachdem sie sorgfältig zerbrochen und dann mit einer beabsichtigten seitlichen Verschiebung von 20 Micron im Reaktionsapparat 50 gekoppelt wurde.
Fig. 11A zeigt Fluoreszenzdaten, wenn die Kapillaren eine Lücke von 50 Micron und eine Verschiebung von 25 Micron haben.
Fig. 11B zeigt die Fluoreszenzdaten, wenn die Kapillaren eine Lücke von 400 Micron haben.
In Fig. 12A hatten die Kapillaren eine Lücke von 50 Micron und eine Verschiebung von 25 Micron.
In Fig. 12B wurde die Lücke auf 400 Micron erhöht, und das resultierende Spektrum zeigt eine Verringerung der Amplitude ungefähr um den Faktor 1/2 und eine Erhöhung der Spitzenhalbwertbreite um den Faktor 2.
Fig. 13A-13C stellen die Wirkung der Höhe des Pufferbehälters 68 im Vergleich zu den Pufferbehältern 61 und 64 dar.
Fig. 14A und 14B stellen die Verwendung des Reaktionsapparats 50 zur Separation von Tryptophan und Histidin dar.
Fig. 15A und 15B stellen die Veränderung der Fluoreszenzreaktion dar, die durch eine Erhöhung der Temperatur um 10ºC während der Reaktion hinter der Säule von Ortho- Phthaldehyd mit Tryptophan und Histidin verursacht wird.

Beschreibung der bevorzugten Ausführung

Fig. 5 stellt einen Funkenstreckenreaktionsapparat 50 zwischen Kapillaren dar, der bei der Kapillarelektrophorese und der mizellaren elektrokinetischen Chromatographie besonders nützlich ist. Dieser Reaktionsapparat besteht aus einem 2,5 cm breiten, 2,5 cm hohen und 1 cm dicken Körper 51 aus einem transparenten, nichtleitenden Material, z.B. Plexiglas oder Polymethylpenten, einer Linse 52 und zwei Kunststoff-Fittings 53 und 54. Polymethylpenten ist ein besonders geeignetes Material für den Körper, da es klar und chemisch träge ist. Dies ermöglicht es dem Benutzer, in diesen Reaktionsapparat hineinzusehen und verhindert eine Reaktion des Körpers mit den Reagenzien, die diesen Reaktionsapparat durchlaufen.
Die Fittings 53 und 54 sind im Handel bei Optimize Technology erhältlich und umfassen einen Kopf 55, einen Gewindeteil 56 sowie ein verjüngtes Ende 57, das als zwinge dient, wenn dieser Fitting in ein Loch 58 im Körper 51 festgezogen wird. Das Loch 58 ist mit einem Gewinde versehen, um das Gewinde 56 eines Fittings aufzunehmen und hat ein verjüngtes Ende 59, um das Ende 57 eines Fittings zusammenzudrücken, so daß es als Zwinge wirkt. Die Löcher 58 und ein Satz von Kanälen 510 mit einem Durchmesser von 0,16 cm können in den Körper 51 gearbeitet werden. Die Linse 52 wird auf die Seite des Körpers 51 geklebt, um einen Kreuzungspunkt 511 dieser Kanäle zu vergrößern, so daß die Einstellung einer kleinen Lücke 512 zwischen zwei Kapillaren 513 und 514 ermöglicht wird, die durch Fittings 53 bzw. 54 eingeführt wurden. Die Lücke 512 hat üblicherweise eine Länge im Bereich von 1-400 Micron, vorzugsweise im Bereich von 20-50 Micron.
Jede der Kapillaren 513 und 514 hat einen Außendurchmesser von 375 Micron und einen Innendurchmesser, der in einem Bereich von üblicherweise 2-200 Micron gewählt werden kann. Jede dieser Kapillaren wird in ein Teflonröhrchen 515 mit einem Außendurchmesser von 0,16 cm und einem Innendurchmesser von 275 Micron geschoben, so daß jedes Teflonröhrchen seine Kapillare dicht umschließt. Damit die Kapillare durch das engere Teflonröhrchen geschoben werden kann, wird ein Aufweitungswerkzeug, z.B. eine Nadel, in ein erstes Ende des Teflonröhrchen geschoben, um es leicht aufzuweiten. Das Teflon ist nachgiebig genug, daß die Kapillare mit größerem Durchmesser leicht durch dieses Röhrchen geschoben werden kann, so daß sie ca. 1-2 mm aus dem anderen Ende des Teflonröhrchen heraussteht.
Der vom Teflon umhüllte Teil jeder Kapillare wird dann durch eine 0,16 cm weite Bohrung 516 durch den zugehörigen Fitting geschoben, und der Fitting wird leicht auf dem Körper 51 festgezogen, so daß eine bündige, wasserdichte Verbindung des verjüngten Endes 57 mit dieser Kapillare entsteht. Wenn diese Fittings in Löcher 58 geschraubt werden, erstrecken sich die vom Teflon umhüllten Kapillaren in die Kanäle 510. Die geringe Reibung der Teflonumhüllungen ermöglicht es den Kapillaren 513 und 514, weiter durch die Fittings 53 bzw. 54 geschoben zu werden, um die Lücke 512 auf einen vom Benutzer gewählten Wert einzustellen, üblicherweise im Bereich von 1-100 Micron. Während der Einstellung der Lücke wird ein Vergrößerungsglas vor die Linse 52 gehalten, so daß ein ausreichend vergrößertes Bild der Verbindungsstelle 511 entsteht, um die gewünschte Lücke auszuwählen.
Ein Reaktionsapparat, der nur die Fittings 55 und 56 aufweist, kann verwendet werden, um die Testflüssigkeit, die durch die Kapillare 513 in die Kapillare 514 wandert, zu koppeln. Damit jedoch Luftblasen aus dem Kreuzungspunkt 511 entfernt werden können und das Fließen der Reagenzflüssigkeit ermöglicht wird, während sie über die Lücke 512 und durch die Kapillare 514 geht, umfaßt der Reaktionsapparat 50 zusätzliche Fittings und zugehörige Löcher. Die Ausführung aus Fig. 5 umfaßt zwei zusätzliche Löcher 58 sowie Fittings 517 und 518, damit zwei weitere Kapillaren oder Kunststoffröhrchen 519 und 520 mit einem Durchmesser von 0,16 cm an den Reaktionsapparat gekoppelt werden können. "Kapillaren" sind nur Röhrchen, die üblicherweise einen Innendurchmesser im Bereich von 1-700 Micron und einen Außendurchmesser von 0,16 cm haben. Der Nutzen dieser zusätzlichen Kapillaren ist in Fig. 6 dargestellt, in der ein elektrophoretischer Apparat dargestellt ist, der eine Funkenstrecke zwischen Kapillaren zur Fluoreszenzerfassung verwendet.
Ein Eingangsende der Kapillare 513 wird kurz in eine Probenlösung getaucht, so daß eine kleine Menge Probenlösung angesaugt wird, und dann wird dieses Eingangsende in einen anodischen Puffer in einem Pufferbehälter 61 getaucht. Eine positive Spannung von einer Hochspannungsquelle 62 wird durch eine Elektrode 63, die ebenfalls in den anodischen Puffer getaucht wird, an den anodischen Puffer angelegt. Ein Ausgangsende der Kapillare 514 wird in einen kathodischen Puffer in einem geerdeten Pufferbehälter 64 getaucht. Diese angelegte Spannung erzeugt einen elektrophoretischen Fluß geladener Moleküle gelöster Stoffe in der Kapillare 513, so daß die verschiedenen Bestandteile der Probenlösung separiert werden. Die Kapillare 514 geht zur Fluoreszenzerfassung der elektrophoretisch separierten Bestandteile der Probenflüssigkeit durch einen Fluoreszenzdetektor 60.
Um die Fluoreszenzerfassung dieser Bestandteile zu ermöglichen, muß eine fluoreszierende Markierung an den Bestandteilen befestigt werden. Da diese Markierung üblicherweise eine kurze Verfallszeit hat und mit der elektrophoretischen Separation interferieren kann, ist es vorteilhaft, diese Markierung unmittelbar vor dem Fluoreszenzdetektor anzulegen. Dies geschieht durch Einbau einer zusätzlichen Kapillare 519, die an einen Reagenzbehälter 65 angeschlossen wird, der ein Reagenz enthält, das mit der Probenlösung so reagieren kann, daß die fluoreszierende Markierung befestigt wird. Der Fluoreszenzdetektor befindet sich in geringem Abstand (in der Größenordnung von 5-8 cm) zum Reaktionsapparat 50, so daß Fluoreszenzverfall nur in geringem Ausmaß auftritt, bevor die markierte Probe den Fluoreszenzdetektor passiert.
Zusätzliche Kapillaren, z.B. die Kapillare 519, und ein Ventil 66 werden an den Reaktionsapparat 50 angeschlossen, so daß dieser elektrophoretische Apparat zusätzliche Flexibilität erhält. Beispielsweise kann das Ventil 66 aktiviert werden, um die Kapillare 519 an einen zusätzlichen Pufferbehälter 68 anzuschließen, um zusätzliche Reagenzien auf die Probe aufzutragen oder zusätzliche Pufferlösung, um die Probe zu verdünnen. Das Ventil 66 wird auch an einen Abwasserbehälter angeschlossen, um Abwasser aus dem Reaktionsapparat 50 zu ziehen. Ein negativer Kopfdruck kann durch eine Vakuumpumpe 610 an die Flüssigkeit im Behälter 69 angelegt werden, oder indem der Behälter tiefer angeordnet wird als der Reaktionsapparat 50. Dadurch ermöglicht es der Reaktionsapparat 50, zwischen den Kapillaren Puffer und Reagenzien auf die Probenflüssigkeit aufzutragen, wodurch der elektrophoretische Separations- und Erfassungsprozeß vereinfacht wird.
Ein Heizelement 521, das an eine ferne Stromquelle (nicht abgebildet) angeschlossen ist, wird verwendet, um die Temperatur der Verbindungsstelle zu erhöhen, üblicherweise um 10-30ºC, um die Reaktionen zu beschleunigen. Viele Reaktionen sind sehr temperaturabhängig, so daß sogar eine Änderung von wenigen Grad die Reaktionsgeschwindigkeit deutlich beeinflussen kann. Dies ist besonders vorteilhaft für die Reaktion zur Befestigung einer Fluoreszenzmarkierung, da der Fluoreszenzdetektor in einem geringen Abstand zum Kreuzungspunkt 511 angeordnet ist, so daß ein minimaler Verfall der Fluoreszenz auftritt, bevor die markierte Probe den Detektor erreicht.
Der Reaktionsapparat 50 kann auch für spektrophotometrische Messungen der Probenlösung verwendet werden. Für Extinktionsmessungen kann dies erreicht werden, indem anstelle der Kapillaren 519 und 520 zwei optische Fasern 71 und 72 (wie in Fig. 7 dargestellt) durch die Fittings 515 und 516 eingeführt werden. Die optische Faser 71 hat ein Eingangsende, das an eine optische Quelle angeschlossen ist, so daß sie einen optischen Strahl 73 durch die Lücke 512 an die Faser 72 abgibt, die dieses Licht weiter an einen Fotodetektor überträgt. Dieser Aufbau ist vorteilhaft, da die Lichtstreuung im Vergleich zu anderen optischen Systemen, z.B. dem Fluoreszenzdetektor 60, der den optischen Strahl durch die gekrümmten Seiten einer Kapillare leitet, reduziert wird. Für Fluoreszenzmessungen wird ein optischer Strahl durch die Linse 52 auf die Lücke 512 abgebildet und zeigt ebenfalls reduzierte Lichtstreuung im Vergleich zu Systemen, die das Licht durch die Seite einer Kapillare abbilden. Dies ist aufgrund der stark reduzierten Intensität des fluoreszierenden Lichts im Vergleich zur Intensität des optischen Strahls besonders wichtig für Fluoreszenzmessungen. Der Beitrag von gestreutem Licht zur Fluoreszenzemission von Molekülen gelöster Stoffe (das primäre Signal) reduziert die Empfindlichkeit der gesamten Fluoreszenzmessung.
Fig. 8 zeigt, daß die Apparatparameter so ausgewählt werden können, daß der elektroosmotische Fluß F∞1 in der Kapillare 513 geringer ist als der elektroosmotische Fluß F∞2 in der Kapillare 514. Daher wird zusätzlich zur Flüssigkeit aus der Kapillare 513 Puffer oder Reagenz aus dem Röhrchen 519 in die Kapillare 514 gezogen, wie vom Flußpfeil 81 (F) angegeben. Diese Situation kann durch verschiedene gewählte Parameter entstehen, z.B.: (1) Kapillare 513 und 514 sind gleich, bis auf die Tatsache, daß Kapillare 514 einen größeren Innendurchmesser hat als Kapillare 513, so daß die größere Innenfläche der Kapillare 514 einen höheren elektroosmotischen Fluß F∞ als F∞1 erzeugt, der in Kapillare 513 auftritt; (2) Kapillare 513 ist dichter gefüllt als Kapillare 514; oder (3) die Flüssigkeit in Kapillare 519 erhöht den Druck am Kreuzungspunkt 511 über den Wert, den er ohne die Flüssigkeitseinspritzung aus Kapillare 519 hätte.
Es ist wichtig, daß der Reaktionsapparat 50 die Auflösung der elektrophoretischen Separation nicht deutlich herabsetzt. Experimentelle Ergebnisse haben bestätigt, daß dies tatsächlich der Fall ist. Es wird vermutet, daß die elektrischen Feldlinien 91 (in Fig. 9 dargestellt), die sich vom Ausgangsende der Kapillare 513 zum Eingangsende der Kapillare 514 erstrecken, die Ionen des Probenbestandteils, die aus der Kapillare 513 austreten, über die Lücke 512 in die Kapillare 514 drücken.
Fig. 10A, 10B, 11A und 11B stellen die Zonenverbreiterung der Probenspitzen dar, die durch die Einführung einer Lücke in den elektrophoretischen Flußpfad entstehen. Diese Figuren zeigen, daß die Spitzen nicht wesentlich herabgesetzt werden, auch wenn eine beabsichtigte seitliche Versetzung zwischen den Kapillaren an der Verbindung 511 eingeführt wird. Fig. 10A zeigt die elektrophoretischen Daten für den Fall einer einzigen elektrophoretischen Kapillare mit einem Innendurchmesser von 100 Micron, und Fig. 10B zeigt die elektrophoretischen Daten für den Fall derselben Kapillare, nachdem sie sorgfältig zerbrochen und dann mit einer Lücke von 125 Micron und einer seitlichen Versetzung von 50 Micron im Reaktionsapparat 50 gekoppelt wurde. Fig. 11A zeigt die elektrophoretischen Daten für den Fall einer einzelnen elektrophoretischen Kapillare mit einem Innendurchmesser von 50 Micron, und Fig. 11B zeigt die elektrophoretischen Daten für den Fall derselben Kapillare, nachdem sie sorgfältig zerbrochen und mit einer beabsichtigten seitlichen Versetzung von 20 Micron im Reaktionsapparat 50 gekoppelt wurde. Obwohl es eine merkliche Auswirkung auf das Basissignal gibt, bleiben die drei primären Spitzen sehr deutlich und die primäre Spitze wird nur um einen Faktor von ca. 4 verbreitert.
Fig. 12A und 12B stellen die Auswirkung der Lückengröße dar, wenn das Ausgangsende einer ersten Kapillare mit einem Innendurchmesser von 50 Micron im Reaktionsapparat 50 an das Eingangsende einer zweiten Kapillare mit einem Innendurchmesser von 100 Micron gekoppelt wird. Aufgrund der Differenz der Innendurchmesser wird ein Teil des Puffers im Kreuzungspunkt 511 zusammen mit dem Probenflüssigkeitsstrom aus der ersten Kapillare in die zweite Kapillare gezogen. In Fig. 12A hatten die Kapillaren eine Lücke von 50 Micron und eine Versetzung von 25 Micron. In Fig. 12B wurde die Lücke auf 400 Micron vergrößert und die entstehende Spitze zeigt eine Verringerung der Amplitude ungefähr um einen Faktor 1/2 und eine Erhöhung der Spitzenhalbwertbreite um einen Faktor 2.
Fig. 13A und 13B stellen die Auswirkung der Höhe des Pufferbehälters 68 im Vergleich zu den Pufferbehältern 61 und 64 dar. In Fig. 13A hatten diese drei Pufferbehälter dieselbe Höhe. In Fig. 13B war der Behälter 68 5 cm höher als die Behälter 61 und 64. Der zugefügte Druck in der Verbindungsstelle 50 führt zu einer verringerten Durchflußgeschwindigkeit von Probe durch die Kapillare 514 und einer stärkeren Verdünnung der Probe, während sie die Verbindungsstelle passiert. Dies erzeugt die deutlich verringerten Spitzenhöhen in Fig. 13B im Vergleich zu Fig. 13A. In diesen Figuren steht die obere Linie für einen Fluoreszenzdetektor und die untere Linie für einen UV-Absorptionsdetektor. Fig. 13C zeigt die Ergebnisse, wenn sich der Behälter 68 2 cm unter den anderen beiden Behältern befand.
Fig. 14A und 14B zeigen die Verwendung des Reaktionsapparats 50 für Ortho-Phthalaldehyd(OPA)-Derivatisierung hinter der Säule von Tryptophan und Histidin, die elektrophoretisch separiert worden waren. Diese Figuren zeigen UV-Extinktionsdaten für diese Proben. In Fig. 14A betrug die Wellenlänge des UV-Lichts 200 nm, und in Fig. 14B betrug die Wellenlänge des UV-Lichts 230 nm. Die Tryptophan- und Histidinspitzen sind in beiden Figuren angegeben.
Fig. 15A und 15B stellen die Auswirkung einer Erhöhung der Temperatur von nur 10ºC auf die OPA-Derivatisierungsreaktionsgeschwindigkeit und die auftretende Erhöhung der Fluoreszenz dar. Diese Figuren zeigen bedeutend stärkere Fluoreszenzspitzen, wenn die Temperatur des Reaktionsapparats auf 40ºC gehalten wird (wie in Fig. 13B) als bei 30ºC (wie in Fig. 13A).

Claims

1. Ein Verfahren zur Kopplung von Flüssigkeit aus einem Ausgangsende einer ersten elektrophoretischen Kapillare (513) in ein Eingangsende einer zweiten elektrophoretischen Kapillare (514), aufweisend folgende Schritte:

(a) Einführen des Ausgangsendes der ersten Kapillare (513) in ein erstes Ende eines ersten Kanals (510), der sich durch einen Funkenstreckenreaktionsapparat (50) erstreckt, und Befestigen dieser Kapillare am Funkenstreckenreaktionsapparat mit einem ersten Fitting (53),

(b) Einführen des Eingangsendes der zweiten Kapillare (514) in ein zweites Ende des ersten Kanals (510) und Befestigen dieser Kapillare am Funkenstreckenreaktionsapparat (50) mit einem zweiten Fitting (54), wobei der erste und der zweite Fitting jeweils so angeordnet sind, daß die Fasern am Ausgangsende der ersten Kapillare und am Eingangsende der zweiten Kapillare im wesentlichen kollinear ausgerichtet sind, wobei jede der Kapillaren bis zu einer Tiefe in den Reaktionsapparat eingeführt wird, daß das Ausgangsende der ersten Kapillare vom Eingangsende der zweiten Kapillare durch die Funkenstrecke (512) getrennt wird und sich diese Kapillaren nicht überlagern;

(c) Eintauchen dieser beiden Enden und der Funkenstrecke dazwischen in einen ersten Puffer, sowie

(d) Herstellen einer Spannungsdifferenz ungleich Null zwischen Flüssigkeit am Ausgangsende der ersten Kapillare und Flüssigkeit am Eingangsende der zweiten Kapillare, um elektrische Feldlinien herzustellen, die vom Ausgangsende der ersten Kapillare zum Eingangsende der zweiten Kapillare verlaufen, wobei die Verbreiterung der Zone mit der Probenkomponente beim Durchlaufen der Funkenstrecke geringer ist, als wenn die Spannungsdifferenz Null wäre.

2. Ein Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin aufweisend folgenden Schritt:

(e) Regeln der Temperatur des Reaktionsapparats, wodurch die Reaktionsgeschwindigkeiten innerhalb dieses Reaktionsapparats eingestellt werden.

3. Ein Verfahren nach Anspruch 1, wobei die erste (513) und die zweite (514) Kapillare unterschiedliche Innendurchmesser haben.

4. Ein Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Ausgangsende der ersten Kapillare (513) und das Eingangsende der zweiten Kapillare (514) durch einen Abstand in der Größenordnung des Innendurchmessers einer der beiden Kapillaren voneinander getrennt sind.

5. Ein Verfahren nach Anspruch 1, wobei während des Ausrichtens des Ausgangsendes der ersten Kapillare (513) Ende an Ende mit dem Eingangsende der zweiten Kapillare (514) folgender Schritt eingefügt wird:

(f) Ansehen des Bereichs, der die Funkenstrecke (512) enthält, durch eine optische Abbildungsvorrichtung, welche diesen Bereich vergrößert, wodurch eine erhöhte Genauigkeit bei der Auswahl eines gewünschten Abstands zwischen diesen beiden Enden ermöglicht wird.

6. Ein Verfahren nach Anspruch 1, worin die Spannung über die Funkenstrecke hergestellt wird, indem eine Spannungsdifferenz zwischen Flüssigkeit am Eingangsende der ersten Kapillare (513) und Flüssigkeit am Ausgangsende der zweiten Kapillare (514) hergestellt wird.

7. Ein Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin aufweisend folgenden Schritt:

(g) Abbilden eines Lichtstrahls durch die Funkenstrecke (512).

8. Ein Verfahren nach Anspruch 7, weiterhin aufweisend folgenden Schritt:

(h1) Verwenden einer ersten optischen Faser (72), um Licht zu sammeln, das von der Funkenstrecke (512) kommt.

9. Ein Verfahren nach Anspruch 8, weiterhin aufweisend folgenden Schritt vor Schritt (g1):

(g0) Einführen des Eingangsendes der ersten optischen Faser (72) in einen zweiten Kanal (510), der den ersten Kanal (510) schneidet, sowie

(g0') Verwenden eines dritten Fittings (518), um diese Kapillare am Funkenstreckenreaktionsapparat (50) zu befestigen, so daß das erste Eingangsende dieser optischen Faser so angeordnet und ausgerichtet wird, daß es Licht von der Funkenstrecke (512) empfängt.

10. Ein Verfahren nach Anspruch 9, worin das Abbilden eines Lichtstrahls durch die Funkenstrecke (512) eine Übertragung dieses Strahls (73) vom Ausgangsende einer zweiten optischen Faser (71) umfaßt, die mit einem vierten Fitting (517) am Funkenstreckenreaktionsapparat (50) befestigt ist,

worin das Eingangsende der ersten optischen Faser (72) im wesentlichen kollinear mit dem Strahl (73) ausgerichtet ist, so daß der Strahl durch die Funkenstrecke (512) zur ersten optischen Faser (72) geht, wobei dieses Verfahren für Extinktionsmessungen besonders geeignet ist.

11. Ein Verfahren nach Anspruch 7, worin Licht durch die Funkenstrecke (512) abgebildet wird, ohne die erste (513) oder zweite (514) Kapillare bedeutend zu beleuchten, wobei die Streuung von solchen Kapillaren wesentlich verringert wird.

12. Ein Verfahren nach Anspruch 8, worin das Eingangsende der ersten optischen Faser (72) so ausgerichtet ist, daß es im wesentlichen kein Licht direkt vom Lichtstrahl empfängt, wobei dieses Verfahren für die Fluoreszenzfeststellung besonders geeignet ist.

13. Ein Funkenstreckenreaktionsapparat (50) zur Kopplung einer ersten Kapillare (513) und einer zweiten Kapillare (514), so daß das Ausgangsende der ersten Kapillare im wesentlichen mit dem Eingangsende der zweiten Kapillare kollinear ist, wobei der Funkenstreckenreaktionsapparat folgendes aufweist:

einen Körper (51) mit einem ersten Kanal (510) durch diesen zwischen einem ersten Fitting (53) und einem zweiten Fitting (54);

das Ausgangsende der ersten Kapillare, das in das erste Ende des ersten Kanals eingeführt und mit dem ersten Fitting (53) in einer ersten Position festgeklemmt ist;

das Eingangsende der zweiten Kapillare, das in das zweite Ende des ersten Kanals (510) eingeführt und mit dem zweiten Fitting (54) in einer zweiten Position festgeklemmt ist, so daß das Ausgangsende und das Eingangsende im wesentlichen kollinear ausgerichtet sind, wobei diese Kapillaren jeweils bis zu einer Tiefe in diesen Kanal eingeführt sind, daß ihre beiden Enden durch eine Funkenstrecke (512) voneinander getrennt sind; sowie

eine Spannungsquelle (62), die mit Flüssigkeit in der ersten und der zweiten Kapillare verbunden werden kann, um eine Spannungsdifferenz zwischen dem Ausgangsende der ersten Kapillare und dem Eingangsende der zweiten Kapillare herzustellen.

14. Ein Funkenstreckenreaktionsapparat (50) nach Anspruch 13, weiterhin aufweisend ein Heizgerät (521), das am Körper befestigt ist.

15. Ein Funkenstreckenreaktionsapparat (50) nach Anspruch 13, worin die erste (513) und die zweite (514) Kapillare unterschiedliche Innendurchmesser haben.

16. Ein Funkenstreckenreaktionsapparat (50) nach Anspruch 13, worin das Ausgangsende der ersten Kapillare (513) und das Eingangsende der zweiten Kapillare (514) durch einen Abstand in der Größenordnung des Innendurchmessers einer der Kapillaren voneinander getrennt sind.

17. Ein Funkenstreckenreaktionsapparat (50) nach Anspruch 13, weiterhin aufweisend:

eine Linse (52), die an einer Seite des Reaktionsapparats angebracht ist, so daß ein Benutzer durch diese Linse sehen kann, um einen Bereich des ersten Kanals (510) optisch zu vergrößern.

18. Ein Funkenstreckenreaktionsapparat (50) nach Anspruch 13, worin der Körper (51) aus Polymethylpenten besteht, wobei dieser Körper einen hohen Grad an Klarheit und chemischer Trägheit besitzt.

19. Ein Funkenstreckenreaktionsapparat (50) nach Anspruch 13, weiterhin aufweisend:

eine Quelle eines optischen Strahls, der auf die Funkenstrecke (512) abgebildet wird.

20. Ein Funkenstreckenreaktionsapparat (50) nach Anspruch 19, weiterhin aufweisend:

eine erste optische Faser (72), die im Funkenstrekkenreaktionsapparat so angeordnet und ausgerichtet ist, daß sie Licht empfängt, das von der Funkenstrecke zwischen der ersten (513) und der zweiten (514) Kapillare kommt.

21. Ein Funkenstreckenreaktionsapparat (50) nach Anspruch 20, weiterhin aufweisend:

einen dritten Fitting (518), der die erste optische Faser (72) anordnet und am Funkenstreckenreaktionsapparat festklemmt.

22. Ein Funkenstreckenreaktionsapparat (50) nach Anspruch 21, weiterhin aufweisend:

eine zweite optische Faser (71), die mit einem vierten Fitting (517) so am Reaktionsapparat angeordnet und festgeklemmt wird, daß sie einen Lichtstrahl durch die Funkenstrecke richtet.

23. Ein Funkenstreckenreaktionsapparat (50) nach Anspruch 19, worin der Strahl durch die Funkenstrecke gerichtet wird, ohne die erste (513) und zweite (514) Kapillare bedeutend zu überlagern, wodurch die Zerstreuung der Kapillaren verringert wird.

24. Ein Funkenstreckenreaktionsapparat (50) nach Anspruch 23, weiterhin aufweisend:

eine erste optische Faser (72), die im Funkenstrekkenreaktionsapparat so angeordnet und ausgerichtet ist, daß sie Licht empfängt, das von der Funkenstrecke (512) zwischen der ersten und der zweiten Kapillare kommt.

25. Ein Funkenstreckenreaktionsapparat (50) nach Anspruch 13, worin der Körper (51) auch einen zweiten Kanal (510) aufweist, der den ersten Kanal (510) schneidet, wobei dieser zweite Kanal (510) mit einem dritten Fitting (518) abschließt, der eine dritte Kapillare (520) aufnehmen kann, wobei durch diese dritte Kapillare Flüssigkeiten in die Funkenstrecke zwischen der ersten und der zweiten Kapillare eingeführt werden können.

26. Ein Funkenstreckenreaktionsapparat nach Anspruch 25, worin sich das Ausgangsende der ersten Kapillare (513) und das Eingangsende der zweiten Kapillare (514) jeweils in einen Schnittpunkt des ersten Kanals (510) mit dem zweiten Kanal (510) erstrecken.

27. Ein Verfahren nach Anspruch 12, worin Schritt (g) das Abbilden von Licht durch eine Seitenwand des Reaktionsapparats auf einen Teil des Reaktionsapparats in einer Richtung umfaßt, die ungefähr senkrecht zu einer Ebene ist, in der sich der erste Kanal (510) und der zweite Kanal (510) befinden.