DE69405233T2

DE69405233T2 - Biochemisches mehrfach-kapillaranalysegerat

Info

Publication number: DE69405233T2
Application number: DE69405233T
Authority: DE
Inventors: Norman J. Edmonton Alberta T6G 2J9 Dovichi; Jian Zhong Edmonton Alberta T6E 1Y2 Zhang
Original assignee: University of Alberta
Current assignee: University of Alberta
Priority date: 1993-06-03
Filing date: 1994-06-02
Publication date: 1998-03-19
Anticipated expiration: 2014-06-03
Also published as: CA2164207A1; ES2106545T3; ATE157452T1; DE69405233D1; EP0701694B1; US5439578A; DK0701694T3; AU695154B2; EP0701694A1; AU6922394A; US5741412A; NZ267045A; US5584982A; WO1994029712A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft eine zur biochemischen Analyse verwendete Vorrichtung.

TECHNISCHER HINTERGRUND UND KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die gleichzeitige Analyse einer großen Anzahl von biologischen Proben ist bei der Durchflußcytometrie, DNA-Sequenzierung, Flüssigkeits-Chromatographie, Oligonudeotidanalyse, Zonenelektrophorese von Proteinen sowie bei anderen Elektrophoresetechniken nützlich. Insbesondere ist die rasche DNA- Analyse für das Human Genom Projekt wichtig, bei dem es sich um einen Versuch handelt, die Sequenz der Basen (Didesoxynudeotide) in menschlicher DNA zu identifizieren.
Eine zur Sequenzierung von DNA angewandte Technik ist die Kapillarelektrophorese. Bei der Kapillarelektrophorese wird eine geeignete Lösung polymerisiert oder geliert, um in einem verschmolzenen Quarzglas-Kapillarröhrchen mit Innenabmessungen in der Größenordnung von 50 µm eine poröse Matrix zu bilden. Ein elektrisches Feld wird über die Matrix angelegt. Fragmente der Proben-DNA, die in ein Ende des Kapillarröhrchens injiziert werden, wandern unter der Einwirkung des elektrischen Feldes mit Geschwindigkeiten durch die Matrix, die von der Länge des Fragments abhängig sind. Somit erreichen Fragmente unterschiedlicher Länge einen Detektionsteil der Kapillare zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Das Didesoxynucleotid an einem Ende des Fragments kann mit einem fluores zierenden Marker während eines Reaktionsschrittes gekennzeichnet werden. Der fluoreszierende Marker ist mit dem terminalen Didesoxynucleotid verbunden. Wenn das Fragment durch einen Lichtstrahl aus einem Laser in der Detektionszone läuft, fluoresziert der fluoreszierende Marker und die Fluoreszenz kann als ein elektrisches Signal erfaßt werden. Die Intensität des elektrischen Signals ist von der Länge des fluoreszierenden Markers, der in der Matrix in der Detektionszone vorhanden ist, abhängig. Das Didesoxynucleotid an dem Ende des Fragments kann anschließend durch verschiedene Verfahren identifiziert werden. Wenn Fragmente unterschiedlicher Länge unter dem angelegten Feld durch die Matrix wandern, kann ein Profil der Fragmente erhalten werden.
Die Verwendung von drei verschiedenen DNA-Sequenzierungstechniken ist in Swerdlow, H. et al., Three DNA Sequencing Methods Using Capillary Gel Electrophoresis and Laser Induced Fluorescence, Anal. Chem., 53, 2835-2841, 15. Dezember 1991 und der darin angeführten Literatur dargelegt. In der Technik von Tabor und Richardson (spektrale Einkanal-Sequenzierung) wird ein einzelner fluoreszierender Marker verwendet, und die Menge des Didesoxynucleotids in der Reaktionsmischung wird variiert, so daß jede Base des DNA-Fragments mit einer bestimmten Fluoreszenz-Peakhöhe identifiziert werden kann. Beispielsweise kann die Konzentration der Didesoxynucleotide im Verhältnis von 8:4:2:1 variiert werden. Die Variation der Fluoreszenzintensität über die Zeit identifiziert dann die Basensequenz. In dem DuPont System (spektrales Zweikanal- Sequenzieren) werden Succinylfluoresceinfarbstoffe zur Markierung von vier Didesoxynucleotiden verwendet. Eine einzelne Wellenlänge (488 nm) wird zur Anregung der Fluoreszenz der Farbstoffe verwendet. Die Emission wird zwischen zwei Spektralkanälen verteilt, deren Mitte bei 510 und 540 nm liegt. Das Verhältnis der Fluoreszenzintensität in den beiden Spektralkanälen wird zur Identifizierung des terminalen Didesoxynucleotids verwendet. In dem Applied Biosystems-System (spektrale Vierkanal-Sequenzierung) werden vier Farbstoffe -(FAM, JOE, TAMRA und ROX) verwendet, um Primer zu markieren, die mit jeder Didesoxynucleotidreaktion zu verwenden sind. Zwei Linien aus einem Argonlaser (514,5 und 488 nm) werden verwendet, um Fluoreszenz anzuregen. Interferenzfilter werden verwendet, um die Emission bei 540, 560, 580 und 610 nm zu isolieren und Peaks der resultierenden vier elektrischen Signalprofile werden zur Identifizierung der Basen verwendet.
Die Anwendung der Kapillarelektrophorese für die DNA-Analyse ist durch die Streuung von Licht durch die poröse Matrix und die Kapillarwände schwierig. Aus diesem Grund wurde die Verwendung einer Hüllströmungscuvette vorgeschlagen, in der ein Probenstrom von DNA unter laminaren Strömungsbedingungen in die Mitte einer umgebenden Hüllströmung injiziert wird, die allgemein denselben Brechungsindex hat. Eine derartige Cuvette ist in Swerdlow H., et al., Capillary Gel Electrodhoresis for DNA Sequencing: Laser Induced fluorescence detection with the sheath flow cuvette, Journal of Chromatography, 516, 1990, 61-67 beschrieben.
Die vorstehend beschriebenen Verfahren zur DNA-Sequenzierung unter Verwendung von Kapillarelektrophorese haben jedoch Einzelkapillaren verwendet und die rasche DNA-Sequenzierung und andere biologische Prozesse, die die gleichzeitige Analyse von Probeströmen erfordern, erfordern die Verwendung von Mehrfachkapillarsystemen.
Ein derartiges Mehrfachkapillarsystem ist in Huang et al., Capillary Array Electrophoresis Using Laser Excited Confocal Fluorescence Detection, Anal. Chem. 64, 967-972, 15. April 1992 beschrieben. In der Vorrichtung nach Huang werden mehrere Kapillaren, die nebeneinander in einem flachen Anordnungshalter liegen, sequentiell durch einen Laserstrahl abgetastet und Fluoreszenz wird von den Kapillaren unter Verwendung einer Photovervielfacherröhre detektiert. Eine derartige Vorrichtung leidet unter denselben Schwierigkeiten wie bei einer Einzelkapillare, die mit einem Laser abgetastet wird, nämlich daß Streulicht von den Kapillarwänden und Grenzflächen zwischen der Matrix und Kapillare vorhanden ist.
Die Erfinder haben daher eine Mehrfach-Kapillaranalysevorrichtung vorgeschlagen, die das Detektieren von Licht aus mehreren Kapillaren mit einer verringerten Anzahl von Grenzflächen erlaubt, durch die das Licht bei dem Detektieren des von einer zu analysierenden Probe emittierten Lichts treten muß.
In einem Aspekt der Erfindung wird eine Analysevorrichtung zum Analysieren organischer Proben geschaffen, welche Analysevorrichtung umfaßt: eine Strömungskammer (26) mit einen inneren Hohlraum und einem Detektionsbereich im Hohlraum, ein Mittel (90) zum Einbringen einer Hüllflüssigkeit (96) in die Strömungskammer (26), eine Vielzahl von Kapillarröhrchen (14) zur Aufnahme von zu analysierenden Proben und ein Mittel (30), das bewirkt, daß Proben in den Kapillarröhrchen (14) sich darin bewegen, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel (90) zum Einbringen der Hüllflüssigkeit (96) bewirkt, daß diese durch den Detektionsbereich als allgemeine Hüllflüssikeitsströmung hindurchfließt, wobei die Kapillarröhrchen (14) Enden (18) besitzen-, die in der Strömungskammer (26), in strömungsrichtung der Hüllflüssigkeitsströmung gesehen, stromaufwärts vom Detektionsbereich enden, um zu analysierende Proben in den Detektionsbereich zu transportieren, und wobei das Mittel (30), das bewirkt, daß sich die Proben in den Kapillarröhrchen (14) bewegen, bewirkt, daß sich die Proben von den Kapillarenenden (18) weg in die Strömungskammer (26) hinein bewegen, so daß die Proben als Probenströme (58) in der allgemeinen Hüllflüssigkeitsströmung (96) im Detektions bereich mitgeführt werden, wobei ein Mittel zum Sammeln der mitgeführten Probenströme (58) und der Hüllflüssigkeit (96) als gemeinsamer kombinierter Strom, das eine Öffnung (108) stromabwärts vom Detektionsbereich zum Entfernen des gemeinsamen kombinierten Stroms aus der Kammer umfasst, sowie Detektionsmittel (36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56 oder 36, 136, 137, 138, 140 oder 142) zur Detektion von Proben in den mitgeführten Strömen (58) vorgesehen sind.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung bilden die Kapillarröhrchen eine zweidimensionale Anordnung, welche Anordnung mehrere Reihen von Kapillarröhrchen umfaßt, wobei jede Reihe von Kapillarröhrchen in einer Ebene endet, die von jeder anderen Reihe von Kapillarröhrchen verschieden ist.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung umfaßt das Mittel zum Entfernen einen Bereich in der Kammer stromabwärts von dem Detektionsbereich zum Sammeln der Probeströme und der Hüllflüssigkeit als eine gemeinsame Strömung sowie eine Öffnung zum Entfernen der gemeinsamen Strömung aus der Kammer, wobei die Kapillarröhrchen Einlaßenden zum Empfangen der Probe haben, welche Kapillarröhrchen ein Elektrophoresegel enthalten, welche Einrichtung zum Bewirken der Probenbewegung ein Mittel zum Anlegen einer Elektrophoresespannung zwischen den Einlaßenden und den erstgenannten Enden enthält, welches Mittel zum Anlegen der Spannung ein Mittel zum Erden der Hüllflüssigkeit einschließt.
Nach einem weiteren Aspekt schafft die Erfindung ein Verfahren zum Detektieren von Substanzen in organischen Proben, umfassend die folgenden Schritte: das Leiten der Proben durch eine Vielzahl an Kapillarröhrchen (14), die Seite an Seite angeordnet sind und Enden (18) aufweisen, dadurch gekennzeichnet, daß eine Hüllflüssigkeit (96) als allgemeine Hüllflüssigkeitsströmung an den Enden (18) der Kapillarröhrchen (14) vorbei geführt wird und die Proben aus den Kapillarröhrchen (14) hinaus in die allgemeine Hüllflüssigkeitsströmung hinein geleitet werden, so daß die Proben als Ströme (58) in der allgemeinen Hüllflüssigkeitsströmung mitgeführt werden, das Detektieren der Substanzen in den mitgeführten Probenströmen (58), das Sammeln der mitgeführten Probenströme (58) und der Hüllflüssigkeitsströmung (96) als gemeinsame kombinierte Strömung nach dem Detektieren sowie das Entfernen der gemeinsamen kombinierten Strömung.

KURBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Nachfolgend wird eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung unter Bezug auf die Zeichnungen zur Erläuterung beschrieben, in welchen gleiche Bezugszeichen gleiche Elemente bezeichnen.
Figur 1 ist eine isometrische schematische Ansicht einer beispielhaften biochemischen Analysevorrichtung gemäß der Erfindung, die eine Hüllströmungscuvette, mehrfache Kapillaren, eine Strömungskammer und ein optisches System zeigt;
Figur 2 ist eine Schnittansicht durch die Kammer von Figur 1 ohne optische Bestandteile;
Figur 3A ist eine Schnittansicht durch die Kammer von Figur 1, die den Durchtritt eines Laserstrahls durch die Kammer zeigt;
Figur 3B ist eine schematische Ansicht, die ein Lichtsammelund Detektionssystem zur Verwendung mit der Analysevorrichtung aus Figur 2 zeigt;
Figur 4 ist eine Schnittansicht durch die Mehrfachkapillaren- Hüllströmungscuvette aus Figur 2 (der Schnitt verläuft durch die Mitte, zeigt jedoch auch Sockel, die außerhalb der Mitte verlaufen und hinter der Kammer erscheinen);
Figur 5 ist eine Schnittansicht im rechten Winkel zur Schnittansicht von Figur 4 (der Schnitt verläuft durch die Mitte, zeigt aber auch Sockel, die außerhalb der Mitte verlaufen und hinter der Kammer erscheinen);
Figur 6 ist eine Schnittansicht entlang der Linie 6-6 in Figur 5, die den Einlaß für die Hüllflüssigkeit zeigt;
Figur 7 ist eine Schnittansicht entlang der Linie 7-7 in Figur 5, die die außermittigen Sockel zeigt, die die Strömungskammer festhalten;
Figur 8 ist eine Schnittansicht entlang der Linie 8-8 in Figur 4, die die Basis der Cuvette zeigt;
Figur 9 ist eine Schnittansicht enllang der Linie 9-9 in Figur 4, die einen geteilten Stab mit einem Schlitz entlang seiner Mittelachse zum Festhalten der Kapillarröhrchen zeigt;
Figur 10A ist eine Schnittansicht durch die Oberseite der Hüllströmungscuvette;
Figur 10B ist ein Längsschnitt durch die Hüllströmungscuvette;
Figur 10C ist eine Schnittansicht durch die Unterseite der Hüllströmungscuvette;
Figur 11A, 11B und 11C sind Kurven, die die Resultate einer DNA-Sequenzierung unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zeigen;
Figur 12 zeigt eine schematische Darstellung eines weiteren Verfahrens zur Detektierung eines Analyts;
Figur 13 zeigt eine Vorrichtung zur Verwendung bei der elektrochemischen Detektion eines Analyts;
Figur 14 ist eine schematische Schnittansicht einer Analysevorrichtung, die eine rechteckige (in diesem Fall quadratische) Anordnung in einer quadratischen Strömungskammer hat;
Figur 15 ist eine schematische Ansicht von der Unterseite der Kammer von Figur 14; und
Figur 16 ist eine isometrische Ansicht eines quadratischen Gitters von Kapillaren zum Einführen in die Kammer von Figur 14.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG VON BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

In Figur 1 und 2 ist eine Analysevorrichtung zum Analysieren einer DNA-Probe gezeigt, die eine Hüllflüssigkeitscuvette 12 enthält, die die Enden von fünf Kapillarröhrchen 14 einschließt, die nebeneinander in einer Linie wie die Zähne eines Kammes angeordnet sind. Die Kapillarröhrchen 14 sind in einem Kopf stück 16 gehalten, wobei ihre gespaltenen Enden 18 im Inneren der Kammer 12 enden. Die anderen Enden 20 der Kapillarröhrchen 14 enden in fünf Vertiefungen 22 einer herkömmlichen Mikrotiterplatte 24. Die Kapillarröhrchen 14 sind in herkömmlicher Weise verschmolzene Quarzglaskapillaren mit etwa 50 µm innerem Durchmesser und 150 jim äußerem Durchmesser, die von Polymicro erhältlich sind. Die Cuvette 12 ist aus einer Quarzkammer 26 gebildet, die in einem Halter 28 aus rostfreiem Stahl befestigt ist, dessen Konstruktion in Figur 4 bis 9 detaillierter dargestellt ist. Eine Hochspannungsquelle 30, wie z.B. eine Spellman RHR-30PN60 30 KV Leistungsversorgung, ist durch eine erste Elektrode 32 (geerdet) mit dem Halter 28 aus rostfreiem Stahl verbunden und ferner durch fünf zweite Elektroden 34 mit der Flüssigkeit in den Vertiefungen 22 verbunden. Somit kann, wenn die Kapillarröhrchen 14 und die Kammer 12 mit leitfähigem Material gefüllt sind, eine Hochspannung über das Material in den Kapillarröhrchen unter Verwendung der Hochspannungsquelle 30 angelegt werden. Der Schaltkreis wird durch die geerdete Elektrode 32, den Halter 28 aus rostfreiem Stahl (gebildet aus einer Kappe 68, einer Kapillarenhalteeinrichtung 64, einer Kammerhalteeinrichtung 66 und einer Kappe 70), die Flüssigkeit in der Cuvette 12 und in der Kammer 26, die Matrix in den Kapillarröhrchen einschließlich Probenpuffer, sofern vorhanden, Pufferlösung in den Vertiefungen 22 und die Elektroden 34 gebildet.
Ein Laser 36 oder eine andere Quelle kollimierter elektromagnetischer Strahlung gibt einen kollimierten Lichtstrahl 38 ab, der so ausgerichtet ist, daß er durch eine Fokussierlinse 40 in die Kammer 12 entlang eines in die Kammer vorragenden Abschnitts der Kapillarröhrchen so nahe wie möglich an den Enden der Kapillarröhrchen 14 tritt, wie in Figur 3A dargestellt. Die Wellenlänge des Lasers 36 ist so gewählt, daß sie in der zu analysierenden Probe, wie z.B. mit einem Fluorophor umgesetzte DNA, Fluoreszenz anregt. Eine geeignete Wahl für die DNA-Analyse ist ein Innova 70-4 Argon-Ionenlaser, der von Coherent Inc. aus Pab Alto, Kalifornien erhältlich ist. Ein derartiger Laser kann mit Mehrfachwellenlängenspiegeln (488 und 514,5 nm) betrieben werden, wobei die geeignete Auswahl der Wellenlänge von dem zur Sequenzierung der DNA angewandten Verfahren abhängig ist.
Fluoreszenz von der Probe in der Kammer 12 wird durch eine Sammellinse 42 erfaßt, die die Fluoreszenz auf eine Vielzahl von GRIN- (Gradientenindex)-Linsen 44 mit 1 mm Apertur (erhältlich von Nipon Scientific Glass über Precision Cells, Inc. in Farmingdale, NY) abbildet, die an Aufnahmeenden 46 von optischen Fasern 48 befestigt sind. Die optischen Fasern 48 können in bekannter Weise befestigt sein, wie beispielsweise an einem optischen Versuchsaufbau nach Melles Griot (nicht dargestellt) . Die übertragungsenden 50 der optischen Fasern 48 führen in Lawinenphotodioden 52 oder andere Einzelphotonendetektoren, einen für jedes Kapillarröhrchen 14, deren Ausgangssignal durch eine Schnittstelle 54 mit einem Computer 56 verbunden ist. Beispiele für Photodioden 52 sind RCA (EG&G) C30902S Photodioden, die von einer P5310 Stanford Research System Hochspannungsleistungsversorung mit Leistung versorgt werden, oder Photodioden Modell SPCM 100, die von EG&G Canada Ltd. erhältlich sind. Die Fluoreszenz wird entlang den optischen Fasern 48 zu den Photodioden 52 übertragen, deren elektrisches Ausgangssignal proportional zur Intensität der Fluoreszenz ist. Die von den Photodioden 52 abgegebenen elektrischen Signale werden durch eine Datenerfassungsplatine 54 (wie etwa von National Instruments oder von Data Translation, Modell DT2221-G erhältlich) zu einem Computer 56 geleitet, wie etwa einem Macintosh II Computer, zur Verarbeitung gemäß bekannten Techniken. Eine derartige Verarbeitung schließt die Filterung des Signals ein, um ein gewünschtes Frequenzansprechverhalten zu erzielen, sowie ein zweites Filter oder Phase Lock Loop, um die Position der Peak-Zentren zu identifizieren. Bei Schnittstellenplatinen von National Instruments kann es erforderlich sein, die Beleuchtungsintensität zu verringern, um eine Übersättigung der Photonendetektoren zu vermeiden. Alternativ kann das in einzelnen GRIN-Linsen 44 gesammelte Licht durch ein optisches Faserbündel geleitet werden und auf einem Array-Detektor angeordnet werden oder an diesem zum Anliegen gebracht werden. CCD-Kameras werden jedoch für eine Hochgeschwindigkeits-DNA- Sequenzierung für nicht schnell genug gehalten.
Wie in den Figuren 3A und 3B gezeigt, kann dann, wenn die von der DNA-Probe emittierte Fluoreszenz ein Spektrum hat, das in mehr als einer Lichtwellenlänge sein Zentrum hat, eine Einrichtung zum Teilen des Spektrums des empfangenen Lichts verwendet werden. Licht vom Laser 36 tritt durch die Fokussieroptik 40 und tritt durch die Probenströme 58. Fluoreszenz von den Probenströmen wird durch die Optik 42 gesammelt und durch ein Spektralfilter 60 (zum Filtern von Streulicht) zu GRIN- Linsen 44 an den Enden der optischen Fasern 48 geleitet. Das Licht in den optischen Fasern 48 wird durch Wellenlängenteilungs-Demultiplexer 62 geleitet, wo Licht aus verschiedenen Spektralbanden in zwei Sätze 48a und 48b von optischen Fasern und zwei Sätze von Lawinenphotodioden 52a und 52b getrennt wird.
Die Auswahl des Filters 60 und des optischen Systems ist von der auszuführenden Sequenzierungsreaktion abhängig. Für einen Einzelcodon-Sequenzer, der das Sequenzierungsverfahren von Richardson-Tabor verwendet, kann ein einzelnes Spektralfilter 60 mit einer Bandbreite von 45 nm, zentriert bei 530 nm verwendet werden, um Fluorescein-markierte Produkte zu detektieren. Das Filter sollte so gewählt sein, daß durch Raman- und Raleigh-Streuung des Anregungsstrahls 38 bedingte Hintergrundsignale minimiert werden. Bei dem Dupont-Sequenzierungssystem sind zwei Detektionskanäle erforderlich, ein Detektorkanal zur Abbildung von Licht in einem Band mit der Mitte bei 510 nm und der anderer zur Abbildung von Licht mit der Mitte bei 540 nm. Von der Sammeloptik gesammeltes Licht wird unter Verwendung von Wellenlängenteilungs-Demultiplexern 62 in zwei Wege geteilt, wobei ein Weg zu einem Satz von Photonendetektoren 52a führt und der andere zu dem anderen Satz von Photonendetektoren 52b führt. Andere Verfahren zur Wellenlängenteilungs-Demultiplexbearbeitung können verwendet werden, wie beispielsweise das rasche Umschalten eines Filterrades, so daß das Licht von der Probenströmung zeitteilungs-demultiplexbearbeitet wird. Zur Sequenzierung unter Verwendung des durch Applied Biosystems Inc. entwickelten Verfahrens (siehe den Artikel von Swerdlow) sind vier Kanäle erforderlich. Wie bei dem Dupont-System werden zwei Detektorsysteme verwendet und ein Filterrad kann als das Spektralfilter 60 verwendet werden, um zwei ausgewählte Filter durch den Weg des von der Sammeloptik gesammelten Lichts umlaufen zu lassen. Durch Abwechseln der beiden Filter in den zwei Detektionssystemen kann ein Signal aus vier Spektralkanälen erzeugt werden.
Die Sammeloptik 42 sollte so gewählt sein, daß sie ein Bild abgibt, das hinsichtlich der Größe an die Apertur der GRIN- Linsen 44 angeglichen ist, wie es etwa von einem Flachfeld- Mikroskopobjektiv mit hoher numerischer Apertur abgegeben wird, wie beispielsweise von Leitz/Wild hergestellt (0,40 NA achromatisches Objektiv). Bei einem Probenströmungsdurchmesser von 50 µm und einem GRIN-Linsendurchmesser von 1 mm sollte die Vergrößerung beispielsweise etwa 20x sein, was einige Millimeter voneinander entfernt liegende Punkte erzeugt. Da das Licht von der Sammeloptik zur Ausbreitung mit einer gekrümmten Wellenfront neigt, sollten die GRIN-Linsen so angeordnet sein, daß ihre Sammelflächen senkrecht zu den Radien der Wellenfront liegen.
Wie in Figur 4 bis 9 gezeigt, ist die Kammer 26 in einem Halter 28 aus rostfreiem Stahl gehalten, um eine Hüllströmungscuvette zu bilden. Der Halter 28 enthält einen oberen Abschnitt oder eine Kapillarenhalteeinrichtung 64 und einen unteren Abschnitt oder eine Kammerhalteeinrichtung 66, die jeweils aus einzelnen Stabstahlstücken gefräst sind. Die Halteeinrichtungen 64 und 66 sind bei 65 durch ein Gewinde verbunden (Gewinde nicht dargestellt). Eine obere Kappe 68 ist auf das obere Ende der Halteeinrichtung 64 aufgeschraubt. Eine Bodenkappe 70 ist auf das untere Ende der Halteeinrichtung 66 aufgeschraubt. Eine obere Dichtung 72, die aus Kunststoff hergestellt ist, bildet eine Dichtung zwischen der Kappe 68 und der Halteeinrichtung 64. Eine entsprechende Dichtung (nicht dargestellt) kann verwendet werden, um die Kappe 70 dicht mit der Halteeinrichtung 66 zu verbinden. Ein O-Ring (nicht dargestellt) oder eine geeignete Dichtung sollten vorgesehen sein, um sicherzustellen, daß die Halteeinrichtungen 64, 66 dicht miteinander verbunden sind, um eine Undichtigkeit bei 65 zu vermeiden. Die Kappe 68 hat ein zentrales Loch zur Aufnahme der Kapillarröhrchen 14. Eine Kunststoffbuchse 74, in die die Kapillaren eingeschraubt sind, ist mit Epoxy versehen worden, um eine Dichtung um die Kapillarröhrchen 14 bei ihrem Eintritt in die Kappe 68 zu bilden. Die Kapillarenhalteeinrichtung 64 enthält eine hohle Bohrung, die mit einem zylindrischen und ringförmigen Kunststoffabstandshalter 76 ausgekleidet ist. Die hohle Bohrung der Halteeinrichtung 64 ist mit zwei einander gegenüberliegenden halbkreisförmigen Metallstäben 78 ausgefüllt, die jeweils mit einer in ihren einander gegenüberliegenden flachen Flächen gefrästen Nut versehen sind, um einen rechteckigen Schlitz 80 zu bilden. Der Schlitz 80 ist so dimensioniert, daß er die Kapillaren 14 eng aufnimmt und sie in einer Linie aneinander hält.
Die Kammerhalteeinrichtung 66 enthält zwei kreisförmige Abschnitte 82 und 84 und einen Sockelabschnitt 86, in welchem die Kammer 26 sicher gehalten ist. Das Metall in der Kammerhalteeinrichtung 66 ist in dem Sockelabschnitt 86 abgefräst, so daß Vertiefungen 89 gebildet sind. Das Abnehmen des Metalls in diesem Bereich 86 erlaubt es, ein Mikroskopobjektiv nahe an der Kammer 26 (innerhalb einiger Millimeter) anzuordnen. Der obere kreisförmige Abschnitt 82 enthält einen Hüllflüssigkeitseinlaß 90 und eine Bläschenentfernungsöffnung 92.
Der Hüllflüssigkeitseinlaß 90 ist mit einem Teflontm-Rohr 94 (siehe Figur 2) mit einer Hüllflüssigkeitsquelle 96 (nicht maßstabsgerecht dargestellt) verbunden. Die Blasenentfernungsöffnung 22 ist durch ein Teflontm-Rohr 98 mit einem Ventil 100 verbunden. Das Rohr 94 kann ein Dreiwegeventil 102 mit einer Abfallflüssigkeitsleitung 104 zum Entfernen von Bläschen aus der Hüllflüssigkeit enthalten. In der Kammerhalteeinrichtung 66 ist an der Basis der Kammer 26 ein Kunststoffbodenstopfen 106 vorgesehen, der die Kammer 26 in ihrer Position hält. Die Kappe 70 ist mit einer Abfallflüssigkeitsauslaßöffnung 108 versehen, die mit einem Teflontm-Rohr 110 mit einem Abfallflüssigkeitsbehälter 112 verbunden ist.
Wie Figur 2 zeigt, wird die Hüllflüssigkeit durch den Einlaß 90 zugeführt. Die Hüllflüssigkeit tritt in die Oberseite der Kammer 26 ein und bewegt sich als eine Syphonströmung unter Schwerkraft von der Oberseite der Kammer zu der Unterseite an den Enden 18 der Kapillarröhrchen 14 vorbei. Die Flüssigkeit sollte in einer stetigen nicht gepulsten Strömung zugeführt werden und sollte gefiltert und gereinigt werden, um jegliches Hintergrundsignal zu vermeiden, das aufgrund von durch das Blickfeld der Sammeloptiken laufenden Partikeln erzeugt wird. Die Flüssigkeit wird so gewählt, daß sie einen ähnlichen Brechungsindex hat wie die Flüssigkeit, die die Proben- DNA trägt, um Reflexion und Brechung an den Grenzflächen zwischen den Flüssigkeiten mit verschiedenen Brechungsindizes zu vermeiden. Der einfachste Weg, dies zu erreichen, ist die Verwendung derselben Flüssigkeit als Hüllflüssigkeit, die auch die Proben-DNA trägt, wie beispielsweise 1xTBE. Der Volumenstrom der Hüllflüssigkeitsströmung ist niedrig, in der Größenordnung von weniger als 10 ml/h, was bei der beschriebenen Ausführungsform in der Größenordnung von 4 mm/s liegt, obgleich er für einige Anwendungen bis zu 10x niedriger sein kann. Die Flüssigkeit wird nach dem Verlassen der Kammer 12 durch die Öffnung 108 in die Abfallflüssigkeit entleert. Das Abfallflüssigkeitsgefäß 112 sollte zur Hälfte mit Puffer gefüllt gehalten werden. Wenn der Abfallstrom Tröpfchen bildet, wird das Probenströmungsprofil gestört, wenn sich der Tropfen löst. Ein periodisches Rauschen resultiert aus dem periodischen Ablösen von Tropfen. In den Behälter 112 ist vorzugsweise ein kleines Loch gebohrt, aus dem eine Leitung zu einem größeren Behälter 114 führt. Der Spiegel des ersten Behälters 112 bleibt konstant, so daß sich die Hüllströmungsgeschwindigkeit unter Schwerkraftströmungsbedingungen langsam ändert. Ein konstanter Schwerkraftflüssigkeitsdruck kann ebenfalls die Sicherstellung einer konstanten Hülldurchflußmenge unterstützen. Für die beschriebene Vorrichtung hat sich ein Schwerkraftflüssigkeitsdruck von 5 cm als angemessen erwiesen. Bläschen sollten in der Hüliströmung nicht vorhanden sein. Diese können durch visuelle Untersuchung eliminiert werden und unter Verwendung des Dreiwegeventils 102 (indem die das Bläschen enthaltende Flüssigkeit in die Abfallflüssigkeit umgeschaltet wird) eliminiert werden.
Wie in Figur 10A, B und C gezeigt, enthält die Kammer 26 Stirnwände 122a, 122b, Seitenwände 124a, 124b, eine Oberseite 126 und einen Boden 128. Die Wände müssen nicht planar sein, sondern können Vorsprünge zum Ausrichten der Kapillaren enthalten. Jede Wand ist an der Oberseite 1 mm dick und aus einem optischen Quarz hoher Qualität oder einem anderen derartigen inerten Material hergestellt, das für die ausgewählte elektromagnetische Strahlung transparent ist, die entweder von dem Laser 36 oder der Probe aus den Kapillarröhrchen 14 austretend emittiert wird. Die Seitenwände 124a, 124b haben von der Oberseite zum Boden eine konstante Dicke, während die Stirnwände sich jeweils zum Boden hin nach innen um 50 µm verdicken. Das Innere 130 der Kammer 26 hat seitlich dieselbe Abmessung X wie die Dicke des verwendeten Kapillarröhrchens (150 µm in der beispielhaften Ausführungsform) und eine Abmessung Y&sub1; von Stimwand zu Stimwand, die geringfügig größer (50 µm größer in der beispielhaften Ausführungsform) ist als die Summe der Dicken der Kapillarröhrchen 14. Das Innere 132 am Boden der Kammer hat seitlich dieselbe Abmessung X wie die Dicke der verwendeten Kapillaren und die Abmessung Y&sub2; von Stimwand zu Stimwand, die geringfügig kleiner (50 µm in der beispielhaften Ausführungsform) ist als die Summe der Dicken der Kapillarröhrchen 14. Die Kapillarröhrchen 14 sollten eng in das Innere der Kammer 26 eingepaßt sein, wobei ihre Enden einander unmittelbar benachbart enden. Es ist bevorzugt, daß die Kapillarröhrchen 14 in der Kammer 26 angeordnet werden, bevor sie mit Matrixmaterial gefüllt werden.
Insbesondere wenn die Kapillarröhrchen wiederverwendet werden, sind die Sammeloptiken einschließlich der GRIN-Linsen 44 fixiert und die Kapillarröhrchen 14 müssen mit der Sammeloptik ausgerichtet werden, so daß Fluoreszenz von dem Probenstrom, der mit dem Laserstrahl 38 bestrahlt wird, auf die GRIN-Linsen 44 abgebildet wird. Die Kapillarröhrchen 14 werden zunächst durch die Kappe 68 und die Halteeinrichtung 64 in den Schlitz 80 eingeführt, der von den beiden Stäben 78 gebildet ist. Die Kapillarröhrchen 14 können zusammen oder einzeln nacheinander geladen werden. Die Kapillarröhrchen 14 werden in die Kammer 26 auf diese Weise eingeführt und in der Kammer 26 zusammengeschoben, bis sie fest in der Kammer 26 gehalten sind. In der Kammer 26 mit den dargelegten Abmessungen enden die Kapillarröhrchen 14 etwa auf halbem Wege durch die Kammer 26. Die Oberseite der Kammer 26 umschließt so die Kapillarröhrchen 14, wobei die Kapillarröhrchen 14 an den Innenwänden der Kammer an den Enden nahe der Mitte der Kammer und an den Seiten über die Gesamtlänge der Kapillarröhrchen innerhalb der Kammer 26 anliegen. Das Anliegen der Kapillarröhrchen an den Innenwänden der Kammer dichtet jegliche Lükken zwischen den Kapillarröhrchen in der Mitte der Kammer 26. Werden derartige Lücken nicht abgedichtet, können Ungleichförmigkeiten in der Hüllströmung resultieren, was die Signalqualität beeinträchtigen kann. Die Kapillarröhrchen 14 sind vorzugsweise an ihren Enden unter Verwendung bekannter Techniken, die bei der Herstellung von optischen Fasern verwendet werden, gespalten, um ein gleichmäßiges und flaches Ende zu erhalten. Die Kapillarröhrchen 14 erstrecken sich daher in das Innere der Kammer 26 in einem Ausmaß, das von der Rate der Verringerung der Abmessung von Stirnwand zu Stirnwand der Kammer abhängig ist und das bei der beschriebenen beispielhaften Ausführungsform typischerweise 1 cm beträgt. Die Kammer 26 hat eine Höhe H von etwa 2 cm von der Oberseite zum Boden, wie in dem Beispiel dargestellt. Derartige Kammern können von Nipon Scientific Glass durch Precision Cells, Inc. in Farmingdale, NY auf Bestellung erworben werden. Die Höhe H der Kammer ist relativ beliebig, ausreichend, um sowohl die Fixierung der Kapillarröhrchen sicherzustellen als auch den Durchtritt des Lichtstrahls durch die Kammer unterhalb der Kapillarenenden zu erlauben. 2 cm wird gewählt, um das Hinzufügen eines zweiten Laserstrahls unterhalb des ersten zu ermöglichen, wenn zwei Laser für die Analyse verwendet werden. Die Oberseite der Seitenwände 124a, 124b sollte leicht abgeschrägt sein, um das Einführen der Kapillarröhrchen 14 zu erleichtern. Der Aufbau der Kammer ist sehr wichtig, insbesondere wenn die Kapillarröhrchen nicht gegen die über das poröse Matrixmaterial in den Kapillarröhrchen angelegte Hochspannung elektrisch isoliert sind. Wenn die Kapillarröhrchen nicht elektrisch isoliert sind, können Abstoßungskräfte zwischen ihnen Kräfte erzeugen, die, wenn sie nicht gleichmäßig verteilt sind, die Kapillarröhrchen zerstören können. Die Kapillarröhrchen 14 sollten daher alle sicher in der Kammer gehalten werden, um zu verhindern, daß sich diese Belastungen an einem Röhrchen konzentrieren.
Die Kapillarröhrchen 14 sollten innerhalb von etwa 10 µm voneinander enden. Der Laserstrahl 38 sollte vollständig innerhalb von etwa 100 µm von den Enden der Kapillarröhrchen durchtreten. Eine sorgfältige Ausrichtung der Kapillarröhrchen ist erforderlich, so daß das Fluoreszenzbild direkt auf die GRIN-Linsen fällt. Dies kann geprüft werden, indem Licht rückwärts durch die GRIN-Linsen geleitet wird. Das Licht sollte exakt an demselben Punkt durch den Probenstrom treten, an dem die durch den Laserstrahl bedingte Fluoreszenz auftritt. Eine visuelle überprüfung kann verwendet werden, um die korrekte Ausrichtung der Kapillarröhrchen sicherzustellen, wobei geeignete Sicherheitsmaßnahmen aufgrund der Verwendung von Laserlicht zu treffen sind.
Die Länge der Strömungszelle (Distanz zwischen den Stirnwänden 124a und 124b) und die Anzahl der Kapillaren, die in einer einzelnen Strömungszelle detektiert werden können, sind durch die Distanz bestimmt, über die die Laserstrahlgröße an den Probenstromradius bei Austritt aus der Kapillare angepaßt werden kann. Zur Optimierung der Empfindlichkeit sollte der Laserstrahl so nahe wie möglich an den Enden der Kapillaren angeordnet sein, um Diffusionseffekte der Probe in die Hüllflüssigkeit zu minimieren. Der Laserstrahl sollte daher durch den Beschleunigungsbereich des Probenstromes treten. An diesem Punkt zieht eine rascher in Bewegung empfindliche Hüllflüssigkeit die Probenflüssigkeit aus der Matrix. Da die gesamte Cuvette geerdet ist (durch die Elektrode 32), besteht ein sehr kleines elektrisches Feld im Inneren der Cuvette und die Probenflüssigkeit wird nicht durch das elektrische Feld aus den Kapillaren gezogen. Somit ist es die Hüllströmung, die die Probenflüssigkeit aus der Matrix in den Kapillaren zieht. Wenn sich die Probenflüssigkeit von den Enden der Kapillaren wegbewegt, zieht sich ihr Querschnitt zusammen und dehnt sich anschließend aufgrund von Diffusion der Probenflüssigkeit in die Hüllflüssigkeit aus. Der Laserstrahl sollte durch einen Punkt oberhalb des Punktes der maximalen Kontraktion treten, d.h. vor der Diffusionszone.
Ein einzelner Laserstrahl ist parallel zu der Längsachse der Cuvette (Stimwand 122a zu Stimwand 122b) ausgerichtet und regt gleichzeitig Fluoreszenz in jedem Probenstrom an. Die Größe des Laserstrahls sollte so gewählt sein, daß eine ähnliche Beleuchtung jedes Probenstromes sichergestellt ist. Mit einer Linse (beispielsweise einem Mikroskopobjektiv mit einfacher Vergrößerung) zwischen dem Laser 36 und der Kammer 26 kann eine Strahleinschnürung in der Mitte der Kammer angeordnet werden. Die Strahlenpunktgröße in der Mitte der Kammer sollte gleich dem Probenstromdurchmesser an diesem Punkt sein. Bei Kapillarröhrchen mit 50 µm innerem Durchmesser sind dies etwa 50 µm. Der Strahldurchmesser ist in beiden Richtungen von diesem Punkt entfernt größer, aber mit dieser Anordnung ist die Fluoreszenz nahezu optimal.
Bei der Einrichtung der Analysevorrichtung für die DNA- Analyse ist bekanntlich vorsichtiges Vorgehen für die Kapillarelektrophorese nötig. So muß das Matrixmaterial hinsichtlich der Stabilität, der Unterscheidung von längeren Basenlängen und der Sequenziergeschwindigkeit ausgewählt werden. Es ist nicht eine Matrix für alle Anwendungen geeignet. Es hat sich herausgestellt, daß zur DNA-Sequenzierung ein 0%C (nicht vernetztes) 5-6%T Acrylamidgel geeignet ist und den zusätzlichen Vorteil der niedrigen Viskosität hat, was es ermöglicht, daß es ohne weiteres ersetzt werden kann, ohne daß die Kapillarröhrchen 14 aus der Kammer 26 entfernt werden. Ein markengeschütztes Gel, Long-Rangertm von AT Biochemicals, hat sich als nützlich für Anwendungen erwiesen, die Hochspannung in der Größenordnung von 800V/cm verwenden, wie etwa bei diagnostischen Anwendungen. Long-Rangertm Gel erlaubt Sequenzierungsraten in der Größenordnung von 200 Basen in drei Minuten mit einer Genauigkeit von mehr als 95%. 0%C-Gele ergeben Sequenzierungsraten in der Größenordnung von 600 Basen in 2 Stunden bei 200V/cm. Es wurde festgestellt, daß Gel-Temperaturen zwischen 20 ºC und 35 ºC gute Ergebnisse ergeben.
Das Long-Rangertm Gel wird innerhalb einer Kapillare mit 50 µm innerem Durchmesser durch Polymerisierung einer sorgfältig entgasten 5%-Lösung von Long-Rangertm in einem 7 M Harnsäure, 0,6 x TBE-Puffer hergestellt. Die Polymerisierung wird mit 0,4 Teilen pro Tausend (V/V) TEMED und 0,4 Teilen pro Tausend (W/V) Ammoniumpersulphat initiiert. Ein derartiges Gel ist stabil und kann für drei Trennungen verwendet werden. Die Verwendung von Long-Rangerttm Gel mit einer einzelnen Kapillare mit 50 µm innerem Durchmesser hat Sequenzierungsraten von 3200 Basen pro Stunde bei 800V/cm ergeben.
Das Gel kann 0 - 20% Formamid enthalten. Die Zugabe von Formamid in diesem Bereich verringert Kompressionen, insbesondere im Bereich von 10 - 20%, wodurch die Auflösung in Bereichen der Kompression erhöht wird. Es wurde jedoch festgestellt, daß zuviel (20% oder mehr) Formamid die Trennungsrate, den theoretischen Plattenzähiwert und die Auflösung für normal wandernde Fragmente ohne eine damit einhergehende Verringerung der Kompressionen reduziert. Ein optimale Konzentration von 10% Formamid verbessert die Auflösung von komprimierten Regionen ohne die Verschlechterung der übrigen Eigenschaften des Gels. Auch wurde festgestellt, daß ein Betreiben des Gels bei Raumtemperatur angemessen ist und den Konstruktionsaufwand der Analysevorrichtung vereinfacht. Die Resultate der Verwendung von Formamid wurden in Rocheleau, M. J. et al., Electrophoresis, 13, 484-486, 1992 beschrieben.
Das Gel sollte in den Kapillarröhrchen 14 ohne Leerräume oder Bläschen eingerichtet werden, die sich während der Polymensation des Acrylamids aufgrund von Schrumpfung bilden, was besonders auffällig sein kann, wenn ein bifunktionales Silanreagens verwendet wird, um das Gel an die Kapillarwand zu binden. Derartige Bläschen können unter Verwendung von Acrylamid mit niedrigem Prozentsatz, kurzen Säulen, Zugabe von Polyethylenglykol zu der Monomermischung (obgleich dies bei DNA-Fragmenten, die länger als etwa 100 Basen sind, nicht erwünscht ist, da dies die Trennung verschlechtert), oder indem der Ablauf der Polymerisation in einem Druckgefäß ermöglicht wird oder durch andere nach dem Stand der Technik entwickelte Verfahren eliminiert werden.
Auch können Defekte in dem Gel an den Enden 20 auftreten, wenn DNA-Proben in die Kapillarröhrchen 14 geladen werden. Derartige Defekte sind besonders dann von Bedeutung, wenn die Kapillarröhrchen 14 wiederverwendet werden. Es ist daher wünschenswert, einen Abschnitt (einige Millimeter) des Kapillarröhrchens 14 nach einem Durchlauf abzuschneiden. Ferner kann ein derartiger Defekt minimiert werden, indem kleinere Mengen einer DNA-Probe, bis zu fünf mal niedriger im Vergleich zur herkömmlichen Elektrophorese-Sequenzierung von DNA, geladen werden. So sollte beispielsweise die die aufgezeigte Vorrichtung verwendende Probe bei 150V/cm 60 Sekunden lang geladen werden.
Fehlerstellen in dem Gel können durch visuelle Untersuchungen in einem Mikroskop oder durch Durchleiten von zwei Laserlichtstrahlen in einem Winkel durch das Gel, so daß sie sich in dem Gel schneiden, geprüft werden. Eine modulierte Lichtstreuung des Laserlichts aus Fehlerstellen in dem Gel kann unter Verwendung einer Sammeloptik und einer Photovervielfacherröhre detektiert werden.
Beim Laden des Geis in die Kapillarröhrchen 14 ist ebenfalls Sorgfalt erforderlich. Es ist wünschenswert, daß die Geleigenschaften von Kapillarröhrchen zu Kapillarröhrchen gleichförmig sind. Wenn die Kapillarröhrchen der Reihe nach mit Gel beladen werden, können Unterschiede in dem Gel die Analyse stark verschlechtern. Es ist bevorzugt, das Gelmonomer in einen einzelnen Behälter zu laden und die Kapillaren mit dem Gel aus dem einzelnen Behälter gleichzeitig zu füllen, wie etwa durch Vakuumschwerkraftzufuhr des Geis. Bei hohen elektrischen Feldern (in der Größenordnung von 800V/cm) kann das Gel etwa 50 µm aus dem Detektionsende der Kapillare extrudiert werden. Um die Extrusion zu eliminieren, werden etwa 2 cm des Gels an dem Detektionsende kovalent an die Innenwände der Kapillarröhrchen mit γ-Methacryloxypropyltrimethoxysilan gebunden. Bekannte Verfahren zur Einrichtung eines Gels, wie in den US-Patenten 4,865,706 und 4,865,707 für Karger et al. und 4,810,456 für Bente et al. beschrieben, können ebenfalls verwendet werden.
Von dem System aus Figur 1 wurden mit der Detektion an drei Kapillaren unter Verwendung der Sequenzierungstechnik nach Tabor und Richardson Daten gesammelt. Ein M13mp18-Template wurde zur Erzeugung von DNA-Fragmenten verwendet. Mangan wurde anstelle von Magnesium in dem Sequenzierungspuffer verwendet. Sequenase wurde zur Kettenverlängerung verwendet. Ein FAM-markierter Primer wird verwendet und eine Einzel-Sequenzierungsreaktion wird mit ddATP, ddCTP, ddGTP und ddTTP ausgeführt, die in einem Verhältnis von 8:4:2:1 vorhanden sind. Eine 50 µm Kapillare wurde mit 4%T, 5%C-Gel gefüllt und bei 200V/cm betrieben. Bei einem Lauf von 330 Basen in 70 Minuten wurden vergleichbare Daten erhalten wie bei Einzel-Kapillarensystemen, obgleich der Durchsatz 850 Basen/Stunde bei einem Drei-Kapillarensystem betrug. Figur 11a, 11b und 11c zeigen die Resultate der Sequenzierung.
Die Auflösung ist auf Fragmente von weniger als 300 Basen Länge bei Hochspannung nahe 800V/cm begrenzt. Allgemein gesprochen steigt die Rückhaltezeit linear mit der Fragmentlänge für ein gegebenen hohes V/cm an, bis die Mobilität der Fragmente einen Grenzwert erreicht und keine Trennung erzielt wird. Dies wird vorgespannte Reptation genannt. Mit ansteigendem elektrischem Feld bewegt sich der Übergang zur vorgespannten Reptation zu kürzeren Fragmenten. Die vorgespannte Reptation ist äußerst unerwünscht, da sie zur Koelution von Sequenzierungsfragmenten führt und die Trennungsauflösung zerstört. Daher kann bei längeren Fragmenten (in der Größenordnung von 600 Basen) das elektrische Feld auf etwa 140 V/cm verringert werden, womit die Trennungszeit erhöht wird. Eine mäßige Gel-Temperatur (in der Größenordnung von 20 ºC bis 35 ºC) kann die Verbesserung der Sequenzierungsrate unterstüt zen, obgleich dies den übergang von Reptation zur vorgespannten Reptation nicht stark zu beeinflussen scheint. Niedrige %T-Acrylamid-Gele können ebenfalls die Sequenzierung von längeren Fragmenten unterstützen.
Die hier beschriebene Analysevorrichtung ist mit einigen Modifikationen für eine große Vielzahl von Anwendungen nutzbar. In jedem Fall ist ein Mittel zum Hindurchdrängen des Analyts durch die Kapillaren vorhanden, die Kapillaren werden in der Kammer gehalten, wie beispielsweise in Figur 1 und 2 gezeigt, und eine Hüllflüssigkeit wird durch die Cuvette zugeführt, wobei die Hüllflüssigkeit vorzugsweise denselben Brechungsindex hat wie die den Analyt tragende Flüssigkeit.
Die Detektion des Analyts kann auch unter Verwendung von thermooptischer Absorption erreicht werden. Bei dieser Technik wird der Laser 36 verwendet, um den Analyt anzuregen, was die Tendenz hat, den Analyt zu erwärmen und den Brechüngsindex der Flüssigkeit, von der er getragen wird, zu ändern. Wie Figur 12 zeigt, wird die Beugung der Strahlen 138 aus einem zweiten Laser 136 nach der Kollimierung mit einer geeigneten Optik 137 durch die aus den Enden der Kapillarröhrchen 14 austretende Flüssigkeit dann durch das optische System 140 detektiert, das wie in Figur 1 dargestellt konstruiert sein kann.
Eine Analysevorrichtung zur Verwendung als ein elektrochemischer Detektor ist in Figur 13 gezeigt. Elektroden 142 treten in die Kammer 26 (aus einem inerten lichtleitenden Material, wie etwa Quarz hergestellt) von dem unteren Ende 132 der Kammer her ein. Jede Elektrode 142 ist mit einem Verstärker (nicht dargestellt) verbunden und das Ausgangssignal des Verstärkers wird einem Prozessor zugeführt, beispielsweise einem Computer, und zwar durch eine Schnittstelle zur Analyse gemäß bekannten Prinzipien (ähnlich der optischen Verarbeitung der Signale). In diesem Fall ist der Laser 36 nicht erforderlich, da die Identifizierung der Probe durch elektrochemische Analyse erfolgt. Mehrfache Kapillaren ermöglichen eine rasche Analyse.
Die Analysevorrichtung kann auch zum Detektieren von Verunreinigungen in Flüssigkeiten durch Detektieren der Lichtstreuung verwendet werden. In diesem Fall ist die Hochspannungsquelle 30 nicht erforderlich, da die Flüssigkeit direkt als eine Flüssigkeit durch die Kapillarröhrchen gepumpt werden kann, noch ist das Spektralfilter 60 erforderlich, da die Gesamtintensität des gestreuten Lichts detektiert werden kann. Die GRIN-Linsen 44 und die Detektoren 52 detektieren Variationen der Lichtstreuung, die von Partikeln oder Verunreinigungen in der Flüssigkeit herrühren.
Die Analysevorrichtung ist ebenfalls zur Detektion von organischen Kontaminierungsstoffen nützlich, beispielsweise die Fluorenszenzdetektion von polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen. Bei einer derartigen Detektion werden die Kapillarröhrchen mit chromatographischem Packungsmaterial (beschichteten Quarzglasperlen) anstelle eines Polymers gefüllt und die Analytprobe wird durch die Kapillarröhrchen unter Verwendung einer Pumpe anstelle der Hochspannungsquelle 30 zwangsweise gefördert. Der Laser 36 sollte Strahlung bei etwa 330 nm oder einer entsprechenden anderen geeigneten Wellenlänge zur Detektion von organischen Kontaminierungsstoffen emittieren. Die von der Probe des Kontaminierungsstoffes emittierte Fluoreszenz wird durch ein geeignetes Spektralfilter 60 und beispielsweise den in Figur 1 dargestellten optischen Apparat detektiert.
In einem weiteren Beispiel kann die Analysevorrichtung zur Durchflußcytometrie verwendet werden. Bei der Durchflußcytometrie wird eine Zellen enthaltende Probe, die von einem tierischen oder menschlichen Körper durch Aspiration mit einer feinen Nadel entnommen wurde, unter Verwendung eines fluoreszierenden Reagans, wie z.B. Nukleinsäurefarbstoff oder Antikörper, gefärbt. Mit der erfindungsgemäßen Analysevorrichtung wird die Probe unter Luftdruck durch eine Pumpe, die die Hochspannungsquelle 30 ersetzt, zwangsweise durch die Kapillarröhrchen 26 gefördert und der Laserstrahl 38 wird durch die Probe geleitet, wenn sie aus den Kapillarröhrchen 26 in die Hüllströmung austritt. Die Intensität der Fluoreszenz von dem fluoreszierenden Reagans wird unter Verwendung des optischen Systems von Figur 1 detektiert und verwendet, um die Anzahl von Chromosomensätzen in den Zellen zu schätzen, was gemäß bekannten Vorgehensweisen bei der Diagnose und Prognose - von Krebs nützlich ist.
Mehrfachkapillarröhrchen können auch zum Einsprühen von Analyt in ein Massenspektrometer verwendet werden. In diesem Fall werden die Kapillaren in einer kreisförmigen oder vieleckigen Cuvette mit einer Hüllströmung um die Kapillaren gebündelt. Das Kapillarenbündel wird in die Ionisierungskammer eines Massenspektrometers, wie z.B. des dreifachen Quadrupol- Massenspektrometers, das von Sciex Division von MDS Health Group Limited aus Thornhill, Ontario, Kanada unter seinem Warenzeichen TAGA 6000E verkauft wird, eingeführt. Zum elektrischen Sprühen des Analyts werden die Kapillarröhrchen an dem Ende, das in die Ionisierungskammer ragt, leitend gemacht. Elektrisches Potential wird an die Enden der Kapillaren in bekannter Weise angelegt.
Eine quadratische, rechteckige oder andere geeignete vielekkige Anordnung von Kapillarröhrchen kann auch, wie in Figur 14, 15 und 16 dargestellt, im Fall einer quadratischen Kapillaranordnung verwendet werden. Die Anordnung kann auch rechteckig sein. Andere vieleckige Anordnungen könnten im Prinzip verwendet werden, was aber die Optiken komplizierter macht. Die Anordnung von Kapillarröhrchen 14 ist aus fünf Reihen 144 mit jeweils fünf Kapillarröhrchen 14 gebildet, die alle in einer quadratischen Kammer 146 gebunden sind, die einen Teil einer quadratischen Hüllströmungscuvette bildet. Die Cuvette ist der in Figur 4 - 9 dargestellten Cuvette ähnlich, wobei nur die zentrale Kammer quadratisch ist. Ein optisches System 148, das der Cuvette benachbart angeordnet ist, enthält eine Sammeloptik 154, GRIN-Linsen 156 und optische Fasern 158, die zu Photodioden führen, sowie den Rest des optischen Systems, das in Figur 1 dargestellt ist.
Jede Reihe 144 von Kapillarröhrchen ist der in Figur 1 dargestellten Reihe ähnlich, aber nachfolgende Reihen in Richtung des optischen Systems 148 enden höher in der Hüllströmungscuvette, wie bei 160 gezeigt. Alle Kapillarröhrchen 14 in einer Reihe enden unmittelbar aneinander. Die Hüllströmung ist um alle Röhrchen 14 innerhalb der Hüllströmungscuvette vorgesehen. Alle vier Wände 150 der Hüllströmungscuvette verjüngen sich zu dem Boden 152 der Kammer nach innen. Die Enden der Kapillarröhrchen 14 bilden eine geneigte Ebene P, die nach unten von dem optischen System 148 weg abfällt. Ein elliptischer oder mit einem anderen linearen Querschnitt versehener Laserstrahl 162, der in derselben Ebene wie die abfallende Ebene (oder nahe dieser) ausgerichtet ist, ist unmittelbar unterhalb der Enden der Kapillarröhrchen 14 gerichtet. Fluoreszenz der Proben bildet eine abfallende quadratische Anordnung von Fluoreszenzpunkten 164, die als ein quadratisches Punktgitter 166 im rechten Winkel zu der Cuvette hin gesehen erscheint.
Fluoreszenz von den Probeströmen, die aus den Kapillarröhrchen 114 austritt, wird durch eine Optik 154 gesammelt und auf eine quadratische Anordnung von GRIN-Linsen 156 abgebildet, die in der Bildebene der von der Optik 154 erzeugten Fluoreszenzpunkte liegt. Die GRIN-Linsen 156 sind mit ihren Flächen senkrecht zur Wellenfront von der Sammeloptik 154 ausgerichtet. Durch die GRIN-Linsen gesammeltes Licht wird durch optische Fasern zu Photodetektoren der in Figur 1 gezeigten Bauart übertragen.
Es ist möglich, die Cuvette umgekehrt zu betreiben, um es zu ermöglichen, daß Bläschen in der Hüllströmung mit dem Strom nach oben in die Abfallflüssigkeit bewegt werden.
Ein Durchschnittsfachmann könnte Modifikationen ausführen, ohne von der Erfindung gemäß der Definition in den Patentansprüchen abzuweichen.

Claims

1. Analysenvorrichtung zum Analysieren organischer Proben, die folgendes umfasst: eine Strömungskammer (26) mit einen inneren Hohlraum und einem Detektionsbereich im Hohlraum, ein Mittel (90) zum Einbringen einer Hüllflüssigkeit (96) in die Strömungskammer (26), eine Vielzahl an Kapillarröhrchen (14) zur Autuahme von zu analysierenden Proben und ein Mittel (30), das bewirkt, dass Proben in den Kapillarröhrchen (14) sich darin bewegen, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel (90) zum Einbringen der Hüllflüssigkeit (96) bewirkt, dass diese durch den Detektionsbereich als allgemeine Hüllflüssigkeitsströmung hindurch fließt, wobei die Kapillarröhrchen (14) Enden (18) besitzen, die in der Strömungskammer (26), in Strömungsrichtung der Hüllflüssigkeitsströmung gesehen, stromaufwärts vorn Detektionsbereich enden, um zu analysierende Proben in den Detektionsbereich zu transportieren, und wobei das Mittel (30), das bewirkt, dass sich die Proben in den Kapillarröhrchen (14) bewegen, bewirkt, dass sich die Proben von den Kapillarenenden (18) weg in die Strömungskammer (26) hinein bewegen, sodass die Proben als Probenstöme (58) in der allgemeinen Hüllflüssigkeitsströmung (96) im Detektionsbereich mitgeführt werden, wobei ein Mittel zum Sammeln der mitgeführten Probenströme (58) und der Hüllflüssigkeit (96) als gemeinsamer kombinierter Strom, das eine Öffnung (108) stromabwärts vom Detektionsbereich zum Entfernen des gemeinsamen kombinierten Stroms aus der Kammer umfasst, sowie Detektionsmittel (36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56 oder 36, 136, 137, 138, 140 oder 142) zur Detektion von Proben in den mitgeführten Strömen (58) vorgesehen sind.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, worin das Detektionsmittel (36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56) einen Detektor für elektromagnetische Strahlung (52) umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel (36) zum gleichzeitigen Hindurchschicken von elektromagnetischer Strahlung (38) durch die mitgeführten Ströme (58) vorgesehen sind.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, worin die Detektionsmittel (36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56) optische Detektionsmitte (36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56) sind, dadurch gekennzeichnet, dass das Mitte zum gleichzeitigen Hindurchschicken von elektromagnetischer Strahlung durch die mitgeführten Ströme (58) ein Lasermittel (36) umfasst.

4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Enden (18) der Kapillarröhrchen (14) entlang einer geraden Linie angeordnet sind.

5. Vorrichtung nacn Anspruch 4, worin die Kapillarröhrchen (14) jeweils einen inneren Durchgang und eine Außenfläche aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass die inneren Durchgänge in der Strömungskammer gleichmäßig voneinander beabstandet sind.

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Außenflächen der Kapillarröhrchen (14) an den Enden (18) der Kapillarröhrchen (14) benachbarten Bereichen mit den Außenflächen benachbarter Kapillaröhrchen (14) in Kontakt stehen.

7. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kapillarröhrchen (14) eine zweidimensionale Anordnung bilden.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die zweidimensionale Anordnung mehrere Reihen (144) von Kapillarröhrchen (14) umfasst, wobei jede Reihe (144) von Kapillarröhrchen (14) in einer anderen Höhe als alle anderen Reihen (144) von Kapillarröhrchen (14) endet.

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Anordnung eine rechteckige Anordnung ist.

10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Außenflächen der Kapifllarröhrchen (14) an den Enden (18) der Kapillarröhrchen (14) benachbarten Bereichen mit den Außenflächen benachbarter Kapillarröhrchen (14) in Kontakt stehen.

11. Vorrichtung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Kapillarröhrchen (14) ein Elektrophorese-Celenthalten, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel, das die Prohenwanderung bewirkt, eine elektrophoretische Spannungsquelle (30) umfasst, die betreibbar ist, um Wanderung der Proben innerhalb eines Kapillarröhrchens (14) zu den Enden (18) der Kapillarröhrchen hin zu verursachen.

12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 und 7 bis 10, worin die Strömungskammer (26) einen Seitenwandabschnitt (122b) benachbart zum Detektionsbereich umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass der Seitenwandabschnitt (122b) für elektromagnetische Strahlung durchlässig ist, wobei das Detektionsmittel (36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56) eine Quelle (36) kollimierter elektromagnetischer Strahlung (38) umfasst, deren Wellenlänge die Proue dazu anregen kann, Strahlung zu emittieren, und die ausgerichtet ist, durch den durchlässigen Seitenwandabschnitt (122b) hindurchzutreten und im Detektionsbereich für kollimiertes Licht durch die mitgeführten Probenströme (58) hindurch zu sorgen.

13. Vorrichtung nach Anspruch 1, 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel, das die Probe durch die Kapillarröhrchen (14) hindurchzwingt, eine Pumpe umfasst, und die Kapillarröhrchen (14) chromatografisches Packungsmaterial enthalten.

14. Vorrichtung nach Anspruch 1, 7 oder 8, worin die Kammer (26) einen ersten (130) und einen zweiten (132) gegenüberliegenden Abschnitt umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zum Einbringen von Hüllflüssigkeit (96) ein Rohr (94) umfasst, das mit dem ersten Abschnitt (130) der Kammer (26) verbunden ist, wobei der zweite Abschnitt (132) der Kammer (26) die Enden (18) der Kapillarröhrchen (14) umschließt.

15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Kammer (26) eine umschließende Seitenwand (122a, 122b, 124a, 124b) aufweist, die von einer Öffnungsweite, die größer als die Summe der Durchmesser der Kapillarröhrchen (14) ist, zu einer Öffnungsweite, die kleiner als die Summe der Durchmesser der Kapillarröhrchen (14) ist, nach innen geneigt ist.

16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 und 7 bis 10, worin das Detektionssystem (36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 60, 62) ein optisches Detektionssystem ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Detektionssystem einen Wellenlängenteilungs-Demultiplexer (62) zum Auftrennen der von den mitgeführten Strömen (58) abgegebenen Strahlung in Licht zumindest zweier Spektralbanden sowie Mittel (48a, 48b, 52a, 52b) zum Detektieren von Strahlung für jede der Spektralbanden umfasst.

17. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Kannmer (26) auf Massepotential gehalten wird.

18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 und 7 bis 10, worin die Kammer (26) zumindest teilweise aus einem transparenten Material besteht, dadurch gekennzeichnet, dass die Kammer (26) angrenzend an den Detektionsbereich einen vertieften Abschnitt (89) umfasst, in dem das durchlässige Material der Kammer (26) freiliegt, wobei der Detektor (36, 38, 40, 42, 44, 46, 46, 48, 50, 52, 54, 56) eine Quelle (36) kollimierter Strahlung (38) und ein Mittel (44, 46, 48, 50, 52, 54, 56) zum Empfangen der von den mitgeführten Probeströmen emittierten Strahlung umfasst, wobei die Quelle (36) kollimierter Strahlung (38) und das Mittel (42) zum Empfangen emittierter Strahlung im vertieften Abschnitt (39) und angrenzend an das transparente )Material angeordnet sind.

19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin das organische Material in den Kapillarröhrchen (14) von einer Flüssigkeit mitgeführt wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit im wesentlichen den gleichen Brechungsindex wie die Hüllflüssigkeit (96) aufweist.

20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel (110, 112, 114) zur Verhinderung der Troptenbildung der aus der Austrittsöffnung (108) austretenden Flüssigkeit vorgesehen sind.

21. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel (110, 112, 114) zur Verhinderung der Troptenbildung der aus der Austrittsöffnung (108) austretenden Flüssigkeit vorgesehen sind, wobei die Mittel zur Verhinderung der Tropfenbildung einen Behälter (112) umfassen, der zumindest teilweise mit Hüllflüssigkeit (96) gefüllt und mit der Austrittsöffnung (108) verbunden ist und in den Hüllflüssigkeit (96) aus der Kammer (26) abfließt.

22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 und 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Detektionsmittel (36, 136, 137, 138, 140) einen thermo-optischen Absorptionsdetektor (140) umfasst.

23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin die organischen Proben in den Kapillarröhrchen (14) von einer Flüssigkeit mitgeführt werden, dadurch gekennzeichnet, dass das Detektionsmittel (36, 136, 137, 138, 140) folgendes umfasst: einen ersten Laser (36), der mit der Anordnung von Kapillarröhrchen (14) ausgerichtet ist, um gleichzeitig die organischen Proben in den mitgeführten Probenströmen (58) anzuregen und die Flüssigkeit zu erhitzen, einen zweiten Laser (136), um in einer zur Ausrichtungsrichtung des ersten Lasers (36) im allgemeinen im rechten Winkel stehenden Richtung einen Laserstrahl durch jeden mitgeführten Probestrom (58) hindurchzusenden, sowie ein optisches System (140) zum Empfangen des von den mitgeführten Probeströmen (58) emittierten Lichts.

24. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 und 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass däs Detektionsmittel (36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56 oder 36, 136, 137, 138, 140 oder 142) einen elektrochemischen Detektor (142) umfasst.

25. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin die Kapillarröhrchen (14) ein Elektrophorese-Cel enthalten, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel, das die Probenwanderung bewirkt, ein Mittel (30) zum Anlegen euler elektrophoretischen Spannung zwischen dem Einlassenden (20) und den ersterwälinten Enden (18) umfasst, wobei das Mittel (30) zum Anlegen der Spannung ein Mittel (32) zum Erden der Hüllflüssigkeit (96) umfasst.

26. Verfahren zum Detektieren von Substanzen in organischen Proben, umfassend die folgenden Schritte: das Leiten der Proben durch eine Vielzahl an Kapillarröhrchen (14), die Seite an Seite angeordnet sind und Enden (18) aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass eine Hüllflüssigkeit (96) als allgemeine Hüllflüssigkeitsströmung an den Enden (18) der Kapillarröhrchen (14) vorbei geführt wird und die Proben aus den Kapillarröhrchen (14) hinaus in die allgemeine Hüllflüssigkeitsströmung hinein geleitet werden, sodass die Proben als Ströme (58) in der allgemeinen Hüilflüssigkeitsströmung mitgeführt werden, das Detektieren der Substanzen in den mitgeführten Probenströmen (58), das Sammeln der mitgeführten Probenströme (58) und der Hüllflüssigkeitsströmung (96) als gemeinsame kombinierte Strömung nach dem Detektieren sowie das Entfernen der gemeinsamen kombinierten Strömung.

27. Verfahren nach Anspruch 26, gekennzeichnet durch den Schritt des Hindurchschickens eines Strahls kollimierter elektromagnetischer Strahlung (38) durch die mitgeführten Probenströme (58) hindurch und des Detektierens von Strahlung aus den mitgeführten Probenströmen (58).

28. Verfahren nach Anspruch 27, gekennzeichnet durch den Schritt des im wesentlichen gieichzeitigen Beleuchtens der mitgeführten Probenströme (58) mit elektromagnetischer Strahlung (38) aus einem Laser (36).

29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Kapillarröhrchen (14) in einer zweidimensionalen Anordnung so angeordnet sind, dass die mitgeführten Probenströme (58) in der allgemeinen Hüllflüssigkeitsströmung in einer zweidimensionalen Anordnung angeordnet werden, und dass alle mitgeführten Probenströme (58) im wesentlichen gleichzeitig mit einem Strahl kollimierter elektromagnetischer Strahlung (38) beleuchtet werden.

30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass die zweidimensionale Anordnung aus mehreren Reiben (144) von Kapillarröhrchen (14) besteht, wobei jede Reihe (144) auf einer anderen Höhe als alle anderen Reihen (144) von Kapillarröhrchen (14) endet und wobei der Detektierschritt das Detektieren von Strahlung aus jedem der mitgeführten Probenströme (58) in einer Richtung im rechten Winkel zum Strahl umrasst.

31. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass die Hüllflüssigkeit (96) aut Massepotential gehalten wird.

32. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 30, gekennzeichnet durch den Schritt des Haltens der Außenfläche jedes Kapillarröhrchens (14) an den Enden (18) benachbarten Bereichen in Kontakt mit den Außenflächen benachbarter Kapillarröhren (14).