FI109362B - Laite nukleiinihappomonistusten seuraamiseksi - Google Patents

Description

109362

Laite nukleiinihappomonistusten seuraamiseksi Tämä keksintö koskee laitetta useiden nukleiinihappomonistusten seuraamiseksi samanaikaiseksi.

5 Tässä kuvataan myös nukleiinihapon (DNA:n tai RNA:n) monistumisen havaitsemista ja tarkemmin sanottuna nukleiinihappojen useiden monistusreaktioiden samanaikaista seurantaa tosiajassa. Tässä kuvataan myös menetelmää koottujen koetulosten käyttämiseksi sen konsentraation 10 kvantitointiin, joka tutkittavalla nukleiinihappojaksolla on yhdessä tai useammassa näistä seoksista reaktion alussa, sekä niiden monistusreaktiossa vallitsevien olosuhteiden vaikutusten seuraamiseen, jotka vaikuttavat reaktio-kinetiikkaan.

15 On olemassa useita erilaisia tunnettuja menetelmiä nukleiinihappojen monistumisen havaitsemiseksi. Tunnetaan esimerkiksi useita määrityksiä sen polymeraasiketjureaktiossa (PCR) käytettyjen DNA-templaattien lukumäärän määrittämiseen, joka näillä on reaktion alussa.

20 Jotkin näistä määrityksistä sisältävät PCR-tuotteen määrityksen lämmittämiseen perustuvan lämmityssykli-.!'! käsittelyn lopussa ja tämän pitoisuuden on katsottu olevan yhteydessä DNA:n konsentraatioon reaktion alussa.

’ Tällaisesta tyypillisesti PCR:ää käyttäen tehdystä ' ·’ 25 "päätepiste"analyysista käy selville, sisältääkö näyte mahdollisesti tutkittavaa DNA: ta, mutta tästä ei yleensä J,·1 ·’ saada käyttökelpoista arviointiperustetta reaktion alussa olevan tutkittavien DNA-molekyylien lukumäärän määrit-tämiseksi.

.···. 30 Toisiin määrityksiin sisältyy sellaisen kilpaile- • · · van monistustuotteen käyttö, jonka templaattia lisätään ' tunnettuun konsentraatioon reaktioseokseen ennen lämmitys- ·...· syklikäsittelyä. Kilpailevan tuotteen käyttöön perustu- • vissa menetelmissä tutkitaan monistuksesta otettu näyte * · i » 35 geelielektroforeesilla. Määrityksessä selvitetään tutkittavalle molekyylille spesifisen ja kilpailevan PCR- 109362 2 tuotteen suhteellinen määrä; tätä suhdetta käytetään sen tutkittavan molekyylin templaattien lukumäärän laskemiseen, joka niillä on ollut reaktion alussa. Mitä suurempi on tutkittavalle molekyylille spesifisen tuotteen ja 5 kilpailevalle templaatille spesifisen tuotteen välinen suhde, sitä suurempi on DNA:n konsentraatio reaktion alussa.

Sen lisäksi, että näissä muissa määrityksissä on käytettävä "jälkikäteen tehtävää" käsittelyä, kuten hybri-10 disaatiota tai geelielektroforeesia, on niiden dynaaminen toiminta-alue (eli herkkyys tutkittavan nukleiinihapon eri konsentraatioille) myös suppeampi. Kilpailevaan jaksoon perustuvissa määrityksissä herkkyys templaatin konsentraatio-eroille heikkenee silloin, kun joko tutkittavaa DNA:ta tai 15 lisättyä kilpailevaa DNA:ta on toiseen osapuoleen verrattuna huomattava ylimäärä. Niiden määritysten dynaamista toiminta-aluetta, jotka perustuvat lopputuotteen määrän määrittämiseen, voi rajoittaa myös se, että joissakin reaktioista on valitulla syklien lukumäärällä tuotteen pitoisuus 20 mahdollisesti saavuttanut "tasanteen". Reaktion alussa olevilla templaatin pitoisuuseroilla ei siten ole asianmukais-ta yhteyttä saatuihin tuloksiin näissä reaktioissa. Tuot-* teen määritetyssä määrässä olevat pienet eroavuudet johta- t · '·' ' vat lisäksi siihen, että arviot templaatin konsentraatiosta : .* 25 reaktion alussa poikkeavat huomattavasti toisistaan, mikä johtaa huomattavaan epätarkkuuteen, joka johtuu reak-: tio-olosuhteiden muuttumisesta, näytteenotossa tapah tuvista vaihteluista tai inhibiittoreiden esiintymisestä.

PCR-olosuhteet optimoidaan tyypillisesti määrit-.···. 30 tämällä eri olosuhteiden vaikutus PCR-tuotteen lopulliseen saantoon ja spesifisyyteen. Tiedon kokoamiseksi koko ‘N : monistamisen ajalta pannaan lämmityssykli-inkuboin- :...· tilaitteeseen (thermal cycler) useita rinnakkaisnäytteitä, jotta kukin niistä voidaan poistaa lämmityssykli-35 inkubointilaitteesta eri lämmityssyklin kohdalla. Poistetuista putkista tehdään sitten geelielektroforeesianalyysi 109362 3 syklin järjestysnumeron funktiona. Kuten tästä patentti-selityksestä käy ilmi, on tällainen optimointi monimutkaista ja aikaa vievää siinä mielessä, että siihen tarvitaan useita näytteen käsittelyvaiheita sekä 5 jälkikäteen tehtävää elektroforeesianalyysiä.

Kaikkien suuressa mittakaavassa käytettäviksi tarkoitettujen (esimerkiksi kliiniseen käyttöön tarkoitettujen) määritysten on oltava paitsi luotettavia myös mahdollisimman pitkälle yksinkertaistettuja, jotta mää-10 rityksen automatisointi ei tuota vaikeuksia. On siten olemassa tarve saada käyttöön luotettavat tulokset antava ja automatisoitavaksi soveltuva laite sekä menetelmä sellaisten nukleiinihappojen monistumista osoittavien koetulosten keräämiseksi, joita voidaan käyttää esimerkiksi reaktion 15 alussa olevien konsentraatioiden määrittämiseen näytteestä sekä reaktio-olosuhteiden optimoimiseen.

Tämän keksinnön tavoitteena on saattaa käyttöön sellainen laite nukleiinihappojen monistumisen havaitsemiseksi, jonka avulla on mahdollista seurata saman-20 aikaisesti useissa monistusreaktioseoksissa tapahtuvia monistamisia tosiajassa ja jolla tämän ansiosta voidaan vält-tää tekniikan tason mukaisiin ratkaisuihin liittyvät ongel- • ·’ mat ja haitat.

* * * -* '·’ ’ Tämän keksinnön mukaiselle laitteelle useiden nuk- : .* 25 leiinihappomonistusten seuraamiseksi samanaikaiseksi on ..]·* tunnusomaista se, että laite käsittää: : lämmityssykli-inkubointilaitteen, joka sisältää lämpöä johtavan osan, jossa on useita siihen tehtyjä syven-: nyksiä; .···, 30 säteilylähteen, joka on yhdistetty optisesti lämmi- ’· tyssykli-inkubointilaitteeseen ja suunniteltu jakamaan sä- ·' teily lukuisiin syvennyksiin lämpöä johtavassa osassa; ja 109362 4 anturin, joka on suunniteltu havaitsemaan samanaikaisesti lukuisista syvennyksistä emittoituvaa säteilyä.

Edullisessa sovellutusmuodossa tämän keksinnön mukainen laite käsittää lisäksi säteilylähteen, joka on op-5 tisessa yhteydessä mainittuun lämmityssykli-inkubointi-laitteeseen ja joka on suunniteltu valaisemaan mainitun lämpöä johtavan osan siitä osaa, jossa on useita siihen tehtyjä mainittuja syvennyksiä.

Tämän keksinnön mukaisen laitteen toisessa 10 edullisessa sovellutusmuodossa lämmityssykli-inkuboin-tilaitteen lämpöä johtavan osan mainitut syvennykset on valmistettu sellaisiksi, että ne läpäisevät tämän pinnan, jotta nukleiinihappojen monistusreaktioseoksia sisältävät reaktioastiat voidaan asettaa niihin; ja mainittu anturi on 15 kuvantamislaite, joka on optisessa yhteydessä mainittuun lämpöä johtavaan osaan kuvan muodostamiseksi mainitusta pinnasta ja reaktioastioista, kun mainitut astiat on sijoitettu mainittuihin lämpöä johtavan osan useisiin syvennyksiin.

20 Tämän keksinnön mukaisen laitteen vielä yhdessä edullisessa sovellutusmuodossa lämmityssykli-inkuboin-.!'! tilaitteen mainitussa lämpöä johtavassa osassa on useita siihen tehtyjä syvennyksiä ja ne on tehty sellaisiksi, että ’·’ ‘ nukleiinihappojen monistusreaktioseokset voidaan panna : 25 niihin, ja laite käsittää lisäksi kotelon, joka on sijoitettu mainitun lämpöä johtavan osan päälle ja kiinnitetty mainittuun lämmityssykliinkubointilaitteeseen; säteilylähteen, joka on suunniteltu lähettämään 30 säteilyä mainitussa kotelossa ja kohdistamaan säteilyn mainittuja syvennyksiä kohti; ja » · · ·: ·* puoliläpäisevän peilin, joka on sijoitettu :...· mainittuun koteloon ja jonka sijoituskohta on mainittujen syvennyksien yläpuolella, joka mainittu puoliläpäisevä 35 peili läpäisee ensimmäisellä aallonpituudella tulevaa säteilyä ja heijastaa sellaisella toisella aallonpituudella 109362 5 tulevaa säteilyä, joka poikkeaa mainitusta ensimmäisestä aallonpituudesta, ja mainittu anturi on suunniteltu vastaanottamaan mainitun puoliläpäisevän peilin mainitusta toisesta pinnasta heijastunutta säteilyä.

5 Tämän keksinnön mukaisen laitteen vielä yhdessä edullisessa sovellutusmuodossa lämmityssykli-inku- bointilaitteen mainitussa lämpöä johtavassa osassa on siihen tehtyjä useita syvennyksiä ja nämä on tehty sellaisiksi, että niihin voidaan panna nukleiinihappojen 10 monistusreaktioseoksia, jotka sisältävät nukleiinihap-pojakson ja fluoresoivaa sitoutuvaa ainetta, ja laite käsittää lisäksi kotelon, joka on sijoitettu mainitun lämpöä johtavan osan päälle ja kiinnitetty mainittuun lämmi-15 tyssykliinkubointilaitteeseen; säteilylähteen, joka on suunniteltu lähettämään säteilyä mainitussa kotelossa; ja anturin, joka on suunniteltu toimimaan mainitussa kotelossa; ja 20 puoliläpäisevän peilin, joka on sijoitettu mainittuun koteloon ja mainittujen syvennysten yläpuolelle, ja mainittu puoliläpäisevä peili läpäisee säteilyä, jonka •fi; aallonpituus vastaa virityssäteilylähteestä lähtevän '·’ ' säteilyn aallonpituutta, ja heijastaa säteilyä, jonka : 25 aallonpituus vastaa sen fluoresenssin aallonpituutta, jota tulee fluoresoivaa sitoutuvaa ainetta sisältävästä :: : nukleiinihappojen monistusseoksesta silloin, kun kyseinen seos on sijoitettu yhteen lämpöä johtavan osan syvennykseen ja siihen on kohdistettu virityssäteilylähteestä tulevaa .···. 30 säteilyä, ja mainittu peili on suunnattu siten, että se ’· muodostaa optisen tien mainittujen syvennysten ja mainitun : anturin välille.

Yhdessä tämän keksinnön mukaisen laitteen sovellutusmuodossa havaitaan kaksinauhaisen DNArn (dsDNArn) 35 kertyminen kustakin monista polymeraasiketjureaktiosta samanaikaisesti CCD-kameralla käyttäen hyväksi kuhunkin 109362 6 monistusreaktioseokseen reaktion alussa lisätyn havait-semiskelpoisen fluoresoivan väriaineen aikaansaaman fluoresenssin lisääntymistä. Fluoresenssi johtuu fluoresoivan väriaineen sitoutumisesta kaksinauhaiseen DNA:hän.

5 Tämän sovellutusmuodon etu on se, että sillä vältytään optisista kuiduista tehtyjen valokaapeleiden käytöltä ja tästä johtuvilta ongelmilta, jotka liittyvät kuituoptiikan kytkemiseen yksittäisiin reaktioseoksiin.

Vielä yhden tämän keksinnön kohteen mukaisesti on 10 se optinen järjestelmä, jonka välityksellä virityssäteily siirtyy säteilylähteestä laitteen osan muodostavassa lämmityssykli-inkubaattorissa monistettaviin useisiin reaktioseoksiin, suunniteltu kohdistamaan virityssäteily reaktioseoksiin yhdenmukaisesti. Tämä tarkoittaa sitä, että 15 optinen järjestelmä mahdollistaa virityssäteilyn jakautumisen olennaisesti yhdenmukaisesti lämmityssykli-inku-bointilaitteen lämmönvaihtimeen niin, että kuhunkin monistusreaktioseokseen tulee olennaisesti yhtä suuri määrä virityssäteilyä.

20 Tällä laitteella voidaan koota fluoresenssikoe- tuloksia ja niitä voidaan käyttää reaktion alussa olleen tutkittavan nukleiinihappo jakson määrän kvantitointiin. Edullisessa kvantitointimenetelmässä käytetään useita ’·’ ’ monistusreaktioseoksia. Yhdessä monistusreaktioseoksessa on : 25 tiettyä nimenomaista nukleiinihappojaksoa tuntemattomassa konsentraatiossa. Tätä samaa tiettyä nukleiinihappojaksoa : on muissa reaktioseoksissa erilaisissa mutta tunnetuissa konsentraatioissa. Näitä monistusreaktioseoksia, joiden nukleiinihappokonsentraatiot ovat tunnettuja ja tunte-30 mattomia, käsitellään lämmityssykli-inkubointilaitteessa rinnakkain useiden syklien ajan. Reaktioseoksista *: : emittoituvaa fluoresenssia seurataan tosiajassa ja määritetään se syklien lukumäärä, joka kullakin reaktioseoksella tarvitaan tietyn fluoresenssin ____: 35 voimakkuusarvon saavuttamiseen. Sitä syklien lukumäärää, joka nukleiinihappokonsentraatioltaan tuntematonta seosta 109362 7 käytettäessä tarvitaan tämän arvon saavuttamiseen, verrataan siihen syklien lukumäärään, joka nukleiini-happokonsentraatioltaan tunnettuja seoksia käytettäessä tarvitaan tämän arvon saavuttamiseen, sen mainitun 5 spesifisen nukleiinihappojakson määrän selville saamiseksi, joka sillä oli reaktion alussa konsentraatioltaan tuntemattomassa seoksessa.

Koska monistuksia seurataan tosiajassa, on keksinnön mukaiselle laitteelle havaittu mahdolliseksi saavuttaa 10 ainakin kuusi kertaluokkaa kattavalla konsentraatioalueella oleva herkkyys tutkittavalle nukleiinihapolle. Määrityksellä voidaan lisäksi päästä herkkyyteen, joka on jopa 100 ss-DNA-templaattia taustassa, jossa on 40 000 solua vastaava määrä monimutkaista genomin DNA:ta.

15 Keksinnön yhteydessä kuvataan myös edullinen fluoresenssikoetulosten käsittelytapa, jonka avulla voidaan luotettavasti analysoida erilaisten reaktio-olosuhteiden vaikutusta monistumisen kinetiikkaan. Koska useita monistuksia voidaan seurata samanaikaisesti, niin reaktioon 20 vaikuttavien useiden erilaisten muuttujien vaikutus on mahdollista määrittää nopeasti. Tämä on käyttökelpoista .I'* monistusreaktioiden optimoimisessa optimaalisen saannon ja * ·’ tehokkuuden saavuttamiseksi.

I * · ’·’ ’ Tosiaikaisesta seuraamisesta saadaan myös se etu, : ’.· 25 että sillä voidaan havaita ne tapaukset, joissa PCR on osittain inhiboitunut, millä voi olla huomattava vaikutus :: : kvantitoinnin tarkkuuteen. Kuten kuviosta 10D käy ilmi, nämä tapaukset voidaan havaita reaktioprofiilinsa I perusteella, joten nämä näytteet voidaan puhdistaa ,···, 30 uudelleen sekä toistaa tutkimus. Lisäksi ne tapaukset, ·' joissa reaktio on täydellisesti inhiboitunut ja jotka i < · : muutoin johtaisivat siihen väärään johtopäätökseen, ettei näytteessä ole lainkaan tutkittavaa nukleiinihappoa, on mahdollista havaita sen odotuksen perusteella, että kun 35 syklien määrä on riittävä, niin jopa sellaisissa PCR-reaktioissa, joista tutkittava DNA puuttuu, syntyy 8 109362 ei-spesifisten monistumistuotteiden aiheuttamaa fluoresenssia. Jos tällaista fluoresenssia ei havaita odotettuun sykliin mennessä, niin seoksessa voidaan päätellä olevan inhibiittoreita.

5 Vielä yksi tämän keksinnön etu on se, että muut monistamisen loppuun sijoittuvat aikaa vievät käsittelytoimenpiteet useiden reaktioiden saannon määrittämiseksi jäävät pois. Voidaan siis esimerkiksi välttyä käyttämästä jälkikäteen tehtävää hybridisaatiota 10 tai geelielektroforeesia.

Vaikka kuvioissa 2 ja 3 kuvatulla tämän keksinnön mukaisella sovellutusmuodolla, jossa ei käytetä kuituoptiikkaa, on edellä olevan kuvauksen mukaan useita etuja, niin anturi, joka on edullisesti videokamera, on 15 parallaksin minimoimiseksi sijoitettu huomattavalle etäisyydelle lämpöä johtavassa osassa olevista reaktioseoksista. Tämän mukaisesti myös säteilylähde on huomattavan etäällä lämpöä johtavassa osassa olevista reaktioseoksista, jotta säteily saataisiin tasaiseksi ja 20 vältyttäisiin esteiltä anturin näkökentässä. Tällainen järjestelmä asettaa tavallisesti merkittävän suuret tilavaatimukset, mikä puolestaan voi vaatia kokonaisen *_; pimiön varaamista laitteelle. Monissa kliinisissä '·’ ‘ laboratorioissa ei kuitenkaan ole pimiöitä tai ylimääräistä : 25 tilaa pimiön rakentamiseksi. Vaikka röntgenhuoneista, joita .. 1 ·' voi ilman muuta olla kliinisissä laboratorioissa, voi i t » : löytyä sopiva ympäristö virityssäteilyn ja fluore- senssiemissioiden optisille teille, niin tila näissä J.j huoneissa on varattu käytännöllisesti katsoen kokonaan • · ,···. 30 röntgenlaitteille.

i · » ·

Vielä yhden tämän keksinnön sovellutusmuodon mukaan i » i : virityssäteily- ja fluoresenssin havaitsemiskonfiguraatio yhdistetään laitteeseen niin, että virityssäteilyn ja fluoresenssiemissioiden optiset tiet voidaan saada 35 kulkemaan taitettuina, jotta laite saataisiin tilan- 109362 9 käytöltään tehokkaaksi ja optisten teiden sulkeminen valotiiviiseen ympäristöön yksinkertaistuisi. Näin laitetta voidaan vaikeuksitta käyttää pöydällä ilman pimiön apua.

Tämän sovellutusmuodon mukaan sisältää laite 5 useiden nukleiinihappomonistusten seuraamiseksi samanaikaisesti lämmityssykli-inkubointilaitteen, jossa on lämpöä johtava osa ja siihen tehdyt useat syvennykset, joihin nukleiinihappojen monistusseokset on tarkoitettu pantavaksi. Lämpöä johtavan osan päälle on sijoitettu 10 kotelo, jonka tarkoituksena on muodostaa valotiivis kammio. Kotelona toimivaan kammioon on suunniteltu säteilylähde säteilyn lähettämiseksi kammioon pantujen monistusseosten virittämistä varten. Koteloon on sijoitettu syvennysten päällä sijaitseva puoliläpäisevä peili. Puoliläpäisevä 15 peili läpäisee ensimmäisellä aallonpituudella tulevaa säteilyä ja heijastaa toisella aallonpituudella tulevaa säteilyä, jonka aallonpituus poikkeaa ensimmäisen säteilyn aallonpituudesta. Edullisessa sovellutusmuodossa peili on pieniä aallonpituuksia läpäisevä puoliläpäisevä peili.

20 Peili on konstruoitu sellaiseksi, että säteily, jolle se on läpinäkyvä tai jonka se läpäisee, vastaa aallonpituudeltaan ,1’! sellaista säteilyä, joka vastaa säteilylähteen synnyttämän *ti' säteilyn aallonpituutta ja että se heijastaa * aallonpituudeltaan sellaista säteilyä, joka vastaa sen : 25 monistusseosten emittoiman fluoresenssin aallonpituutta, ,,!** joka syntyy näihin kohdistetusta virityssäteilystä. Toisena i t * ·,! · vaihtoehtona on käyttää suuria aallonpituuksia läpäisevää puoliläpäisevää peiliä. Tässä tapauksessa peili heijastaa aallonpituudeltaan sellaista säteilyä, joka vastaa • » .·*·. 30 säteilylähteen synnyttämän säteilyn aallonpituutta ja • » · • säteily, jolle se on läpinäkyvä tai joka sen läpäisee, ia* · vastaa sen monistusseosten emittoiman fluoresenssin •’,..* aallonpituutta, joka syntyy näihin kohdistetusta virityssäteilystä. Koteloon on suunniteltu anturi, jota 1*4· 35 käytetään havaitsemaan monistusseoksista emittoituvaa • · fluoresenssia. Järjestelmässä, joka käsittää pieniä 109362 10 aallonpituuksia läpäisevän puoliläpäisevän peilin, on anturi suunniteltu vastaanottamaan peilistä heijastuvaa fluoresenssia. Suuria aallonpituuksia läpäisevän järjestelmän ollessa kyseessä ovat kuitenkin anturin ja 5 säteilylähteen paikat päinvastaiset.

Laitteen ollessa suunniteltu tällä tavalla voidaan virityssäteilylähde ja anturi sijoittaa kumpikin suhteellisen lähelle lämpöä johtavaa osaa, esimerkiksi noin 15 - 30 cm:n etäisyydelle tästä, millä on siten mahdollista 10 saada virityssäteilylähteen ja fluoresenssisäteilyn optiset tiet mahtumaan suhteellisen pieneen tilaan. Tällä periaatteella suunniteltu tilaa säästävä ratkaisu edistää optisten teiden sijoittamista lämmityssykli-inkubointi- laitteeseen yhdistettyyn koteloon, jonka tarkoituksena on 15 muodostaa käytännöllisesti katsoen valotiivis kammio tai pimiö virityssäteilyä ja monistusseoksesta lähtevää säteilyä varten. Laitetta voidaan tässä muodossa käyttää miltei missä tahansa tarvitsematta käyttää laitteelle varattua omaa pimiötä. Kotelon edullinen lisäominaisuus on 20 se, että se suojaa anturia ulkopuoliselta säteilyltä, kuten ,·/ laitteen yhteydessä käytetyistä monitoreista ja lämmityssykliinkubaattoriin ja tietokonelaitteistoon liittyvistä valodiodeista tulevalta säteilyltä.

:·.*. Vielä yksi etu siitä, että anturi on sijoitettu • * 25 hyvin lähelle lämpöä johtavaa osaa, johon nukleiinihappojen ‘.‘.1 monistusseokset on määrä sijoittaa, on se, että anturin ' herkkyysvaatimuksia voidaan pienentää. Koska anturi on siirretty lähemmäksi lämpöä johtavaa osaa, lisääntyy « · · ’· '· reaktioseosten lähettämän ja anturiin saapuvan säteilyn • · · 30 voimakkuus. Tämän perusteella voidaan CCD-kameratyyppistä : anturia käytettäessä korvata suhteellisen kallis • i » · .···, jäähdytetty CCD-kamera, jollaista tavallisesti tarvitaan *·’ suurehkojen herkkyysvaatimusten kyseessä ollessa, ...: edullisemmalla CCD-kameralla, jolla heikon säteilyn vaste 35 on hyväksyttävää luokkaa ja jonka lämpökohina on pieni.

109362 11

Etuja on saavutettavissa myös valolähteen sijainnista aivan lähellä reaktioseoksia. Kun säteilylähde siirretään lähemmäksi reaktioseosten syvennyksiä, niin syvennyksiin pantuihin reaktioseoksiin saapuvan säteilyn 5 voimakkuus suurenee, mikä siten lisää fluoresenssisäteilyn voimakkuutta. Näin menetellen voidaan melko pienet tutkittavan jakson konsentraatiot havaita melko aikaisissa lämmityssyklikäsittelyvaiheissa. Jokin osa saavutetusta fluoresenssisäteilyn lisäyksestä voidaan lisäksi käyttää 10 paremman aallonpituuksien erottelukyvyn hyväksi käyttämällä suppeamman aallonpituusalueen läpäisevää suodinta. Tällä tavoin voidaan havaita aallonpituuksia, jotka ovat peräisin laajemmalta alueelta, ja sellaiset leimat, joiden aallonpituudet ovat hyvin lähekkäiset, voidaan erottaa 15 toisistaan.

Vielä yhden tämän sovellutusmuodon kohteen mukaisesti valolähteeseen on liitetty peittolevy, jonka tarkoituksena on päästää virityssäteily ajoittain reaktioseoksiin. Peittolevy on edullisesti ajoitettu 20 päästämään virityssäteily seoksiin molekyylien yhteen-| : liittymis/pidentymisvaiheen aikana, jolloin seoksista tuleva fluoresenssi on tavallisesti maksimaalista. Tämä konfiguraatio vähentää seoksen tai näytteen altistumista virityssäteilylle, joka voi olla hyvin voimakasta, koska se 25 sijaitsee hyvin lähellä lämpöä johtavaa osaa. Peittolevy parantaa järjestelmän suorituskykyä lisäämällä näytteen pysyvyyttä sillä perusteella, että se minimoi näytteen altistumisen virityssäteilylle, joka on tyypillisesti ‘.v UV-säteilyä, mutta tämä voi myös olla muillakin 30 aallonpituuksilla olevaa säteilyä. Voimakas virityssäteily ; voi muussa tapauksessa aiheuttaa näytteen valo- < t · i ,···, deaktivoitumista, josta tavallisesti käytetään nimitystä ’·’ "haalistuminen".

Vielä yhden tämän sovellutusmuodon kohteen mukaan 35 on puoliläpäisevän peilin ja anturin väliin asetettu 109362 12 etulinssi näiden välisestä kentästä johtuvan parallaksin minimoimiseksi.

Vielä yksi tämän keksinnön edullinen piirre sisältää lämmitettävän ikkunan, joka on heti lämpöä 5 johtavan osan yläpuolella ja joka voidaan varsinaisesti sijoittaa monistusseokset sisältävien koeputkien päälle. Lämmitettävä ikkuna estää lämmönhukan reaktiokoeputkista, edistää osaltaan seosten lämmityssyklikäsittelyn lämpö-tilaprofiilien pysymistä halutunlaisina ja minimoi 10 refluksoitumista samalla kun se päästää säteilyn lävitseen. Edullisen sovellutusmuodon mukaisesti lämmitettävää ikkunaa pidetään denaturaatiolämpötilassa, joka on tavallisesti noin 95 - 105 °C.

Anturiin on liitetty edullisesti suodin tai 15 suodinkiekko, jotta anturilla voidaan havaita valikoivasti eri aallonpituuksilla tulevaa säteilyä. Suodin(timet) voi(vat) myös estää virityssäteilyn pääsyn anturiin. Käyttämällä useita suotimia, jotka voivat olla järjestettynä suodinkiekoksi, voidaan suotimia vaihtaa 20 vaikeuksitta tietyn nimenomaisen yhteenliittymis/piden-' tymisvaiheen aikana esimerkiksi niin, että eri aallonpituuksilla tapahtuvia emissioita, esimerkiksi erilaisista homogeenisista nukleaasikoettimista (näitä on kuvattu tuonnempana), voidaan seurata. Eri emissio-25 aallonpituuksia ja siten tietyssä näytteessä olevia ’!!! erilaisia nukleiinihappojaksoja voidaan seurata ja tutkittavan jakson esiintyminen määrittää.

Järjestelmän suuri herkkyys antaa lisäksi mahdollisuuden määrittää hyvin tarkasti fluoresenssin, joka 30 syntyy homogeenisesta määritys järjestelmästä, kuten : järjestelmästä, joka on kuvattu Gelfand, et al.':n ,··. US-patentti julkaisussa nro 5 210 015, joka on liitetty ’’’ tähän keksintöön siihen oikeuttavien säädösten nojalla.

Tässä määritysjär jestelmässä käytetään nukleiinihappo-35 polymeraasin 5'-3 ' -nukleaasiaktiivisuutta yhteenliitty-neiden leimalla varustettujen oligonukleotidien pilkko- 109362 13 miseen koettimen ja tutkittavan nukleiinihapon hybridisoituneista duplekseista ja vapauttamaan leimalla varustetut oligonukleotidifragmentit niiden havaitsemiseksi. Tämä määritys on erityisen käyttökelpoinen useiden 5 tutkittavien nukleiinihappojen havaitsemiseksi samasta monistusreaktioseoksesta. Nämä koettimet ovat myös käyttökelpoisia tutkittavan nukleiinihapon esiintymisen varmistamisessa epäspesifisten monistumistuotteiden läsnäollessa.

10 Homogeenisessa määrityksessä käytetään hyväksi sellaista koetinta, jonka fluoresenssi sammuu normaalisti toiseen leimaan tapahtuvalla fluoresenssienergian siirrolla, eli FET:llä. DNA-polymeraasin 5'-nukleaasi-aktiivisuus erottaa fluoroforin koettimesta ja 15 sammuttimesta, mikä keskeyttää FET:n ja palauttaa fluoresenssin. Tämän muutoksen, joka voidaan havaita puoliläpäisevään peiliin perustuvan järjestelmän sisältävällä tämän keksinnön mukaisella seurantalaitteella, havaitsemiseen ei tarvita mitään käsittelyä. Mikäli nämä 20 koettimet on varustettu erilaiset fluoroforit sisältävillä : : leimoilla, niin niitä voidaan käyttää useiden tutkittavien nukleiinihappojen havaitsemiseen.

/F; Tässä patenttiselityksessä käytetään seuraavia ter- mejä. Oheen liitetyt määritelmät ovat tarkoitettu selityk-25 sen selventämiseksi eivätkä niinkään keksinnön rajoittami-seksi.

Termi "tutkittava nukleiinihappojakso" tarkoittaa puhdistettua tai osittain puhdistettua monistettavaa nukle-' *· iinihappoa.

',,,· 30 Termi "monistusreaktioseos" tarkoittaa vesipitois- : .·. ta liuosta, joka käsittää tutkittavan nukleiinihapon .···. monistamiseen käytetyt useat erilaiset reagenssit. Näihin '·’ kuuluvat entsyymit, vesipitoiset puskurit, suolat, monistusalukkeet, tutkittava nukleiinihappo ja 35 nukleotiditrifosfaatit.

109362 14

Sen mukaan missä yhteydessä seosta käytetään, se voi olla joko täydellinen tai epätäydellinen monistusreaktioseos.

Termi "aluke" tarkoittaa oligonukleotidia, joka kykenee toimimaan DNA-synteesin aloituskohtana silloin, kun 5 se on liittynyt pituussuunnassa nukleiinihappotemplaattiin olosuhteissa, joissa alukkeen pidennystuotteen synteesi käynnistyy, toisin sanoen neljän eri nukleotiditrifosfaatin ja DNA-polymeraasin läsnäollessa asianmukaisessa puskurissa (pH, ionivahvuus, kofaktorit ja niin edelleen), ja 10 sopivassa lämpötilassa.

Termi "templaatti" tarkoittaa sitä tutkittavan nukleiinihappojakson osaa, johon aluke pituussuunnassa liittyy.

Edellä olevissa kappaleissa on kuvattu pää-15 piirteittäin joitakin tekniikan tason mukaisten menetelmien puutteita ja tämän keksinnön sekä kuvatun menetelmän etuja.

Tämän keksinnön muut ominaisuudet, edut ja sovellu-tusmuodot käyvät alan ammattikokemuksen perusteella selville seuraavasta selityksestä, oheistetuista piir-roksista ja 20 patenttiselitykseen liitetyistä patent-tivaatimuksista.

:: Kuvio 1 on graafinen esitys jatkuvasta tosiaikai- sesta PCR:n seuraamisesta; kuvio IA on kuviossa 1 olevan kehyksen IA ympäröi-män alueen suurennos; 25 kuvio 2 on perspektiivikuva tämän keksinnön peri- aatteiden mukaisesta monistuslaitteesta; • kuvio 3 on osasuurennos kuvion 1 mukaisesta lämmi- tyssykli-inkubointilaitteesta, josta käy ilmi lämmitys-·: sykli-inkubointilaitteen lämmönvaihtoblokki ja sen kansi; 30 kuvio 4 on lohkokaavio kuviossa 2 esitetystä lait- : teestä; t I I · ·, kuvio 5 on esitys esimerkeiksi tarkoitetuista digitoiduista kuvista, jotka esittävät useita reaktio-seoksia, 109362 15 kuvio 6 on kuvaus keskiarvon laskemista varten valitusta pikselimatriisista yhden fluoresenssiarvon aikaansaamiseksi; kuvio 7 on esitys fluoresenssimäärityksessä tapah-5 tuvasta ryöminnästä syklistä toiseen; kuvio 8A on esitys useista fluoresenssi-profiileista; kuvio 8B on esitys kuvion 8A mukaisista fluoresenssiarvoista normalisoinnin jälkeen; 10 kuvio 8C on kuvaus kuvioissa 8A ja B olevien profiilien edustamien monistumistuotteiden geelielekt-roforeesista; kuvio 9 on kuvaus reaktion alussa olevien templaattien kappalemäärien logaritmin ja valitun 15 fluoresenssiarvon saavuttamiseen vaadittavien syklien lukumäärän välisestä lineaarisesta suhteesta; kuviot 10A - D ovat kuvaus reaktio-olosuhteissa olevien muutosten vaikutuksesta; kuviot 11 - 13 ovat yksinkertaistettuja vuokaa- 20 vioita fluoresenssiarvojen laskemiseen vaadittavista vai-: : heistä; • ·': kuvio 14 on sellainen perspektiivikuva tämän kek- _Ί'; sinnön mukaisesta monistuslaitteesta, jossa on lisäksi ku- vattu vielä yksi virityssäteily- ja emissio/-25 fluoresenssidetektorijärjestelmän sovellutusmuoto osittais-leikkauksessa; ja kuvio 15 on suurennus kuvion 14 mukaisessa osit-taisleikkauksessa esitetystä virityssäteily- ja emissio/ 't fluoresenssidetektorijärjestelmästä; 30 kuvio 16 on käyrä, joka esittää läpikulkukerrointa : aallonpituuden funktiona ja joka on edustava esimerkki ,··. tämän keksinnön mukaisten periaatteiden mukaan • · '·’ valmistetusta puoliläpäisevästä peilistä saatavista käyristä; ja 109362 16 kuvio 17 on päällyskuva kuumennettavasta ikkunasta, joka on tarkoitettu tämän keksinnön mukaisten reaktio-seoksen sisältävien säiliöiden yläosaa varten.

Tämä keksintö sisältää laitteen nukleiinihappojen 5 monistamiseksi ja monistamistuotteiden havaitsemiseksi, seuraamiseksi ja kvantitoimiseksi. Jotta tämän keksinnön mukainen monistamiskoetulosten keräys- ja käsitte-lyjärjestelmä olisi helpompi ymmärtää, tarkastellaan ensin tiiviin yhteenvedon muodossa esitettynä nukleiinihappojen 10 monistusmenetelmiä, jotka soveltuvat erityisesti käytettäväksi tämän keksinnön yhteydessä.

Tämän alan ammattikokemuksen perusteella on selvää, että tässä keksinnössä tarvitaan nukleiinihapon dupleksimuodon monistamista. Nukleiinihappojen monista-15 miseen on olemassa tunnettuja menetelmiä. Monistuskeino ei ole ratkaisevan tärkeä ja tämä keksintö toimii minkä tahansa sellaisen menetelmän kanssa, jossa syntyy nukleiinihappoduplekseja. Näitä useita erilaisia menetelmiä koskeva katsaus on esitetty julkaisussa 20 Bio/Technology 8 (huhtikuu 1990) 290 - 293, joka on liitetty tähän keksintöön siihen oikeuttavien säädösten :v. nojalla. Niihin kuuluvat PCR, LCR, ζ)β ja 3SR, mainittuihin ;·. kuitenkaan rajoittumatta. Vaikkakaan 3SR:ään ja QP*.aan ei ;·_ sisälly lämpösykli-inkubointia, niin niiden monistusten ! 25 tulosta voidaan seurata edellä tarkastellulla fluore- « · · senssin havaitsemiseen käytettävällä järjestelmällä ja '·’ analysoida tämän keksinnön periaatteiden mukaisesti.

Kutakin näistä menetelmistä tarkastellaan pääpiirteittäin tuonnempana.

'30 DNA:n PCR-monistukseen liittyvät toimintasyklit, ; ,·, joissa toistetaan vaiheita, jotka ovat DNA:n lämpö- I * » ’!!/ denaturointi, kahden oligonukleotidialukkeen liittäminen jaksoihin, jotka ovat monistettavan DNA-jakson molemmilla puolilla, ja yhteenliittyneiden alukkeiden pidentäminen 35 DNApolymeraasilla. Alukkeet hybridisoituvat tutkittavan jakson vastakkaisiin nauhoihin ja ne ovat suuntautuneet 109362 17 sillä tavoin, että polymeraasin DNA-synteesi etenee alukkeiden välisen alueen läpi ja kukin peräkkäinen sykli olennaisesti kaksinkertaistaa edellisessä syklissä syntetoituneen DNA:n määrän. Tämä johtaa tietyn tutkittavan 5 fragmentin eksponentiaaliseen kerääntymiseen nopeudella, joka on noin 2 n kutakin sykliä kohti, jossa n on syklien lukumäärä. Täydellinen katsaus tähän menetelmään on esitetty teoksessa PCR Technology, Principles and Applications, Ed. Erlich, H.A., Stockton Press, New York, 10 1989.

Käytettäessä PCRrää on tämän keksinnön yhteydessä edullista käyttää Taq-DNA-polymeraasia, vaikkakaan tämä ei ole tämän keksinnön olennainen piirre. Taq-polymeraasi, joka on lämmönkestävä polymeraasi, on aktiivinen korkeissa 15 lämpötiloissa. Menetelmiä Taq:n valmistamiseksi on kuvattu US-patenttijulkaisussa nro 4 889 818 ja se on liitetty tähän keksintöön siihen oikeuttavien säädösten nojalla.

PCRissä voidaan myös käyttää muita lämmönkestäviä DNA-polymeraaseja, jotka on eristetty muista 20 Thermus-lajeista tai ei-Thermus-lajeista (esimerkiksi

Thermus thermophilus tai Thermotoga maritima) , sekä lämpöä kestämätöntä DNA-polymeraasia, kuten T4-DNA-polymeraasia, • · /·’; T7-DNA-polymeraasia, E. colin DNA-polymeraasi I:tä tai E.

colin Klenowf ragmenttia. Menetelmiä lämmönkestävien • · 25 DNA-polymeraasien aikaansaamiseksi on saatavilla Ί!! kansainvälisistä patenttihakemusjulkaisuista WO-A-91/09 950 » · · ja WO-A-92/03 556, jotka on liitetty tähän keksintöön siihen oikeuttavien säädösten nojalla.

t i f '· '· Ligaasiketjureaktio on kuvattu kansainvälisessä 9 9 9 30 patenttihakemusjulkaisussa nro W0 89/09 835, joka on : liitetty tähän keksintöön siihen oikeuttavien säädösten » i · · ,*·. nojalla. Tähän menetelmään liittyy ligaasin käyttö • » sellaisten oligonukleotidisegmenttien yhdistämiseksi, jotka 1 > · liittyvät pituussuunnassa tutkittavaan nukleiinihappoon.

35 Ligaasiket jureaktio (LCR) johtaa alkuperäisen tutkittavan molekyylin monistumiseen ja siitä voidaan saada 109362 18 miljooniakappaleita tuotteena olevaa DNA:ta. Tämän johdosta LCR johtaa kaksinauhaisen DNA:n nettolisäykseen. Tässä kuvatut havaitsemismenetelmät ovat sovellettavissa LCR:ään sekä PCR:ään. LCR:ssa tarvitaan tyypillisesti jokin keino, 5 kuten oligonukleotidikoetin, tuotteena olevan DNA:n havaitsemiseksi. Tällaiset keinot ovat tässä selitettyjen monistustuotteiden havaitsemismenetelmien yhteydessä käytettynä tarpeettomia ja LCR-tulos on välittömästi havaittavissa.

10 Toisessa monistusjärjestelmässä, Q3-replikaasissa, käytetään hyväksi RNA-bakteriofagista ζ)β peräisin olevan replikaasin käyttöä. Tässä monistusjärjestelmässä tutkittavaan nukleiinihappojaksoon ligatoidaan ensin tutkittavalle jaksolle spesifisen jakson sisältävä 15 muunnettu yhdistelmä-bakteriofagigenomi. Bakteriofagi-koettimen ja näytteessä olevan nukleiinihapon välisten dupleksien rikastuksen jälkeen lisätään Οβ-replikaasia, joka säilyneen yhdistelmägenomin tunnistettuaan alkaa valmistaa tästä molekyylistä suuria määriä kopioita.

20 Οβ-järjestelmässä ei tarvita alukejaksoja eikä siinä ole lämpödenaturaatiovaiheita, kuten PCR- ja :V, LCR-monistusjärjestelmissä. Reaktio tapahtuu yhdessä ·;·. lämpötilassa tyypillisesti 37 °C:ssa. Edullinen templaatti .! . on Qp-replikaasin substraatti, midvariant-l-RNA. Tätä ' *, 2 5 järjestelmää käyttäen saadaan templaattien lukumäärä *;;; lisääntymään hyvin suureksi. Katsaus tähän monistus- '·* ' järjestelmään on esitetty kansainvälisessä patentti hakemus julkaisussa nro WO 87/06 270 ja julkaisussa Lizardi, et ai., Bio/Technology 6 (1988) 1197 - 1202.

: 30 3SR-järjestelmä on muunnos in vitro -transkriptioon ; "·, perustuvasta monistusjärjestelmästä. Transkriptioon ‘1!.’ perustuva monistusjär jestelmä (TAS) sisältää sellaisten ·;* alukkeiden käytön, jotka koodaavat promoottori jaksoa sekä tutkittavan nauhan jakson suhteen komplementaarista jaksoa, 35 tutkittavasta nauhasta valmistettavien DNA-kopioiden muodostamiseksi ja DNA-kopioista tehtävien RNA-kopioiden 109362 19 muodostamisen RNA-polymeraasilla. Tätä kysymystä on käsitelty esimerkiksi US-patenttijulkaisun nro 4 683 202 esimerkissä 9B ja eurooppalaisessa patenttihakemus- julkaisussa nro EPA-0 310 229. 3SR-j är j estelmä on 5 järjestelmä, jossa käytetään kolmea entsyymiä tutkittavien nukleiinihappojen replikoimiseksi isotermisissä olosuhteissa .

Järjestelmän käyttö lähtee tutkittavasta yksi-nauhaisesta RNA:sta, johon T7-RNA:n DNA-aluke on liittynyt.

10 Kun aluke pidennetään käänteistranskriptaasilla, muodostuu cDNA:ta, ja cDNA vapautetaan heterodupleksista RNAasi H -käsittelyllä. Toinen aluke liitetään cDNA:han ja kaksinauhainen cDNA muodostuu käänteistrans- kriptaasikäsittelyä käyttäen. Yksi (tai molemmat) näistä 15 alukkeista koodaa(vat) promoottoria, esimerkiksi T7-RNA-polymeraasin promoottoria, niin että kaksinauhainen cDNA on RNA-polymeraasin transkriptiotemplaatti.

Transkriptioon kykenevät cDNA-molekyylit muodostavat alkuperäisen tutkittavan molekyylin antisense-20 RNA-kopioita. Käänteistranskriptaasi muuttaa sitten nämä transkriptiotuotteet kaksinauhaiseksi cDNA:ksi, joka sisältää kaksinauhaiset promoottorit, jotka sijaitsevat ;·. vaihtoehtoisesti molemmissa päissä orientoituneena käänteisinä toistumajaksoina. Näistä DNA-molekyyleistä 25 voidaan saada RNA-molekyylejä, jotka voivat palata takaisin ;;; sykliin. 3SR-järjestelmää koskeva täydellisempi kuvaus on esitetty julkaisussa Guatelli, et ai., Proc. Natl. Acad.

Sei. USA 87 (1990) 1874 - 1878 ja eurooppalaisessa patenttihakemus julkaisussa nro EP-A-0 329 822, jotka 30 kumpikin-on liitetty tähän keksintöön siihen oikeuttavien ; säädösten nojalla. TAS-järjestelmä on myös kuvattu t * * julkaisussa Gingeras, et ai., teoksessa Innis, et ai. eds, • · '1* 1990, PCR Protocols, Academic Press, San Diego, joka on liitetty tähän keksintöön siihen oikeuttavien säädösten 35 nojalla.

109362 20 Tämän keksinnön mukaisella laitteella nukleiinihapon monistumista seurataan havaitsemalla fluoresenssia, joka emittoituu silloin, kun fluoresoiva väriaine, kuten reaktioseokseen lisätty interkaloituva fluoresoiva väri-5 aine, sitoutuu kaksinauhaiseen nukleiinihappoon kunkin yhteenliittymis/pidentymisvaiheen aikana käsiteltäessä seosta peräkkäisissä kahden lämpötilan välillä vuorottelevissa toimintasykleissä (lämpösyklikäsittely).

Fluoresenssin lisääntyminen viittaa positiiviseen 10 tulokseen tutkittavan nukleiinihapon monistamisessa. Sopiviin interkaloituviin aineisiin tai väriaineisiin kuuluvat etidiumbromidi, propidiumbromidi, proflaviini, akridiinioranssi, akriflaviini, fluorikumariini, ellipti-siini, daunomysiini, klorokiini, distamysiini D, 15 kromomysiini, homidium, mitramysiini, ruteniumpoly-pyridyylit, antramysiini, metidiumbromidi, 2—[2—(4— hydroksifenyyli)-6-bentsimidatsoli-6-(l-metyyli-4-piperat-siini)bentsimidatsolitrihydrokloridi ja muut näitä vastaavat aineet, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta.

20 Tässä keksinnössä käyttökelpoisia ovat myös ne tällä alalla kuvatut fluoroforit ja DNA: hän sitoutuvat * * · kromoforit, jotka ovat käyttökelpoisia käytettäväksi 5 ' —3' — nukleaasimäärityksessä, joka on kuvattu US-patent-, ti julkaisussa nro 5 210 015. Sopivat donorif luoroforit ja i · · * ; 25 sammuttimet valitaan sillä tavoin, että donorifluoroforin • « · ··''* emissiospektri on osittain päällekkäinen sammuttimen * t t tt* V ' absorptiospektrin kanssa. Ihanteellisessa tapauksessa fluoroforeilla tulisi olla suuri Stokesin siirtymä (suuri i * : \j ero maksimaalista absorptiota vastaavan aallonpituuden ja 30 maksimaalista emissiota vastaavan aallonpituuden välillä) * * . niiden häiriöiden minimoimiseksi, jotka syntyvät hajavalona t · t i t > saapuvasta virityssäteilystä.

* » *;·' Sopiviin leimoihin, jotka ovat tällä alalla ·; tunnettuja, kuuluvat f luoreskeiini ja sen johdannaiset, >;·; 35 kuten FAM, BEX, TET ja JOE; rodamiini ja sen johdannaiset, kuten teksasinpuna (Texas Red), ROX ja TAMRA; Lucifer 109362 21

Yellow -väriaine, ja kumariinijohdannaiset, kuten 7-Μβ2Ν-kumariini-4-asetaatti, 7-OH-4-CH3-kumariini-3-asetaatti ja 7-NH24-CH3-kumariini-3-asetaatti (AMCA). FAM-, HEX-, TET-, JOE-, ROX- ja TAMRA-väriaineita pitää kaupan Perkin 5 Elmer-yhtiön Applied Biosystems -divisioona (Foster City, CA) . Teksasinpunaa ja monia muita sopivia yhdisteitä pitää kaupan Molecular Probes -yhtiö (Eugene, OR) . Esimerkkeihin kemiluminesoivista ja bioluminesoivista yhdisteistä, jotka voivat soveltua käytettäväksi energiadonoreina, kuuluvat 10 luminoli (aminoftaalihappohydratsidi) ja sen johdannaiset sekä lusiferääsi.

Kuviossa 1 on esitetty fluoresenssikäyrä, joka esittää DNA:n monistumista yhden sellaisen polymeraasiketjureaktion (PCR) kyseessä ollessa, joka sisältää 15 reaktioseoksen lämpötilan vuorottelun peräkkäisissä sykleissä kahden lämpötilan, esimerkiksi 94 °C:n ja 50 °C:n, välillä. Reaktioseos sisälsi interkaloituvaa fluoresoivaa DNA:hän sitoutuvaa väriainetta, etidium-bromidia (EtBr) , joka interkaloituu eli sitoutuu 20 kaksinauhaisiin PCR-tuotteisiin ja fluoresoi reaktion kunkin yhteenliittymis/pidentymisvaiheen aikana. Tämän johdosta tuloksena oleva fluoresenssi lisääntyy kaksinauhaisen DNA:n määrän lisääntyessä. Kuten kuviosta 1 käy ilmi, fluoresenssin voimakkuus nousee ja laskee 25 lämpötilaan kääntäen verrannollisesti. Fluoresenssin voimakkuus on pienimmillään denaturaatiolämpötilassa (94 °C) ja suurimmillaan yhteenliittymis/pidentymis- • · · ‘ lämpötilassa (50 °C). Fluoresenssin voimakkuudessa 50 °C:ssa esiintyy siten toimintasyklistä riippuvainen ’· “· 30 nousu, joka heijastaa kaksinauhaisen DNA: n määrän • » · ’...· suurentumista. Kun lämmityssykli-inkubointilaitteen lämpö- j tila palautettiin takaisin 25 °C:ksi 30 syklin mittaisen ,··, käsittelyn päätyttyä, fluoresenssi lisääntyi loppuarvoon, joka oli yli kolme kertaa 25 °C:ssa havaittua fluoresenssin « · « 35 alkuarvoa suurempi. Toisaalta denaturaatiolämpotilojen ’·”· kohdalla olevat fluoresenssin minimiarvot eivät mer- 109362 22 kittävässä määrin lisäänny otaksuttavasti sen vuoksi, että tässä lämpötilassa ei ole ds-DNA:ta, johon EtBr voisi sitoutua.

Kuten US-patenttihakemusjulkaisussa nro 07/695 201 5 on selitetty, nämä koetulokset kerättiin käyttäen kuituoptista kaapelia ja spektrofluorimetriä. Kuituoptista kaapelia käytettiin virityssäteilyn syöttöön suoraan reaktioseoksen sisältävään koeputkeen ja koeputki oli sijoitettu lämmityssykli-inkubointilaitteen lämmitys/jääh-10 dytysblokkiin. Tätä samaa kuituoptista kaapelia käytettiin tuomaan fluoresoiva säteily takaisin spektrofluorimetriin, jossa emittoitunutta fluoresenssia vastaava arvo luettiin.

Tässä järjestelmässä monistumistuotteiden syntymistä voidaan seurata reaktion edistyessä, mikä käy ilmi kuviossa 15 1 olevista koetuloksista. Koska sitoutuvan aineen muodostama signaali voidaan havaita tarvitsematta avata reaktiokoeputkea, voidaan signaalia seurata koko monistumistapahtuman ajan, ennen sitä, sen aikana ja sen jälkeen.

20 Yhden PCR:n havaitsemiseksi ja kuviossa 1 esitettyjen koetulosten aikaansaamiseksi tarkoitettu laite .·.· rakennettiin seuraavasti: Spex-Fluorolog-2-f luorimetri, : jossa oli kuituoptiikkalisälaite (Spex':n tuoteluettelon nro 1950) asetettiin lähettämään virityssäteilyä 500 nm: n 25 aallonpituudella, jonka kaistanleveys oli noin 3,4 nm.

Toisen kertaluokan säteilyn poissulkemiseksi käytettiin 435 ’···, nm:n GG-rajasusuodinta (tämä oli hankittu yhtiöstä Melles • · *

Grist Inc.). Emissiosäteily havaittiin 570 nm:n aallonpituudella käyttäen noin 13,6 nm: n kaistanleveyttä.

'· '· 30 Virityssäteilyn poistamiseksi käytettiin OG530-suodinta (katkaisuraja 530 nm:n kohdalla).

I Reaktiokoeputki, 0,5 ml:n vetoinen polypropyl- ,···. eenikoeputki, sisälsi 60 ng miespuolista humaani- DNA:ta.

^ Koeputken yläosa oli leikattu pois kuituoptisen kaapelin ···· 35 liittämiseksi. Kuituoptinen kaapeli liimattiin reak- '· * tiokoeputken yläosaan epoksilla. Emissiosäteily koottiin 109362 23 putkessa olevan öljykerroksen läpi. Musta "suojus" rakennettiin putken ympärille ja reaktioseos sijoitettiin lämmityssykli-inkubointilaitteeseen. Lämmityssykli-inku-bointilaite ohjelmoitiin toimimaan yhden minuutin 5 pituisilla toimintasykleillä 94 °C:ssa ja 50 °C:ssa 30 syklin ajan, jonka jälkeen inkubointia jatkettiin yhtäjaksoisesti 25 °C:ssa. Fluorometri ja lämmitys-sykli-inkubointilaite käynnistettiin samanaikaisesti. Fluorometrin asetusarvot olivat: aikaan perustuva päälläolo 10 viiden sekunnin integrointiajalla; emissiosignaali suhteutettiin virityssäteilyyn valolähteen voimakkuudessa olevien muutosten kontrolloimiseksi.

Tämän keksinnön mukaisesti siitä saadaan käyttöön laite useiden monistusreaktioseosten monistumisen ha-15 vaitsemiseksi yhtäaikaisesti tosiajassa. Kussakin reaktioseoksessa on tutkittavaa nukleiinihappojaksoa. Siten käytettäessä lämmityssykli-inkubointilaitetta (esimerkiksi kaupallisesti yhtiöstä Perkin Elmer Cetus Instruments saatavilla olevaa lämmityssykli-inkubointilaitetta), jossa 20 on kuumennus- ja jäähdytysblokki, johon kyetään asettamaan jopa 48 reaktiokoeputkea, voidaan esimerkiksi suorittaa 48 monistusreaktiota ja kaikista 48 näytteistä saatava F.’. PCR-monistustuote havaita samanaikaisesti käsittelemättä t · *:'. näytteitä, avaamatta koeputkia tai keskeyttämättä 25 lämmityssyklin käyttöön perustuvaa reaktiota. Saman- aikaisesti seurattavien reaktioiden lukumäärää rajoittaa ainoastaan lämmitys- ja jäähdytysblokin kapasiteetti, ’*’ ‘ käytettäessä 96-kuoppaista lämmitys- ja jäähdytysblokkia, voidaan siten seurata 96 monistusreaktiota ja havaita 30 monistumistuote samanaikaisesti. Kuten edellä kuvatussa ‘ esimerkkitapauksessa oli asianlaita, on selvää, että ; ,·. vaikkakin tämän keksinnön tuonnempana kuvattavat sovellutusmuodot on kuvattu PCR-reaktioiden ja tietyissä 'F esimerkeissä käytettävän tutkittavan DNA-jakson monis- 35 tumista osoittavan spesifisen fluoresoivan aineen muo- dostamien signaalien yhteydessä, voidaan näitä 109362 24 sovellutusmuotoja käyttää muiden sellaisten monis-tusmenetelmien tai sitoutuvien aineiden yhteydessä, kuten esimerkiksi niiden menetelmien tai sitoutuvien aineiden yhteydessä, jotka on edellä esitetty lyhyen yhteenvedon 5 muodossa sekä kuvattu Gelfand et ai.':n US-patenttijulkaisussa nro 5 210 015, joka on liitetty tähän keksintöön siihen oikeuttavien säädösten nojalla.

Useiden monistusreaktioseosten havaitsemiseen tarkoitetun laitteen ensimmäisessä sovellutusmuodossa 10 tarkoitukseen sopiva optinen järjestelmä siirtää virityssäteilyn säteilylähteestä lämmityssykli-inku-bointilaitteeseen asetettuihin useisiin reaktiokoeputkiin ja määrittää kustakin koeputkesta peräisin olevan emissiosäteilyn. Tällainen optinen järjestelmä voi käsittää 15 useita kuituoptisia kaapeleita, jotka ottavat lukemia niistä kaikista PCR-koeputkista, joille lämmityssyklien inkubointia ollaan suorittamassa. Fluoresenssin lukemiseen reaktiokoeputkista tarvitaan ainoastaan yksi fluorometri, koska kukin kuituoptinen kaapeli voidaan lukea nopeasti 20 yksi kerrallaan PCR:n lämpötilakäsittelyn aikakehyksessä (esimerkiksi yhteenliittymis/pidentymisaikana, kuten kuviossa IA esitetty kohtien a - c välinen aika) . Alan : * : ammattikokemuksen perusteella on selvää, että tällainen havaitsemisjärjestelmä ei välttämättä rajoitu tiettyyn tv. 25 lämmityssykli-inkubointilaitteeseen tai reaktioastiaan.

Monistumisen havaitsemisjär jestelmiin sisältyvät ’···, kuituoptiset kaapelit virityssäteilyn ja fluoresenssi- emissioiden välittämiseksi. Tähän tarkoitukseen soveltuu mikä tahansa päällyslevy, koeputken tulppa tai ’· '· 30 kansilevylaite, joka käsittää tai johon voidaan liittää ..." kuituoptinen kaapeli, kunhan vain reaktiokuopat tai • ;·; koeputket ovat sillä tavoin valolta suojattuja, että .···. ulkopuolisten valonlähteiden vaikutukset fluoresenssin • havaitsemiseen estyvät. Yhdessä tämän keksinnön mukaisessa V 35 sovellutusmuodossa reaktiokoeputken tulpat voidaan poistaa ’· · kuituoptisen kaapelin sovittamiseksi näihin. Sellaisen 109362 25 reaktioastian käyttö, jossa on kirkas tai läpinäkyvä tulppa, tekee kuitenkin kaapelin työntämisen koeputkeen tarpeettomaksi. On selvää, että haluttuja ovat sellaiset reaktiokoeputket, joihin kuituoptinen kaapeli kyetään 5 asentamaan ilman, että kaapeli joutuu fyysiseen kosketukseen monistusreaktion komponenttien kanssa.

Kuviossa 2 on esitetty vielä yksi sovellutusmuoto laitteesta useiden tutkittavien nukleiinihappojaksojen monistumisen havaitsemiseksi tosiajassa ja siitä käytetään 10 viitenumeroa 10. Tässä sovellutusmuodossa on se edullinen piirre, että sillä vältytään käyttämästä edellä kuvattuja kuituoptisia kaapeleita säteilyn syöttämiseen laitteeseen ja fluoresenssin johtamiseen laitteesta, sekä näihin liittyviltä ongelmilta, jotka liittyvät kuituoptiikan 15 yhdistämiseen reaktiokoeputkiin. Edellä olevan tarkastelun mukaisesti laitetta 10 selitetään asioiden yksinkertaistamiseksi tutkittavan DNA-jakson PCR-monistuksen yhteydessä käyttäen signaalin muodostamiseen fluoresoivaa sitoutuvaa ainetta, mutta tämän tarkoituksena ei ole 20 rajoittaa laitteen käyttöä tähän monistusmenetelmään, nukleiinihappoon tai monistussignaalin muodostavaan yhdisteeseen.

Laite 10 käsittää tavallisesti lämmityssykli- /·*. inkubaattorin 12, joka on tarkoitettu kuumentamaan ja :V. 25 jäähdyttämään reaktiokammiossa olevia koeputkia tai säiliöitä 26 (näihin on lisätty etukäteen monistettava (t) ".V.' nukleiinihappo (ot) ) , laitteen sivulle asetetut viri- > · · * tyssäteilylähteet tai lamput 14, kuvantamislaite 16 (tämä käsittää CCD-kameran 16a, kameran ohjauslaitteen 16b ja ’· ’· 30 jäähdyttimen 16c) ja kuvankäsittelyprosessorin 20, joka voi olla PC, joka on varustettu ruudunsieppauskortilla, kuten 1 · j : PC Vision Plus, joka on kaupallisesti saatavilla Itex Inc.

I -yhtiöstä, ja IEEE 488 -liityntäkortilla. Nämä yksiköt on esitetty lohkokaaviossa kuviossa 4. Vaikkakin 35 lämityssykli-inkubaattori 12 tämän keksinnön edullisen sovellutusmuodon mukaisesti on konstruktioltaan tavan- 109362 26 omainen, on lämmityssykliinkubaattorin 12 tietyt ominaisuudet esitetty tuonnempana apukeinona tämän keksinnön selityksen ymmärtämiselle.

Lämpösykli-inkubointilaite 12 sisältää lämmön-5 vaihtimen 22 reaktiokoeputkien 26 lämmittämiseksi ja jäähdyttämiseksi. Lämmönvaihdin 22 on edullisesti alumiinista valmistettu lämpöä johtava blokki, jossa on useita siihen muodostettuja syvennyksiä 24 ja joka on sen suuruinen, että siihen mahtuu tietty määrä reaktiokoeputkia 10 26 (esimerkiksi 0,5 ml: n vetoisia Eppendorf-putkia) .

Lämmönvaihtimen 22 tarkoitus on tukea reaktiokoeputkia 26 ja toimia lämmönvaihtimena lämpöenergian siirtämiseksi koeputkissa oleviin nesteisiin ja niistä pois, jotta reaktion komponentteja voidaan inkuboida eri lämpötiloissa 15 käyttäjän määräämien aikojen ajan. Lämmityssykli-inkubointilaite 12 sisältää siten myös järjestelmän lämmönvaihtimen lämmittämiseksi ja jäähdyttämiseksi ja keinon, kuten tietokonejärjestelmän, lämmitys- ja jäähdytysjärjestelmän ohjaamiseksi lämmönvaihtimen ja 20 reaktiokoeputkien kuumentamista ja jäähdyttämistä varten tällä alalla tavanomaiseen tapaan. Käyttäjä ohjelmoi .·/· tietokoneen tai keinon lämmönvaihtimen ja reaktiokoeputkien i * : lämmityksen ja jäähdyttämisen kontrolloimiseksi haluttuun lämpötilaprof iiliin, jollainen on esimerkiksi kuviossa 1 25 kuvattu profiili, käyttämällä näytön ja näppäimistön sisältävää käyttöliittymää 28.

Lämmönvaihdin (lämpöä johtava blokki), keino lämmönvaihtimen jäähdyttämiseksi ja kuumentamiseksi ja keino lämmönvaihtimen sekä koko lämmityssykli-inku-’· 30 bointilaitteen kuumentamiseksi ja jäähdyttämiseksi voidaan konstruoida US-patenttijulkaisun nro 5 038 852 mukaisesti, j joka on liitetty tähän keksintöön siihen oikeuttavien .···. säädösten nojalla. Sopivia lämmityssykli-inku- bointilaitteita on kaupallisesti saatavilla, kuten 35 esimerkiksi GeneAmp PCR system 9600 thermal cycler -laite '·”· (Perkin-Elmer, Norwalk, CT), joka on esitetty kuviossa 2.

109362 27

On kuitenkin selvää, että edeltä käsin täytettyjen reaktiokoeputkien kuumentamiseksi ja jäähdyttämiseksi voidaan käyttää muita laitteita tämän keksinnön suojapiiristä poikkeamatta. Välttämätöntä on ainoastaan se, 5 että mitä tahansa laitetta reaktiokoeputkien lämmittämiseen ja jäähdyttämiseen käytetäänkin, niin tämän on kyettävä saavuttamaan ja pidettävä yllä reaktioihin liittyviä lämpötiloja ja saavuttamaan haluttu lämpötila ja aika -profiili. Tällaisen laitteen on siten nukleiinihapon 10 monistamistarkoituksia varten kyettävä vuorottelemaan toimintasykliensä aikana monistusreaktioseoksen lämpötilaa denaturointilämpötilan Ti (joka voi olla alueella noin 80 -105 °C ja edullisesti 90 - 100 °C) ja yhteenliittymis/-pidentymislämpötilan T2 (tämä voi olla alueella noin 30 -15 90 °C ja edullisesti 50 - 70 °C) välillä, jossa Ti > T2, mikä on tunnettua alan ammattikokemuksen perusteella.

Kansiblokki 27, joka sisältää kahvan 27a, on yhdistetty lämmönvaihtimeen siten, että se on työnnettävissä syrjään, lämmönvaihtimen 22 peittämiseksi tai 20 paljastamiseksi tällä alalla tavanomaisella tavalla. Kansiblokki 27 pidetään viimeksi mainitussa asemassa kuviossa 3 esitetyllä tavalla tämän keksinnön kuviossa 2 esitetyn sovellutusmuodon monistus/havaitsemistapahtuman ajan. Tämän avulla on kameralla 16a mahdollista 25 vastaanottaa monistusreaktiokoeputkista emittoituvat f luoresenssisignaalit.

Lämpösykli-inkubointilaitteessa 12 on myös keino niiden tulostuvien tietojen lähettämiseksi, jotka esittävät lämmönvaihtimen tai monistusreaktioseoksen lämpötila-’· “· 30 profiilia, kuten syklin järjestysnumeroa, lämpötilaa ja aikaa, kuvankäsittelyprosessorille 20 linjan 30 : välityksellä. Esimerkiksi GeneAmp PCR system 9600 thermal ,···. cycler -laitteessa on R5232-väylä näiden tulosten lähettämiseksi.

> » · ..·*· 35 Nämä tulostuvat tiedot esitetään käyttäjälle myös LED-näytössä 28a laitteen toiminnan aikana.

109362 28 CCD-kamera 16a on sijoitettu lämmönvaihtimen 22 ja reaktiokoeputkien päälle kokoamaan reaktioseoksista koeputkien yläosien kautta emittoituvat fluoresenssisignaalit laitteen 12 vuorottaessa seoksien lämpötilaa monistuksen 5 kuluessa. On tärkeää, että kameran 16a vastaanottamaan fluoresenssikuvaan vaikuttavien parallaksi-ilmiöiden vähentämiseksi kamera 16a on sijoitettu niin etäälle lämmönvaihtimesta 22 kuin käytännössä on mahdollista.

Muista valonlähteistä peräisin olevan taustakohinan 10 vähentämiseksi on kameran 16a kuitenkin oltava riittävän lähellä lämmönvaihdinta ja reaktiokoeputkia, ja sijoitettuna niin, että kamera voi koota riittävästi reaktiokoeputkista 26 tulevaa säteilyä. On havaittu, että lämmönvaihtimeen suunnatun kameran linssin 4 6 ja 15 lämmönvaihtimen 22 välinen optimaalinen etäisyys d on käytetyn linssin mukaan alueella 15 cm - 1,5 m. Esimerkiksi 70 mm:n linssiä käytettäessä d on edullisesti noin 0,6 m. Kaistanpäästöinterferenssisuodin 48, joka on edullisesti 600 nm:n suodin, on sijoitettu linssin eteen rajoittamaan 20 havaitsemisen halutulle aallonpituudelle, koska määritettävän fluoresenssin aallonpituudet ovat noin 600 nm.

*’·*: Kuviossa 2 kamera 16a on esitetty kiinnitettynä tavanomaiseen kamera jalustaan 32 kameran sijoittamiseksi 25 lämmönvaihtimen 22 ja reaktiokoeputkien 26 yläpuolelle.

» ♦

Kamerajalusta 32 sisältää pystysuoran tukiosan 34, joka on kiinnitetty pidikkeeseen 36. Pidäke 36 on kiinnitetty jalustaa vastassa olevaan pintaan 38, jonka päällä laite 10 lepää. Liukuosa 40 on kiinnitetty liikuttelemisen 30 mahdollistavalla tavalla pystysuoraan osaan 34 pystysuorassa suunnassa tapahtuvaa liikuttelua varten ja : .*. siinä on nuppi 42, joka sitä kierrettäessä vastaa ,···. liukuosaan 40 liikuteltavan osan 40 lukitsemiseksi ’’’ kiinteästi alan ammattikokemuksen mukaan tavanomaisella 35 tavalla. Kamerapidikkeessä 44 on toinen pää, joka on kiinnitetty liukuosaan 40 ja toinen pää, joka on 109362 29 kiinnitetty kameraan 16a. Siten kameran 16a korkeutta voidaan säätää liukuosan 40 välityksellä halutulle korkeudelle lämmönvaihtimen ja reaktiokoeputkien yläpuolelle. Kamera 16a on edullisesti tavanomainen 5 tietokoneen ohjaama jäähdytetty CCD-kamera. Jääh dytysnestettä kierrätetään kameran 16 läpi monikanavaisen putken 50 kautta. Kamera on kuvien laadun parantamiseksi ja kohinan vähentämiseksi edullisesti jäähdytetty. Yksi sopiva kamera on yhtiöstä Photometries (Tucson, AZ) kaupallisesti 10 saatavilla oleva Star 1 -merkkinen CCD-kamera. Tässä on käytetty termoelektrisesti jäähdytettyä CCD-kennoa, jonka pikselierottelukyky on 12-bittinen. Sillä on mahdollista käyttää myös vaihtelevia valotusaikoja herkkyyden muuttamiseksi havaittavaa fluoresenssia vastaavaksi.

15 Laitteessa on IEEE 488 -väylä (tämä on merkitty viitenumerolla 58), joka on kameran 16a ja kuvankäsittelyprosessorin 20 välillä, jotta kuvankäsit-telyprosessori 20 voi säätää reaktiokoeputkista otettavan kuvan valotusta ja sitä aikaväliä, jona kuva otetaan.

20 Kuviossa 4 on kameran 16a ja lämmönvaihtimen 22 välissä olevan optisen tien sivuilla kaksi UV-lamppua 14.

Tässä suhteessa on tärkeää ainoastaan se, että lamput 14 ovat riittävän lähellä kameran linssiä 46, jotta niiden ·:*. kehykset eivät työnny ollenkaan reaktiokoeputkien ja 25 kameran linssin 46 väliselle optiselle tielle. Tätä • · tarkoitusta varten lamput 14 voidaan ripustaa kamerapidikkeestä 44 pidikkeen 52 välityksellä. Lamput 14 I i * *’ ’ ovat myös yhdensuuntaiset lämmönvaihtimen suhteen, jotta virityssäteily kohdistuu reaktiokoeputkiin yhdenmukaisesti.

30 Johdot 54 tulevat lampuista 14 ja ne on tehty sopiviksi ',,,· tavallisiin 115 voltin seinäpistorasioihin, josta lamput ; saavat tarvitsemansa virran. UV-lamppujen 14 aallonpituus /·, valitaan fluoresoivan nukleiinihappoihin sitoutuvan yhdisteen vaatimusten mukaan. Esimerkiksi etidiumbromidin 35 virittämiseksi on 302 nm haluttu aallonpituus. Sopiva 302 ’· nm keskialueen UV-lamppu on saatavilla kaupallisesti 30 109362 yhtiöstä U.V. Products Inc. (San Gabriel CA) Chroma-Vue-nimisenä lamppuna.

Kameran 16a ottama kuva välittyy kuvankäsit-telyprosessoriin 20 linjan 56 välityksellä, joka edellä ku-5 vattua Star 1 -järjestelmää käytettäessä on RS170-linja. Kuvankäsittelyprosessori 20 sisältää kuvaruudun-sieppausyksikön digitaalisten kuvien muodostamiseksi linjalta 56 tulevien kameran tietojen perusteella. Vaikkakin kamera 16a sisältää 12-bittisen digitaalisen ulostulon, 10 käytetään kameran analogiaulostuloa niissä tapauksissa, joissa kuvankäsittelyprosessori 20 on 8-bittinen kuvankäsittelyprosessori. Tässä tapauksessa kuvankäsittelyprosessori 20 sisältää kuvaruudun sieppausyksikön 8-bittisten digitaalisten kuvien aikaansaamiseksi linjalta 56 tulevan 15 analogisen signaalin perusteella, jotta kuvankäsittelyprosessori 20 voi käsitellä saadut kuvat digitaalisena tietona .

Lämmityssykli-inkubointilaitteesta tuleva datalinja 30 on myös liitetty kuvankäsittelyprosessoriin 20 antamaan 20 prosessorille tiedot lämpötilaprofiilista, ajasta ja kulumassa olevasta monistussyklistä. Tällä tavoin prosessori 20 voidaan ohjelmoida lähettämään lau-·*·’. kaisusignaali linjaa 58 myöten kameran ohjausyksikköön 18, ··.·. joka ohjaa kameran 16a sulkimen avautumista etukäteen 25 valittuina aikoina monistuksen kuluessa. Kuvan-\t käsittelyprosessori 20 sisältää IEEE 488 -väyläkortin “,'/, yhteydenpitoa varten IEEE 488 -linjaan 58 kameran 16a t i · ’·’ * ohjaamiseksi. Prosessorissa 20 on myös tavanomainen näppäimistö- ja/tai hiirikäyttöliittymä 60/64 sekä monitori 30 62. Seuraavaksi on esitetty yleiskatsaus laitteen 10 toimintaan.

; Lämmönvaihdinblokkiin 22 (kuvio 3) on sijoitettu t useita reaktiokoeputkia 26, jotka kukin sisältävät t * reaktioseoksen (esimerkiksi monistettavan(at) nukleiini-35 hapon (pot), lämmönkestävän entsyymin polymeroinnin kataly-soimiseksi, spesifiset oligonukleotidikoettimet ja 4 eri 109362 31 nukleotiditrifosfaattia). Reaktiokoeputket voidaan sulkea tavanomaisilla tulpilla, höyrystymisen estävällä mineraaliöljyllä tai Ampliwax™ -merkkisellä suoja-materiaalilla. Lämmityssykli-inkubaattori kytketään 5 toimintaan ja virta kytketään virityslamppuihin, jotka on suunnattu reaktiokoeputkiin. Kamera 16a ottaa kameran ohjausyksiköstä 16b tulevalle signaalille reagoivana laitteena kuvan kaikista reaktiokoeputkista 26, joka kuva heijastaa eri fluoresenssitasoja ensimmäisessä syklin 10 yhteenliittymis/pidentymisvaiheessa. Tämä analogikuva lähetetään kuvankäsittelyprosessoriin, jossa kuva digitoidaan kuvaruudun sieppausohjelmalla, koska tässä on analogi/digitaalimuunnin.

Kuviossa 5 on esitetty osia kolmesta tällaisesta 15 digitoidusta kuvasta, jotka on otettu kuuden samanaikaisen monistuksen kuluessa. Prosessori laskee kustakin reaktiokoeputkesta mainitun yhteenliittymis/pidenty- misvaiheen aikana emittoituneen säteilyn voimakkuutta vastaavan keskiarvon ja normalisoi nämä voimakkuusarvot 20 yhden fluoresenssiarvon määrittämiseksi kustakin reaktiokoeputkesta. Normalisointimenetelmää tarkastellaan yksityiskohtaisemmin tuonnempana kuvioiden 8A-C yhteydessä.

·”·*: Nämä vaiheet toistetaan monistusmenetelmän jokaista sykliä • · ;·. käyttäen. Normalisoidut f luoresenssiarvot talletetaan 25 tietokoneen taulukkolaskenta-arkille niiden myöhempää analyysiä ja käyrien laatimista varten. Nämä normalisoidut f luoresenssiarvot jatkokäsitellään sen määrittämiseksi, ’ mikä tutkittavan nukleiinihappo jakson määrä oli kokeen alussa (toisin sanoen kokeen alussa olleiden tutkittavien • $ '.*·: 30 nukleiinihappotemplaattien lukumäärä ennen monistusta), tai • » » reaktiokinetiikkaan kohdistuvien monistusreaktio-olo-: ,·. suhteiden vaikutuksen analysoimiseksi. Seuraavissa kappaleissa tarkastellaan yksityiskohtaisemmin edellä pääpiirteittäin esitettyjä fluoresenssiarvon saamiseen ja 35 käsittelyyn liittyviä vaiheita.

109362 32

Ensimmäisenä tarkastelun kohteena on kunkin kameran valotuksen ajoittaminen emittoituneen fluoresenssin suhteen. Koska fluoresenssi on suurimmillaan kunkin lämmityssyklikäsittelyssä olevan syklin yhteenliit-5 tymis/pidentymisvaiheessa (esimerkiksi tämä on väli a - c kuviossa IA) ja se antaa viitteitä nukleiinihapon monistumisen määrästä, niin silloin, kun kameralla 16a otetaan tietyssä syklissä ainoastaan yksi kuva, on se otettava syklin tässä vaiheessa, koska voimakkain signaali 10 saadaan juuri tässä vaiheessa ja tämän aikavälin aikana otetut signaalit edustavat parhaiten valmistuvan materiaalin määrää. Koska kuitenkin muut koetulokset reaktion aikana voivat olla käyttökelpoisia koko monistumisen edistymisen analysoimisessa, on selvää, että 15 voi olla haluttua ottaa useampia kuvia kuin vain yksi kuva sykliä kohti. Kukin kuva voidaan esimerkiksi ottaa 20 sekuntia sen jälkeen, kun reaktiossa on saavutettu yhteenliittymis/pidentymislämpötila, mitä osoittaa viite-kirjain b kuviossa IA. Tässä esimerkkitapauksessa on 20 asianlaita niin, että silloin, kun yhteenliittymislämpötila on 68 °C, niin prosessori 20 lähettää signaalin 20 sekunnin kuluttua siitä, kun lämmityssykliinkubointilaite 12 osoittaa lämpötilan saavuttaneen arvon 68 °C, RS 232 ·;·. -linjan 30 kautta kameran ohjausyksikköön 16a kameran

( i I

25 sulkimen laukaisemiseksi (tätä ei ole esitetty) .

*. Valotusaika voi vaihdella sovellutuksesta toiseen, mikä on selvää alan ammattikokemuksen perusteella. On selvää, että « * ’ laukaisutapahtuma kameran sulkimen avaamiseksi voidaan tehdä käsikäyttöiseksi käyttäjän seuratessa näytöllä 28a *.’’ 30 esitettyä lämpötila- ja aikatietojen tulostusta.

CCD-kamera laskee yhteen valotuksen aikana : vastaanotetun valon määrän ja tuottaa kuvan, josta ilmenee 1 * * kaikkien lämmönvaihtimessa olevien reaktiokoeputkien fluoresenssi kyseisenä aikavälinä. Tämä kuva lähetetään 35 linjan 56 välityksellä kuvankäsittelyprosessoriin 20. Monitorissa 62, joka on kytketty prosessoriin 20, voidaan 109362 33 esittää kolme ikkunaa, joista kuviossa 5 käytetään merkintöjä 64A C. Ikkunassa 64A voidaan seurata kameran näkökenttää ja kameraa käytettäessä siinä voidaan saattaa käyttöön valikko kameran valotuksen säädön tyyppisten 5 toimintojen suorittamiseksi. Digitaalinen kuva esitetään ikkunassa 64B, joka tukee käsiteltävän (esimerkiksi tuonnempana tarkasteltavaa keskiarvon laskemista varten otettavan) kuvan osan manuaalista valintaa. Ikkunassa 64C esitetään tietokoneen käyttöjärjestelmän komentorivi.

10 Prosessori digitoi kuvan ja esittää sen ikkunassa 64B, jonka käyttötapa on sellainen, että käyttäjä voi osoittaa ryhmän pikseleitä kuuluvaksi kuvan siihen alueeseen, joka kattaa yhden reaktiokoeputken kuvan. Tämä voidaan suorittaa piirtämällä hiiren avulla suorakaiteita ikkunassa 64B 15 olevan reaktiokoeputken 26 digitoidun kuvan osien ympärille, tai käyttäen ohjelmaa, jolla tarkastellaan kunkin pikselin fluoresenssia sen määrittämiseksi, mitkä pikselit kuuluvat mihinkin reaktiokoeputkeen, jollainen menettely on selvää tietokonegrafiikan alan 20 ammattikokemuksen perusteella. Tätä on kuvattu kuviossa 6, jossa 6x6 -kokoa oleva pikselimatriisi sisältää yhden reaktiokoeputken 26 kuvan. On selvää, että tämä matriisikoko on valittu ainoastaan esimerkkitarkoituksessa ja että tämän keksinnön suojapiiristä poikkeamatta voidaan 25 käyttää muun kokoisia matriiseja. Pikseliarvot, jotka on

| I

''t annettu arvoina "5", tarkoittavat fluoresenssia, jolla ei ole merkitystä, ja ne vastaavat lämmönvaihtimen yläpinnan • · · emittoimaa fluoresenssia, kun taas pikseliarvot, jotka on annettu arvoina "200", tarkoittavat 6x6 -kokoa olevassa • t : 30 pikselimatriisissa havaittua maksimaalista fluoresenssia ja ’ ,,,· ne vastaavat reaktiokoeputken keskustan emittoimaa i : fluoresenssia, joka on kuvannettu pikseleiksi. Pikseliarvot i i » "100" vastaavat lämmönvaihtimesta ja reaktiokoeputkesta muodostuvan osan emittoimaa fluoresenssia. Nämä tietyt 35 nimenomaiset pikseliarvot eivät luonnollisestikaan edusta 109362 34 välttämättä todellisia arvoja, vaan ne ovat ainoastaan esimerkkejä.

Kuvankäsittelyprosessori 20 laskee tämän jälkeen keskiarvot niistä pikseliarvoista, jotka on määrätty 5 kuuluvaksi reaktiokoeputken sisältävään alueeseen, tätä reaktiokoeputkea vastaavan yhden fluoresenssiarvon aikaansaamiseksi tästä reaktiokoeputkesta nukleiinihappojen monistusmenetelmän syklille 1. Kutakin reaktiokoeputkea vastaavan yhden fluoresenssiarvon aikaansaamiseen on 10 kuitenkin muitakin keinoja, kuten pikseliarvojen yhteenlasku. Suorakaide, joka ympäröi 6x6 -matriisia ja joka sisältää ensimmäisen reaktiokoeputken, siirretään sitten osoittamaan seuraavaa reaktiokoeputkea, jossa vaiheessa laskutoimitukset pikseliarvojen keskiarvon 15 laskemiseksi toistetaan ja saadaan tulokseksi yksittäinen fluoresenssiarvo, ja näin jatketaan, kunnes kukin syklin 1 koeputkista on saanut fluoresenssiarvonsa. Vaihtoehtoisesti voidaan vaiheet fluoresenssiarvon antamiseksi kullekin | reaktiokoeputkelle 26 tietyssä syklissä tehdä parallee- 20 lisinä vaiheina. Näitä fluoresenssiarvojen laskuvaiheita ♦ .:.· kustakin reaktiokoeputkesta toistetaan kussakin syklissä, • kunnes monistusvaiheet on suoritettu loppuun.

: Reaktiota aloitettaessa, toisin sanoen asetettaessa reaktiokoeputkia 26 lämmönvaihdinblokkiin 22, asetetaan • * ··· 25 yhteen kuopista 24 myös kontrollikoeputki 26C.

Kontrollikoeputken tarkoituksena on antaa käyttöön vakiofluoresenssilähde, jota vastaan esimerkiksi pienistä . . lämpötilan muutoksista tai virityssäteilyn voimakkuuden ryöminnästä johtuvat määritysvaihtelut syklistä toiseen *;*’ 30 voidaan havaita. Tällä tavoin kustakin reaktiokoeputkesta : saatu fluoresenssiarvo voidaan korjata näiden vaihtelujen huomioonottamiseksi seuraavaksi esitettävällä tavalla. Kontrollikoeputki 26C on lisätty etukäteen ainoastaan ··*· fluoresoivaa väriainetta, kuten etidiumbromidia (EtBr) .

35 Koska kontrollikoeputkessa ei ole lainkaan nukleiinihappoa, sen fluoresenssi ei myöskään monistu lämmityssyklien 109362 35 aikana. Kontrollikoeputki emittoi siten olennaisesti vakiotasoista fluoresenssia tätä monistuksen aikana virityssäteilyllä säteilytettäessä ja se toimii perustasona koko monistustapahtuman aikana. Tätä on kuvattu kuviossa 7, 5 joka esittää kuvaajaa kontrollikoeputken fluoresenssin voimakkuudesta useiden syklien aikana.

Kuviossa 7 on i0 kontrollikoeputken fluoresenssi reaktion alussa ja tämä muodostaa perusviivan. Syklin 2 kohdalla alkaa kontrollikoeputkesta 26 mitattu voimakkuus 10 laskea, mikä viittaa siihen, että fluoresenssissa on tapahtumassa ryömintää. Siten yhtäjaksoinen viiva 72 syklissä 4 vastaa näennäisiä voimakkuusarvoja. Esimerkiksi syklin 4 kohdalla, kun kamera ottaa talteen koetuloksia neljännen syklin yhteenliittymis/pidentymisvaiheessa, on 15 kontrollikoeputken fluoresenssin näennäinen arvo on iA4.

Tämän jälkeen tälle syklille määritellään korjauskerroin ί0/ΪΑ4· Jokainen kustakin reaktiokoeputkesta saatu fluoresenssiarvo kerrotaan korjauskertoimella, millä saadaan varsinaiset fluoresenssiarvot. Edellä olevat 20 toimenpiteet toistetaan kunkin syklin omilla lähtötiedoilla. Tiivistetysti voidaan sanoa, että « · · • '.· korjauskerroin kuvataan tavallisesti muodossa Ϊο/Ϊαπ, jossa • t·’ · i0 on kontrollikoeputken f luoresenssiarvo reaktion alussa :*·*: ja iAn on kontrollikoeputken näennäinen f luoresenssiarvo, ··· 25 joka on otettu syklin numero n aikana. Kukin reaktiokoeputkelle saatu f luoresenssiarvo, joka on saatu käyttäen esimerkiksi laskemalla keskiarvon (tämä on tehty . . edellä kuvatulla tavalla), kerrotaan korjausarvolla. Edellä olevat toimenpiteet toistetaan kullekin sykleistä.

·;·’ 30 Normalisointia ja kvantitointia kuvataan sellaisten : : : koetulosten avulla, jotka on saatu tietystä esimerkki- tapauksesta, joka on tarkoitettu ainoastaan esimerkiksi.

Nämä koetulokset on kuvattu kuviossa 8A. On selvää, että ····, tämän keksinnön ei ole tarkoitus rajoittua PCR:ään tai 35 tiettyihin nimenomaisiin monistusreaktioseoksiin, monistusten lukumäärään, lämmityssykli-inkubointilaitteeseen, 109362 36 lämpötilaprofiiliin tai siihen aikaväliin, jolla fluoresenssikuvat otetaan, mikä on alan ammattikokemuksen perusteella selvää. Välttämätöntä on ainoastaan seurata sellaisia monistusreaktioseoksia, joissa reaktion 5 alkuvaiheessa on eri konsentraatioita tutkittavaa nukleiinihappojaksoa sen tutkittavan jakson konsentraation kvantitoimiseksi, joka esiintyy reaktion alkuvaiheessa monistusreaktioseoksessa, jossa tämä konsentraatio on alkuvaiheessa tuntematon, mitä on tarkasteltu yksityis-10 kohtaisemmin tuonnempana.

Kuviossa 8A on esitetty fluoresenssiarvoja, jotka on saatu kahdeksasta PCR-monistuksesta, joita on seurattu yhtäaikaisesti viidenkymmenenviiden lämmityssyklin ajan CCD-kameralla edellä kuvattujen periaatteiden mukaisesti.

15 Nämä arvot edustavat siten kustakin reaktiokoeputkesta saatuja arvoja (tähän on käytetty esimerkiksi keskiarvon laskemista vastaavista pikselimatriiseista) , jotka on korjattu niissä esiintyneiden määritysvaihtelujen suhteen (esimerkiksi ryöminnän suhteen) edellä kuvatulla tavalla.

20 Tässä esimerkkitapauksessa 7 reaktioseosta sisälsi .:.· tunnettuja konsentraatioita tiettyä tutkittavaa DNA-jaksoa • (toisin sanoen tunnettua määrää näytettä, jota oli lisätty . : : reaktioon sen alkuvaiheessa), minkä tarkoituksena oli tukea reaktion alussa esiintyvän tuntemattoman näytteen määrän 25 kvantitointia, mikä käy ilmi tuonnempana olevasta kuvauksesta. Kahdeksas seos ei sisältänyt ollenkaan tutkittavaa DNA:ta, ja tämä toimi taustainformaatiota . . antavana kontrollireaktiona. Tunnettua näytettä sisältävät ! * · ♦ seitsemän monistusta käynnistettiin käyttäen yksi-·;·’ 30 nauhaisesta HIV-templaatti-DNA: sta valmistettua laimen- : nossarjaa.

Ennen laimennosten tekoa valmistettiin PCR-reak-tioseoksia, joiden tilavuudet olivat 100 μΐ ja joiden • · ·

*···_ koostumus oli 10 mM Tris-HCl, pH 8,3; 50 mM KC1; 3 mM

35 MgCl2; 2,5 U:ta Taq-DNA-polymeraasia (Perkin Elmer, Norwalk, CT); 100-mikromolaarinen konsentraatio kutakin 109362 37 dNTP:tä (Promega Corp., Madison, WI); 4 pg etidiumbromidia (Bio Rad, Richmond, CA) millilitrassa; 100 pmol kutakin HIV:lie spesifistä (gag-alue) oligonukleotidialuketta SK145 ja SK431 (Perkin Elmer, Norwalk, CT) ja 300 ng istukasta 5 valmistettua humaani-DNA:ta (Sigma, St. Louis, MO). Tutkittavana nukleiinihappotemplaattina käytettiin HIV:n gag-alueen M13-jatkokloonia.

Lähtien 108 templaatista valmistettiin 102 temp-laattiin asti ulottuvia kymmenkertaisia laimennoksia, ja 10 näitä käytettiin HIV:lie spesifisten alukkeiden kanssa 142 ep:n suuruisen PCR-tuotteen valmistamiseen. Näistä lähtökonsentraatloista muodostuneet ja kuviossa 8A esitetyt fluoresenssiprofiilit on kussakin tapauksessa erikseen merkitty viitenumeroilla 108, 107 . . . 102. Seurattiin myös 15 kontrollimonistusta, joka oli jätetty ilman templaattia.

Tämän seoksen fluoresenssiprofiilia esittää viitenumerolla O merkitty viiva. Sellaisen PCR:ään perustuvan seu-lontakokeen simuloimiseksi, jossa lymfosyytin DNA:sta etsitään siihen liittyneitä HIV:n genomeja, sisälsivät 20 kaikki reaktiot 300 ng eli 40 000 solua vastaavan määrän ihmisen genomin DNA:ta.

• Lämmityssyklikäsittelyj ä suoritettiin 55 syklin . : : ajan GeneAmp PCR system 9000 thermal cycler -laitteessa :*·*: (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) , jossa oli kahden lämpöti- 25 lan ohjelma: 15 s 94 °C:ssa denaturointia varten; 30 s 68 °C:ssa yhteenliittymistä ja pidentymistä varten.

"Kuumakäynnistyksen", joka on tällä alalla tavanomainen . . keino spesifisyyden parantamiseksi reaktiossa (tämä tehtiin h/ julkaisussa Chou, Q., Russell, M., Birch, D.E., Raymond, J.

···’ 30 ja Bloch, W., "Prevention of pre-PCR mis-priming and primer : dimerization improves low-copy-number simplifications",

Nucleic Acids Research 20 (1992) 1717 - 1723, kuvatulla tavalla), aikaansaamiseksi meneteltiin niin, että 1 ···· reaktioseosta pidettiin käsittelyn alkuvaiheessa 75 °C:ssa, ‘ ‘ 35 jona aikana sitten, kun näytteet olivat saavuttaneet tämän lämpötilan, lisättiin MgCl2:ta (tämän tilavuus oli 12 μΐ) .

109362 38

Kutakin lämmityssykliä vastaavat fluoresenssikuvat otettiin CCD-kameralla kohdalla, joka sijaitsi 20 sekuntia 30 sekunnin mittaisen yhteenliittymislämpötilassa tehtävän käsittelyn aloituksesta käyttäen noin 1 sekunnin 5 valotusaikaa. Kuten edellä on kuvattu, ei lämmittimen kansiblokkia 27 käytetty ja se oli siirretty syrjään reaktiokoeputkien tieltä kuvantamisen mahdollistamiseksi.

Kuten kuviosta 8A käy ilmi, muuttuu kustakin reaktiosta peräisin oleva fluoresenssi ensimmäisiksi 10 tulevissa lämmityssykleissä vähäisesti ja se kohoaa sitten sitä mukaa kun näissä syntyy havaittavia määriä PCR-tuotetta. Mitä useampia kappaleita templaattia reaktion alussa on käytetty, sitä varhaisemmassa vaiheessa tällainen fluoresenssin kohoaminen tapahtuu. Tämä käy ilmi 15 esimerkiksi käyrästä, jota on merkitty merkinnällä 108, joka tarkoittaa sitä, että fluoresenssikäyrä vastaa sellaisesta reaktioseoksesta emittoitunutta fluoresenssia, jossa reaktio on käynnistetty lisäämällä reaktioon sen alussa suurin templaattikonsentraatio, toisin sanoen 108 20 templaattia. Kuten kuviosta 8A käy ilmi, nousee 108-käyrä odotetusti ensimmäisenä.

: ' : Eri monistuksista peräisin olevan fluoresenssin alkuarvoissa on kuitenkin huomattavaa vaihtelua, vaikka näiden arvojen olisi oltava samat. Niiden on oltava samat, ♦ · 25 koska yksinauhaisen DNA:n määrät ovat niin pieniä, että sen *·!’. vaihtelevilla määrillä reaktiokoeputkissa on niin pieni vaikutus yhdestä koeputkesta odotettuun kokonaisfluo-resenssiin, että se voidaan jättää huomioonottamatta. Tämän vaihtelun lähteiden arvellaan olevan valaistuksen 30 epähomogeenisuus tai epäyhtenäisyys, parallaksi ja : koeputkien tulpista johtuva fluoresenssin vaihteleva * * I » .·*·. vaimentuminen. Monistusten seuraaminen ilman tulppia *_ mineraaliöljystä tehdyn höyrystymisesteen tai ··- Ampliwax™-tuotenimellä myytävän suojakalvon läpi vähentää ’ 35 tätä vaihtelua mutta ei poista sitä kokonaan.

i i i j 109362 39

Sen epähomogeenisuuden ja siten kuviossa 8A esitettyjen vaihtelujen kompensoimiseksi, joka tulee valaistuksesta, parallaksista ja vaihtelevasta vaimentumisesta, prosessori määrittää kutakin monistusta koskevan 5 normalisointikertoimen. Kukin kerroin määritetään syklissä koottujen koetulosten perusteella ja se on kaikista reaktioista lasketun lähtöfluoresenssikeskiarvon suhde kunkin reaktion havaittuun lähtöfluoresenssiin. Prosessori kertoo kaikki kussakin monistuksessa saadut fluore-10 senssiarvot tätä vastaavalla normalisointikertoimella.

Tämän normalisoinnin tulos on esitetty kuviossa 8B. Siten sen reaktion ollessa kyseessä, joka oli sisältänyt reaktion alussa 108 kappaletta templaattia, on suhde (normalisointikerroin) syklissä 1 olevien kaikkien 15 kahdeksan fluoresenssiarvon summa jaettuna luvulla 85, joka on reaktion 108 alkufluoresenssiarvo, mikä käy ilmi kuviosta 8A. Merkinnällä 108 merkityn reaktion fluo-resenssiarvot kerrotaan sitten tällä kertoimella kuvion 8B mukaisen normalisoidun käyrän muodostamiseksi. Kukin käyrä 20 normalisoidaan samalla tavalla. Tämä normalisointi perustuu siihen oletukseen, että kuvan vaihtelujen perussyy heikentää tai voimistaa fluoresenssisignaalia samassa 'K. suhteessa kaikilla signaalivoimakkuuksilla.

Kuviossa 8B on alkufluoresenssin arvo kaikissa 25 reaktioissa olennaisesti sama ja suurin osa reak-tioprofiileista on säännönmukaisen välimatkan päässä ’·’ ’ toisistaan tulosten ollessa yhdenmukaiset käytettyjen laimennussarjojen suhteen. Profiilit ovat muodoltaan hyvin samanlaiset ja miltei yhdensuuntaiset. Tehokkaan PCR:n (t<: 30 varhainen eli logaritminen vaihe sisältää DNA: n : kappalelukumäärän kahdentumisen jokaisessa syklissä. Kunkin "'.’t lähtömateriaalina käytetyn templaatin kymmenkertaisen laimennuksen voidaan ennustaa tarvitsevan 3,32 uutta sykliä PCR-tuotteen saannon kohottamiseksi tiettyyn konsent-35 raatioon. Siten normalisoidut arvot vaikuttavat olevan odotuksen mukaisia suurimmalta osalta fluoresenssiarvojen 109362 40 aluetta. Kuviota 8B tutkimalla voidaan havaita, että lukuunottamatta niitä syklejä, joissa reaktion alussa oli käytetty 102 kappaletta ja O kappaletta, kukin laimennoksista eroaa toisistaan lähes kolmella syklillä. On 5 myös ilmeistä, että tämä syklien määrän siirtymä säilyy PCR-reaktioiden logaritmisen vaiheen ohi. Sitävastoin kuvion 8A mukaisissa normalisoimattomissa koetuloksissa olevia laimennoksia erottavien syklien lukumäärän vaihtelu on huomattavaa.

10 Normalisoituja fluoresenssikoetuloksia, kuten kuviossa 8B esitettyjä koetuloksia, käyttämällä voidaan tutkittavan nukleiinihapon määrä reaktion alussa kvantitoida tai eri reaktio-olosuhteiden vaikutus monistusreaktion kinetiikkaan voidaan analysoida.

15 Ensimmäiseksi tarkastellaan tutkittavan molekyylin määrän kvantitointia reaktion alussa. Kuviosta 9 käy ilmi se lineaarinen suhde, joka vallitsee reaktion alussa käytettävien templaattien lukumäärien logaritmin ja niiden syklien määrän välillä, joka tarvitaan kuviossa 8B kyseessä 20 olevaa monistamista varten siihen, että saavutetaan .·.· sattumanvaraisesti 190:n suuruiseksi valittu fluore- l ’ · senssitaso. Kuviossa 9 esitetty käyrä on regressiokäyrä, joka on sovitettu koetulospisteisiin, jotka ovat alueelta 108 - 103 kappaletta molekyylejä reaktion alussa (r2 >0,99).

• · * 2 25 Se koetuloksista, joka vastaa 10 kappaletta reaktion alussa, poikkeaa merkittävästi tästä käyrästä (O kappaletta ei voida esittää logaritmisessa kuvaajassa). 102 kappaleen , , kohdalla olevan koetulospisteen ohella on regressiokäyrästä '· '· eniten poikkeava koetulospiste arvon 105 kohdalla, josta on ··’ 30 ennustettavissa sovitetun käyrän yhtälöä käyttäen arvo, • joka 13 % pienempi kuin tunnettu kappaleiden lukumäärä

.··*. reaktion alussa. Tulokset ovat samanlaiset, jos kuviossa 8B

valittu fluoresenssitaso on mikä tahansa väliltä 125 - 225 valittu taso.

* 35 Syy poikkeavuuteen lineaarisuudesta 102 kappaletta

vastaavan koetulospisteen kohdalla käy ilmi kuviossa 8C

109362 41 esitettyjen monistustuotteiden geelielektroforeesiana-lyysista. Monistuksen spesifisyys on sellainen, että templaatin kappalemäärien ollessa alueella 108 - 105, on ainoa havaittavissa oleva tuote odotettua kokoa oleva 5 tuote. Kun reaktion alussa käytetään 104 kappaletta templaattia, tulee esiin pienempi epäspesifinen monistumistuote, joka on juuri ja juuri havaittavissa. Tätä tuotetta esiintyy huomattavampi määrä käytettäessä 103 kappaletta, ja käytettäessä 102 kappaletta valmistuu yhtä 10 suuret määrät epäspesifistä tuotetta ja HIV:lie spesifistä tuotetta. Kontrollissa, johon ei ole lisätty ollenkaan templaattia, valmistuu ainoastaan epäspesifistä tuotetta.

Koska spesifisestä tuotteesta johtuvaa fluoresenssia ei voida erottaa epäspesifisestä tuotteesta peräisin olevasta 15 fluoresenssista, on tämän määrityksen "perustaso" sen syklin järjestysnumeron kohdalla, johon mennessä syntetisoituu niin suuri määrä epäspesifistä tuotetta, että kaikella muulla spesifisen tuotteen synteesillä on pieni vaikutus reaktioprofiiliin. Koska konsentraatiomääritykset 20 perustuvat interpolointiin joukosta standardeja, toisin sanoen reaktion alussa lisättyä tutkittavaa nukle-:·.*. iinihappojaksoa sisältävistä reaktiokoeputkista, joiden ·:·, konsentraatio on tunnettu, tämä perustaso saattaakin olla # merkittävästi kauempana sijaitsevien syklien kohdalla kuin 25 sen syklin järjestysnumeron kohdalla, jonka kohdalla ·;;; poikkeaminen lineaarisuudesta alkaa. Käytännössä olemme * havainneet, että reaktioprofiilin vaihtelu näytteestä toiseen templaattien määrän ollessa alle 102 templaattia tekee toistettavan kvantitoinnin tämän määrän alapuolella * : 30 mutkikkaaksi (näitä koetuloksia ei ole esitetty).

; \· t Näytteessä reaktion alussa olevan tutkittavan »Il nukleiinihapon määrän kvantitoimiseksi käytetään ensimmäisenä vaiheena normalisoituja fluoresenssikoe-_ tuloksia joukosta standardeja sen suhteen määrittämiseksi, ·:*: 35 joka vallitsee reaktion alussa olevan tutkittavan nukleiinihapon määrän ja tämän laitteen havaitsemisrajan 109362 42 sisäpuolella olevan sattumanvaraisesti valitun fluore-senssitason saavuttamiseksi tarvittavien syklien lukumäärän (esimerkiksi kuviossa 9 esitetyn määrityksen mukainen määritys) välillä. Tämä sattumanvaraisesti valittu 5 fluoresenssiarvo (AFV) valitaan edullisesti sellaiselta reaktioprofiilin alueelta, jolla kuviota 8B tarkastellen profiilit ovat yhdensuuntaiset eri standardien kyseessä ollessa. Tämä pitää tavallisesti paikkansa, jos valittu AFV on 0,1 - 0,5 kertaa se maksimaalinen fluoresenssiarvo, joka 10 on saatu käyttäen standardia, johon on käytetty suurinta tunnettua tutkittavan nukleiinihapon konsentraatiota reaktion alussa.

Kun AFV on valittu, valitaan kutakin stan-dardimonistusta vastaava korjaus ja normalisoitu 15 fluoresenssi (fluor) -arvo, joka on lähinnä tätä AFV:tä.

Ottaen käyttöön tämä arvo ja ne fluoresenssiarvot, jotka vastaavat sen syklin neljää edeltävää sykliä ja neljää myöhempää sykliä, jonka kohdalla tämä arvo esiintyy, suoritetaan sovitus regressiokäyrään, joka esittää syklin 20 järjestysnumeron (joka voi olla murtoluku) suhdetta * fluoresenssiin. Tämän jälkeen AFV sijoitetaan tämän : ''1 regressiokäyrän yhtälöön ja tästä saadaan tätä standardinäytettä vastaava niiden syklien lukumäärän arvo, joka tarvitaan AFV:n saavuttamiseksi.

25 Kun kullekin standardille on tässä vaiheessa t’.·. määritetty AFV: n saavuttamiseen tarvittavien syklien I I t lukumäärä, sovitetaan regressiokäyrä koetuloksiin, jotka kuvaavat reaktion alussa olevan tutkittavan nukleiinihapon • · · ’· ’· määrän ja AFV:n saavuttamiseen tarvittavien syklien 30 lukumäärän välistä suhdetta. Nyt sitten yhdessä | standardinäytteiden kanssa monistetun sen tutkittavan • · · * nukleiinihapon määrän määrittämiseksi, joka tuntemattomassa •t näytteessä oli reaktion alussa, määritetään AFV:n ••d saavuttamiseen tarvittavien syklien lukumäärä menetellen * * 35 samoin kuin standardinäytteiden kyseessä ollessa. Tämä syklien lukumäärä (joka voi olla murtoluku) sijoitetaan 109362 43 sovitetun regressiokäyrän yhtälöön ja yhtälöstä saadaan arvo, joka on tuntemattomassa näytteessä oleva reaktion alussa esiintyvä tutkittavan nukleiinihapon määrä. Nämä toimenpiteet voidaan toistaa kunkin tuntemattoman näytteen 5 kyseessä ollessa. Nämä kuvatut koetulosten käsittelytoimenpiteet voidaan suorittaa vaivatta ja nopeasti käyttäen sopivalla tavalla ohjelmoitua mikroprosessoria.

Tätä nukleiinihappojen kvantitointitapaa voidaan käyttää ei ainoastaan käyttäen hyväksi fluoresenssia, joka 10 on peräisin väriaineista, joiden sitoutuminen ei ole sekvenssille spesifistä, vaan sitä voidaan myös käyttää sellaisen fluoresenssin yhteydessä, joka johtuu sellaisten oligonukleotidikoettimien sekvenssispesifisestä sitoutumisesta, kuten US-patenttijulkaisussa nro 5 210 015 15 kuvatuissa homogeenisissa monistus/havaitsemisjär jestelmissä käytetyt koettimet. Näillä koettimilla tarvitaan edellä olevassa patenttijulkaisussa esitetyn kuvauksen mukaan vaihtoehtoisia säteilylähteitä ja suotimia. Useiden sellaisten jaksospesifisten koettimien 20 käyttö, joissa kullakin on oma toisista poikkeava fluoresenssinsa, tekee mahdolliseksi useiden tutkittavien • nukleiinihappojaksojen havaitsemisen ja kvantitoinnin ·:*. samanaikaisesti yhdessä monistusreaktiossa.

Kuvioissa 10A - D tarkastellaan niiden vaikutusten \m 25 tutkimista, jotka eri reaktio-olosuhteilla on PCRrään.

Näitä vaikutuksia voidaan tavallisesti seurata lisäämällä, | *·’ vähentämällä tai muuttamalla normaaleja PCR:n komponentteja S ja tarkastelemalla muuttunutta reaktioprofiilia. Kuviossa 10A on esitetty Taq-DNA-polymeraasin titraus. Yhdeksän 30 rinnakkaista PCR:ää, jotka sisälsivät 108 tutkittavaa ; ,·. HIV-templaattia, käynnistettiin käyttäen tästä kuviosta * » » ilmenevällä alueella olevia Taq-polymeraasipitoisuuksia.

Niiden entsyymimäärien ollessa kyseessä, jotka ovat alueella 1-10 yksikköä reaktiota kohti, alkaa "·"· 35 fluoresenssi olla havaittavissa kaikissa reaktioissa suunnilleen saman syklin kohdalla. Tämä viittaa siihen, 109362 44 että nämä entsyymipitoisuuksien erot vaikuttavat vähän monistumisen tehokkuuteen varhaisissa toimintasykleissä.

Erot PCR-tuotteen pitoisuuksissa tulevat kuitenkin ilmi myöhemmissä sykleissä, niin että verrattaessa 10 yksikön 5 käyttöä yhden yksikön käyttöön on sykliin 50 mennessä valmistunut lähes kaksinkertainen määrä DNA:ta. Näistä reaktioista ei saatu geelielektroforeesilla todisteita epäspesifisen ei-HIVPCR-tuotteen muodostumisesta (nämä tulokset on jätetty esittämättä). Kun Taq-polymeraasia 10 käytetään ainoastaan 0,5 yksikköä, jää havaittava tuote äkillisesti puuttumaan. Koska PCR on tapahtumasarja, jossa DNA:n konsentraatio lisääntyy eksponentiaalisesti, ei ehkä ole hämmästyttävää, että entsyymillä on kynnystaso, jonka alapuolella monistumista ei ilmeisesti kykene tapahtumaan.

15 Voidaan myös seurata alukekonsentraatioiden muutosten vaikutusta monistuksen kinetiikkaan. Kuviossa 10B on esitetty HIV-templaattien havaitsemiseksi suoritettujen PCR-reaktioiden profiileja (ssDNA-molekyylien määrä reaktion alussa 108 kappaletta) käyttäen sellaisia 20 alukepitoisuuksia, jotka olivat alueella, joka alkoi 2-mikromolaarisesta pitoisuudesta (kutakin aluketta) ja • « · väheni 0,05-mikromolaariseen pitoisuuteen asti. Kussakin ··,·, PCR:ssä käytettiin vakiomäärää entsyymiä (2,5 U) . On i ♦ · .1^ huomattava, että alueella, jossa alukekonsentraatiot ovat « · ' ! 25 0,05 - 0,4 μΜ, nousee DNA-pitoisuus reaktiossa tiettyyn ♦ i · | "·; pitoisuuteen ja pysyy sitten vakiona. Jos nämä lopulliset ! · < · | '»* ' tuotteen pitoisuudet arvioidaan käyttäen kuviossa 4 olevia koetuloksia ja olettaen 142 ep:n suuruisen PCR-tuotteen •,’·* määräksi 10,6 pmol/pg, voidaan havaita, että kun alukkeen • : 30 konsentraatiot ovat 0,05, 0,10 ja 0,20 μΜ, niin näistä . ’.t valmistuu vastaavassa järjestyksessä ilmoitettuna tuotetta, « · · jonka konsentraatiot ovat 0,05, 0,10 ja 0,20 μΜ. Näissä *;* pitoisuuksissa alukkeen konsentraatio on ilmeisesti /1* rajoittava tekijä tuote-DNA:n saannolle. Sitävastoin ;'*i 35 silloin, kun alukkeen konsentraatio on 0,8 μΜ ja tätä suurempi, nousee DNA-pitoisuus jatkuvasti kunkin 109362 45 lärnmityssyklin ollessa kyseessä, kuten kuviossa 6Ά on asianlaita, ja alukkeen määrän suurentumisella on vähän vaikutusta profiiliin. Kuviossa 6A oleviin koetuloksiin verrattuna voidaan tehdä se johtopäätös, että näitä 5 reaktioita rajoittaa tässä vaiheessa entsyymi eikä aluke.

Kuviossa 10C on esitetty tulokset, jotka on saatu vaihtelemalla KCl-konsentraatiota käyttäen samaa HIV-testijärjestelmää, joka sisältämä alukepitoisuus oli 1 μΜ ja entsyymimäärä 2,5 U 100 pl:ssa reaktioseosta.

10 Taq-DNA-polymeraasiaktiivisuus inhiboituu voimakkaasti suurilla KClkonsentraatioilla. Tämän suhteen yhdenmukaisesti ei niissä KCl-konsentraatioissa, jotka ovat 125 mM tai tätä suurempia, ole lainkaan havaittavaa PCR-tuotetta. Käyttäen templaattina aktivoitua lohen maidin 15 DNA:ta on Taq-DNA-polymeraasiaktiivisuuden optimi alueella 50 - 90 mM KC1. Tämä määritys osoittaa, että tuotteen saanto on suurimmillaan, kun KCl:n konsentraatio on 50, 75 ja 100 mM, ja tästä määrästä valmistuu vain puolet, kun KCl-konsentraatio on 0 mM. On mahdollista, että tämä ero 20 johtuu pienestä ionivahvuudesta, jolla on alukkeen yhteenliittymistä destabiloiva vaikutus, vaikkakaan tämä ei • '· sovi yhteen sen havainnon kanssa, että ampilifioinnin tehokkuus KCl:n konsentraation ollessa 0 mM vaikuttaa |. olevan lähes sama kuin tehokkuudet 50 • · 25 100-millimolaarisessa KCl:ssa, mikä on havaittavissa vielä noin syklin 20 kohdalla. Tuotteen saanto pienenee vasta myöhemmissä sykleissä, mikä vastaa pienempää polymeraasipitoisuutta käytettäessä saatuja tuloksia, jotka '· ”· on esitetty kuviossa 6A. Jos alukkeen yhteenliittyminen .·.* 30 olisi destabiloitunut, voitaisiin monistumisen tehokkuuden • odottaa olevan pienentynyt kaikissa sykleissä.

I · * ·

Viimeiseksi lisättiin PCR-reaktioihin eri konsent- > ·

I I I

\ raatioita hematiinia, joka on tunnettu PCR:n inhibiittori.

« · · ·“> Hematiini lisättiin samaan HIV-testijärjestelmään kuin mitä : ‘ 35 oli käytetty edellä lukuunottamatta sitä, että käytetty alukekonsentraatio oli 0,2 μΜ. Kuten kuviosta 10D käy ilmi, 109362 46 ei O,2-mikromolaarisessa ja tätä suuremmissa hematiini-konsentraatioissa saatu havaittavaa DNA-tuotetta. Kon-sentraation ollessa 0,1 μΜ viivästyi tuotteen havaitseminen 3-4 syklillä, mikä viittaa siihen, että toisin kuin 5 O-millimolaarisella KCl:lla tai pienemmällä entsyymi-määrällä saatujen tulosten kyseessä ollessa, esiintyy sekä varhaisissa että myöhemmissä monistussykleissä monis-tustehokkuuteen heikentävästi vaikuttavia vaikutuksia. Tämä reaktioprofiileissa esiintyvä ero viittaa siihen, että 10 osittain inhiboituneet PCR-reaktiot voidaan erottaa inhiboitumattomista reaktioista.

Kuvioissa 11 - 13 on esitetty yksinkertaistetut vuokaaviot, jotka kuvaavat tämän keksinnön mukaisella laitteella suoritettavia vaiheita. Kuviossa 11 on kuvattu 15 fluoresenssiarvon saamiseen käytetyt päävaiheet, kun taas kuvioissa 12 - 13 on esitetty fluoresenssin keskiarvon laskemiseen ja normalisointiin käytetyt aliohjelmat.

Tarkasteltaessa kuviota 11 siinä on esitetty suorituksen aloittaminen ja syklin 1 fluoresenssiarvojen 20 laskutapa. Tämän jälkeen prosessori laskee kutakin näytettä ♦ ,1/ vastaavat normalisointikertoimet. Tämän jälkeen tässä '•'i syklissä olevaa kutakin arvoa vastaava fluoresenssiarvo /·’· normalisoidaan kertomalla kukin fluoresenssiarvo sitä * ;v. vastaavalla normalisointikertoimella. Prosessori tulostaa » » % i 25 sitten normalisoidut arvot ja ottaa seuraavan toiminta- « syklin fluoresenssiarvot. Tätä toistetaan niin kauan, I · 4 * kunnes kaikki fluoresenssikuvat on käsitelty.

Tarkasteltaessa kuviota 12, joka kuvaa sitä, miten * · » *· "· fluoresenssiarvot saadaan käyttöön, käynnistetään * i » 30 lämmityssykli-inkubointilaite ja virityssäteilylähteeseen j kytketään virta kameran ohjausyksikön jäädessä odottamaan >11 » laukaisusignaalia. Kun kameran ohjausyksikkö saa '·* ohjausprosessorista laukaisusignaalin, se lähettää * » · ...! signaalin kameralle kameran sulkimen avaamiseksi n:n » 35 sekunnin ajaksi, jona aikana kamera laskee yhteen pikselien arvot, jotka osoittavat sulkimen sulkemiseen mennessä 109362 47 tapahtunutta fluoresenssia. Analogikuva lähetetään kuvankäsittelyprosessorille, jossa kuvankäsittelyproses-sorin kuvaruudunsieppausohjelma digitoi kuvan. Tässä vaiheessa digitoitu kuva voidaan tallettaa sen myöhempää 5 käsittelyä varten tai se voidaan käsitellä tosiajassa. Viimeksi mainitussa tapauksessa kuvankäsittelyprosessori merkitsee ryhmän pikseleitä alueeksi, joka kattaa yhden reaktiokoeputken ja ottaa keskiarvon tällä alueella olevista kaikista arvoista yhden fluoresenssiarvon 10 aikaansaamiseksi, joka talletetaan. Prosessori toistaa näitä vaiheita siihen asti, kunnes kaikista tässä syklissä olevista reaktiokoeputkista on saatu yksi fluoresenssiarvo.

Tämän jälkeen prosessori tulostaa tätä sykliä vastaavat talletetut arvot. Tässä toimintasyklissä toistetaan sitten 15 edellä esitettyjä vaiheita. Kuvio 13 on aliohjelma kuviossa 11 kuvatulle normalisointikertoimen laskemisvaiheelle.

Ensin määritetään keskiarvo kaikista syklin 1 perusarvoista. Tämän jälkeen tämä keskiarvo jaetaan kullakin syklissä 1 olevalla fluoresenssiarvolla sen 20 kutakin monistusreaktioseosta koskevan normalisoin-tikertoimen laskemiseksi, jota sitten käytetään jäljellä * i · olevissa sykleissä. Vaikka vuokaaviot eivät sisällä syklien • · • ;'t välistä korjausta, myös tämä voidaan sisällyttää • « · .! . prosessoriin.

• * · • # * ; 25 Kuvioissa 14 ja 15 on esitetty vielä yksi i t · sovellutusmuoto laitteen 10 yhteydessä käytettävästä • « · V * virityssäteily- ja fluoresenssiemission vastaanotto- järjestelmästä. Tätä viritys- ja fluoresenssin vas- • · taanottojärjestelmää merkitään tavallisesti viitenumerolla 30 100 ja se käsittää tavallisesti kannen tai kotelon 102 . syvennysten 24 peittämiseksi valotiiviisti, lampun tai säteilylähteen 14' virityssäteilyn kohdistamiseksi *;·’ syvennyksiin asetettuihin reaktionäytteisiin, anturin tai *:* kameran 16a' reaktionäytteistä emittoituneen fluoresenssin ·;··: 35 havaitsemiseksi tai vastaanottamiseksi ja puoliläpäisevän peilin 104 virityssäteilyn ja fluoresenssiemissioiden 109362 48 erottamiseksi sillä tavoin, että kamera 16a' havaitsee olennaisesti ainoastaan nämä emissiot. Fluoresenssi tai monistamistulokset käsitellään edellä kuvatulla tavalla.

Kotelo tai kansi 102 on esitetty siinä muodossa, 5 että siinä on yläpuolinen seinämä 106, sivuseinämät 108, 110, etuseinämä 112 ja takaseinämä 114. Kansi tai kotelo 102 on sijoitettu lämmityssykli-inkubointilaitteen 12 yläpinnalle sillä tavoin, että kotelo sulkee sisäänsä lämmönvaihtimen 22 ja siten siihen tehdyt syvennykset 24, 10 jotka ovat kooltaan sellaiset, että niihin voidaan panna useita koeputkia 26, jotka on suunniteltu niihin lisättäviä nukleiinihappojen monistusnäytteitä varten. Tarkemmin sanottuna kotelo 102 on konstruoitu muodostamaan valotiivis kammio näytekoeputkiin 26 lisättyjä näytteitä sekä 15 valolähteen ja näytteiden ja anturin välisiä optisia teitä varten. Tämän mukaisesti kotelo on kiinnitetty lämpösykliinkubointilaitteeseen 12 valotiiviin yhteyden muodostamiseksi näiden välille. Lisäksi lukuunottamatta aukkoja 116 ja 118, jotka ovat muodoltaan sellaisia, että 20 valolähde tai lamppu 14' ja kameran 16a' linssi 120 sopivat :: niihin, ovat kannen tai kotelon seinämät rei'ittämättömät ja ne on tehty olennaisesti valoa läpäisemättömästä materiaalista. Lisäksi seinämät käsittävät edullisesti • · · :·.·. materiaalia, jonka lämmön johtokyky on suhteellisen pieni, 25 kuten muovia, lämmönsiirto-osasta 22 ja koeputkissa 26 *"! olevista näytteistä tapahtuvan lämmön siirtymisen • · · estämiseksi. Yksi kotelon seinämiin sopiva materiaali on polykarbonaatti.

’· Laitteessa käytetään mekanismia, jolla päästään * * · ’...· 30 käsiksi kotelon tai kannen 102 sisäosaan ja siten : lämmönvaihtimessa 22 oleviin näytteisiin. Kuvioiden 14 ja I i * · .···. 15 ollessa kyseessä voi etuseinämä 112 olla saranoitu '·' yläpuoliseen seinämään 106 saranalla 112 tällaisen käsiksipääsyn mahdollistamiseksi. Vaikkakin kotelosta on 35 kuvattu yksi nimenomainen konfiguraatio, on selvää, että muitakin konfiguraatioita voidaan käyttää valotiiviin 109362 49 kammion muodostamiseksi virityssäteilyn ja fluore-senssiemission valoteitä varten sekä koteloksi yksiköille, joita pidetään kotelossa 102 ja joita on kuvattu yksityiskohtaisemmin tuonnempana.

5 Lampun tai valonlähteen 14' konfiguraatio poikkeaa oleellisesti lampusta 14. Lamppuun 14' sisältyy kondensoiva heijastin tai kehys 14a' ja hehkulamppu tai hehkulanka 14b' säteilyn tuottamiseksi samalla tavoin kuin lampun 14 ollessa kyseessä tällä alalla tavanomaisella tavalla.

10 Lamppu 14' on valittu niin, että siitä saadaan sellaisella aallonpituudella olevaa säteilyä, joka vastaa sitä aallonpituutta, joka tarvitaan tutkittavassa näytteessä olevan fluoresoivan sitoutuvan aineen virittämiseen. Esimerkiksi käytettäessä etidiumbromidia fluoresoivana 15 sitoutuvana aineena, on säteilylähde 14' valittu edullisesti sillä tavoin, että se säteilee Um-säteilyä noin 302 nm: n aallonpituudella. Sopiva säteilylähde 302 nm: n (UV-) valon aikaansaamiseksi on saatavilla kaupallisesti yhtiöstä U.V. Products, Inc. (CA) mallinumerolla UVM-57 20 (302 nm) . On kuitenkin selvää, että etidiumbromidi voidaan : virittää noin 480 nm:n aallonpituudella sekä noin 302 nm:n :*·*: aallonpituudella. Lisäksi muita fluoroforeja, kuten muita DNA: ta sitovia väriaineita tai edellä kuvattuja homogeenisen 5' nukleaasimäärityksen koettimia, voidaan • t 25 virittää aallonpituuksilla, jotka eivät ole UV-alueella.

”j Siten toisena vaihtoehtona voidaan käyttää valonlähdettä, *’ ’ joka synnyttää 480 nm:n säteilyä. 480 nm:n aallonpituudella säteilevät valonlähteet tuottavat tavallisesti kuitenkin • · näkyvän valon spektrin. Tämän mukaisesti tällaista 30 valonlähdettä käytettäessä käytetään halutun 480 nm:n : .·. säteilyn aikaansaamiseksi suodinta. Tavallisesti voidaan ,·>·, käyttää mitä tahansa säteilylähdejärjestelmää, kunhan vain siitä saadaan reaktioseoksiin kohdistuvaa haluttua aallonpituutta. Esimerkkejä sopivista säteilylähteistä ovat 35 monokromaattorit ja laserit.

109362 50

Lamppu 14' on kiinnitetty koteloon 102 sillä tavoin, että virityssäteily tulee syvennysten 24 päälle keskitetystä aukosta 116, minkä tarkoituksena on minimoida epäyhtenäinen valonjakautuminen syvennysten päällä, ja se 5 kohdistuu kaikkiin syvennyksissä 24 oleviin näytteisiin. On selvää, että lamppu 14' voi sijaita muissakin paikoissa.

Lamppu 14' voidaan esimerkiksi sijoittaa kokonaan koteloon 102 ja aukko 116 jättää pois. Valoa säteilevä yksikkö, esimerkiksi hehkulamppu 14b, on kuitenkin edullisesti 10 yhdensuuntainen lämmönvaihtimen 22 yläpinnan suhteen ja keskitetty syvennysten yläpuolelle lämmönvaihtimen yläpuolella olevan valon jakautumisen yhtenäisyyden parantamiseksi edellä käsiteltyjen syiden perusteella. Jos haluttu aallonpituus muodostetaan suotimella, voidaan 15 suodin kiinnittää esimerkiksi koteloon aukon 116 kohdalle lampun ja syvennyksissä 24 olevien näytteiden väliselle optiselle tielle.

Puoliläpäisevä peili 104, joka on edullisesti pieniä aallonpituuksia läpäisevä puoliläpäisevä peili, 20 asetetaan välittömästi lämmönvaihtimen 22 yläpuolelle ja : : edullisesti noin 45° kulmassa sen sijoittamiseksi oikealla ·'·*: tavalla lampun 14' ja kameran 16a' suuntauksen suhteen.

·;·. Piirroksissa esitetyssä järjestelmässä on puoliläpäisevä peili 104 pieniä aallonpituuksia läpäisevä puoliläpäisevä ''.m 25 peili, joka on konstruoitu läpäisemään säteilyä tai läpinäkyväksi säteilylle, jonka aallonpituus vastaa ·* ' virityssäteilylähteestä 14' lähtevää säteilyä, ja heijastamaan säteilyä, jonka aallonpituus vastaa syvennyksissä 24 olevista näytteistä emittoituvaa säteilyä, 30 kun näitä säteilytetään virityssäteilyllä (tätä on : ,·. käsitelty kuviossa 15) . Puoliläpäisevän peilin läpäisy- ja hei j astusominaisuudet valitaan luonnollisesti tietyn 'Γ nimenomaisen sovellutuksen mukaan. Esimerkiksi käytettäessä fluoresoivana sitoutuvana aineena etidiumbromidia voi, 35 kuten edellä mainittiin, virityssäteilyn aallonpituus olla noin 302 tai 480 nm. Jommassakummassa tai molemmissa 109362 51 tapauksissa emissioaallonpituus on noin 600 nm. Puoliläpäisevä peili voidaan siten konstruoida sellaiseksi, että se läpäisee säteilyä, jonka aallonpituus on noin 302 tai 480 nm, tai sellaiseksi, että se läpäisee sekä noin 302 5 että noin 480 nanometrin aallonpituista säteilyä. Kummassakin tapauksessa puoliläpäisevä peili konstruoidaan sellaiseksi, että se heijastaa noin 600 nm:n aallonpituudella olevaa säteilyä. Kuvio 16 esittää käyrää, joka esittää läpäisevyyttä aallonpituuden funktiona ja joka 10 edustaa puoliläpäisevän peilin sopivia ominaisuuksia käytettäessä etidiumbromidia fluoresoivana sitoutuvana aineena. Tässä esimerkissä puoliläpäisevä peili läpäisee erittäin tehokkaasti säteilyä, jonka aallonpituus on alueella noin 300 - 510 nm (viimeksi mainittu aallonpituus 15 on leikkausaallonpituus) ja muuttuu sitten voimakkaasti heijastavaksi aallonpituuden lähestyessä arvoa 600. On myös huomattava, että puoliläpäisevää peiliä, jolla on kuviossa 16 kuvatut ominaisuudet, voidaan käyttää käytettäessä muita fluoresoivia sitoutuvia aineita, kuten fluoreskeiinia.

20 Fluoreskeiinin viritys- ja emissioaallonpituudet ovat noin 495 ja 522 nm, vastaavassa järjestyksessä ilmoitettuna. Läpäisevyyden ja heijastavuuden ollessa kyseessä on >:·, kuviossa 16 esitetty peili, joka kykenee läpäisemään noin • · · . 85 % virityssäteilyä heijastaen samalla 98 % emittoitunutta * ; 25 fluoresenssia kameraan 16a', tuottanut sopivia tuloksia • · « *;*j nukleiinihapon monistumisen havaitsemiseksi tämän keksinnön ‘ mukaisesti etidiumbromidia käyttäen.

Seuraavat yksityiskohdat on esitetty tämän * keksinnön kuvaamiseksi eikä niiden tarkoituksena ole • · 30 rajoittaa sitä. Sellaiset spesifikaatiot, jotka soveltuvat < * · . yhdelle puoliläpäisevälle peilille viritys- ja emissiosäteilyn erottamiseksi käytettäessä etidiumbromidia * » fluoresoivana sitoutuvana aineena, ovat: UV:tä läpäisevä ;;· 510 nm:n leikkausrajalla varustettu pieniä aallonpituuksia ·;**: 35 läpäisevä peili: läpäisevyys 300 - 500 nm:n alueella keskimäärin >80 % ja 300 nm: n aallonpituudella 109362 52 absoluuttisesti >65 %; heijastavuus 525 - 610 nm:n aallonpituudella absoluuttisesti >90 %; kova heijastava oksidipintapäällystys; alusta - Corning 7940 sulatettu kvartsi; ja hionta 0,010 x 45° kaikissa reunoissa. Sopivien 5 puoliläpäisevien peilien valmistajiin kuuluvat Omega Optical, Inc. (VT) ja Janos Optical, Inc. (VT).

Vaikkakin tässä keksinnössä on kuvattu pieniä aallonpituuksia läpäisevä järjestelmä, voidaan vaihtoehtoisesti käyttää suuria aallonpituuksia läpäisevää 10 puoliläpäisevää peiliä. Tällaista suuria aallonpituuksia läpäisevää puoliläpäisevää peiliä käytettäessä on lampun 14' ja kameran 16a' sijainti käänteinen, kuten alan ammattikokemuksen perusteella on selvää.

Palaten kuvioissa 14 ja 15 esitetyn sovellu-15 tusmuodon osien järjestämiseen, on puoliläpäisevä peili 104 saranoitu kiinni ripaan tai ulokkeeseen 126 saranalla 128, jotta peili voidaan kääntää syrjään, jotta näin menetellen päästään käsiksi lämmönvaihtimeen 22. Ripa tai uloke 126 työntyy esiin yläseinämästä 106 ja se on konstruoitu siten, 20 että se estää tai minimoi valolähteestä 14' tulevan valon kulkeutumisen saranan 128 kautta kameran 16a suuntaan.

I · · jV. Valolähteen peittolevyä, joka on esitetty kaaviona :*. kuviossa 15, jossa sille on annettu viitenumero 124, • · · käytetään tämän edullisen sovellutusmuodon mukaan ! 25 rajoittamaan reaktionäytteiden altistumista viritysvalolle.

"" Kuviossa 15 olevan kaavion mukaisesti voidaan peittolevy ’** * 124 kiinnittää sen syrjään työntämisen mahdollistavalla i i tavalla yläseinämään 106 sen työntämiseksi ensimmäisestä ·,’·· asemasta (tämä on esitetty yhtäjaksoisella viivalla) , jossa ' 30 aukko 116 jää avoimeksi, toiseen asemaan (tämä on esitetty : ’·, pilkkuviivalla) , jossa se peittää aukon 116. Peittolevy ’I.V voidaan saattaa jousen avulla pysymään kiinnipitoasennossa V ja käyttää solenoidia työntämään se aukipitoasentoon tällä alalla tavanomaisella tavalla. Peittolevy voidaan saattaa *:1 : 35 avautumaan ohjauksen alaisuudessa PCR:n aikana ainoastaan kunkin syklin yhteenliittymis/pidentymisvaiheen aikana, 53 109362 toisin sanoen silloin, kun fluoresenssin oletetaan olevan maksimaalinen. Tällä tavoin peittolevy parantaa systeemin tehokkuutta lisäämällä näytteiden pysyvyyttä. Koska tässä sovellutusmuodossa lamppu on lähempänä reaktionäytteitä, on 5 näytteisiin kohdistuva virityssäteily voimakkuudeltaan suhteellisen suuri, mikä voi aiheuttaa näytteiden pilkkoutumista tai valodeaktivoitumista, joka tunnetaan toisella nimityksellä "haalistuminen" ("bleaching").

Peittolevy minimoi näytteen säteilylle altistumisen keston 10 ja siten eliminoi haalistumisongelman tai pienentää sitä merkittävästi. Vaikkakin peittolevy on esitetty liitetyksi koteloon 102, se voidaan liittää lamppuun 14', joka on asetettu suoraan lämpöä johtavan blokin, ja siten näytteiden, yläpuolelle tai jollakin muulla tavalla 15 säännöstelemään näytteiden altistumista virityssäteilylle.

Voidaan myös käyttää muita mekanismeja tällaisen altistumisen säännöstelemiseksi tai ajoittamiseksi.

Kameran 16a' linssin 120 ja puoliläpäisevän peilin 104 välissä on etulinssi eli tasokupera linssi 130.

20 Etulinssi 130 poikkeuttaa peilistä 104 heijastuneet säteet .·. sisäänpäin, jotta olennaisesti kaikki näytteistä ja • · · lämmönvaihtimesta 22 peräisin oleva emittoitunut fluoresenssi suuntautuu linssiä 120 kohti. Etulinssi 130 on • · · .!. kiinnitetty siirtämisen mahdollistavalla tavalla koteloon ’ ; 25 102, jotta sitä voidaan siirtää linssiä 120 kohti tai tästä >·! poispäin näytteistä tulevien emissioiden aallonpituuden · mukaan, mikä on selvää alan ammattikokemuksen perusteella.

Kameraan voidaan kiinnittää yksi suodin tai useita : suotimia, kuten suodinkiekko, jotta tulisi mahdolliseksi ·*”; 30 havaita pelkästään tietty(j)ä aallonpituutta (ksia) .

. Tarkasteltaessa kuviota 15 siinä on esitetty suodinkiekko 132 yhdistettynä linssiin 120 tällä alalla tavanomaisella t · tavalla, jotta useiden leimojen tai tutkittavien ’!’ molekyylien havaitseminen tai seuraaminen kävisi *;··· 35 mahdolliseksi. Toisin sanoen havaitsemisen rajoittamiseksi halutulle aallonpituudelle voidaan näitä suotimia vaihtaa 109362 54 toisiinsa kiekkoa pyörittämällä. Vaihe, jossa suodinten | vaihto toisiinsa suoritetaan, voi sovellutuksen mukaan olla j | kunkin yhteenliittymis/pidentymisvaiheen aikana tai j ennakolta valittujen syklien määrän jälkeen. Vaihto- ! 5 ehtoisesti ajatellaan käytettäväksi kameraa, joka erottaa toisistaan aallonpituuksia, kuten spektrikuvantamislaitetta (spectral imager).

Kuviossa 15 on laitteessa edullisesti käytettävä lämmitettävä läpinäkyvä tai säteilyä läpäisevä ikkuna tai 10 osa 134 lämmityssyklien käytön aikana vallitsevien olosuhteiden parantamiseksi. Osan 134 on oltava läpäisykyvyltään ainakin sitä luokkaa, että näytteiden virittyminen ja sen synnyttämän fluoresenssin havaitseminen tapahtuvat tehokkaasti. Lämmitysosa eli ikkuna 134 voi 15 käsittää esimerkiksi kvartsia ja se voidaan sijoittaa j reaktiokoeputkien 26 päälle tai hieman näiden yläpuolelle.

Lämmitysosaa 134 käytetään tavallisesti ylläpitämään reaktioseosten lämmityssyklien lämpötilaprofiilit ennal laan, jotta ne voivat noudattaa ennakolta valittuja 20 profiileja mahdollisimman tarkasti, sekä minimoimaan j refluksoitumisen. Lämmitysosa pidetään edullisesti alueella 95 - 100 °C olevassa lämpötilassa ja se lämpötila on *..! edullisesti noin 100 °C. Tämä tarkoittaa sitä, että ikkunaa .! . pidetään edullisesti denaturaatiolämpötilaa vastaavassa • 25 lämpötilassa. Osaa 134 voidaan lämmittää esimerkiksi ···· krominikkelilangalla tai muilla tavanomaiseen käytäntöön ·.· · kuuluvilla lämmitysyksiköillä.

Kuviossa 17 on esitetty lämmitysosa, jossa : lämmitysyksikkönä on käytetty krominikkelilankaa. On myös ·"; 30 huomattava, että vaikkakin lämmitysyksikön 134 on esitetty . ’. peittävän lämmönvaihtimen, jossa on ainoastaan 9 II· syvennystä, tämä on tehty ainoastaan piirroksen yksinkertaistamiseksi. Krominikkelilanka 136 voidaan ’·* sijoittaa osan 134 sisään tai kiinnittää sen pintaan. Lanka *;··· 35 on asetettu edullisesti sillä tavoin, että se ei joudu lämmönvaihtimessa olevien syvennysten 24 päälle eikä siten 55 109362 muodosta viritysja emissiosäteilyn optisille teille osuvaa estettä. Lanka on myös yhdistetty tavanomaiseen lämmön-säätimeen 138, joka pitää yksikön 134 lämpötilan halutussa lämpötilassa.

5 Laitteessa käytetään edullisesti prosessoriin kytkettyä näyttöä koetulosten esittämiseksi, joista käy ilmi tutkittavan jakson esiintyminen sekä sen konsentraatio. Lisäksi monistusten jatkuvan seurannan ollessa kyseessä (tätä on tarkasteltu edellä) keino 10 havaittujen monistumisten esittämiseksi voidaan esittää monistusten ollessa käynnissä. Tämä mahdollistaa lämmityssyklien käsittelyaikojen lyhentämisen. Mikäli se johtopäätös, että reaktioseos sisältää tutkittavan jakson, voidaan tehdä suhteellisen varhaisessa vaiheessa, voidaan 15 näyte poistaa ja toinen näyte lisätä sen tilalle. Tämä lisää siten läpimenoa. Tämä on erityisen edullista silloin, kun jopa 96 kuoppaa sisältävään lämmönvaihtimeen on lisätty erilaisia reaktioseoksia (esimerkiksi toiset näistä geneettisen sairauden tutkimiseksi ja toiset HIV:n 20 tutkimiseksi ja niin edelleen) tai silloin, kun seokset ;*· lisätään eri aikoina.

:v. Edellinen esitys on yksityiskohtainen selitys tämän ·;·, keksinnön mukaisesta tietystä nimenomaisesta sovellu- • •t.f tusmuodosta. On selvää, että keksinnön suoj apiiristä i 25 poikkeamatta selitetystä sovellutusmuodosta voidaan poiketa I *;;; eri tavoin ja että siihen on tehtävissä alan '·’ ammattikokemuksen perusteella selviä muutoksia. Tämän : keksinnön koko suojapiiri on esitetty seuraavissa * · 1 patenttivaatimuksissa ja niiden vastineissa. Tämän

Iti *iit: 30 mukaisesti patenttivaatimusten ja patenttiselitysten ei ole ; katsottava kaventavan sitä täydellistä suojapiiriä, johon f * » tämä keksintö on oikeutettu.

i * »

» * » I

I t t I I * »

Claims (6)

109362 Paten ttivaatimukset

1. Laite useiden nukleiinihappomonistusten seuraamiseksi samanaikaisesti, tunnettu siitä, että se 5 käsittää: lämmityssykli-inkubointilaitteen (12), joka sisältää lämpöä johtavan osan, jossa on useita siihen tehtyjä syvennyksiä; säteilylähteen (14), joka on yhdistetty optisesti 10 lämmityssykli-inkubointilaitteeseen ja suunniteltu jakamaan säteily lukuisiin syvennyksiin lämpöä johtavassa osassa; ja anturin (16) , joka on suunniteltu havaitsemaan samanaikaisesti lukuisista syvennyksistä emittoituvaa sätei- 15 lyä, jolloin anturi (16) sisältää CCD-kameran.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen laite, tunnettu siitä, että se lisäksi käsittää keinon kutakin I säteilyä emittoivaa syvennystä koskevan keskiarvon laske miseksi anturin havaitsemasta säteilystä.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen laite, tun nettu siitä, että se lisäksi käsittää a) keinon lämpöä johtavan osan lämpötilan muuttamiseen toimintasyklin aikana sellaisen ennakolta valitun i lämpötila-aika-profiilin mukaan, joka koskee useita sykle- • 25 jä; . : : b) useita nukleiinihappojen monistusreaktioseoksia, joista kukin seos käsittää fluoresoivan sitoutuvan aineen, • * ja on sijoitettu yhteen syvennyksistä, jotka kussakin tapa- t · * * uksessa ovat eri syvennyksiä; • · · 30 ja siitä, että . . säteilylähteestä saadaan olennaisesti tasainen sä- teilyvuo lukuisiin reaktioseoksiin; ··* ja anturi on yhdistetty optisesti lukuisiin reak- :tioseoksiin kustakin lukuisista reaktioseoksista emit- » 1 » ♦ 35 toidun fluoresenssin havaitsemiseksi samanaikaisesti. » · i 109362

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen laite, tunnettu siitä, että lämmityssykli-inkubointilaitteen lämpöä johtavan osan syvennykset on tehty sen pinnan läpi niin, että nukleiinihappojen monistusreaktioseoksia sisäl-5 tävät reaktioastiat voidaan sijoittaa niihin; ja siitä, että mainittu anturi on kuvantamislaite, joka on yhdistetty optisesti lämpöä johtavaan osaan kuvan muodostamiseksi pinnasta ja reaktioastioista silloin, kun astiat on sijoitettu lämpöä johtavan osan syvennyksiin.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen laite, tunnettu siitä, että lämmityssykli-inkubointilaitteen lämpöä johtavassa osassa on siihen tehtyjä useita syvennyksiä ja se on tehty sellaiseksi, että siihen voidaan sijoittaa nukleiinihappojen monistusreaktioseoksia, ja siitä, et-15 tä mainittu laite lisäksi käsittää kotelon, joka on asetettu lämpöä johtavan osan ylä-I puolelle ja liitetty lämmityssykli-inkubointilaitteeseen; säteilylähteen, joka on suunniteltu lähettämään säteilyä kotelossa ja suuntaamaan sen lukuisiin syven-20 nyksiin; ja puoliläpäisevän peilin, joka on sijoitettu koteloon ja optisesti yhdistetty säteilylähteeseen ja lukuisiin syvennyksiin, ja puoliläpäisevä peili läpäisee säteilyä, jol-la on ensimmäinen etukäteen määrätty aallonpituus, ja hei-25 jastaa säteilyä, jolla on toinen etukäteen määrätty aallon-/·’: pituus, joka eroaa ensimmäisestä etukäteen määrätystä aal- lonpituudesta; ja anturi on optisesti yhdistetty puoliläpäisevään '!!! peiliin ja suunniteltu havaitsemaan samanaikaisesti lukui- 30 sista syvennyksistä lähetettyä säteilyä. _

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen laite, t u n - ! '· n e t t u siitä, että lämmityssykli-inkubointilaitteessa olevassa lämpöä johtavassa osassa on siihen tehtyjä useita : .·. syvennyksiä vastaanottamaan nukleiinihappojen monistusreak- ,···, 35 tioseoksia, jotka sisältävät nukleiinihappo jakson ja fluo- '·* resoivaa sitoutuvaa yhdistettä, ja siitä, että mainittu 109362 ! 58 j laite lisäksi käsittää kotelon, joka on asetettu lämpöä johtavan osan yläpuolelle ja liitetty lämmityssykli-inku-bointilaitteeseen; säteilylähteen, joka on suunniteltu lähettämään säteilyä kotelossa; anturin, joka on sijoitettu 5 koteloon; ja puoliläpäisevän peilin, joka on sijoitettu koteloon ja syvennysten yläpuolelle, ja puoliläpäisevä peili läpäisee säteilyä, jonka aallonpituus vastaa säteilylähteen j | muodostaman säteilyn aallonpituutta, ja heijastaa säteilyä, i ! jonka aallonpituus vastaa sellaisesta nukleiinihappojen mo- 10 nistusseoksesta emittoituvan fluoresenssin aallonpituutta, joka sisältää fluoresoivaa sitoutuvaa yhdistettä, kun seos on sijoitettu yhteen lämpöä johtavaan osaan tehdyistä syvennyksistä ja siihen on kohdistettu säteilylähteestä tulevaa säteilyä, ja peili on suunnattu niin, että se muodostaa 15 optisen tien syvennysten ja anturin välille. 109362