CN118103522A - 可温度选择的fret盒信号传导 - Google Patents
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Abstract
一种多重化核酸扩增和检测系统，所述多重化核酸扩增和检测系统可用于仅使用核酸分析仪的单个荧光检测通道以温度依赖性方式检测多个特定核酸序列或单核苷酸多态性(即，“SNP”)的存在。可以使用配备用于荧光检测或监测的标准PCR仪器进行所述技术。
Description
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2021年9月30日提交的美国临时申请号63/250,894的权益。将此在先申请的全部公开内容通过引用特此并入。
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技术领域
本公开文本总体上涉及生物技术领域。更具体地，本公开文本涉及用于使用侵入性切割反应和单个荧光检测通道检测和区分不同分析物核酸的组合物、方法、试剂盒和系统。
背景技术
核酸的定量在生物学和医学领域发挥着重要作用。例如，核酸的定量被用于癌症的诊断和预后，以及由细菌、真菌和病毒病原体引起的感染性疾病的诊断和监测。
在单个反应混合物中检测多种核酸分析物具有很大的价值。事实上，所谓的“多重”检测大大提高了核酸测定的价值，同时降低了相关试剂成本。然而，不同的测定形式在不同程度上适应多重化能力，这意味着存在实际的权衡。例如，下一代测序技术允许获取大量信息，但所述技术在技术上非常具有挑战性并且通常需要高度专业化的设备。另一种被称为“侵入性切割测定”的技术允许核酸序列检测达到单核苷酸差异(“SNP”)的水平，并且已经与一些多重测定形式联合使用。
例如，Hall等人在美国专利5,994,069中描述了两种可与侵入性切割检测方法联合使用的多重化方法。首先，特定靶序列(或内部对照)的存在可以被设计为以荧光能量转移形式触发与不同可检测部分(如不同染料)偶联的不同级联。可以统计每个特定靶序列对最终产物的贡献，从而允许定量检测核酸序列混合物中包含的不同核酸序列。在第二种配置中，希望确定样品中是否存在几种分析物中的任何一种，但不需要知道每种分析物的确切身份。例如，在血库中，希望知道血液样品中是否存在多种感染原中的任何一种。因为无论存在哪种感染原，血液都会被丢弃，所以在这种应用中不需要由不同的探针产生不同的信号，并且出于保密的原因实际上可能是不希望的。因此，当不需要或不希望在分析物之间进行区分时，可以使用单个可检测标记。
在其他地方，Peterson等人在公开的美国专利申请2018/0163259A1中描述了通过在不同温度和不同时间进行二级侵入性切割反应来检测不同的核酸分析物。在此处，第一次二级侵入性切割反应在第二次二级侵入性切割反应开始前完成。通过在不同温度下在不同时间进行反应，可以在单个多重反应中区分核酸分析物。
使用不同的测定形式，Kozlov等人在美国专利号11,034,997中指示了用于使用标记的水解探针进行多重化实时PCR以检测和定量靶核酸的方法。因为具有5'到3'外切核酸酶活性的聚合酶切割标签部分并水解探针的剩余部分，所以单个探针切割事件在PCR反应的每个循环中发生。当标签包含与探针的退火部分上的淬灭剂分离的荧光团时，可以产生荧光信号。与和靶核酸杂交的寡核苷酸探针缔合的荧光标记可以在引物延伸(即，聚合)反应的一个循环期间从随后被降解的探针的靶标互补部分切割。因此，渐增信号强度取决于进行另外的PCR反应循环。同样，Kozlov等人教导，“淬灭分子”(例如，寡核苷酸)在用于在PCR的引物延伸反应中延伸引物的温度下与未切割的水解探针的标签部分杂交。在PCR反应中的引物延伸循环之前，荧光被连接到探针的退火部分和淬灭分子的淬灭剂部分淬灭。
尽管现有的核酸多重检测平台可用，但仍然需要能够容易地适应自动化测试平台的另外的方法。更特别地，需要在不需要硬件改变的情况下使采用的测试仪器的检测能力最大化。
发明内容
本文提供了以下编号的实施方案。
实施方案1是一种包含FRET盒报告系统的组合物，所述组合物包含：(i)5'瓣FRET盒寡核苷酸，其包含：含有第一荧光团部分的5'瓣部分、含有第一淬灭剂部分的茎环部分和含有切割的瓣杂交序列的3'部分，其中与所述5'瓣FRET盒寡核苷酸的所述切割的瓣杂交序列互补的盒特异性侵入性寡核苷酸的杂交形成在所述第一荧光团部分与所述第一淬灭剂部分之间的切割位点处可被FEN-1核酸内切酶切割的侵入性切割结构，其中在所述切割位点处切割所述5'瓣FRET盒寡核苷酸产生包含所述5'瓣部分和所述第一荧光团部分的盒切割的瓣；以及(ii)包含第二淬灭剂部分的掩蔽寡核苷酸，其中所述掩蔽寡核苷酸的至少一部分可与所述FRET盒寡核苷酸的所述5'瓣部分特异性杂交，其中所述掩蔽寡核苷酸与所述盒切割的瓣的杂交形成具有展现出第一解链峰的第一解链温度的双链体，并且其中来自所述双链体中的所述第一荧光团部分的荧光发射被所述第二淬灭剂部分淬灭。
实施方案2是根据实施方案1所述的组合物，其中所述第一淬灭剂部分和所述第二淬灭剂部分彼此相同。
实施方案3是根据实施方案1或实施方案2所述的组合物，所述组合物进一步包含FEN-1核酸内切酶。
实施方案4是根据实施方案3所述的组合物，其中所述FEN-1核酸内切酶是热稳定的FEN-1核酸内切酶。
实施方案5是根据实施方案4所述的组合物，其中所述热稳定的FEN-1核酸内切酶来自古生菌生物体。
实施方案6是根据实施方案1至5中任一项所述的组合物，所述组合物进一步包含第一靶标特异性侵入性寡核苷酸和第一靶标特异性初级探针寡核苷酸，其中所述第一靶标特异性侵入性寡核苷酸和所述第一靶标特异性初级探针寡核苷酸中的每一个包含这样的序列，所述序列被配置成与靶核酸杂交以形成可被FEN-1核酸内切酶切割从而产生初级切割的瓣的侵入性切割结构序列，并且其中所述初级切割的瓣是盒特异性侵入性寡核苷酸，其被配置成与所述5'瓣FRET盒寡核苷酸的所述切割的瓣杂交序列杂交以形成可被所述FEN-1核酸内切酶切割的侵入性切割结构。
实施方案7是根据实施方案6所述的组合物，所述组合物进一步包含所述靶核酸。
实施方案8是根据实施方案7所述的组合物，所述组合物进一步包含脱氧核苷三磷酸(dNTP)、热稳定的DNA聚合酶、以及具有能够由所述热稳定的DNA聚合酶在模板依赖性核酸扩增反应中使用所述靶核酸作为模板来延伸的3'端的引物。
实施方案9是根据实施方案1至8中任一项所述的组合物，所述组合物进一步包含：(iii)第二FRET盒寡核苷酸，其包含含有第二荧光团部分的5'部分、含有第三淬灭剂部分的茎环部分、以及含有第二切割的瓣杂交序列的3'部分，其中第二盒特异性侵入性寡核苷酸与所述第二FRET盒寡核苷酸的所述第二切割的瓣杂交序列的杂交形成在所述第二荧光团部分与所述第三淬灭剂部分之间的切割位点处可被FEN-1核酸内切酶切割的侵入性切割结构，并且其中在所述切割位点处切割所述第二FRET盒寡核苷酸产生包含所述第二荧光团部分的盒切割产物。
实施方案10是根据实施方案9所述的组合物，其中所述第二FRET盒寡核苷酸是包含5'瓣部分的第二5'瓣FRET盒，其中所述盒切割产物是包含所述第二荧光团的第二盒切割的瓣，并且其中所述组合物进一步包含：(iv)含有第四淬灭剂部分的第二掩蔽寡核苷酸，其中所述第二掩蔽寡核苷酸的至少一部分可与所述第二FRET盒寡核苷酸的所述5'瓣部分特异性杂交，其中所述第二掩蔽寡核苷酸与所述第二盒切割的瓣的杂交形成具有高于所述第一解链温度的第二解链温度的第二双链体，并且其中来自所述第二双链体中的所述第二荧光团部分的荧光发射被所述第四淬灭剂部分淬灭。
实施方案11是根据实施方案9所述的组合物，其中所述第二盒切割产物包含不多于5个、优选地不多于4个、优选地不多于3个、优选地不多于2个核苷酸。
实施方案12是根据实施方案9至11中任一项所述的组合物，其中来自所述第一荧光团部分和所述第二荧光团部分的发射信号在荧光监测设备的相同荧光检测通道中是可检测的。
实施方案13是根据实施方案9至12中任一项所述的组合物，其中所述第一荧光团部分和所述第二荧光团部分彼此相同。
实施方案14是根据实施方案9至12中任一项所述的组合物，其中所述第一荧光团部分和所述第二荧光团部分彼此不同。
实施方案15是根据实施方案10和12至14中任一项所述的组合物，其中所述第三淬灭剂部分和所述第四淬灭剂部分彼此相同。
实施方案16是一种确定反应混合物中两个不同FRET盒中哪一个被切割以产生荧光信号的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在所述反应混合物中进行多重侵入性切割反应以切割第一FRET盒和第二FRET盒中的一个或两个，从而如果发生切割则产生两种不同的荧光切割产物，所述第一FRET盒包含具有附接到其上的荧光团的第一5'瓣部分，所述荧光团的附接被布置成使得在所述多重侵入性切割反应中FEN-1核酸内切酶对所述第一FRET盒的切割产生包含所述荧光团的第一盒切割的瓣，所述反应混合物包含第一掩蔽寡核苷酸，所述第一掩蔽寡核苷酸在低于第一Tm的温度下与所述第一盒切割的瓣稳定杂交以形成第一双链体，但在高于所述第一Tm的温度下并非如此，其中来自所述第一双链体的所述第一盒切割的瓣的荧光团的荧光发射被淬灭，并且在所述多重侵入性切割反应中产生的两种不同的荧光切割产物中的每一种的特征在于所述反应混合物中不同的温度依赖性荧光淬灭谱；(b)在差异地淬灭由所述多重侵入性切割反应的不同荧光切割产物产生的荧光的温度条件下，使用荧光监测设备的单个通道测量在所述反应混合物中产生的荧光信号；以及(c)根据步骤(b)的结果确定不同FRET盒中的哪一个在所述多重侵入性切割反应中被切割。
实施方案17是根据实施方案16所述的方法，其中步骤(a)中的所述第二FRET盒如果被切割则产生荧光切割产物，所述荧光切割产物不与所述反应混合物中的任何掩蔽寡核苷酸杂交以导致荧光淬灭。
实施方案18是根据实施方案17所述的方法，其中步骤(c)包括比较在低于所述第一Tm的温度和高于所述第一Tm的温度下测量的荧光信号。
实施方案19是根据实施方案18所述的方法，其中步骤(c)包括通过计算测量的荧光信号之间的差异来比较荧光信号。
实施方案20是根据实施方案17所述的方法，其中步骤(b)包括在低于所述第一Tm的温度下测量任何所述荧光信号，其中来自所述第一双链体的所述第一盒切割的瓣的荧光团的荧光发射被淬灭，并且其中步骤(c)包括如果在步骤(b)中检测到可测量的荧光，则确定所述第二FRET盒在所述反应混合物中被切割。
实施方案21是根据实施方案17所述的方法，其中步骤(b)包括在低于所述第一Tm的温度和高于所述第一Tm的温度中的每一个温度下测量任何所述荧光信号，并且其中步骤(c)包括如果在高于所述第一Tm的温度下测量的荧光信号大于在低于所述第一Tm的温度下测量的荧光信号，则确定所述第一FRET盒在所述反应混合物中被切割。
实施方案22是根据实施方案16至21中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括测量在所述反应混合物中产生的随温度变化的任何所述荧光信号，以产生解链/退火曲线。
实施方案23是根据实施方案22所述的方法，其中步骤(c)包括计算所述解链/退火曲线的导数，然后根据所计算的导数确定所述反应混合物是否包含以所述第一Tm为特征的所述第一双链体作为所述第一FRET盒在所述反应混合物中被切割的指示。
实施方案24是根据实施方案16所述的方法，其中所述第二FRET盒包含具有附接到其上的荧光团的第二5'瓣序列，所述荧光团的附接被布置成使得在所述多重侵入性切割反应中所述FEN-1核酸内切酶对所述第二FRET盒的切割产生包含所述荧光团的第二盒切割的瓣，其中所述反应混合物包含第二掩蔽寡核苷酸，所述第二掩蔽寡核苷酸在低于第二Tm的温度下与所述第二盒切割的瓣杂交以形成第二双链体，但在高于所述第二Tm的温度下并非如此，其中来自所述第二双链体的所述第二盒切割的瓣的荧光团的荧光发射被淬灭，并且其中所述第一Tm与所述第二Tm相差至少5℃。
实施方案25是根据实施方案24所述的方法，其中所述第一Tm大于所述第二Tm，其中步骤(b)包括在低于所述第二Tm的温度和高于所述第一Tm的温度下测量任何所述荧光信号，并且其中步骤(c)包括如果在高于所述第一Tm的温度下测量的荧光信号大于在低于所述第二Tm的温度下测量的荧光信号，则确定所述第一FRET盒和所述第二FRET盒中的至少一个在所述反应混合物中被切割。
实施方案26是根据实施方案24或25所述的方法，其中步骤(b)包括测量在所述反应混合物中产生的随温度变化的任何所述荧光信号，以产生解链/退火曲线。
实施方案27是根据实施方案26所述的方法，其中步骤(c)包括计算所述解链/退火曲线的导数，然后根据所计算的导数确定所述反应混合物是否包含以所述第一Tm为特征的所述第一双链体作为所述第一FRET盒在所述反应混合物中被切割的指示。
实施方案28是根据实施方案26所述的方法，其中步骤(c)包括计算所述解链/退火曲线的导数，然后根据所计算的导数确定所述反应混合物是否包含以所述第二Tm为特征的所述第二双链体作为所述第二FRET盒在所述反应混合物中被切割的指示。
实施方案29是根据实施方案16至28中任一项所述的方法，其中所述第一FRET盒和所述第二FRET盒用相同的荧光团标记。
实施方案30是根据实施方案16至28中任一项所述的方法，其中所述第一FRET盒和所述第二FRET盒不用相同的荧光团标记。
实施方案31是根据实施方案16至30中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的所述多重侵入性切割反应的所述FEN-1核酸内切酶包括热稳定的FEN-1核酸内切酶。
实施方案32是实施方案16至31中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括利用用软件编程的计算机进行确定。
实施方案33是一种分析包含靶核酸的样品的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在反应混合物中，使所述样品的任何第一靶核酸与包含与其互补的序列的第一初级探针寡核苷酸和FEN-1核酸内切酶在这样的条件下接触，所述条件使得如果所述第一初级探针寡核苷酸与所述第一靶核酸杂交，则所述第一初级探针被所述FEN-1核酸内切酶切割以产生第一初级切割的瓣，其中所述第一初级切割的瓣与包含在所述反应混合物中的第一FRET盒寡核苷酸的切割的瓣杂交序列杂交以形成侵入性切割结构，所述侵入性切割结构在所述第一FRET盒寡核苷酸的第一荧光团部分与第一淬灭剂部分之间的切割位点处被所述FEN-1核酸内切酶切割以释放包含所述第一荧光团部分的第一盒切割的瓣，其中包含第二淬灭剂部分的第一掩蔽寡核苷酸在低于所述第一掩蔽寡核苷酸和所述第一盒切割的瓣的第一Tm的温度下与所述第一盒切割的瓣杂交以形成双链体，其中来自所述双链体中的所述第一荧光团部分的荧光发射被所述第二淬灭剂部分淬灭，并且其中在高于所述第一Tm的第二温度下，所述第一掩蔽寡核苷酸和所述第一盒切割的瓣不形成稳定的双链体；(b)在所述第二温度下检测从所述第一荧光团部分发射的任何荧光；以及(c)如果在步骤(b)中检测到从所述第一荧光团部分发射的荧光，则确定所述样品包含所述第一靶核酸，或如果在步骤(b)中未检测到从所述第一荧光团部分发射的荧光，则确定所述样品不包含所述第一靶核酸。
实施方案34是根据实施方案33所述的方法，其中步骤(a)进一步包括在所述反应混合物中使所述样品的任何第二靶核酸与包含与其互补的序列的第二初级探针寡核苷酸和所述FEN-1核酸内切酶在这样的条件下接触，所述条件使得如果所述第二初级探针寡核苷酸与所述第二靶核酸杂交，则所述第二初级探针被所述FEN-1核酸内切酶切割以产生不同于所述第一初级切割的瓣的第二初级切割的瓣，其中所述第二初级切割的瓣与包含在所述反应混合物中的第二FRET盒寡核苷酸的切割的瓣杂交序列杂交以形成侵入性切割结构，所述侵入性切割结构在所述第二FRET盒寡核苷酸的第二荧光团部分与第三淬灭剂部分之间的切割位点处被所述FEN-1核酸内切酶切割以释放包含所述第二荧光团部分的第二盒切割的瓣，其中在低于第二Tm的第三温度下，包含第四淬灭剂部分的第二掩蔽寡核苷酸与所述第二盒切割的瓣杂交以形成双链体，其中来自所述双链体的所述第二荧光团部分的荧光发射被所述第四淬灭剂部分淬灭，其中在高于所述第二Tm的第四温度下，所述第二掩蔽寡核苷酸和所述第二盒切割的瓣不形成稳定的双链体，并且其中所述第一Tm与所述第二Tm彼此相差至少5℃；其中步骤(b)进一步包括在所述第四温度下检测从所述第二荧光团部分发射的任何荧光；并且其中步骤(c)进一步包括如果在步骤(b)中检测到从所述第二FRET盒寡核苷酸的5'瓣切割产物的所述第二荧光团部分发射的荧光，则确定所述样品包含所述第二靶核酸，或如果在步骤(b)中未检测到从所述第二FRET盒寡核苷酸的5'瓣切割产物的所述第二荧光团部分发射的荧光，则确定所述样品不包含所述第一靶核酸。
实施方案35是根据实施方案33所述的方法，其中步骤(a)进一步包括在所述反应混合物中使所述样品的任何第二靶核酸与包含与其互补的序列的第二初级探针寡核苷酸和所述FEN-1核酸内切酶在这样的条件下接触，所述条件使得如果所述第二初级探针寡核苷酸与所述第二靶核酸杂交，则所述第二初级探针被所述FEN-1核酸内切酶切割以产生第二初级切割的瓣，其中所述第二初级切割的瓣与包含在所述反应混合物中的第二FRET盒寡核苷酸的切割的瓣杂交序列杂交以形成侵入性切割结构，所述侵入性切割结构在所述第二FRET盒寡核苷酸的第二荧光团部分与第三淬灭剂部分之间的切割位点处被所述FEN-1核酸内切酶切割以释放包含所述第二荧光团部分的切割产物，其中所述切割产物不与所述反应混合物中的任何掩蔽寡核苷酸杂交以导致荧光淬灭；其中步骤(b)进一步包括检测从所述切割产物的所述第二荧光团部分发射的任何荧光；并且其中步骤(c)进一步包括如果在步骤(b)中检测到从所述第二荧光团部分发射的荧光，则确定所述样品包含所述第二靶核酸，或如果在步骤(b)中未检测到从所述第二荧光团部分发射的荧光，则确定所述样品不包含所述第一靶核酸。
实施方案36是根据实施方案34或实施方案35所述的方法，其中步骤(b)包括用荧光监测装置的单个通道检测从所述第一荧光团部分和所述第二荧光团部分发射的任何荧光。
实施方案37是根据实施方案36所述的方法，其中在所述反应混合物中发生核酸扩增反应的同时进行步骤(b)，并且其中所述核酸扩增反应的产物包含所述第一靶核酸和所述第二靶核酸。
实施方案38是根据实施方案37所述的方法，其中所述核酸扩增反应包括热循环步骤，并且其中所述反应混合物进一步包含热稳定的DNA聚合酶。
实施方案39是根据实施方案33至36中任一项所述的方法，其中在所述反应混合物的温度降低以允许掩蔽寡核苷酸和互补盒切割的瓣退火时进行步骤(b)。
实施方案40是根据实施方案36所述的方法，其中所述第一荧光团部分和所述第二荧光团部分彼此相同。
实施方案41是根据实施方案36所述的方法，其中检测任何荧光的步骤(b)包括测量任何荧光。
实施方案42是根据实施方案41所述的方法，所述方法进一步包括在所述第一温度下检测或测量荧光的步骤。
实施方案43是根据实施方案34或35中任一项所述的方法，其中所述第一荧光团部分和所述第二荧光团部分二者在能量传感器装置的相同荧光检测通道中都是可检测的。
实施方案44是根据实施方案43所述的方法，其中所述第二荧光团部分与所述第一荧光团部分相同。
实施方案45是根据实施方案43所述的方法，其中所述第二荧光团部分与所述第一荧光团部分不同。
实施方案46是根据实施方案33至43中任一项所述的方法，其中在所述第一温度下检测和/或测量来自所述第二荧光团的荧光。
实施方案47是根据实施方案33至44中任一项所述的方法，其中所述第三淬灭剂部分与所述第一淬灭剂部分和/或所述第二淬灭剂部分相同。
实施方案48是根据实施方案33至47中任一项所述的方法，其中所述反应混合物包含扩增靶核酸的引物寡核苷酸，其中至少一种引物寡核苷酸在初级探针寡核苷酸和靶核酸和/或靶扩增子的存在下充当侵入性寡核苷酸，以形成被所述热稳定的FEN-1核酸内切酶切割的侵入性切割结构。
实施方案49是实施方案33至48中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括利用用软件编程的计算机进行确定。
实施方案50是一种用于确定多种靶核酸分析物中的哪一种存在于反应混合物中的系统，其中所述多种靶核酸分析物中的每一种靶核酸分析物可通过荧光信号检测，所述系统包含：热循环仪；与所述热循环仪光通信的荧光计，其中所述荧光计用单个光通道测量指示通过所述热循环仪实现的核酸扩增产物产生的荧光信号；和与所述荧光计通信的计算机，其中所述计算机用软件指令编程，使得所述计算机：(a)获得根据由所述荧光计进行的测量得到的解链/退火曲线数据集，(b)通过在所述反应混合物中的荧光被最大化淬灭的温度下检测到所述解链/退火曲线数据集中来自第一荧光切割产物的荧光信号，确定所述反应混合物中存在第一靶核酸，(c)根据所述解链/退火曲线数据集得到导数图，以及(d)如果所述导数图包含第一双链体特有的特征，则确定所述反应混合物中存在第二靶核酸，其中所述第一双链体包含第一掩蔽寡核苷酸以及当所述第二靶核酸存在时在所述反应混合物中产生的第二荧光切割产物。
实施方案51是根据实施方案50所述的系统，其中所述计算机进一步用软件指令编程，使得所述计算机：(e)如果所述导数图包含第二双链体特有的特征，则确定所述反应混合物中存在第三靶核酸，其中所述第二双链体包含第二掩蔽寡核苷酸以及当所述第三靶核酸存在时在所述反应混合物中产生的第三荧光切割产物。
实施方案52是根据实施方案50或实施方案51所述的系统，其中所述第一双链体特有的特征包括计算的导数的最大值、最小值或过零点。
实施方案53是根据实施方案52所述的系统，其中所计算的导数包括计算的一阶导数，其中所述第一双链体特有的特征包括所述解链/退火曲线数据集的计算的一阶导数的第一最大值作为第一解链峰，并且其中所述第二双链体特有的特征包括所述解链/退火曲线数据集的所述计算的一阶导数的第二最大值作为第二解链峰。
实施方案54是根据实施方案50至53中任一项所述的系统，其中所述热循环仪、所述荧光计和所述计算机都是实时PCR仪器的组件。
实施方案55是根据实施方案50所述的系统，其中由所述计算机获得的所述解链/退火曲线数据集包含指示随温度变化的荧光的数据点。
附图说明
图1提供了采用在相同反应混合物中以连续方式进行的两种侵入性切割反应的测定的示意图。在初级反应中，“侵入性寡核苷酸”(SEQ ID NO:1)和“初级探针寡核苷酸”(SEQID NO:2)(即，5'瓣寡核苷酸)与“靶链”核酸(SEQ ID NO:3)杂交，以形成可被FEN-1核酸内切酶切割从而释放切割的5'瓣(“初级切割的瓣”)(SEQ ID NO:4)的侵入性切割结构。在二级反应中，来自初级反应的初级切割的瓣与FRET盒(“FRET盒1”)(SEQ ID NO:5)(用荧光染料和淬灭剂分子标记的发夹寡核苷酸)杂交，以形成可被FEN-1核酸内切酶在荧光团(显示为“HEX”)与淬灭剂(“Q”)之间的位点处切割的第二侵入性切割结构。“FRET盒1”(SEQ IDNO:5)的切割产生“切割的FRET盒1”(SEQ ID NO:6)，并将淬灭剂与荧光团分离，从而可以检测到来自荧光团的荧光信号。每个初级切割的瓣可以与一系列新的未切割的FRET盒杂交，以形成另外的荧光切割产物。
图2呈现了展示5'瓣FRET盒的结构和用途的一系列示意图。图2A呈现了示例“5'瓣FRET盒”(SEQ ID NO:7)的结构。图2B呈现了与“来自初级探针的切割的瓣”(SEQ ID NO:8)(即，用作侵入性寡核苷酸的初级切割的瓣)杂交的示例“5'瓣FRET盒1”(SEQ ID NO:7)。图2C展示了“盒切割的瓣”(SEQ ID NO:9)(即，从5'瓣FRET盒切割的5'瓣)与互补的“掩蔽寡核苷酸”(SEQ ID NO:10)之间的温度依赖性相互作用。
图3示意性地展示了如何可以通过温度依赖性淬灭来区分通过切割三种不同的FRET盒(“无瓣FRET盒”(SEQ ID NO:11)；“5'瓣FRET盒1”(SEQ ID NO:7)；和“5'瓣FRET盒2”(SEQ ID NO:13))产生的荧光信号。“来自靶标2初级探针的切割的瓣”(SEQ ID NO:8)与“5'瓣FRET盒1”(SEQ ID NO:7)杂交以促进酶依赖性切割反应。“盒切割的瓣1”(SEQ ID NO:9)或从“5'瓣FRET盒1”(SEQ ID NO:7)切割的5'瓣可以与“掩蔽寡核苷酸1”(SEQ ID NO:10)杂交，以形成展现出淬灭荧光的第一杂交双链体。“来自靶标3初级探针的切割的瓣”(SEQ IDNO:14)与“5'瓣FRET盒2”(SEQ ID NO:13)杂交以促进酶依赖性切割反应。“盒切割的瓣2”(SEQ ID NO:15)或从“5'瓣FRET盒2”(SEQ ID NO:13)切割的5'瓣可以与“掩蔽寡核苷酸2”(SEQ ID NO:16)杂交，以形成展现出淬灭荧光的第二双链体。这两种杂交双链体被设计成具有独特的解链/退火特性，这允许将一种杂交双链体与另一种区分开来。通过切割“无瓣FRET盒”(SEQ ID NO:11)产生的信号在所有温度条件下都是可检测的。
图4是使用无瓣FRET盒和两种不同的5'瓣FRET盒制备的切割产物的示意图，其中所有三个FRET盒都被用相同的报告染料(HEX)标记。不同的FRET盒允许仅使用核酸分析仪的单个荧光检测通道来检测不同的核酸靶序列。在所展示的实施方案中，温度1低于温度2(例如，温度1可以是40℃，并且温度2可以是50℃)。使用不具有对应的掩蔽寡核苷酸的无瓣FRET盒(例如，来自图3的SEQ ID NO:11)进行靶标1的检测，使得来自靶标1的信号在所有温度下都是可检测的。用产生“盒切割的瓣1”(SEQ ID NO:9)的5'瓣FRET盒(例如，来自图3的SEQ ID NO:7)进行靶标2的检测，当反应混合物低于温度1时，所述“盒切割的瓣1”(SEQ IDNO:9)通过与“掩蔽寡核苷酸1”(SEQ ID NO:10)杂交被掩蔽。在高于温度1但低于温度2时，可以检测到反映靶标1和靶标2二者的检测的信号。用产生“盒切割的瓣2”(SEQ ID NO:15)的5'瓣FRET盒(例如，来自图3的SEQ ID NO:13)进行靶标3的检测，当反应混合物低于温度2时，所述“盒切割的瓣2”(SEQ ID NO:15)通过与“掩蔽寡核苷酸1”(SEQ ID NO:16)杂交被掩蔽。在高于温度2时，来自靶标1、2和3中的所有三个的信号都是可检测的。在所展示的实施方案中，选择用于检测不同FRET盒的切割的温度与三种不同靶核酸的序列无关。
图5提供了显示在HEX通道中测量的随循环数变化的荧光的一组图。反应包含靶分析物A(图5A)、靶分析物B(图5B)或同时包含靶分析物A和B(图5C)，如实施例1所述。
图6提供了显示如实施例2所述对于含有靶分析物A、靶分析物B以及同时含有靶分析物A和B的反应，使用在HEX通道中检测到的荧光进行的解链曲线分析的图。
图7A-图7D提供了显示在HEX通道中测量的随循环数和进行荧光测量的温度变化的荧光的一组图。图7A和图7B显示了分别在63℃和39℃下测量荧光时获得的对于仅包含靶分析物B的反应(使用5'瓣FRET盒和在低温下淬灭的掩蔽寡核苷酸)的结果。图7C和图7D显示了获得的对于同时包含靶分析物A和B的反应的结果，其中使用无瓣FRET盒(不包含5'瓣)检测分析物A并且所述反应产生在两种温度下都能发出荧光的产物，其中分别在63℃和39℃下测量荧光。程序描述于实施例3中。
图8提供了显示如实施例4所述在HEX通道中对于含有靶分析物A、靶分析物B、靶分析物C和所有三种靶分析物的组合的反应检测到的解链曲线分析的图。
图9提供了显示如实施例4所述对于另外的分析物组合观察到的独特解链/退火曲线谱的图。图的左小图显示了对于扩增分析物B或分析物C的反应的解链/退火曲线结果。图的右小图显示了对于扩增单独的分析物B、单独的分析物C或分析物B和分析物C的组合的反应的解链/退火曲线分析结果。
图10提供了图9的两个小图中所示的测量的荧光数据的一阶导数图。
定义
为了便于理解本公开文本，下面定义了许多术语和短语。在整个具体实施方式中阐述了另外的定义。在整个说明书和权利要求中，除非上下文另有明确规定，否则以下术语具有在本文中明确相关的含义。
如本文所用，短语“在一个实施方案中”不一定指相同的实施方案，尽管它可以。此外，如本文所用，短语“在另一个实施方案中”不一定指不同的实施方案，尽管它可以。因此，如下所述，在不脱离本技术的范围或精神的情况下，可以容易地组合本技术的各种实施方案。
除非上下文另有明确规定，否则术语“基于”不是排他性的，并且允许基于未描述的另外因素。此外，在整个说明书中，“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述”的含义包括复数指示物。“在……中(in)”的含义包括“在……中(in)”和“在……上(on)”。
如在本申请中的权利要求中使用的过渡短语“基本上由……组成”将权利要求的范围限制为特定的材料或步骤“以及那些不会实质性影响所要求保护的发明的一种或多种基本和新颖特征的材料或步骤”，如In re Herz,537F.2d 549,551-52,190USPQ 461,463(CCPA 1976)中所讨论的。例如，“基本上由所述要素组成”的组合物可能含有未被说明的污染物，所述污染物的水平使得虽然存在污染物，但与纯组合物(即，“由所述组分组成”的组合物)相比，污染物不会改变所述组合物的功能。如本文所用，术语“样品”是指可能含有相关分析物(例如，微生物、病毒、核酸如基因、或其组分，其包括分析物中的核酸序列或源自分析物的核酸序列)的样本。样品可以来自任何来源，如生物样本或环境来源。生物样本包括源自活的或死的生物体的任何组织或材料，其可能含有分析物或分析物中的核酸或源自分析物的核酸。生物样品的例子包括：鼻拭子样品、阴道拭子样品、呼吸组织、渗出物(例如，支气管肺泡灌洗液)、活检、痰、外周血、血浆、血清、淋巴结、胃肠道组织、粪便、尿液、或其他液体、组织或材料。环境样品的例子包括水、冰、土壤、泥浆、碎片、生物膜、空气中的颗粒物和气溶胶。样品可以是经过处理的样本或材料，如通过使用过滤、离心、沉积或粘附于介质(如基质或支持物)来处理样品而获得的。样品的其他处理可以包括物理或机械破坏组织、细胞聚集体或细胞的处理，以将包括核酸的细胞内组分释放到可能含有其他组分(如酶、缓冲液、盐、去污剂等)的溶液中。正在测试是否存在分析物的样品有时可以称为“测试样品”。
术语“靶核酸”和“靶序列”是指待检测或分析的核酸。因此，试图将“靶”核酸与其他核酸或核酸序列区分开来。例如，当用于提及扩增反应时，这些术语可以指将被反应扩增的核酸或核酸的一部分，当用于提及多态性时，它们可以指疑似多态性的核酸中的基因座。当用于提及侵入性切割反应时，这些术语通常是指含有与第一核酸分子(例如，探针寡核苷酸)和第二核酸分子(侵入性寡核苷酸)选择性地杂交以形成重叠的侵入性切割结构的序列的核酸分子。通常，靶核酸(例如，存在于样品内、从样品中分离、富集或扩增)位于靶区域内，并且可经由与可被切割剂切割的第一和第二核酸分子(例如，探针寡核苷酸和侵入性寡核苷酸)组合的侵入性切割结构的成功形成来识别。来自生物体的靶核酸不限于基因组DNA和RNA。来自生物体的靶核酸可以包括任何核酸种类，包括但不限于基因组DNA和RNA、信使RNA、结构RNA、核糖体和tRNA、以及小RNA(如snRNA、siRNA和微RNA(miRNA))。参见例如，美国专利号7,851,150，将其通过引用以其整体并入本文。“区段”被定义为靶序列内的核酸区域。
因为单核苷酸以某种方式反应制备寡核苷酸，使得与一个单核苷酸戊糖环相连的5'磷酸经由磷酸二酯连接在一个方向上附接至其邻近者的3'氧，所以如果其5'磷酸不与单核苷酸戊糖环的3'氧连接，则寡核苷酸的一端被称为“5'端”，如果其3'氧不与后续单核苷酸戊糖环的5'磷酸连接，则称为“3'端”。如本文所用，核酸序列，即使在较大寡核苷酸内部，也可以说具有5'和3'端。如果当沿着5'到3'方向的核酸链移动时第一区域的3'端在第二区域的5'端之前，则沿着核酸链的第一区域被称为在另一区域的上游。
如本文所用，术语“5'末端部分”是指具有5'末端(即5'端，其5'磷酸不与单核苷酸戊糖环的3'氧连接)的核酸的一部分。术语“3'末端部分”是指具有3'末端(即3'端，其3'氧不与后面的单核苷酸戊糖环的5'磷酸连接)的核酸的一部分。
如本文所用，术语“杂交(hybridization)”或“杂交(hybridize)”(以及语法等同词)用于指互补核酸的配对。杂交和杂交强度(即参与双链体的核酸链之间缔合的强度)受到如核酸之间的互补程度、所涉及的条件的严格性、所形成的杂交体的Tm和核酸内的G:C比例等因素的影响。
当两个不同的非重叠寡核苷酸退火至相同线性互补核酸的不同区域，并且一个寡核苷酸的3'端与另一个寡核苷酸的5'端邻近时，前者可称为“上游”寡核苷酸，后者称为“下游”寡核苷酸。类似地，当两个重叠的寡核苷酸与相同线性互补核酸杂交时，第一寡核苷酸的位置使其5'端位于第二寡核苷酸的5'端的上游并且第一寡核苷酸的3'端位于第二寡核苷酸的3'端的上游，则第一寡核苷酸可称为“上游”寡核苷酸并且第二寡核苷酸可称为“下游”寡核苷酸。
如本文所用，术语“Tm”用于指核酸链关于互补核酸链的“解链温度”。核酸双链体的解链温度是双链核酸分子群被一半地解离成单链的温度。测量经标记的核酸双链体的解链温度通常包括绘制荧光随温度变化的图以产生具有双链体解离特征的解链曲线。当解链曲线的负一阶导数被绘制为随温度变化时，Tm可被识别为峰。参见例如，KM Ririe等人,Analytical Biochemistry 245:154-160(1997)。
“计算的Tm”是指通过根据互补核酸的物理序列以及反应条件的因素(例如，盐浓度、混合物中互补链的浓度)进行计算而确定的解链温度。用于计算核酸的Tm的几个方程是本领域熟知的。如标准参考文献所示，当核酸在1M NaCl的水溶液中时，Tm值的简单估算可以通过以下方程计算：Tm＝81.5+0.41(G+C％)(参见例如，Young和Anderson,(1985)Nucleic Acid Hybridisation:A Practical Approach(Hames和Higgins编辑)第47-71页,IRL Press,Oxford)。用于计算Tm的其他计算是本领域已知的，并且考虑结构和环境以及序列特征(参见例如，Allawi,H.T.和SantaLucia,J.,Jr.Biochemistry 36,10581-94(1997))；和SantaLucia,Proc Natl Acad Sci U S A.,95(4):1460(1998))。
如本文所用，术语“循环杂交”是指这样的情况，其中在杂交核酸链(例如，探针寡核苷酸及其互补靶核酸)的Tm下或接近Tm下(例如，在Tm的4℃内、更优选地在Tm的3℃内、仍更优选地在Tm的2℃内以及又仍更优选地在Tm的1℃内)孵育包含核酸的反应混合物，使得寡核苷酸在没有温度循环的情况下不断地退火以及从靶链解离(即不改变反应混合物的温度以可替代地使探针-靶核酸双链体解链和退火)。
如本文所用，“侵入性切割测定”是通过酶切一种或多种不同的侵入性切割结构来检测或定量靶核酸的方法，其中至少一种切割结构包括FRET盒。在优选的实施方案中，侵入性切割测定将两种侵入性信号扩增反应(例如，“初级反应”和“二级反应”)串联组合在单个反应混合物中。用于侵入性切割测定的试剂可以包括：结构特异性5'核酸酶(例如，FEN-1核酸内切酶)、“侵入性寡核苷酸”、“初级探针”和“FRET盒”。
如本文所用，术语“INVADER测定”是指结构特异性瓣状核酸内切酶切割测定(Hologic,Inc.)，并且描述于例如美国专利号5,846,717；5,985,557；5,994,069；6,001,567；6,090,543；6,872,816；7,935,800；9,133,503；9,096,893，Lyamichev等人,Nat.Biotech.,17:292(1999)，Hall等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97:8272(2000)，Allawi等人,RNA(2004),10:1153–1161(2004)，出于所有目的，将其各自通过引用以其整体并入本文。
如本文所用，术语“侵入性切割结构”(有时简称为“切割结构”)是指重叠的核酸双链体结构，其是用于通过瓣状核酸内切酶(例如，FEN-1核酸内切酶)切割的底物。由酶催化的切割反应不需要任何核酸链的延伸。在一些实施方案中，侵入性切割结构包括：(i)连续核酸链(例如，靶DNA或RNA)；(ii)与靶链的第一部分杂交以形成上游双链体的上游核酸(例如，侵入性寡核苷酸，有时称为INVADER寡核苷酸)；和(iii)杂交以形成下游双链体的下游核酸(例如，5'瓣探针，或具有与靶链不互补的5'瓣的初级探针寡核苷酸)。上游和下游核酸退火至靶核酸的连续区域，并且其中在上游核酸的3'部分与在下游核酸与靶核酸之间形成的双链体之间形成重叠。无论上游核酸的一个或多个重叠碱基是否与靶核酸互补，并且无论这些碱基是天然碱基还是非天然碱基，当来自上游核酸和下游核酸的一个或多个碱基相对于靶核酸碱基占据相同位置时，重叠发生。在一些实施方案中，与下游双链体重叠的上游核酸的3'部分是非碱基化学部分，如芳香环结构(例如，如美国专利号6,090,543中所披露的，将其通过引用以其整体并入本文)。在一些实施方案中，一种或多种核酸可以通过共价连接(如核酸茎环)或通过非核酸化学连接(例如，多碳链)彼此附接。当切割的5'瓣与FRET盒杂交时(例如，其中“靶核酸”和“下游核酸”以茎环配置共价连接)，也会产生侵入性切割结构。与切割的5'瓣杂交的FRET盒的“靶核酸”序列可称为“切割的瓣杂交序列”。
在一些实施方案中，靶核酸被扩增(例如，通过PCR)，并且在扩增反应发生时使用侵入性切割测定检测扩增产物。配置用于执行检测测定(例如，侵入性切割测定)与扩增测定组合的测定描述于美国专利号9,096,893，出于所有目的，将其通过引用以其整体并入本文。在另外的实施方案中，可以在单个反应中使用侵入性切割测定逆转录、扩增和检测RNA靶核酸，如WO 2006/050499所述，出于所有目的，将其通过引用以其整体并入本文。
如本文所用，术语“探针寡核苷酸”是指与靶核酸相互作用形成可检测复合物的寡核苷酸。在一些实施方案中，探针与靶标之间的复合物在其存在时被检测到。在其他实施方案中，当复合物不再存在时，可以检测复合物的形成(例如，通过检测作为探针/靶复合物形成的结果而发生的事件，如切割事件)。
如本文所用，术语“瓣探针”是指探针寡核苷酸，其包含与靶核酸特异性杂交的靶标特异性部分和不与靶核酸杂交的5'瓣部分。通常，5'瓣部分与靶核酸中在靶核酸与瓣探针的靶标特异性部分之间形成的双链体邻近的区域不互补。
如本文在提及一系列侵入性切割测定时所使用的，“初级探针”是包含与待检测的靶核酸互补的3'序列或部分和与靶核酸不互补的5'瓣部分(即，不互补的5'瓣部分不与靶核酸杂交)的瓣探针。5'瓣部分被配置成使得在依序侵入性切割测定的“初级”反应中参与侵入性切割结构的初级探针被切割后，从初级探针释放的切割的5'瓣可以与FRET盒杂交以促进依序侵入性切割测定的二级反应。
如本文所用，术语“初级反应”通常是指初级探针的瓣核酸内切酶切割，由此产生切割的5'瓣。当用FEN-1核酸内切酶切割初级探针时，来自初级探针的切割的5'瓣的序列通常是初级探针的5'瓣部分加上初级探针的靶标特异性部分的第一(最多5')核苷酸。
如本文所用，术语“二级反应”通常是指来自初级反应切割的5'瓣与FRET盒的杂交以形成二级侵入性切割结构，以及通过瓣核酸内切酶对二级侵入性切割结构的切割以产生可检测信号。
如本文所用，当产生反应产物时，反应是“活性的”。例如，在以下情况下，二级反应是活性的：在允许在反应混合物中切割的5'瓣与FRET盒循环杂交的温度下孵育含有必要组分(例如，包括FRET盒、对FRET盒具有特异性的切割的5'瓣和FEN酶)的反应混合物，从而导致FRET盒的切割以及供体(例如，荧光团)和受体(例如，淬灭剂)部分的分离。
术语“侵入性寡核苷酸”(有时称为“INVADER寡核苷酸”)是指在探针与靶核酸之间的杂交区域附近的位置与靶核酸杂交的寡核苷酸，其中侵入性寡核苷酸包含与在探针和靶标之间的杂交区域重叠的部分(例如，化学部分或核苷酸，无论是否与该靶标互补)。在一些实施方案中，侵入性寡核苷酸在其3'端包含与位于探针寡核苷酸的5'端的序列基本相同的序列。
如本文所用，术语“FRET”是指荧光共振能量转移，这是一种化学部分(例如，荧光团)在它们之间转移能量或从荧光团转移到非荧光团(例如，淬灭剂分子)的过程。在一些情况下，FRET涉及激发的供体荧光团经由短距离(例如，约10nm或更小)偶极间相互作用将能量转移到较低能量的受体荧光团。在其他情况下，FRET涉及供体荧光能量的损失和受体荧光团中荧光的增加。在仍其他形式的FRET中，能量可以被从激发的供体荧光团交换到非荧光分子(例如，淬灭分子)。FRET是本领域技术人员已知的，并且已经进行了描述(参见Stryer等人,1978,Ann.Rev.Biochem.,47:819；Selvin,1995,Methods Enzymol.,246:300；Orpana,2004Biomol Eng 21,45-50；Olivier,2005Mutant Res 573,103-110，将其各自通过引用以其整体并入本文)。
如本文所用，术语“FRET盒”是指包含茎环或发夹结构(即，核酸碱基分子内配对形成双螺旋茎的区域，所述双螺旋茎具有连接茎一端碱基配对链的核苷酸环)的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括供体部分(例如，“荧光团”)和附近的受体部分(例如，“淬灭剂”)，其中供体和受体部分与同一FRET盒的附接显著抑制(例如，淬灭)来自供体部分的可检测能量发射(例如，荧光发射)。FEN-1酶催化邻近单链和双链DNA连接处的磷酸二酯键3'的水解切割，通常一个核苷酸进入寡核苷酸茎环部分的5'端，从而从FRET盒的茎环部分释放5'核苷酸或5'瓣。荧光团部分通常在5'末端或5'瓣中附接到FRET盒寡核苷酸，而淬灭剂部分通常附接到寡核苷酸的茎环部分。
FRET盒的“切割的瓣杂交序列”是指与互补核酸或寡核苷酸(例如，从初级探针切割的5'瓣(“初级切割的瓣”))的3'端特异性杂交的FRET盒的3'部分的核苷酸碱基序列，其中当瓣切割产物与FRET盒杂交时，互补寡核苷酸的3'末端被定位成形成侵入性切割结构(即FEN酶的底物)，使得FRET盒上的切割位点被定位在荧光团部分与淬灭剂部分之间。
如本文所用，术语“5'瓣FRET盒”是指具有单链5'瓣部分、茎环部分和包含切割的瓣杂交序列的单链3'部分的FRET盒寡核苷酸，并且其中5'瓣部与切割的瓣杂交序列彼此不互补。
如本文所用，术语“无瓣FRET盒”是指不具有单链5'部分(例如，一个或多个非互补的5'核苷酸)的FRET盒，并且其中寡核苷酸的5'末端核苷酸可碱基配对为FRET盒的茎环部分的非环端上的最后一个碱基对。
由于来自FRET盒切割的荧光信号的扩增是由互补寡核苷酸(例如，从初级探针切割的5'瓣)与FRET盒群体中的切割的瓣杂交序列的重复或循环杂交引起的，所以初级探针通常被设计成使得聚合酶使用FRET盒作为模板不能延伸切割的5'瓣。例如，初级探针通常被设计成产生5'切割的瓣产物，当所述5'切割的瓣产物与FRET盒杂交时具有与FRET盒中的切割的瓣杂交序列不互补的3'末端。
在一些实施方案中，(例如，在多重侵入性切割反应中)可以使用具有两个或更多个不同的切割的瓣杂交序列的FRET盒的混合物。当切割的瓣产物可与一个切割的瓣杂交序列杂交且不可与另一个切割的瓣杂交序列可测量杂交(例如，在侵入性切割测定条件下)时，两个切割的瓣杂交序列被称为彼此“不同”，反之亦然。在二级反应中FEN酶(例如，FEN-1核酸内切酶)对FRET盒的切割分离供体和受体部分，其结果是解除抑制并允许产生信号。在一些实施方案中，供体和受体部分通过荧光共振能量转移(例如，FRET)相互作用。在其他实施方案中，FRET盒的供体和受体通过非FRET机制相互作用。
如本文所用，“相互作用”标记对是指供体部分和受体部分附接到相同FRET盒，并且彼此具有能量转移关系(即，无论是通过FRET还是非FRET机制)。当供体和受体部分分离时(例如，通过在二级反应中切割FRET盒)，可以产生信号(例如，荧光信号)。与不同切割的5'瓣特异性杂交的不同FRET盒可以各自包含相同的相互作用标记对。
如本文所用，提及探针寡核苷酸所用的术语“未标记”是指不包含任何生色团或荧光团以便于检测的探针寡核苷酸。未标记的探针可以包含修饰如3'阻断基团，以防止聚合酶的延伸。
如本文所用，术语“供体”是指在第一波长下吸收并在第二更长波长下发射的部分(例如，荧光团)。术语“受体”是指一个部分，如荧光团、生色团或淬灭剂，当其靠近供体基团时(通常在1-100nm之间)，其能够吸收供体发射的一些或大部分能量。受体可以具有与供体的发射光谱重叠的吸收光谱。通常，如果受体是荧光团，那么它以第三仍更长的波长重新发射。如果受体是生色团或淬灭剂，它会释放从供体吸收的能量，而不会发射光子。在一些优选的实施方案中，检测(例如，经由测量供体和/或受体部分之间或来自供体和/或受体部分的能量转移)供体和/或受体部分的能量水平的变化。这可能涉及检测光发射。在一些优选的实施方案中，受体部分的发射光谱不同于供体部分的发射光谱，使得来自这些部分的发射(例如，光和/或能量的发射)可以彼此区分开(例如，光谱分辨)。
在一些实施方案中，供体部分与多个受体部分组合使用。在优选的实施方案中，供体部分与非荧光淬灭剂部分和受体部分组合使用，使得当供体部分与淬灭剂接近(例如，1-100nm之间，或更优选地1-25nm之间，或甚至更优选地约10nm或更小)时，其激发被转移到淬灭剂部分而不是受体部分，并且当淬灭剂部分被去除时(例如，通过探针的切割)，供体部分激发被转移到受体部分。在一些优选的实施方案中，检测来自受体部分的发射(例如，使用波长偏移分子信标)(参见Tyagi等人,Nature Biotechnology 18:1191(2000)；Mhlanga和Malmberg,2001Methods 25,463-471；Olivier,2005Mutant Res 573,103-110，和美国专利申请20030228703，将其各自通过引用以其整体并入本文)。
如本文所用，提及信号(例如，一个或多个标记的信号)的术语“不同”是指可以通过例如光谱特性(如荧光发射波长、颜色、吸光度、质量、尺寸、荧光偏振特性、电荷等)或通过与另一个部分(如与化学试剂、酶、抗体等)的相互作用的能力来彼此区分的信号。
如本文所用，提及多核苷酸或寡核苷酸(例如，探针)所用的术语“合成”是指在体外无细胞反应(例如，酶或化学合成反应)中产生的核酸。合成核酸的酶形成的例子包括通过限制性酶消化、聚合(模板化或非模板化)、连接等形成。核酸的化学合成的例子包括但不限于磷酸二酯和磷酸三酯化学、亚磷酰胺和H-膦酸盐化学等。参见例如，Methods inMolecular Biology,第20卷:Protocols for Oligonucleotides and Analogs第165-189页(S.Agrawal编辑,Humana Press,1993).；Oligonucleotides and Analogues:APractical Approach,第87-108页(F.Eckstein编辑,1991)；和Uhlmann和Peyman,同上，Agrawal和Iyer,Curr.Op.Biotech.6:12(1995)；和Anti-sense Research andApplications(Crooke和Lebleu；编辑,CRC Press,Boca Raton,1993)，Beaucage和Caruthers,Tetrahedron Lett.22:1859-1862(1981)，以及Agrawal和Zamecnik的美国专利号5,149,798(1992)。在一些实施方案中，将预先形成的合成寡核苷酸引入反应中，而在其他实施方案中，在反应中(例如，通过聚合酶、连接酶、切割酶等的作用)形成或修饰合成寡核苷酸。
如本文所用，术语“瓣状核酸内切酶”或“FEN”(例如，“FEN酶”)是指一类在DNA结构上起结构特异性核酸内切酶作用的核分解酶，这些结构具有这样的双链体，所述双链体在被另一条核酸链取代的一条链上含有单链5'突出端或5'瓣，使得在单链与双链DNA之间的连接处存在重叠的核苷酸。FEN酶催化单链和双链DNA连接处附近的磷酸二酯键3'的水解切割，从而释放突出端或“瓣”(参见Trends Biochem.Sci.23:331-336(1998)和Annu.Rev.Biochem.73:589-615(2004))。FEN酶可以是单独的酶或多个亚基酶。在一些特定的实施方案中，FEN酶活性可以作为另一种酶或蛋白质复合物(如DNA聚合酶)的活性存在。在一些优选的实施方案中，FEN酶不具有DNA聚合活性(例如，即使在模板、引物和dNTP的存在下也不聚合DNA)。在其他优选的实施方案中，FEN酶具有DNA聚合活性，但通过以基本上排除与FRET盒的循环杂交的方式延伸寡核苷酸(例如，从初级探针切割的或源自另一来源的5'瓣)而不展现出这种活性。例如，参与二级侵入性切割反应以从FRET盒切割荧光团或荧光5'瓣的FEN酶不会延伸来自初级探针(即，与FRET盒可逆杂交以催化切割反应的侵入性探针)的切割的5'瓣。瓣状核酸内切酶可能是热稳定的。可用于本文公开的方法的FEN酶的例子描述于美国专利号5,614,402；5,795,763；6,090,606；以及由WO 98/23774；WO 02/070755；WO 01/90337；以及WO 03/073067鉴定的已公开的PCT申请中，将其各自通过引用以其整体并入。可商购的FEN酶的特定例子包括酶(Hologic股份有限公司)。
如本文所用，“FEN-1”是指如由FEN-1(瓣结构特异性核酸内切酶1)基因所编码的来自真核生物或古生菌生物的非聚合酶瓣状核酸内切酶。参见例如，Kaiser等人的美国专利号6,562,611，和Kaiser M.W.等人(1999)J.Biol.Chem.,274:21387；WO 02/070755，和美国专利号US 7,122,364，出于所有目的，将其通过引用以其整体并入本文。术语“FEN-1活性”是指FEN-1酶的任何酶活性。如WO 02/070755和美国专利号US 7,122,364中所述，FEN-1核酸内切酶还包含经修饰的FEN-1蛋白(例如，包含来自不同生物体的FEN-1酶的部分的嵌合蛋白)和包含一个或多个突变(例如，取代、缺失、插入等)的酶。古生菌生物是古生菌界中任何一种通常为单细胞的生物。
对“第一”和“第二”和“第三”等的提及(例如，靶核酸、FRET盒、侵入性切割测定等)只提供用于区分彼此的标识符，而不一定指示一个在另一个之前。
“反应混合物”是单个反应器皿中试剂(例如，寡核苷酸、靶核酸、酶等)的组合。
如本文所用，“多重”测定是一种在测定的单次运行中检测或测量多种分析物(两种或更多种)的测定。它与每个反应混合物测量一种分析物的程序不同。通过将用于使用独立的侵入性切割测定检测或测量两种或更多种不同分析物的试剂组合到单个反应器皿中来进行多重侵入性切割分析。在一些实施方案中，在多重测定的每个测定中检测相同种类的荧光报告物。在其他实施方案中，使用不同种类的荧光报告物，但是不同的报告物在检测一定范围的荧光波长的仪器的相同通道中是可检测的。
如本文所用，术语“互补”是指能够形成双链氢键区域的核碱基序列。核碱基序列可以是“完全互补的”(即，一个序列中的每个核碱基能够与第二序列中的对应核碱基配对)，或者它们可以是“部分互补的”(即，一个序列中的至少一个核碱基不能够与第二序列中的对应核碱基氢键合)。核碱基序列可以在相同或不同的多核苷酸中。
如本文所用，术语“双链体”和“杂交双链体”是指包含双链氢键区域的核酸结构。此类结构可以是完全或部分双链的，并且包括RNA:RNA、RNA:DNA和DNA:DNA分子及其类似物。举例来说，“双链体”包括与FRET盒的互补切割的瓣杂交序列杂交的切割的5'瓣序列(例如，初级切割的瓣)；和与互补掩蔽寡核苷酸杂交的盒切割的瓣。
如本文所用，术语“切割的形式”是指已通过一种或多种核酸酶的作用从多核苷酸的剩余部分切割的多核苷酸的一部分。举例来说，当初级探针已被核酸内切酶(例如，FEN酶)切割时，5'瓣序列是“切割的形式”，从而将5'瓣部分与瓣探针的靶标杂交部分分离。
如本文中提及多核苷酸(例如，寡核苷酸、靶核酸等)所使用的术语“单链状态”是指多核苷酸中可用于碱基配对的区域。在具有自互补区域的单链多核苷酸的情况下，术语“单链状态”是指自互补多核苷酸中可用于碱基配对的区域。举例来说，在与掩蔽寡核苷酸杂交之前，或在将盒切割的瓣与掩蔽寡核苷酸分离的解链之后，盒切割的瓣是单链状态。
如本文所用，用于进行反应的“温度条件”是指允许发生反应的温度或温度范围。不同反应的不同温度谱意味着允许发生一个反应的温度条件可能不允许发生不同的反应。该术语还适用于允许掩蔽寡核苷酸与包含荧光团部分的互补寡核苷酸序列杂交的温度谱。
如本文所用，“最佳”(及其语法变体)反应条件是指促进或允许反应发生的最有利的反应条件。例如，进行二级反应的最佳温度是FRET盒在反应混合物中被最有效地切割的温度(例如，对应于荧光信号随反应温度变化的图上的峰)。类似地，最佳温度范围是用于促进或允许反应发生的最有利温度条件的范围。在某些示例性实施方案中，优选的最佳温度范围可以包括最佳温度加或减5℃、更优选地加或减4℃、更优选地加或减3℃、仍更优选地加或减2℃和又仍更优选地加或减1℃。
如本文所用，“附接的”(例如，两种东西是“附接的”)是指化学键合在一起。例如，当荧光团部分与FRET盒的结构化学键合时，荧光团部分“附接”至FRET盒。
如本文所用，“等效”(例如，在“等效供体-受体对”或“等效供体”或“等价荧光团”部分的上下文中)意指可检测化学物质的激发光谱和发射光谱在波长范围上足够相似或重叠，从而允许在用于监测信号的仪器的相同通道中检测荧光发射波长。
如本文所用，术语“光谱重叠”是指具有至少一个共同波长的两个或更多个光谱。
如本文所用，当来自供体的光子的可检测发射被抑制或阻止时，来自供体部分(例如，荧光团)的发射被“淬灭”，因为受体部分(例如，淬灭剂)足够接近。例如，当供体部分和受体部分都附接到相同FRET盒时，来自供体部分的发射被淬灭。类似地，当切割的5'瓣(盒切割的瓣)与包含淬灭剂部分的互补寡核苷酸杂交时，可以淬灭来自附接到从FRET盒切割的5'瓣的供体或荧光团部分的发射。
如本文所用，“特定”是指仅与一个(或仅与特别指示的组)相关，如仅对一个(或仅对特别指示的组)具有特定影响，或者以特定方式仅影响一个(或仅特别指示的组)。例如，对FRET盒具有特异性的切割的5'瓣(例如，初级切割的瓣)将能够与该FRET盒杂交，形成侵入性切割结构，并促进切割反应，但将不能与不同的FRET盒(例如，具有不同切割的瓣杂交序列的FRET盒)杂交以促进切割反应。同样地，当两个寡核苷酸的序列彼此互补时，从FRET盒切割的荧光5'瓣(盒切割的瓣)可以与对该盒切割的瓣具有特异性的掩蔽寡核苷酸杂交。
如本文所用，术语“特异性杂交”意指在给定的杂交条件下，探针或引物基本上仅与包含靶序列的样品中的靶序列可检测地杂交(即，与非靶序列几乎没有杂交或没有可检测的杂交)。类似地，对FRET盒具有“特异性”的切割的5'瓣将能够与该FRET盒特异性杂交以形成侵入性切割结构并促进切割反应，但不会以形成侵入性切割结构的方式与不同的FRET盒杂交。
当用于提及酶(如FEN酶)时，术语“热稳定的”表示酶在升高的温度下(例如，在约55℃或更高温度下)是功能性或活性的(即，可以进行催化)。在一些实施方案中，酶在65℃或更高(例如，75℃、85℃或甚至95℃)的升高温度下具有功能性或活性。
如本文所用，术语“扩增的”是指分子、部分或效应的丰度增加。靶核酸可以被扩增，例如通过体外复制，如通过PCR。
如本文所用，提及核酸扩增所使用的术语“扩增方法”意指特异性扩增相关核酸的丰度的过程。一些扩增方法(例如，聚合酶链式反应或PCR)包括热变性的迭代循环、寡核苷酸引物退火到模板分子以及退火引物的核酸聚合酶延伸。这些步骤中的每一个所需的条件和时间是本领域熟知的。一些扩增方法是在单一温度下进行的，并且被认为是“等温的”。扩增产物的累积可以是指数的或线性的。一些扩增方法(例如，“靶标扩增”方法)通过多次复制靶序列来扩增靶序列的丰度(例如，PCR、NASBA、TMA、链置换扩增、连接酶链式反应、LAMP、ICAN、RPA、SPA、HAD等)，而一些扩增方法扩增可能包含或可能不包含靶序列的核酸物质的丰度，但其扩增表明反应中存在特定靶序列。一些信号扩增方法可以通过转化起始核酸(例如，通过切割起始核酸以形成切割产物，或通过例如聚合或连接使其延伸)来增加核酸物质的丰度。靶标扩增方法可应用于信号分子(例如，PCR可用于产生连接、切割或非靶拷贝反应的产物的更多拷贝)，或反之亦然。
如本文所用，术语“聚合酶链式反应”和“PCR”是指在体外从靶核酸复制DNA区段的酶反应。反应通常涉及用模板依赖性DNA聚合酶在靶核酸的每条链上延伸引物，以产生该链的一部分的互补拷贝。链式反应包括DNA链变性的迭代循环，例如通过加热，然后冷却以允许引物退火和延伸，从而导致靶核酸侧接并包括引物结合位点的区域的拷贝的指数累积。当通过PCR扩增RNA靶核酸时，它通常被能够逆转录的酶转化为DNA拷贝链。示例性酶包括MMLV逆转录酶、AMV逆转录酶以及本领域普通技术人员所熟悉的其他酶。
如本文所用，术语“寡核苷酸(oligonucleotide)”(有时简称为“寡核苷酸(oligo)”)定义为包含两个或更多个核苷酸(例如，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)(优选地至少5个核苷酸、更优选地至少约10-15个核苷酸、和更优选地至少约15至30个核苷酸、或更长)的分子。寡核苷酸的长度通常小于200个残基(例如，在15和100个核苷酸之间)，然而，如本文所用，该术语也旨在涵盖更长的多核苷酸链。准确的大小将依赖于许多因素，而这些因素又依赖于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸通常通过它们的长度被提及。例如，24核苷酸寡核苷酸被称为“24聚体”。寡核苷酸可以通过自身杂交或与其他多核苷酸杂交形成二级和三级结构。此类结构可以包括但不限于双链体、发夹、十字形、弯曲和三链体。寡核苷酸可以以任何方式生成，包括化学合成、DNA复制、逆转录、PCR或其组合。在一些实施方案中，形成侵入性切割结构的寡核苷酸在反应中产生(例如，通过在酶延伸反应中延伸引物)。如本文所用，术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”可以互换使用，并且可以包含非天然存在的单体或其部分。更特别地，寡核苷酸可以包括例如天然和/或修饰的单体或连接的线性或环状寡聚物，包括脱氧核糖核酸、核糖核酸、其经取代的和α-异头物形式、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、2'-O-甲基修饰、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、间隔子等。
如本文所用，“信号”是能量的可检测量或脉冲，如电磁能量(例如，光)。来自适当刺激的荧光团的光的发射是荧光信号的例子。在一些实施方案中，“信号”是指在检测仪器(例如，荧光计)的单个通道中检测到的聚集能量。
如本文所用，“背景”信号是在不允许发生靶核酸特异性反应的条件下产生的信号(例如，荧光信号)。例如，在包括FRET盒和FEN酶但不包括盒特异性侵入性寡核苷酸(例如，初级切割的瓣)的二级反应中产生的信号被视为背景信号。在一些情形下，在省去靶核酸的“阴性对照”反应或试验中测量背景信号。
如本文所用，能量传感器装置(如配备有光学能量传感器的装置)的“通道”是指可以检测或定量的预定义波长带，而不包括其他波长带。例如，荧光计的一个检测通道可能能够将一个或多个荧光标记在一系列波长上发射的光能检测为单个事件。作为荧光结果发射的光可以被定量为给定波长下或波长带上的相对荧光单位(RFU)。常见荧光检测通道的例子包括检测以下范围的荧光发射波长的通道：约510-530nm(例如，常用于“FAM”检测通道)、约560-580nm(例如，常用于“HEX”检测通道)、约610-650nm(例如，常用于“德克萨斯红”检测通道)、约675-690nm(例如，常见于“Cy5”检测通道)和约705-730nm(例如，常见于“Quasar705”检测通道)。Cy5和Alexa647是可以在荧光计的Cy5通道中检测到的两种不同荧光团的例子。
如本文所用，“阈值”或“阈值临界值”是指用于解释实验结果的定量极限，其中高于和低于临界值的结果会导致不同的结论。例如，低于临界值的测量信号可以指示特定靶标的不存在，但是超过相同临界值的测量信号可以指示该靶标的存在。按照惯例，满足临界值(即，恰好具有临界值)的结果与超过临界值的结果具有相同的解释。
如本文所用，“阈值循环数”是指当实时运行曲线信号与任意值或阈值相交时测量时间或循环数的扩增标记。“TTime”和“Ct”测定是基于阈值的扩增标记的例子。其他方法涉及进行实时运行曲线的导数分析。为了本公开文本的目的，还可以使用TArc和OTArc来确定实时运行曲线信号何时与任意值相交(例如，分别对应于曲率的最大或最小角度)。TTime测定的方法披露于U.S.8,615,368；Ct测定的方法披露于EP 0640828 B1；基于导数的方法披露于U.S.6,303,305；并且TArc和OTArc测定的方法披露于U.S.7,739,054。本领域普通技术人员将意识到也可用于确定阈值循环数的变化。
如本文所用，“内部校准物”核酸是可以在体外核酸扩增反应中被扩增并且可以与在相同反应中共扩增的分析物核酸(例如，来自测试样品的靶核酸)区分开的核酸。“内部”意指在与分析物靶核酸或其片段相同的反应混合物中扩增和检测校准物核酸。在一些实施方案中，通过用于扩增待定量的分析物核酸的一种或多种相同引物扩增内部校准物核酸。在其他实施方案中，不同的引物被用于此目的。一般来说，分析物核酸和内部校准物核酸相差至少一个核苷酸位置，该核苷酸位置可以通过侵入性切割反应来区分。这允许多重化侵入性切割测定独立地检测扩增的内部校准物和分析物靶核酸。
如本文所用，“校准标准品”是包含已知或预先确定量的内部校准物核酸的组合物。
如本文所用，“反应器皿”或“反应接收容器”是用于容纳反应混合物的容器。例子包括多孔板的单独孔和塑料管(例如，包括形成的多管单元的线性阵列内的单独管等)。然而，应理解，任何合适的容器都可以用于容纳反应混合物。
如本文所用，“允许”反应发生意指反应混合物提供试剂和条件，以测试特定核酸(例如，靶DNA或切割的5'瓣)的存在，该核酸可能存在于反应混合物中，也可能不存在于反应混合物中。例如，“允许”侵入性切割测定的初级反应发生意指反应混合物在适当的缓冲液和温度条件下包含侵入性探针、含有5'瓣序列的初级探针、和FEN酶，如果反应混合物中也有靶DNA参与初级反应，则允许切割初级探针和释放切割的5'瓣。类似地，“允许”侵入性切割测定的二级反应发生意指反应混合物在适当的缓冲液和温度条件下包含FRET盒和FEN酶，如果反应混合物中也有对FRET盒具有特异性的切割的5'瓣参与二级反应，则允许切割FRET盒。仍进一步地，“允许(permitting)”(或“允许(permit)”或“允许(are permissivefor)”)反应发生的温度条件是有利于进行或允许反应进行的温度条件。
“试剂盒”意指旨在彼此联合使用的材料的包装组合。根据所公开的技术有用的试剂盒可以包含含有各种试剂的一个或多个器皿或管。试剂盒可进一步包含说明书或其他“有形”形式的信息(例如，打印出的信息，以电子方式记录在计算机可读介质上，或以其他方式记录在机器可读介质(如条形码)上)。
具体实施方式
本文公开了一种多重化核酸扩增和检测系统，所述多重化核酸扩增和检测系统可用于仅使用核酸分析仪的单个荧光检测通道以温度依赖性方式检测多个特定核酸序列的存在。所述技术简化了核酸分析物(如单核苷酸多态性(即，“SNP”))的多重检测，如在诊断应用中可使用的。便利地，可以使用配备用于荧光检测或监测的标准PCR仪器执行所述技术。
所公开的程序使用“掩蔽寡核苷酸”，其在侵入性切割测定中通过互补碱基配对与从探针或FRET盒切割的荧光标记的5'瓣(例如，盒切割的瓣)杂交。掩蔽寡核苷酸包含与其附接的荧光淬灭部分(本文中有时为“淬灭剂”)。当掩蔽寡核苷酸与经标记的切割的瓣之间发生杂交时，掩蔽寡核苷酸的淬灭部分靠近切割的5'瓣的荧光团部分。然后，由切割的5'瓣的荧光团发射的荧光信号被淬灭。当不同的切割产物(例如，具有不同长度和/或不同序列的切割的瓣)在适当的温度下与同源掩蔽寡核苷酸杂交时，可以确定释放盒切割的瓣的二级反应的身份，并且从而确定反应混合物中存在哪些靶序列。
侵入性切割反应和测定
与通过切割FRET盒产生荧光信号以指示分析物核酸存在的其他侵入性切割测定不同，本发明技术不需要荧光信号的持续性来确定特定FRET盒是否被切割。实际上，本文所述的技术实际上需要在多重测定中至少一个FRET盒的切割产生荧光信号，所述荧光信号随反应混合物的温度的变化而淬灭或熄灭。这是通过在反应混合物中包含与所述至少一个FRET盒的荧光切割产物互补的掩蔽寡核苷酸来实现的。用于形成包含荧光切割产物和互补掩蔽寡核苷酸的双链体的杂交相互作用的特征在于解链温度(Tm)。在高于Tm的温度下，荧光切割产物处于单链状态，其中可以产生并检测或测量到荧光信号。在低于Tm的温度下，双链体形成并淬灭从附接至从5'瓣FRET盒切割的5'瓣的荧光团发射的荧光。通过在反应混合物中包含与不同荧光5'瓣切割产物互补的不同掩蔽寡核苷酸(其中掩蔽寡核苷酸与荧光切割产物杂交产生的不同双链体展现出不同的Tm)，可以确定使用在荧光计的相同通道中可检测的荧光团标记的多个FRET盒中的哪个FRET盒被切割从而产生信号。这种荧光淬灭能力或荧光信号的温度依赖性差异，对于所公开的技术的功能是必不可少的。
本文所公开的侵入性切割测定涉及侵入性切割结构的形成，以及通过瓣状核酸内切酶(例如，FEN-1)对侵入性切割结构的酶促切割。在一些实施方案中，侵入性切割结构包含：(1)FRET盒；和(2)与FRET盒杂交的侵入性寡核苷酸。在一些实施方案中，与FRET盒杂交的侵入性寡核苷酸是从初级探针切割的5'瓣。在一些实施方案中，侵入性切割测定包括：(1)待检测的靶核酸；(2)具有5'瓣的初级探针，其中初级探针的靶标互补序列与靶核酸杂交；和(3)与杂交的初级探针附近和上游的靶核酸杂交的侵入性寡核苷酸。在一些实施方案中，侵入性切割测定以串联方式组合第一和第二侵入性切割反应(参见图1)，使得来自初级探针的切割的5'瓣(例如，有时称为“初级切割的瓣”)用作侵入性寡核苷酸，以在二级反应中促进对FRET盒的酶促切割。
初级反应的上游侵入性寡核苷酸通常被设计成在测定温度下基本上永久地退火至靶DNA(例如，以具有显著高于测定温度的Tm)，而初级探针寡核苷酸则不是这样。退火至靶链的初级探针的部分被设计成关于靶链具有接近测定温度的Tm，使得反应混合物中的初级探针寡核苷酸将在没有温度循环的情况下在反应温度下不断地退火以及从靶链解离。在一些实施方案中，Tm在测定温度的约4℃内，更优选地在测定温度的3℃内，仍更优选地在测定温度的2℃内，以及又仍更优选地在测定温度的1℃内。在侵入性寡核苷酸旁边且下游的初级探针寡核苷酸退火时形成切割结构。这种切割结构可以被瓣状核酸内切酶切割。
根据本公开文本的侵入性切割反应的一个关键特征和操作原理是，切割产物可以在等温条件下(即，没有温度循环)增加数量并累积。例如，与靶核酸杂交的初级探针寡核苷酸可以在没有温度循环的情况下重复退火和解离。靶DNA上的单个位点可以重复使用或再循环，以在没有温度循环的情况下与一系列新的未切割的探针杂交，从而针对每个靶分子产生数千个切割的探针。参见例如，Olivier,Mutat Res,573:103-110(2005)。同样地，在与从初级探针切割的5'瓣循环杂交后，通过FEN-1切割FRET盒产生的荧光信号也在等温条件下增加和累积。
侵入性切割测定也可以被配置成以依序方式操作，其中使用来自初级侵入性切割反应的切割的瓣形成第二切割结构。例如，Hall的SISAR测定使用两个连续的信号扩增反应来倍增测定产生的信号总量(参见Hall等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.97(2000)8272-8277)。在图1展示的SISAR测定中，每个初级探针的切割释放切割的5'瓣(图1中的“初级切割的瓣”)。切割的瓣与发夹“FRET盒”寡核苷酸杂交，以形成第二切割结构。第二切割结构的切割将荧光团染料与FRET盒的淬灭部分分离，从而使来自荧光团的荧光可检测。
使用FRET盒的侵入性切割测定(例如，系列侵入性切割测定)通常被设计成使得切割的瓣-FRET盒复合物具有接近测定温度的Tm(例如，在测定温度的4℃内，更优选地在测定温度的3℃内、仍更优选地在测定温度的2℃内以及又仍更优选地在测定温度的1℃内)，使得切割的瓣将在反应温度下且在没有温度循环的情况下不断地退火以及从FRET盒解离。在将切割的瓣退火到FRET盒时，形成切割结构，并且该结构可以被瓣状核酸内切酶(例如，FEN-1核酸内切酶)切割。因此，涉及FRET盒的切割的二级反应使用与初级反应相同的再循环原理产生信号。每个切割的瓣可以在没有温度循环的情况下与一系列新的未切割的FRET盒杂交，从而针对每个切割的瓣产生数千个未淬灭的荧光团。
当侵入性探针与初级探针之间存在单个碱基重叠时且当侵入性探针与初级探针二者均与分析物核酸杂交时，存在于进一步包含分析物核酸、侵入性探针、初级探针和FRET盒的反应混合物中的瓣状核酸内切酶(例如，FEN-1)将从初级探针的剩余部分切割5'瓣。这种切割反应被称为“初级”反应。然后，从初级探针释放的5'瓣与具有与其互补的序列的FRET盒进行循环杂交，由此FEN介导的切割反应将荧光团与存在于同一FRET盒上的淬灭剂部分分离，从而产生可检测的荧光发射。这种通过切割FRET盒产生荧光信号的切割反应被称为“二级”反应。如上所述，如果二级反应在接近从初级探针切割的5'瓣与FRET盒之间的双链体的Tm(即，解链温度)的温度下进行以促进循环杂交，则同一5'瓣可以自由地与相似的同源FRET盒相互作用以进一步催化切割反应。可以通过随时间变化的增加的荧光来检测这种可以在固定温度下发生的线性扩增。初级反应和二级反应中的每一个基本上都是等温过程。事实上，即使在热稳定的DNA聚合酶(例如，Taq DNA聚合酶)展现出严重受损的聚合活性的热条件下，FEN-1依赖性二级侵入性切割反应也能在不需要聚合的情况下产生可检测的荧光信号。事实上，切割的5'瓣使用FRET盒作为模板进行的基于聚合酶的延伸将损害有利于荧光信号累积的循环杂交。因此，禁止延伸切割的5'瓣。
有用的荧光团和淬灭剂
在一些实施方案中，根据本发明所公开的技术的多重化侵入性切割测定可以仅使用单个检测通道来检测由多重化侵入性切割测定产生的荧光信号，并且优选地将使用相同化学种类的荧光团在多重化反应中从不同靶标产生信号。在其他实施方案中，可以组合多个不同的荧光团以用于在多重化反应中从不同靶标产生信号。在本发明所公开的技术的FRET盒系统中使用的示例性荧光团包括但不限于：荧光素、罗丹明、REDMOND RED染料、YAKIMA YELLOW染料、六氯荧光素、TAMRA染料、ROX染料、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、和Cy7、4,4-二氟-5,7-二苯基-4-硼-3a,4a-二氮杂--对称引达省-3-丙酸、4,4-二氟-5,对甲氧基苯基-4-硼-3a,4a--二氮杂-对称引达省-3-丙酸、4,4-二氟-5-苯乙烯基-4-硼-3a,4-a二氮杂-对称引达省-丙酸、6-羧基-X-罗丹明、N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明、德克萨斯红、伊红、荧光素、4,4-二氟-5,7-二苯基-4-硼-3a,4a-二氮杂-对称引达省-3-丙酸、4,4-二氟-5,对乙氧基苯基-4-硼-3a,4a-二氮杂-对称引达省3-丙酸、和4,4-二氟-5-苯乙烯基-4-硼-3a,4a-二氮杂-对称引达省-丙酸、6-羧基荧光素(6-FAM)、2',4',1,4,-四氯荧光素(TET)、21,4',51,7',1,4-六氯荧光素(HEX)、2',7'-二甲氧基-4',5'-二氯-6-羧基罗丹明(JOE)、2'-氯-5'-氟-7',8'-融合苯基-1,4-二氯-6-羧基荧光素(NED)、2'-氯-7'-苯基-1,4-二氯-6-羧基荧光素(VIC)、异硫氰酸荧光素(FITC)、5,6-羧甲基荧光素、德克萨斯红、硝基苄-2-氧杂-1,3-重氮基-4-基(NBD)、香豆素、丹磺酰氯、氨基-甲基香豆素(AMCA)、赤藓红、BODIPY染料、CASCADE BLUE染料、OREGON GREEN染料、芘、丽丝胺、呫吨、吖啶、噁嗪、藻红蛋白、QUANTUM DYE、噻唑橙-乙锭异二聚体等。
在所述技术的FRET盒系统中使用的示例性淬灭剂包括但不限于：菁染料(如Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7)、罗丹明染料(如四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)和四丙烷基-6-羧基罗丹明(ROX))、DABSYL染料、DABCYL染料、菁染料、硝基噻唑蓝(NTB)、蒽醌、孔雀石绿、硝基噻唑或硝基咪唑化合物、QSY7(Molecular Probes，俄勒冈州尤金)、ECLIPSE淬灭剂(Epoch Biosciences,Inc.，犹他州洛根)等。可替代的淬灭剂包括Black Hole Quencher染料，特别是BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3(Biosearch Technologies，加利福尼亚州佩塔卢马)；淬灭剂(Berry&Associates，密歇根州East Dexter)；和/>(Integrated DNA Technologies，爱荷华州科拉尔维尔)。在选择用于FRET配置的成对或成组的部分时对各种分子的吸收和发射光谱等因素的分析是本领域技术人员熟知的。
本领域普通技术人员将意识到可以由荧光计的不同通道检测的波长范围，并且因此将能够容易地选择用于不同FRET盒的荧光团，其中可以在相同荧光计通道中检测来自不同荧光团的发射。
温度依赖性多重化技术的特征
与受益于荧光信号的不间断持续性的现有侵入性切割测定不同，本发明所公开的技术受益于在FEN-1介导的FRET盒的切割后对荧光的选择性抑制。Peterson等人在公开的美国专利申请2018/0163259A1中披露了一种方法，其中用相同荧光团标记的不同FRET盒在不同温度下被切割，其中不同温度基本上将一个反应与另一个反应分离。监测随时间或循环数变化的累积荧光信号允许分辨FRET盒的活性。这样，可以仅使用荧光计的单个通道，甚至仅使用单一类型的荧光标记，以多重形式检测多个核酸靶标。如本文所公开的，本发明技术依赖于温度依赖性荧光淬灭来有效地去除由不同FRET盒产生的荧光信号的贡献，即使不同的FRET盒具有相同的荧光标记。因此，在本发明所公开的技术中，在FRET盒切割之后发生的程序或事件提供有用信息。
本发明技术采用至少一个FRET盒，所述至少一个FRET盒被构造为包含这样的5'瓣部分，其在二级反应中被FEN-1酶切割后保留荧光团。优选地，5'瓣的长度在8至30个核苷酸(更优选地8至25个核苷酸，又仍更优选地8至16个核苷酸)的范围内。特别优选的5'瓣长度为9个核苷酸、10个核苷酸、11个核苷酸、12个核苷酸、13个核苷酸、14个核苷酸或15个核苷酸。图1展示了一系列侵入性切割反应，其中FRET盒是不包含5'瓣部分的无瓣FRET盒，并且其中在二级反应中的切割释放附接到单个核苷酸的荧光染料。相反，5'瓣FRET盒(参见图2A)可以通过循环杂交与来自初级探针的切割的瓣(参见图2B)杂交，以产生可被FEN-1酶切割的结构。当处于单链状态时，所得盒切割的瓣发射荧光信号，但该信号可以通过将盒切割的瓣与包含淬灭部分的掩蔽寡核苷酸杂交而被可逆地抑制或淬灭(参见图2C)。可以以温度依赖性方式控制盒切割的瓣与掩蔽寡核苷酸之间的杂交相互作用。当在相同的反应混合物中使用时，无瓣FRET盒和5'瓣FRET盒可以在切割反应发生后产生可通过温度变化分辨的信号。
除了区分由无瓣FRET盒(无5'瓣部分)和5'瓣FRET盒产生的荧光的来源之外，所公开的技术还允许分辨由不同5'瓣FRET盒的相同荧光染料产生的信号。图3示意性地展示了由三个不同的FRET盒(无瓣FRET盒；5'瓣FRET盒1；和5'瓣FRET盒2)产生的荧光信号(每个FRET盒用在荧光计的相同通道中可检测的荧光团(例如，相同的荧光团)标记)可以如何在不同的温度条件下彼此区分。图的上部显示了不包含5'瓣的无瓣FRET盒。在与来自初级探针的互补切割的瓣循环杂交后，此FRET盒可以被FEN-1核酸内切酶切割以释放荧光染料，其中从释放的染料发出的荧光不能通过与反应中使用的任何掩蔽寡核苷酸的相互作用而被淬灭。从这种未淬灭染料发射的荧光在任何温度下都是可检测的。图3中的图的中间部分显示了第一5'瓣FRET盒(5'瓣FRET盒1)，其可以在与来自初级探针的互补切割的5'瓣循环杂交后被FEN-1酶切割以释放5'瓣(“盒切割的瓣1”)。在切割反应之后，盒切割的瓣1保持附接在荧光团上，但是如果盒切割的瓣1与互补掩蔽寡核苷酸杂交，则荧光信号被淬灭。对于包含盒瓣1和互补掩蔽寡核苷酸的杂交双链体，这可能在低于Tm的温度下发生。如果温度升高到高于此Tm(“Tm1”)，则盒切割的瓣1的荧光团可以发射荧光信号，从而使盒切割的瓣1处于单链状态(图中的“未淬灭盒切割的瓣1”)。图3中的图的下部显示了第二5'瓣FRET盒(5'瓣FRET盒2)，其可以在与来自初级探针的互补切割的5'瓣循环杂交后被FEN-1酶切割以释放5'瓣(“盒切割的瓣2”)。在切割反应之后，盒切割的瓣2保持附接在荧光团上，但是如果盒切割的瓣2与互补掩蔽寡核苷酸杂交，则荧光信号被淬灭。对于包含盒切割的瓣2和互补掩蔽寡核苷酸的杂交双链体，这可能在低于Tm的温度下发生。如果温度升高到高于此Tm(“Tm2”)，则盒切割的瓣2的荧光团可以发射荧光信号，从而使盒切割的瓣2处于单链状态(图中的“未淬灭盒切割的瓣2”)。将不同的5'瓣FRET盒设计成包含具有不同Tm的5'瓣部分(例如，通过具有不同的长度和/或G:C含量)允许将由不同切割的瓣产生的信号彼此区分开。例如，可以监测由不同的盒切割的瓣的荧光团发射的信号：(1)使得一次仅有一个盒切割的瓣的荧光团发射信号；或(2)根据其随温度的变化来确定解链谱。这两种可替代方案都展示在本文的工作实施例中。
值得注意的是，在使用多种不同的5'瓣FRET盒和掩蔽寡核苷酸的程序中，用于包含5'瓣切割产物(“盒切割的瓣”)和同源掩蔽寡核苷酸的杂交双链体的Tm优选地必须不同。优选地，在相同多重反应(例如，无论是实时核酸扩增反应还是终点解链/退火分析程序)中分析的不同杂交双链体的Tm相差至少2℃，更优选地至少3℃，更优选地至少5℃，更优选地至少7℃，更优选地至少10℃或甚至至少15℃。用于包含盒切割的瓣和同源掩蔽寡核苷酸的杂交双链体的Tm之间的优选差异的范围为2℃至20℃，更优选地5℃至20℃，更优选地5℃至15℃，或甚至更优选地5℃至10℃。在一些实施方案中，掩蔽寡核苷酸和/或FRET盒寡核苷酸的5'瓣可以包含一个或多个核苷酸修饰，以调节或改变掩蔽寡核苷酸-盒切割的瓣双链体的Tm。例如，在一些实施方案中，所述一种或多种核苷酸修饰选自锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、桥接核酸(BNA)、2'-O烷基取代、L-对映异构体核苷酸或其组合。
图4示意性地展示了通过检测不同FRET盒的FEN-1介导的切割产物来鉴定不同靶序列，其中每个FRET盒包含可以在荧光计的相同通道中检测到的荧光染料(例如，显示为相同的HEX荧光团)。指示的切割产物和掩蔽寡核苷酸对应于图3中所示的那些。来自无瓣FRET盒的含荧光团的切割产物(指示靶标1的存在)(上)在所有温度下保持未淬灭。因此，在低于温度1的温度下，其中盒切割的瓣1和盒切割的瓣2与它们各自的掩蔽寡核苷酸杂交，可检测的荧光指示靶标1的存在。来自5'瓣FRET盒1的含荧光团的切割产物(指示靶标2的存在)(中)在高于温度1的温度下保持未淬灭。在高于温度1且低于温度2的温度下，可检测的荧光可指示靶标1和靶标2的存在。由于在该程序中测量的荧光信号是相加的，在高于温度1但低于温度2(图4的中部)的温度下测量的荧光信号与在低于温度1(图4的上部)的温度下测量的荧光信号之间的差异指示由于目标2的存在而产生的信号。来自5'瓣FRET盒2的含荧光团的切割产物(指示靶标3的存在)(下)在高于温度2的温度下保持未淬灭。在高于温度2的温度下，可检测的荧光可指示靶标1、靶标2和靶标3的存在。因此，在高于温度2(图4的下部)的温度下测量的荧光信号与在高于温度1但低于温度2(图4的中部)的温度下测量的荧光信号之间的差异指示由于靶标3的存在而产生的信号。在本图中，温度1<温度2<温度3。可比较不同温度下的荧光检测结果来确定哪个靶标负责促进一个或多个切割反应。在一些实施方案中，这涉及比较荧光信号的大小，其中在不同温度下测量的信号是已知可检测荧光的相加结果，如紧接的上文所述。在一些实施方案中，确定哪个靶标负责促进一个或多个切割反应涉及进行解链/退火曲线分析。
结果处理和设备
可以使用扩增核酸并监测扩增子产生的常规实验室设备来进行本文所公开的程序，所述设备包括具有用适当软件编程的集成或独立计算机或处理器的设备。“计算机”的含义包括由软件控制的嵌入式处理器。计算机可以由制造商或最终用户编程以执行一个或多个温度变化或步骤，优选地允许在扩增反应的循环发生时监测反应混合物内的荧光。优选地，反应混合物包含在保持在核酸扩增设备内的反应器皿(例如，管或多孔板的孔)内。然而，也有可能在扩增反应完全后完成扩增产物的分析(例如，以建立扩增产物的解链/退火曲线)。后一种分析甚至可以在扩增核酸的设备之外完成。
可以用软件指令编程用于执行所公开的技术的设备的计算机组件，所述软件指令“使”计算机执行某些步骤。这些步骤可以涉及以下任何步骤：控制扩增核酸的热循环仪；接收来自荧光计的输入，所述荧光计监测在侵入性切割反应中发生FRET盒切割的反应混合物中的荧光发射；或处理结果以确定两个或更多个FRET盒中的哪一个被切割从而产生荧光信号。在优选的实施方案中，FRET盒切割以产生荧光切割产物，其中可以在荧光计的单个通道中检测或测量由不同切割产物产生的荧光。在一些实施方案中，用相同的荧光团标记不同的FRET盒。也可以使用计算机执行数学步骤(例如，加法、减法、乘法和/或除法)，从而确定混合物中的哪个FRET盒被切割从而产生可检测或可测量的荧光信号。
可以使用自动化核酸分析仪(如扩增核酸并监测核酸扩增产物的产生的装置)进行本文所公开的方法。这些分析仪包括PCR仪器或可被编程执行一系列温度循环步骤的实时PCR仪器。优选地，PCR仪器配备有监测在管或多孔板(通常为反应“接收容器”)的孔内发生的反应的进展的荧光计。配置用于进行和监测实时PCR反应的仪器特别优选地与所公开的技术一起使用。用于执行、监测和评估可通过所公开的技术获得的结果的优选设备的一个例子是Panther Fusion System(Hologic,Inc.；加利福尼亚州圣地亚哥)，其有利地将程序的步骤自动化。另一个优选的设备是ABI 7500实时PCR系统(ThermoFisher Scientific；纽约)。
用于评估无瓣FRET盒和一个或多个5'瓣FRET盒的混合物中荧光切割产物的状态的一种通用方法涉及分别评估两种类型的FRET盒的切割。此程序可能涉及将反应混合物温度降低到低于对于混合物中掩蔽寡核苷酸与5'瓣FRET盒的荧光切割产物之间形成的任何双链体最低Tm。结果是，残余荧光信号来源于不能淬灭的荧光切割产物，并且因此在荧光随温度变化的一阶导数图上展现出恒定值。因此，当来自其他荧光切割产物的荧光由于与掩蔽寡核苷酸形成双链体而被淬灭时，测量或检测残余荧光信号(例如，超过背景荧光的特定信号)可以指示非可淬灭的荧光切割产物存在。在这种条件下检测荧光信号可以指示反应混合物中存在非可淬灭的荧光切割产物，因此对应的FRET盒被切割。在第二步中，可以得到对于含有荧光切割产物的反应混合物的温度依赖性解链/退火曲线(有时为“淬灭谱”)，并由此得到导数图。例如，随温度变化的荧光变化的一阶导数图将包括对应于反应混合物中存在的不同双链体的峰或最大值，其中双链体形成使来自其中包含的荧光切割产物的信号淬灭。通过这种方式，可以确定哪一个或多个FRET盒被切割以产生荧光切割产物。
本文通过使用不同FRET盒的侵入性切割对两种或三种分析物进行多重检测来展示示例性系统，其中FRET盒包含可以在荧光计或荧光监测设备的单个通道中被检测或监测的荧光标记。在一些实施方案中，在多重程序中使用多个FRET盒。例如，可以将两个不同的FRET盒在单个反应混合物中组合，其中只有一个FRET盒包含与包含在相同反应混合物中的掩蔽寡核苷酸互补的5'瓣序列。另一个FRET盒可以是不包含任何5'瓣序列的无瓣FRET盒，或可替代地可以是不包含互补掩蔽寡核苷酸的反应混合物中的5'瓣FRET盒。在此类情况下，仅切割两个FRET盒中的一个产生的荧光信号将经历温度依赖性荧光淬灭。如上所述，通过切割FRET盒产生的荧光信号随着反应混合物的温度变化而保持基本恒定，其中荧光切割产物不与任何掩蔽寡核苷酸相互作用以淬灭荧光。这种非可淬灭的荧光切割产物的检测可以涉及在这样的温度下检测荧光信号(例如，高于背景的荧光信号)，在所述温度下包含掩蔽寡核苷酸的双链体的形成使来自在反应混合物中在相同荧光通道中监测的所有其他可淬灭的荧光切割产物的荧光信号淬灭。在多重反应混合物中检测可淬灭的荧光切割产物可以涉及简单地确定，与低于Tm的温度(在此温度下荧光淬灭最大)相比，在高于对于掩蔽寡核苷酸双链体形成的Tm的温度下可测得的荧光信号更大。
在不同的实施方案中，多重反应混合物包含两个不同的FRET盒，其中每个FRET盒包含可切割的5'瓣序列，并且其中可以通过与不同的互补掩蔽寡核苷酸杂交来淬灭由每个切割的5'瓣发射的荧光信号。确定哪个FRET盒在反应混合物中被切割可以涉及导数分析，优选地涉及解链/退火曲线的一阶导数图，也如上所述。通过这种方法，可以在单个程序中分辨和鉴定多种切割产物。
在一些实施方案中，多重侵入性切割反应包含三个或更多个不同的FRET盒，每个盒用在荧光计的单个通道中可检测的荧光标记(例如，所有荧光标记可以是相同的)标记。FRET盒可以各自包含在切割后发射荧光信号的不同的可切割的5'瓣序列，其中可以在互补掩蔽寡核苷酸杂交后以温度依赖性方式淬灭荧光信号。当通过不同荧光盒切割的瓣的杂交形成的双链体的特征在于不同的Tm时，可以通过评估解链/退火特征(例如，使用导数分析)来容易地确定双链体的身份。以下使用一阶导数图来检测和鉴定包含与掩蔽寡核苷酸杂交的荧光切割产物的双链体来说明这一点。仍进一步地，在多重反应中使用的FRET盒之一可以产生在反应混合物中不淬灭的荧光切割产物。在这种情况下，聚集的切割产物仍然可以被说成展现出不同的温度依赖性荧光淬灭谱，因为一些产物在不同的温度下展现出荧光淬灭，而一种产物没有展现出荧光淬灭。实际上，随着反应混合物的温度变化，可以通过监测荧光信号来区分不同的切割产物。这可能涉及当温度从高到低变化(例如，以允许互补链的退火以形成双链体)或可替代地从低到高变化(例如，以促进预先形成的双链体的解链)时监测荧光信号。因此，温度依赖性荧光淬灭谱有时被称为“解链/退火”曲线或谱。
可以通过不同的方法分析在多重侵入性切割反应中产生的荧光切割产物的差异淬灭的结果，以确定哪种可替代的FRET盒被切割以产生可在荧光计或荧光检测装置的单个通道中检测的荧光信号。可以自动化(例如，通过计算机、处理器或控制器)的两种优选的分析方法涉及：(1)评价在不同荧光切割产物由于掩蔽寡核苷酸杂交而经历较多或较少荧光淬灭的温度下荧光读数或测量值之间的差异；和(2)评价荧光淬灭谱(即，在互补掩蔽寡核苷酸的存在下测量的随温度变化的荧光)，例如使用数学导数分析通过反应混合物中形成的双链体的特征解链温度(即，“Tm”)来鉴定双链体。在某些优选实施方案中，可以将这些不同方法的组合用于分辨多个不同FRET盒中的哪一个被在反应混合物中切割，其中不同的切割产物包含在荧光计的相同通道中检测的荧光团。在一些实施方案中，不同的FRET盒包含相同的荧光团。例如优选地通过以下方式分析含有不与掩蔽寡核苷酸相互作用以实现淬灭的荧光切割产物以及与同源掩蔽寡核苷酸杂交的一种或多种荧光切割产物的反应混合物：评价在高于和低于包含掩蔽寡核苷酸和5'瓣FRET盒的互补荧光切割产物的双链体的Tm的温度下测量的荧光之间的差异以及随温度变化的荧光变化的导数图(例如，一阶导数图)。
可以通过以下方式分析在多重侵入性切割测定中用于产生两种荧光切割产物(其中只有一种受到温度依赖性淬灭)的FRET盒的切割：评估两个温度下的荧光发射，或可替代地使用这种评估方法连同曲线分析通过Tm鉴定双链体。在反应混合物中不能淬灭的荧光切割产物在测量的温度范围内一致地保持荧光，并且因此在随温度变化的荧光图上具有恒定的斜率(即，零斜率)。随温度变化的荧光变化的一阶导数图将不会展现出指示任何双链体的Tm的任何最大值。相反，指示存在经历温度依赖性淬灭(即，由于掩蔽寡核苷酸杂交)的荧光切割产物的一阶导数图将展现出指示包含荧光切割的5'瓣的双链体的Tm的峰。仍进一步地，在两个温度下测量的荧光信号的简单评估可以指示两种荧光切割产物中的每一种的存在或不存在。更特别地，可以在高于反应混合物中的双链体的Tm的一个温度(即，不发生荧光淬灭时的温度)下，以及在低于反应混合物中的双链体的Tm的第二温度(即，形成双链的温度；完全荧光淬灭)下测量或检测荧光。
在一些情形下，单个非可淬灭的荧光切割产物(例如，由无瓣FRET盒的切割产生，或在不存在互补掩蔽寡核苷酸的情况下由盒切割的瓣产生)存在于具有一种或多种可淬灭荧光切割产物的反应混合物中。如果在低于含有另一荧光切割产物的双链体的Tm的温度(此温度下荧光计通道中荧光淬灭最大)下在荧光计通道中测量到可检测荧光信号，则确定存在未通过掩蔽寡核苷酸杂交而淬灭的荧光切割产物。换句话说，在双链体淬灭来自反应混合物中其他切割产物的荧光的点处的可测量荧光(即，高于背景信号阈值的特定信号)指示存在未通过掩蔽寡核苷酸杂交而淬灭的荧光切割产物。如果在高于Tm的温度(例如，荧光淬灭最小时的温度)下测量的荧光信号超过在低于Tm的温度(即，荧光淬灭完全时的温度)下测量的荧光信号，则可以确定存在通过掩蔽寡核苷酸杂交而淬灭的荧光切割产物。
在一些实施方案中，特别是当通过掩蔽寡核苷酸杂交经历淬灭的多种不同的荧光切割产物与未经历淬灭的一种荧光切割产物组合时，期望将这两种方法组合使用。在此类情形下，可以生成解链/退火曲线并通过导数分析进行评估，以通过检测淬灭荧光的双链体的Tm来确定可淬灭荧光切割产物的存在。同样，可以将解链/退火曲线上对应于完全荧光淬灭和/或不存在荧光淬灭的点用于上述评估。更特别地，可以在由掩蔽寡核苷酸杂交导致的淬灭完全时的降低的温度下评估不经历淬灭的荧光切割产物的存在。当在反应混合物中淬灭完全(即，最大)时检测到残余荧光信号指示非可淬灭荧光切割产物的存在。对于单个可淬灭的荧光切割产物，与在低于双链体形成的Tm的温度(例如，在此温度下双链体形成并且稳定)下的荧光读数相比，在大于对于双链体形成的Tm的温度(例如，在此温度下不存在双链体)下的更高的荧光读数指示可淬灭的荧光切割产物的存在。
可以通过使用导数分析处理解链/退火曲线结果来方便地评估包含多于一种不同荧光切割产物(其中每种产物通过掩蔽寡核苷酸杂交经历淬灭)的反应混合物，以鉴定混合物中可能存在的双链体的Tm。例如，可以处理解链/退火曲线以计算一阶导数，然后建立随温度变化的荧光变化的一阶导数图。一阶导数图上的峰或最大值对应于掩蔽寡核苷酸与互补荧光切割产物之间的双链体的Tm。当每个双链体的特征在于不同的Tm时，可以彼此独立地检测双链体。还考虑更高阶导数用于鉴定双链体，并确定多个FRET盒中的哪一个被切割以产生荧光信号。如本文其他地方所述，期望具有以最小温度差异间隔开的对于不同双链体的Tm，以促进一个双链体与另一个或多个双链体的区分。
在上述描述中包含这样的软件，其使计算机处理结果并确定FRET盒的混合物中的哪个FRET盒产生切割产物。
实施例
本文展示了用于使用至少一个5'瓣FRET盒(即，具有5'瓣部分的FRET盒)(其中其5'瓣部分包含荧光标记)进行多重检测的技术。在侵入性切割测定中由FEN-1核酸内切酶切割5'瓣FRET盒后，可基于温度选择性淬灭从荧光标记发射的信号。在一些实施方案中，侵入性切割测定包含初级和二级侵入性切割反应二者。在一些其他实施方案中，侵入性切割测定包含二级侵入性切割反应，而不包含初级侵入性切割反应。可以理解的是，FEN-1介导的切割将5'瓣FRET盒的荧光团和淬灭剂部分物理分离到不同的寡核苷酸分子上，从而解除完整的5'瓣FRET盒所特有的荧光淬灭。从切割的5'瓣发出的荧光的淬灭是由切割的5'瓣与包含淬灭剂部分的互补掩蔽寡核苷酸的温度依赖性杂交介导的。通过这种方法，可淬灭的瓣不是与待检测的靶核酸杂交的任何探针的一部分。相反，可淬灭的瓣可以是在等温条件下在没有聚合的情况下发生的线性扩增反应的产物。
根据本公开文本，可以使用单通道荧光检测来检测报告不同靶分子的5'瓣FRET盒。用于不同FRET盒的荧光标记可以是相同的荧光标记。在一些实施方案中，在具有不同5'瓣的FRET盒上使用相同的荧光标记。可以使用不同的荧光标记来替代相同的标记，前提是可以在光学检测器(例如，荧光计)的相同荧光通道中检测不同的标记。在所有情形下，切割FRET盒以产生荧光信号是由FEN-1酶(即，非聚合瓣状核酸内切酶)介导的。来自初级探针的切割的5'瓣在FRET盒的切割中起催化作用，这意味着5'瓣与FRET盒瞬时杂交，促进切割以释放荧光信号，然后去杂交以允许切割的瓣与新的FRET盒相互作用。从与待检测的核酸靶标杂交的初级探针切割的5'瓣优选地不包含荧光团部分。
实施例1展示如何使用单通道或双通道荧光检测在相同反应混合物中扩增和检测两种不同的核酸序列(分析物A和分析物B)。通过聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。使用采用荧光标记的FRET盒的侵入性切割反应来检测PCR反应的产物。使用具有第一标记(六氯荧光素或“HEX”)的FRET盒检测分析物A，所述第一标记在实时PCR仪器的荧光计组件的HEX通道中是可检测的。在相同反应混合物中使用两个不同的FRET盒中的任一个检测分析物B，其中每个FRET盒包含不同的标记。用于检测分析物B的第一5'瓣FRET盒包含在PCR仪器的HEX通道中也可检测的第二标记。由连接到从此FRET盒切割的5'瓣的标记发射的信号指示分析物B的存在，并且在将FRET盒的切割的5'瓣与互补掩蔽寡核苷酸杂交后经历淬灭。用于检测分析物B的第二FRET盒包含在PCR仪器的ROX通道中可检测的标记，其中切割后发射的荧光信号不经历淬灭。值得注意的是，在实时扩增和检测仪器的ROX通道中检测到的信号在仪器的HEX通道中基本上检测不到，反之亦然。换句话说，荧光HEX信号在ROX通道中基本上不可检测，并且荧光ROX信号在HEX通道中基本上不可检测。结果证实，两种分析物核酸中的每一种都可以被扩增，并且可以使用在PCR仪器的相同或不同光学通道中检测的荧光团来监测不同扩增产物的合成。
实施例1
单个反应中的两种分析物核酸的单通道或双通道荧光检测
将反应混合物制备为重复试样，其中每个反应混合物包含已吸收到水性重构缓冲液中的冻干组合物。冻干组合物包含dNTP、热稳定的DNA聚合酶(例如，来自威斯康星州麦迪逊的Promega Corporation的Taq DNA聚合酶)、FEN-1瓣状核酸内切酶(例如，来自马萨诸塞州马尔伯勒的Hologic Inc.的Cleavase 2.0酶)、寡核苷酸和海藻糖。对于待检测的两种分析物核酸中的每一种，冻干组合物中的寡核苷酸包括：引物对、具有与待扩增和/或待检测的分析物序列非互补的5'瓣的初级探针、以及在从初级探针切割的5'瓣的杂交后可由FEN-1酶切割的FRET盒。在此实施例中，促进从初级探针切割5'瓣的寡核苷酸也用作核酸扩增反应中的引物。在等温循环杂交反应中，两个不同的初级切割的瓣(一个来自与分析物A和分析物B互补的每个初级探针)与三个不同的FRET盒可逆地杂交。FRET盒1(用于检测分析物A)是用HEX荧光团和BlackBerry Quencher部分(Berry&Associates；密歇根州Dexter)标记的无瓣FRET盒。在FRET盒1的切割后，在用于扩增核酸和监测扩增反应进展的仪器的HEX通道中可检测到来自HEX荧光团的发射信号。FRET盒1不包含5'瓣序列。FRET盒2也是无瓣FRET盒，其不包含5'瓣但用CAL Fluor Red 610荧光团(Biosearch Technologies,Inc.；加利福尼亚州诺瓦托)和淬灭剂部分(Biosearch Technologies,Inc.)标记，并用于检测分析物B。在切割反应后，在用于扩增核酸和监测扩增反应进展的仪器的ROX通道中而不是在HEX通道中可检测到来自CAL Fluor Red 610荧光团的发射信号。也用于检测分析物B的FRET盒3，是在5'瓣上标记有CAL/>Orange 560荧光团的5'瓣FRET盒，所述荧光团用附接到发夹部分的/>淬灭部分(Biosearch Technologies,Inc.)淬灭。在切割反应后，在用于扩增核酸和监测扩增反应进展的仪器的HEX通道中可检测到来自CAL/>Orange560荧光团的发射信号。与FRET盒3的5'瓣互补并且包含/>淬灭部分(BiosearchTechnologies,Inc.)的掩蔽寡核苷酸以超过FRET盒3的三倍摩尔过量包含在反应混合物中。
程序中使用的靶分析物、FRET盒配置和检测通道总结在表1中。
表1多重检测系统
| HEX通道 | ROX通道 | 掩蔽寡核苷酸 | |
| FRET盒1(分析物A) | X | ||
| FRET盒2(分析物B) | X | ||
| FRET盒3(分析物B) | X | X |
采用表1中呈现的检测系统的扩增反应包含单独的分析物A靶标、单独的分析物B靶标或分析物A和分析物B靶标的组合。“无靶标”阴性对照反应包含所有试剂，但不包含添加的模板。每个反应包含所有三个FRET盒和掩蔽寡核苷酸。使用ABI 7500实时PCR系统仪器(ThermoFisher Scientific；纽约格兰德岛)进行热循环和荧光监测。反应条件包括以下的10个循环：95℃持续120秒、69℃持续5秒、67℃持续5秒、65℃持续6秒和72℃持续5秒。随后进行以下的40个循环：95℃持续10秒、69℃持续5秒、67℃持续5秒、65℃持续25秒。在掩蔽寡核苷酸保持未杂交以从FRET盒3释放5'瓣的温度下，收集实时PCR仪器的ROX通道和HEX通道的荧光发射数据。在HEX和ROX通道中测量随包含分析物B和分析物A二者的反应的循环数变化的荧光信号。ROX通道中的信号(数据未示出)导致S形曲线，这反映了信号的循环依赖性增加，表明分析物B在PCR反应中扩增。HEX信号反映了来自分析物B和分析物A的扩增的组合信号，但不区分两者(数据未示出)。HEX和ROX荧光信号在扩增分析物B和分析物A的多重反应中可独立检测。
图5A-图5C展示了在HEX通道中测量随包含单独的分析物或组合的反应的循环数变化的信号，如图所示。图5A中的图证实，在不存在添加的分析物B模板的情况下，可以检测到扩增的分析物A，并显示出对于此分析物的信号累积的特征S形曲线。图5B展示了在HEX通道中测量的信号，所述信号指示在不存在分析物A模板的情况下分析物B模板的扩增。在这种情形下，单调信号累积曲线缺乏图5A中所示曲线的S形特征。图5C显示了在扩增反应中检测到的信号，所述扩增反应在单个反应中包含分析物A模板和分析物B模板二者。这里，在HEX通道中测量的信号以产生延伸的S形曲线的方式增加，表示在荧光计的单个通道中测量到的由分析物A和分析物B FRET盒产生的组合信号。在这种情形下，在荧光计的单个(即，相同)通道中检测到由非相同的荧光团产生的信号。如本文其他地方所讨论的，可以使用解链/退火曲线分析和曲线形状的分析(例如，一阶导数分析)来推断产生每个不同结果的分析物的身份。
实施例2展示了这样的程序，所述程序用于使用掩蔽寡核苷酸淬灭来自用于检测分析物B的5'瓣FRET盒的信号来分辨多重扩增反应混合物中不同分析物核酸的身份。只有从与掩蔽寡核苷酸互补的切割的5'瓣的标记发出的荧光经历淬灭。
实施例2
终点解链/退火曲线分析区分扩增的靶标
在用于核酸扩增的相同实时PCR仪器上，将来自实施例1的PCR后反应混合物用于解链/退火曲线分析。这涉及在温度从90℃到21.4℃之间变化时监测实时PCR仪器的HEX通道中的荧光信号的大小。
扩增后解链/退火曲线分析的结果呈现在图6中。这些数据证实，专门用于检测分析物A的FRET盒的切割产物一致地保持随温度变化的荧光(即，在所示的温度范围内)，所述切割产物具有由用掩蔽寡核苷酸不可淬灭的无瓣FRET盒产生的HEX通道信号。相比之下，在包含淬灭部分的掩蔽寡核苷酸的存在下，在专门用于检测分析物B的5'瓣FRET盒3的切割后产生的HEX通道信号展现出温度依赖性荧光淬灭。更具体地，当温度接近20℃时，仅掺入分析物B模板的反应混合物中的荧光被有效淬灭，从而荧光信号降低到500,000RLU。凭借经验观察到，基本上所有的荧光都在略低于40℃的温度下被淬灭。对于包含分析物A和分析物B模板的反应，HEX通道中的信号基本上是单独的温度谱的组合。更具体地，此解链/退火曲线的谱遵循分析物B模板化反应的解链/退火曲线，但是通过在模板化反应中添加由分析物A的存在引起的不变荧光，信号整体上增加。当温度接近20℃时，指示分析物B存在的信号被淬灭，因此混合反应中的荧光接近在仅分析物A的反应中观察到的信号水平。如图所示，在包含分析物B模板的反应混合物中，荧光在约63℃时最大，并且在高于63℃时减少。虽然不希望受到任何特定操作理论的限制，但在高于63℃时荧光的这种减少可能是由于对荧光团的温度依赖性缓冲效应，因为掩蔽寡核苷酸杂交可能在比5'瓣掩蔽寡核苷酸双链体的Tm高得多(例如，高10℃-20℃)的温度下减少或完全丧失。
如本文所公开的，可以以不同的方式处理使用用于核酸分析物的多重检测的侵入性切割系统获得的结果，以确定测试样品中分析物的存在或不存在。例如，可以将在单个通道(例如，本图中的荧光计的HEX通道)中在两个不同温度(例如，63℃和30℃)下测量的荧光信号与阈值比较，以确定两种不同分析物中的每一种的存在或不存在。阈值可以被预先设定(即，在进行测定之前)，或在进行测定时设定(例如，使用一个或多个具有一种或多种待检测分析物的校准标准)。可以使用在2.2x106RFU和1x106RFU下的示例性阈值以及图6的结果来说明此分析方法。在这些参数下，在63℃下大于2.2x106RFU的荧光读数指示检测到分析物B，而低于此阈值的读数指示不存在分析物B。在63℃下在1.0x106RFU与2.2x106RFU之间的荧光读数指示存在分析物A而不存在分析物B。同样地和可替代地，在30℃下大于1x106RFU的荧光读数指示存在分析物A。这样的读数不提供关于分析物B的存在的信息，因为在该温度下，来自切割的5'瓣的荧光指示该分析物的存在基本上被完全淬灭。在30℃下，小于1x106RFU的荧光读数指示不存在分析物A。
可以使用基于导数的数据分析方法来替代上述基于阈值的分析或与上述基于阈值的分析组合使用。例如，与分析物A的存在相关的数据图(参见图6作为示例)具有恒定的斜率(例如，零斜率)以及是约5x105RFU的背景荧光的至少两倍的荧光大小。可以用此荧光大小(例如，在反应混合物中荧光淬灭最大时的温度下测量的)来指示分析物A的存在。与分析物B的存在相关的数据图展现出在约50℃-58℃的范围内的一阶导数最大值，其中在63℃下具有过零点(即，穿过x轴指示零斜率)。任何展现出这些特征的数据集都可以被解释为指示分析物B的存在。在一些实施方案中，可以将在特定温度下的荧光大小用于基于阈值的分析，并且可以将荧光的温度依赖性变化速率用于基于导数的数据分析，并且可以将这两种分析组合以确定可能存在于测定反应中的多种分析物中的每一种的存在或不存在。
总之，上述结果和讨论表明，对于三种不同的起始靶标条件(即，仅分析物A、仅分析物B、或分析物A与分析物B的组合)中的每一种，独特的谱描绘了解链/退火曲线的特征。这些数据表明，使用单个检测通道的终点解链/退火曲线分析容易地分辨反应混合物中存在哪个或哪些靶标。
前面的实施例展示了使用实时和终点形式的核酸分析使用侵入性切割反应检测两种不同的扩增的核酸靶序列。在反应发生时在监测核酸扩增的仪器的荧光计组件的单个光学通道(即，HEX通道)中检测到对于不同扩增靶标的荧光信号(例如，随时间或循环数变化)。程序利用了这样的事实，即包含掩蔽寡核苷酸和含有荧光标记的切割的瓣的杂交双链体在低于双链体的Tm的温度下是稳定的，并且在高于双链体的Tm的温度下不稳定。结果表明，在约39℃下观察到最大淬灭，并且在约63℃下观察到最小淬灭。总之，图5和图6所示的结果显示了如何仅使用荧光计的单个光学通道在多重反应混合物中检测并分辨多种不同的核酸分析物。虽然这是使用在荧光计的相同光学通道中检测到的不同荧光团物质来实现的，但可以使用单一种类的荧光团来代替(例如，如下所示)。此外，本领域普通技术人员将理解如何用不同的荧光标记替代上述示例性标记，并将理解如何使用HEX通道以外的仪器通道来检测那些标记。
实施例3描述了用于使用PCR仪器的实时监测和荧光计的仅单个光学通道来检测多种分析物的存在或不存在的程序。这里，循环程序包括温度步骤，在此温度步骤下通过掩蔽寡核苷酸的荧光淬灭允许测定两种分析物中的每一种的存在或不存在。更具体地，在PCR程序的循环过程中，在63℃和39℃下测定荧光读数。如下所示，所述技术以实时形式区分在单个光通道中测量的双信号。根据处理实时扩增运行曲线的标准程序，通过确定达到扩增阈值水平的循环数(例如，Ct值)，可以将此程序有利地用于将每种检测到的分析物定量。然后可以将所确定的Ct值与校准图或方程比较，所述校准图或方程将阈值与分析物核酸的量或浓度相关联。可替代的实时程序可以确定分析物核酸是否以高于或低于指定(例如，预先确定)量或浓度水平存在于多重反应混合物中。这可能涉及确定特定的反应进度水平(例如，通过Ct值测量)是否通过指定的循环数实现。值得注意的是，在先前的实施例使用在连接到PCR仪器的荧光计的相同光学通道中检测到的两种不同的荧光团的情况下，这里使用相同的荧光团物质检测到两种不同分析物。
实施例3
使用单个荧光团物质实时监测多重扩增
如下制备用于实时扩增方案的反应混合物。从标准原液制备包含分析物A靶序列的质粒DNA的系列稀释液。含有分析物B靶序列的野生型细菌基因组DNA用作扩增该分析物的模板核酸的来源。使用水性缓冲液重构实施例1中所述的冻干沉淀物，然后掺入专门用于检测分析物B的5'瓣FRET盒和对应的掩蔽寡核苷酸中的每一种。此外，通过来自初级探针的初级切割的瓣催化在反应混合物中的FRET盒的切割。
使用多孔PCR板一式两份制备四种反应混合物(每份一个板以展示高温和低温监测)。阴性对照混合物没有接收分析物A或分析物B的核酸模板。第二组混合物仅接收包含分析物B模板的细菌基因组DNA，而没有接收分析物A质粒。第三组混合物仅接收分析物A质粒，而不接收含有分析物B模板的细菌基因组DNA。第四组混合物接收含有分析物B模板的细菌基因组DNA和分析物A质粒二者。所有试验都包括相比于用于检测分析物B的对应5'瓣FRET盒三倍过量的掩蔽寡核苷酸。使用在63℃(“高”温监测)下进行荧光监测的第一组循环条件或在39℃(“低”温监测)下进行荧光监测的第二组循环条件，在ABI 7500实时PCR仪器上进行具有对通过FRET盒的侵入性切割产生的荧光信号的监测的PCR反应。用于高温(63℃)荧光监测的循环条件如下：(1)95℃持续120秒；(2)95℃持续15秒；69℃持续5秒；67℃持续5秒；65℃持续6秒；和72℃持续25秒x10个循环(初始Taq最佳阶段)，以及(3)95℃持续10秒；69℃持续5秒；67℃持续5秒；65℃持续5秒；和63℃持续25秒x40个循环。用于低温(39℃)荧光监测的循环条件如下：(1)95℃持续120秒；(2)95℃持续15秒；69℃持续5秒；67℃持续5秒；65℃持续6秒；和72℃持续25秒x10个循环(初始Taq最佳阶段)；以及(3)95℃持续10秒；69℃持续5秒；67℃持续5秒；65℃持续5秒；和39℃持续25秒x40个循环。在高温和低温下的荧光监测进行总共50个循环。
程序的结果呈现在图7A-图7D的实时PCR扩增图中。最令人感兴趣的结果是单独使用分析物B模板或分析物B模板与分析物A模板组合进行的试验。单独使用分析物A模板的反应被视为对照，并且未在图中呈现。
图7A和图7B显示了随循环数变化的分析物B特异性荧光，其中在63℃(无荧光淬灭)或在39℃(通过掩蔽寡核苷酸淬灭荧光)下在PCR仪器的HEX通道中测定到荧光。在63℃下，从约第12个循环开始并持续到第40个循环，高于背景的荧光明显增加，如图7A所示。在整个程序中，在39℃下进行的荧光测量基本上保持在背景水平，如图7B所示。这些数据证实，由于切割的瓣与互补掩蔽寡核苷酸的杂交，因此分析物B荧光信号的淬灭在较低的温度下是基本上完全的。在图7B的图中，在较低温度(39℃)下观察到的荧光是由于背景荧光导致的，而不是由于指示分析物B存在的信号导致的。
图7C和图7D显示了通过监测在扩增和检测分析物B和分析物A模板核酸的组合的反应中产生的荧光信号而获得的实时运行曲线结果。图7C中所示的曲线反映了通过两个FRET盒的切割产生的荧光的综合贡献，其中在63℃的温度步骤期间测量荧光读数。只有指示分析物B的存在的FRET盒的切割才会产生荧光瓣序列，所述荧光瓣序列可以与掩蔽寡核苷酸杂交，从而在39℃下淬灭荧光信号。如图7C所示，在63℃的温度步骤(即，无荧光淬灭)下测量的荧光信号在约第11个循环开始上升到背景水平以上，并在约第19个循环进入对数线性期。荧光增加的速率在约第29个循环开始逐渐降低，但信号的大小继续增加。图7D所示的曲线反映了在39℃的温度步骤期间测量的荧光读数。因为来自切割的瓣的指示分析物B存在的信号在此温度下被有效地淬灭，所以图7D中测量的荧光仅来自指示分析物A存在的切割反应。
总之，图7A-图7D中呈现的结果表明，单个反应混合物可以用于使用仅单个荧光检测通道的实时监测(例如，监测来自单个荧光团物质的发射)来检测多个靶核酸，并且可以通过监测不同温度下的荧光发射来区分每个靶标。如所公开的技术所实践的，一个温度对应于荧光淬灭的状况(即，由于切割的瓣导致的荧光基本上完全淬灭或最大淬灭)。分析物B的检测展示了这种状况。所述程序中的不同温度不会淬灭由切割的瓣产生的荧光。
尽管用于产生图7A-图7D所示结果的反应是在相同仪器上依序进行的(即，在63℃步骤或39℃步骤期间进行荧光测量)，但优选在两个温度步骤中监测单个反应混合物的荧光，以简化系统中多个分析物的检测。此外，这是可能的，因为通过荧光淬灭从双阳性样品(即，具有分析物B和分析物A的样品)有效地去除了分析物B信号的检测，从而只留下指示分析物A存在的信号。
如上所述，可以将来自多重反应混合物的实时监测的结果用于将分析物核酸定量，或确定分析物核酸是否以大于或小于阈值量或浓度(例如，甚至为零浓度)的量存在。在一些实施方案中，分析物核酸的定量可以涉及将确定的Ct值与将Ct值与分析物浓度相关联的校准图或方程比较。在其他实施方案中，确定分析物核酸是否以大于或小于阈值量或浓度的量存在可以涉及确定时间依赖性荧光值是否达到特定时间或循环数下的反应进展水平。以图7A-图7D中的数据为例，关于分析物的存在或不存在的定性确定可以涉及确定是否通过30个PCR循环获得至少500,000RFU(相对荧光单位)的荧光读数。图7B和图7D中由于检测分析物B而产生的荧光信号已通过荧光淬灭有效去除。与图7B的图相比，图7A的图中观察到的增加的信号指示由检测分析物B引起的荧光的贡献，并且因此证实了反应混合物中存在该靶标。因此，比较图7A和图7B的结果将指示反应混合物仅含有分析物B而不含有分析物A。与图7D的图相比，图7C的图中观察到增加的信号指示由在该反应混合物中检测分析物B引起的荧光贡献。此外，图7D中绘制的剩余荧光是由于分析物A的检测产生的信号。因此，比较图7C和图7D的结果将指示反应混合物含有分析物A和分析物B二者。可以使用类似的过程来评估三种不同分析物的存在或不存在。
实施例4描述了使用侵入性切割反应在单个反应混合物中检测三种不同的分析物核酸序列的程序，其中三个FRET盒用相同的荧光团(即，HEX)标记。当然，可以将可在与扩增核酸的仪器光通信的荧光计的相同或不同的单个光学通道中检测的其他荧光团用作HEX荧光团的取代。
实施例4
使用单一类型的荧光团进行的三种分析物核酸的多重检测
在相同反应混合物中使用三组不同的寡核苷酸对通过PCR扩增的三种分析物核酸进行侵入性切割检测。使用每组检测寡核苷酸来检测三种分析物(分析物A、分析物B和分析物C)中不同的一种。每种测定反应采用：(1)具有靶标特异性结合序列和与待检测的靶扩增产物不互补的独特5'瓣的独特初级探针；(2)独特的寡核苷酸(称为“侵入性引物”)，当初级探针与其同源靶核酸杂交时，所述独特的寡核苷酸充当侵入性寡核苷酸从初级探针切割5'瓣，并在扩增反应中进一步充当引物；和(3)独特的FRET盒。用HEX荧光团和淬灭剂部分标记三个不同FRET盒中的每一个。用于指示分析物A存在的FRET盒不包含与反应混合物中的任何掩蔽寡核苷酸杂交的5'瓣。更具体地，使用实施例1的侵入性引物、初级探针和无瓣FRET盒检测分析物A。用于检测分析物B和分析物C的FRET盒包含5'瓣序列。程序中使用的FRET盒连同来自初级探针的相关切割的瓣和掩蔽寡核苷酸一起展示在图3中。用于检测分析物A、C和B的FRET盒系统分别显现在图的上部、中部和下部。
多重反应混合物包含两种不同的掩蔽寡核苷酸，一种与用于检测分析物B的FRET盒的5'瓣互补，并且另一种与用于检测分析物C的FRET盒的5'瓣互补。每个掩蔽寡核苷酸在其5'端包含淬灭部分。用于分析物B的FRET 5'瓣-掩蔽寡核苷酸双链体的GC含量为约60％，并且用于分析物C的FRET 5'瓣-掩蔽寡核苷酸双链体的GC含量为约40％。两个双链体的特征在于Tm不同。用于检测分析物B的5'瓣FRET盒的切割产物和互补掩蔽寡核苷酸形成更高稳定性的双链体以用于“高温”检测，用于检测分析物C的5'瓣FRET盒的切割产物和互补掩蔽寡核苷酸形成更低稳定性的双链体以用于“低温”检测。
单独的反应混合物包含所有测定寡核苷酸(包含所有三个FRET盒)，以及所有对于进行三种分析物核酸的PCR扩增、对不同分析物核酸具有特异性的初级探针的切割和对应的FRET盒的切割所需的试剂。反应包含仅分析物A、仅分析物B、仅分析物C或分析物A和B和C的组合。热循环条件如下：(1)95℃持续120秒x1个循环；(2)95℃持续15秒，69℃持续5秒，67℃持续5秒，65℃持续6秒，以及72℃持续25秒x10个循环(初始Taq最佳阶段)；和(3)95℃持续10秒，69℃持续5秒，67℃持续5秒，以及65℃持续25秒x40个循环。在ABI 7500实时PCR仪器上进行90℃至20.7℃范围内的扩增后解链/退火曲线分析。
图8显示了使用三种分析物多核苷酸中的每一种单独或相互组合进行的反应的扩增后解链/退火曲线结果。结果证实，四种反应中的每一种都产生了独特的解链/退火曲线谱，从而证明了使用单一类型的荧光团对三种分析物进行单通道多重化的成功。
图9的两个小图中所示的结果展示了针对另外的分析物组合观察到的独特的解链/退火曲线谱。图9的左侧小图显示了单独扩增分析物B和分析物C的反应的解链/退火曲线结果。结果展示了如何仅使用实时PCR仪器的单个荧光监测通道就可以将来自每个FRET盒的切割的5'瓣彼此区分开来，其中切割的5'瓣与不同的掩蔽寡核苷酸杂交。图9的右侧小图显示了扩增单独的分析物B、单独的分析物C或分析物B和分析物C的组合的反应的解链/退火曲线分析结果。此外，这些结果展示了如何仅使用实时PCR仪器的单个荧光监测通道就可以将来自每个FRET盒的切割的5'瓣彼此区分开来，其中切割的5'瓣与不同的掩蔽寡核苷酸杂交。
图10呈现了图9的两个小图中所示的测量的荧光数据的一阶导数图。图10的左侧小图显示了图9左侧小图中呈现的解链/退火曲线的一阶导数图。随温度变化的荧光的一阶导数图的最大值指示50％杂交发生时的解链温度(Tm)。在这种情形下，两个可淬灭靶标的Tm相差约10℃(即，用于检测分析物C的Tm为约46℃，以及用于检测分析物B的Tm为约56℃)。两条解链/退火曲线之间的这种区别使得能够分辨两种分析物中的哪一种存在于进行分析的反应混合物中。在约46℃下观察到或检测到的单个最大值将指示存在分析物C，而在约56℃下的单个最大值将指示检测到分析物B。图10的右小图显示了图9的右小图中显现的解链图的一阶导数。每条不同的曲线都具有独特的特征使得可以区分含有分析物B、分析物C、或分析物B和分析物C的组合的反应混合物。由于由分析物A的存在引起的荧光信号随温度变化不可淬灭(即，不存在与FRET盒切割产物互补的掩蔽寡核苷酸)，因此对一阶导数没有影响(即，常数的一阶导数为零)。
在上述情形中，使用解链/退火曲线的导数分析来分析测试样品是否存在两种不同的分析物。出于说明的目的，此处使用一阶导数计算。然而，考虑二阶甚至更高阶导数分析用于此目的。程序涉及仅使用实时核酸扩增设备的荧光计组件的单个通道检测或监测扩增反应混合物中的荧光信号。图可以呈现原始数据的一阶导数，但可替代地可以呈现经处理的数据(例如，平滑、相对于恒定最大读数归一化等)的一阶导数。在46℃下在一阶导数图中检测到峰或最大值指示存在分析物C或其扩增产物。在56℃下在一阶导数图中检测到峰或最大值指示存在分析物B或其扩增产物。在46℃和56℃两个温度下均检测到峰(例如，在这两个温度下的高水平信号)指示存在分析物C和分析物B二者或这些分析物的扩增产物。在一些实施方案中，分析可以涉及鉴定大于阈值(例如，预先确定的阈值或基于归一化最大值的分数或百分比的阈值)的信号。虽然实施例展示了一阶导数分析的使用，但也可以使用二阶导数分析。这里，一阶导数图上的最大值将对应于二阶导数图上的过零点。检测分析物A的存在不依赖于导数分析，因为用于检测此分析物的FRET盒不包含与任何掩蔽寡核苷酸互补的5'瓣序列。此FRET盒的切割导致在用于解链/退火曲线分析的温度范围内保持稳定的荧光信号。测试样品中分析物A的存在由一定温度下的荧光的大小反映，在所述温度下，由其他FRET盒(例如，用于检测分析物B和/或分析物C)的切割产生的信号将被淬灭(例如，在图10的图中，在约30℃下)。
本申请中引用的所有文献和类似材料(包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、论文和互联网网页)均出于任何目的通过引用以其整体明确并入。除非另外定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语具有与本文所述各种实施方案所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。当并入的参考文献中的术语的定义显现为与本教导中提供的定义不同时，应以本教导中所提供的定义为准。
在不脱离如所描述的技术的范围和精神的情况下，所描述的组合物、方法和技术用途的各种修改和变化对本领域技术人员来说将是清楚的。尽管已结合特定示例性实施方案描述了所述技术，但应理解的是，要求保护的本发明不应不适当地局限于此类特定实施方案。事实上，对生物化学、分子生物学或相关领域的技术人员而言明显的用于实施本发明的所述模式的各种修改旨在落入以下权利要求的范围内。
Claims (55)
1.一种包含FRET盒报告系统的组合物，所述组合物包含：
(i)5'瓣FRET盒寡核苷酸，其包含：
含有第一荧光团部分的5'瓣部分、
含有第一淬灭剂部分的茎环部分、以及
含有切割的瓣杂交序列的3'部分，
其中与所述5'瓣FRET盒寡核苷酸的所述切割的瓣杂交序列互补的盒特异性侵入性寡核苷酸的杂交形成在所述第一荧光团部分与所述第一淬灭剂部分之间的切割位点处可被FEN-1核酸内切酶切割的侵入性切割结构，
其中在所述切割位点处切割所述5'瓣FRET盒寡核苷酸产生包含所述5'瓣部分和所述第一荧光团部分的盒切割的瓣；以及
(ii)包含第二淬灭剂部分的掩蔽寡核苷酸，
其中所述掩蔽寡核苷酸的至少一部分可与所述FRET盒寡核苷酸的所述5'瓣部分特异性杂交，
其中所述掩蔽寡核苷酸与所述盒切割的瓣的杂交形成具有展现出第一解链峰的第一解链温度的双链体，并且
其中来自所述双链体中的所述第一荧光团部分的荧光发射被所述第二淬灭剂部分淬灭。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一淬灭剂部分和所述第二淬灭剂部分彼此相同。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的组合物，所述组合物进一步包含FEN-1核酸内切酶。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述FEN-1核酸内切酶是热稳定的FEN-1核酸内切酶。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述热稳定的FEN-1核酸内切酶来自古生菌生物体。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，所述组合物进一步包含第一靶标特异性侵入性寡核苷酸和第一靶标特异性初级探针寡核苷酸，
其中所述第一靶标特异性侵入性寡核苷酸和所述第一靶标特异性初级探针寡核苷酸中的每一个包含这样的序列，所述序列被配置成与靶核酸杂交以形成可被FEN-1核酸内切酶切割从而产生初级切割的瓣的侵入性切割结构，并且
其中所述初级切割的瓣是盒特异性侵入性寡核苷酸，其被配置成与所述5'瓣FRET盒寡核苷酸的所述切割的瓣杂交序列杂交以形成可被所述FEN-1核酸内切酶切割的侵入性切割结构。
7.根据权利要求6所述的组合物，所述组合物进一步包含所述靶核酸。
8.根据权利要求7所述的组合物，所述组合物进一步包含脱氧核苷三磷酸(dNTP)、热稳定的DNA聚合酶、以及具有能够由所述热稳定的DNA聚合酶在模板依赖性核酸扩增反应中使用所述靶核酸作为模板来延伸的3'端的引物。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，所述组合物进一步包含：
(iii)第二FRET盒寡核苷酸，其包含
含有第二荧光团部分的5'部分、
含有第三淬灭剂部分的茎环部分、以及
含有第二切割的瓣杂交序列的3'部分，
其中第二盒特异性侵入性寡核苷酸与所述第二FRET盒寡核苷酸的所述第二切割的瓣杂交序列的杂交形成在所述第二荧光团部分与所述第三淬灭剂部分之间的切割位点处可被FEN-1核酸内切酶切割的侵入性切割结构，并且
其中在所述切割位点处切割所述第二FRET盒寡核苷酸产生包含所述第二荧光团部分的盒切割产物。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述第二FRET盒寡核苷酸是包含5'瓣部分的第二5'瓣FRET盒，其中所述盒切割产物是包含所述第二荧光团的第二盒切割的瓣，并且其中所述组合物进一步包含：
(iv)含有第四淬灭剂部分的第二掩蔽寡核苷酸，
其中所述第二掩蔽寡核苷酸的至少一部分可与所述第二FRET盒寡核苷酸的所述5'瓣部分特异性杂交，
其中所述第二掩蔽寡核苷酸与所述第二盒切割的瓣的杂交形成具有高于所述第一解链温度的第二解链温度的第二双链体，并且
其中来自所述第二双链体中的所述第二荧光团部分的荧光发射被所述第四淬灭剂部分淬灭。
11.根据权利要求9所述的组合物，其中所述第二盒切割产物包含不多于5个、优选地不多于4个、优选地不多于3个、优选地不多于2个核苷酸。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的组合物，其中来自所述第一荧光团部分和所述第二荧光团部分的发射信号在荧光监测设备的相同荧光检测通道中是可检测的。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的组合物，其中所述第一荧光团部分和所述第二荧光团部分彼此相同。
14.根据权利要求9至12中任一项所述的组合物，其中所述第一荧光团部分和所述第二荧光团部分彼此不同。
15.根据权利要求10和12至14中任一项所述的组合物，其中所述第三淬灭剂部分和所述第四淬灭剂部分彼此相同。
16.一种确定反应混合物中两个不同FRET盒中哪一个被切割以产生荧光信号的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在所述反应混合物中进行多重侵入性切割反应以切割第一FRET盒和第二FRET盒中的一个或两个，从而如果发生切割则产生两种不同的荧光切割产物，
所述第一FRET盒包含具有附接到其上的荧光团的第一5'瓣部分，所述荧光团的附接被布置成使得在所述多重侵入性切割反应中FEN-1核酸内切酶对所述第一FRET盒的切割产生包含所述荧光团的第一盒切割的瓣，
所述反应混合物包含第一掩蔽寡核苷酸，所述第一掩蔽寡核苷酸在低于第一Tm的温度下与所述第一盒切割的瓣稳定杂交以形成第一双链体，但在高于所述第一Tm的温度下并非如此，其中来自所述第一双链体的所述第一盒切割的瓣的荧光团的荧光发射被淬灭，并且
在所述多重侵入性切割反应中产生的两种不同的荧光切割产物中的每一种的特征在于所述反应混合物中不同的温度依赖性荧光淬灭谱；
(b)在差异地淬灭由所述多重侵入性切割反应的不同荧光切割产物产生的荧光的温度条件下，使用荧光监测设备的单个通道测量在所述反应混合物中产生的荧光信号；以及
(c)根据步骤(b)的结果确定不同FRET盒中的哪一个在所述多重侵入性切割反应中被切割。
17.根据权利要求16所述的方法，其中步骤(a)中的所述第二FRET盒如果被切割则产生荧光切割产物，所述荧光切割产物不与所述反应混合物中的任何掩蔽寡核苷酸杂交以导致荧光淬灭。
18.根据权利要求17所述的方法，其中步骤(c)包括比较在低于所述第一Tm的温度和高于所述第一Tm的温度下测量的荧光信号。
19.根据权利要求18所述的方法，其中步骤(c)包括通过计算测量的荧光信号之间的差异来比较荧光信号。
20.根据权利要求17所述的方法，
其中步骤(b)包括在低于所述第一Tm的温度下测量任何所述荧光信号，其中来自所述第一双链体的所述第一盒切割的瓣的荧光团的荧光发射被淬灭，并且
其中步骤(c)包括如果在步骤(b)中检测到可测量的荧光，则确定所述第二FRET盒在所述反应混合物中被切割。
21.根据权利要求17所述的方法，
其中步骤(b)包括在低于所述第一Tm的温度和高于所述第一Tm的温度中的每一个温度下测量任何所述荧光信号，并且
其中步骤(c)包括如果在高于所述第一Tm的温度下测量的荧光信号大于在低于所述第一Tm的温度下测量的荧光信号，则确定所述第一FRET盒在所述反应混合物中被切割。
22.根据权利要求16至21中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括测量在所述反应混合物中产生的随温度变化的任何所述荧光信号，以产生解链/退火曲线。
23.根据权利要求22所述的方法，其中步骤(c)包括计算所述解链/退火曲线的导数，然后根据所计算的导数确定所述反应混合物是否包含以所述第一Tm为特征的所述第一双链体作为所述第一FRET盒在所述反应混合物中被切割的指示。
24.根据权利要求16所述的方法，
其中所述第二FRET盒包含具有附接到其上的荧光团的第二5'瓣序列，所述荧光团的附接被布置成使得在所述多重侵入性切割反应中所述FEN-1核酸内切酶对所述第二FRET盒的切割产生包含所述荧光团的第二盒切割的瓣，
其中所述反应混合物包含第二掩蔽寡核苷酸，所述第二掩蔽寡核苷酸在低于第二Tm的温度下与所述第二盒切割的瓣杂交以形成第二双链体，但在高于所述第二Tm的温度下并非如此，其中来自所述第二双链体的所述第二盒切割的瓣的荧光团的荧光发射被淬灭，并且
其中所述第一Tm与所述第二Tm相差至少5℃。
25.根据权利要求24所述的方法，
其中所述第一Tm大于所述第二Tm，
其中步骤(b)包括在低于所述第二Tm的温度和高于所述第一Tm的温度下测量任何所述荧光信号，并且
其中步骤(c)包括如果在高于所述第一Tm的温度下测量的荧光信号大于在低于所述第二Tm的温度下测量的荧光信号，则确定所述第一FRET盒和所述第二FRET盒中的至少一个在所述反应混合物中被切割。
26.根据权利要求24或25所述的方法，其中步骤(b)包括测量在所述反应混合物中产生的随温度变化的任何所述荧光信号，以产生解链/退火曲线。
27.根据权利要求26所述的方法，其中步骤(c)包括计算所述解链/退火曲线的导数，然后根据所计算的导数确定所述反应混合物是否包含以所述第一Tm为特征的所述第一双链体作为所述第一FRET盒在所述反应混合物中被切割的指示。
28.根据权利要求26所述的方法，其中步骤(c)包括计算所述解链/退火曲线的导数，然后根据所计算的导数确定所述反应混合物是否包含以所述第二Tm为特征的所述第二双链体作为所述第二FRET盒在所述反应混合物中被切割的指示。
29.根据权利要求16至28中任一项所述的方法，其中所述第一FRET盒和所述第二FRET盒用相同的荧光团标记。
30.根据权利要求16至28中任一项所述的方法，其中所述第一FRET盒和所述第二FRET盒不用相同的荧光团标记。
31.根据权利要求16至30中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的所述多重侵入性切割反应的所述FEN-1核酸内切酶包括热稳定的FEN-1核酸内切酶。
32.根据权利要求16至31中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括利用用软件编程的计算机进行确定。
33.一种分析包含靶核酸的样品的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在反应混合物中，使所述样品的任何第一靶核酸与包含与其互补的序列的第一初级探针寡核苷酸和FEN-1核酸内切酶在这样的条件下接触，所述条件使得如果所述第一初级探针寡核苷酸与所述第一靶核酸杂交，则所述第一初级探针被所述FEN-1核酸内切酶切割以产生第一初级切割的瓣，
其中所述第一初级切割的瓣与包含在所述反应混合物中的第一FRET盒寡核苷酸的切割的瓣杂交序列杂交以形成侵入性切割结构，所述侵入性切割结构在所述第一FRET盒寡核苷酸的第一荧光团部分与第一淬灭剂部分之间的切割位点处被所述FEN-1核酸内切酶切割以释放包含所述第一荧光团部分的第一盒切割的瓣，其中包含第二淬灭剂部分的第一掩蔽寡核苷酸在低于所述第一掩蔽寡核苷酸和所述第一盒切割的瓣的第一Tm的温度下与所述第一盒切割的瓣杂交以形成双链体，其中来自所述双链体中的所述第一荧光团部分的荧光发射被所述第二淬灭剂部分淬灭，并且
其中在高于所述第一Tm的第二温度下，所述第一掩蔽寡核苷酸和所述第一盒切割的瓣不形成稳定的双链体；
(b)在所述第二温度下检测从所述第一荧光团部分发射的任何荧光；以及
(c)如果
在步骤(b)中检测到从所述第一荧光团部分发射的荧光，则确定所述样品包含所述第一靶核酸，或
如果在步骤(b)中未检测到从所述第一荧光团部分发射的荧光，则确定所述样品不包含所述第一靶核酸。
34.根据权利要求33所述的方法，
其中步骤(a)进一步包括在所述反应混合物中使所述样品的任何第二靶核酸与包含与其互补的序列的第二初级探针寡核苷酸和所述FEN-1核酸内切酶在这样的条件下接触，所述条件使得如果所述第二初级探针寡核苷酸与所述第二靶核酸杂交，则所述第二初级探针被所述FEN-1核酸内切酶切割以产生不同于所述第一初级切割的瓣的第二初级切割的瓣，
其中所述第二初级切割的瓣与包含在所述反应混合物中的第二FRET盒寡核苷酸的切割的瓣杂交序列杂交以形成侵入性切割结构，所述侵入性切割结构在所述第二FRET盒寡核苷酸的第二荧光团部分与第三淬灭剂部分之间的切割位点处被所述FEN-1核酸内切酶切割以释放包含所述第二荧光团部分的第二盒切割的瓣，
其中在低于第二Tm的第三温度下，包含第四淬灭剂部分的第二掩蔽寡核苷酸与所述第二盒切割的瓣杂交以形成双链体，
其中来自所述第二双链体中的所述第二荧光团部分的荧光发射被所述第四淬灭剂部分淬灭，
其中在高于所述第二Tm的第四温度下，所述第二掩蔽寡核苷酸和所述第二盒切割的瓣不形成稳定的双链体，并且
其中所述第一Tm与所述第二Tm彼此相差至少5℃；
其中步骤(b)进一步包括在所述第四温度下检测从所述第二荧光团部分发射的任何荧光；并且
其中步骤(c)进一步包括
如果在步骤(b)中检测到从所述第二FRET盒寡核苷酸的所述5'瓣切割产物的第二荧光团部分发射的荧光，则确定所述样品包含所述第二靶核酸，或
如果在步骤(b)中未检测到从所述第二FRET盒寡核苷酸的所述5'瓣切割产物的第二荧光团部分发射的荧光，则确定所述样品不包含所述第一靶核酸。
35.根据权利要求33所述的方法，
其中步骤(a)进一步包括在所述反应混合物中使所述样品的任何第二靶核酸与包含与其互补的序列的第二初级探针寡核苷酸和所述FEN-1核酸内切酶在这样的条件下接触，所述条件使得如果所述第二初级探针寡核苷酸与所述第二靶核酸杂交，则所述第二初级探针被所述FEN-1核酸内切酶切割以产生第二初级切割的瓣，
其中所述第二初级切割的瓣与包含在所述反应混合物中的第二FRET盒寡核苷酸的切割的瓣杂交序列杂交以形成侵入性切割结构，所述侵入性切割结构在所述第二FRET盒寡核苷酸的第二荧光团部分与第三淬灭剂部分之间的切割位点处被所述FEN-1核酸内切酶切割以释放包含所述第二荧光团部分的切割产物，
其中所述切割产物不与所述反应混合物中的任何掩蔽寡核苷酸杂交以导致荧光淬灭；
其中步骤(b)进一步包括检测从所述切割产物的所述第二荧光团部分发射的任何荧光；并且
其中步骤(c)进一步包括
如果在步骤(b)中检测到从所述第二荧光团部分发射的荧光，则确定所述样品包含所述第二靶核酸，或
如果在步骤(b)中未检测到从所述第二荧光团部分发射的荧光，则确定所述样品不包含所述第一靶核酸。
36.根据权利要求34或权利要求35所述的方法，其中步骤(b)包括用荧光监测装置的单个通道检测从所述第一荧光团部分和所述第二荧光团部分发射的任何荧光。
37.根据权利要求36所述的方法，其中在所述反应混合物中发生核酸扩增反应的同时进行步骤(b)，并且其中所述核酸扩增反应的产物包含所述第一靶核酸和所述第二靶核酸。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述核酸扩增反应包括热循环步骤，并且其中所述反应混合物进一步包含热稳定的DNA聚合酶。
39.根据权利要求33至36中任一项所述的方法，其中在所述反应混合物的温度降低以允许掩蔽寡核苷酸和互补盒切割的瓣的退火时进行步骤(b)。
40.根据权利要求36所述的方法，其中所述第一荧光团部分和所述第二荧光团部分彼此相同。
41.根据权利要求36所述的方法，其中检测任何荧光的步骤(b)包括测量任何荧光。
42.根据权利要求41所述的方法，所述方法进一步包括在所述第一温度下检测或测量荧光的步骤。
43.根据权利要求34或35中任一项所述的方法，其中所述第一荧光团部分和所述第二荧光团部分二者在能量传感器装置的相同荧光检测通道中都是可检测的。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述第二荧光团部分与所述第一荧光团部分相同。
45.根据权利要求43所述的方法，其中所述第二荧光团部分与所述第一荧光团部分不同。
46.根据权利要求33至43中任一项所述的方法，其中在所述第一温度下检测和/或测量来自所述第二荧光团的荧光。
47.根据权利要求33至44中任一项所述的方法，其中所述第三淬灭剂部分与所述第一淬灭剂部分和/或所述第二淬灭剂部分相同。
48.根据权利要求33至47中任一项所述的方法，其中所述反应混合物包含扩增靶核酸的引物寡核苷酸，其中至少一种引物寡核苷酸在初级探针寡核苷酸和靶核酸和/或靶扩增子的存在下充当侵入性寡核苷酸，以形成被所述热稳定的FEN-1核酸内切酶切割的侵入性切割结构。
49.根据权利要求33至48中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括利用用软件编程的计算机进行确定。
50.一种用于确定多种靶核酸分析物中的哪一种存在于反应混合物中的系统，其中所述多种靶核酸分析物中的每一种可通过荧光信号检测，所述系统包含：
热循环仪；
与所述热循环仪光通信的荧光计，
其中所述荧光计用单个光通道测量指示通过所述热循环仪实现的核酸扩增产物产生的荧光信号；以及
与所述荧光计通信的计算机，
其中所述计算机用软件指令编程，使得所述计算机：
(a)获得根据由所述荧光计进行的测量得到的解链/退火曲线数据集，
(b)通过在所述反应混合物中的荧光被最大化淬灭的温度下检测到所述解链/退火曲线数据集中来自第一荧光切割产物的荧光信号，确定所述反应混合物中存在第一靶核酸，
(c)根据所述解链/退火曲线数据集得到导数图，以及
(d)如果所述导数图包含第一双链体特有的特征，则确定所述反应混合物中存在第二靶核酸，
其中所述第一双链体包含第一掩蔽寡核苷酸以及当所述第二靶核酸存在时在所述反应混合物中产生的第二荧光切割产物。
51.根据权利要求50所述的系统，其中所述计算机进一步用软件指令编程，使得所述计算机：
(e)如果所述导数图包含第二双链体特有的特征，则确定所述反应混合物中存在第三靶核酸，
其中所述第二双链体包含第二掩蔽寡核苷酸以及当所述第三靶核酸存在时在所述反应混合物中产生的第三荧光切割产物。
52.根据权利要求50或权利要求51所述的系统，其中所述第一双链体特有的特征包括计算的导数的最大值、最小值或过零点。
53.根据权利要求52所述的系统，
其中所计算的导数包括计算的一阶导数，
其中所述第一双链体特有的特征包括所述解链/退火曲线数据集的计算的一阶导数的第一最大值作为第一解链峰，并且
其中所述第二双链体特有的特征包括所述解链/退火曲线数据集的所述计算的一阶导数的第二最大值作为第二解链峰。
54.根据权利要求50至53中任一项所述的系统，其中所述热循环仪、所述荧光计和所述计算机都是实时PCR仪器的组件。
55.根据权利要求50所述的系统，其中由所述计算机获得的所述解链/退火曲线数据集包含指示随温度变化的荧光的数据点。
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