CZ207894A3 - Method of quantitative determination of amount of nucleic acid specific sequence in a sample and apparatus for simultaneous monitoring of a plurality of nucleic acid amplifications - Google Patents

Description

Způsob kvantitativního stanovení množství specifické sekvence nukleové kyseliny ve vzorku a zařízení pro simultánní monitorování většího počtu amplifikací nukleové kyseliny___

Í cn ί ~ i ž — o ! ~ i

Oblast techniky .5 4° ' S: · ¹

S ° ;

......... i I I

Vynález se týká způsobu kvantitativního .^stanovení/ množství specifické sekvence nukleové kyseliny ve vzorku a zařízení pro simultánní monitorování většího počtu amplifikací nukleové kyseliny. Zejména se vynález týká způsobu detekce amplifikace nukleové kyseliny (DNA nebo RNA), a zejména pak současného monitorování většího počtu amplifikačních reakcí nukleové kyseliny v reálném čase. Vynález se také týká použití nashromážděných dat pro kvantitativní stanovení výchozí koncentrace cílové sekvence nukleové kyseliny obsažené v jedné nebo více z těchto směsí, a dále též monitorování vlivu podmínek amplifikační reakce na reakční kinetiku.

Dosavadní stav techniky

Různé metody detekce amplifikace nukleové kyseliny jsou známy. Je známa řada zkoušek, kterými lze například kvantitativně stanovit počet výchozích DNA templátů při řetězové reakci probíhající působením polymerasy (PCR). Některé z těchto zkoušek zahrnují měření produktu PCR na konci tepelného cyklování, přičemž naměřená hodnota je korelována s výchozí úrovní koncentrace DNA. Takovou koncovou analýzou, které se obvykle používá při PCR je možno zjistit přítomnosti nebo nepřítomnosti cílovéDNA, ale obvykle je nepoužitelná pro stanovení výchozího počtu DNA cílů.

Při jiných zkouškách se používá kompetitorového amplifikačního produktu, jehož templát se přidává ve známé koncentraci k reakční směsi před tepelným cyklováním. Podle protokolů ke zkouškám s kompetitorovým produktem se gelovou elektroforézou zkoumá alikvot amplifikační reakční směsi. Měří se relativní množství PCR produktu specifického pro cíl a PCR produktu kompetitoru a poměru těchto množství se používá pro výpočet výchozího počtu cílových templátů. Čím vyšší je poměr cílové specifického produktu ke kompetitor-specifickému produktut, tím vyšší je výchozí koncentrace DNA.

Kromě toho, že takové zkoušení vyžaduje následné zpracování, jako je hybridizace nebo gelová elektroforéza, je dynamický rozsah posledně uvedených zkoušek omezen (tj. citlivost k rozmezí koncentrace cílové nukleové kyseliny). Při zkouškách s kompetitorem se citlivost k rozdílům v koncentraci templátů snižuje, když je buď cílová DNA nebo přidaná DNA kompetitoru přítomna ve značném nadbytku vzhledem ke druhé složce. Dynamický rozsah zkoušek, kterými se měří cílový produkt, může být také omezen tím, že při zvoleném počtu cyklů mohou některé reakce dospět do ustálené koncentrace produktu (což se v křivce projeví vznikem plato). Rozdíly v koncentraci výchozího templátů se při těchto reakcích proto dobře neodrazí. Kromě toho, malé rozdíly v naměřeném množství produktu vedou k velkým změnám v odhadu koncentrace výchozího templátů, což má za následek velkou nepřesnost, s ohledem na měnící se reakční podmínky, změny při vzorkování nebo přítomnosti inhibitorů.

Optimalizace podmínek PCR se obvykle dosahuje tím, že se měří účinek různých podmínek na konečný, výtěžek a specificitu produktu PCR. Pro zajištění informací o průběhu amplifikace je nutno do tepelného cyklovacího zařízení (cyklovače) umístit mnoho replikovaných vzorků, aby bylo možno z tepelného cyklovače v různých teplotních cyklech tyto vzorky vyjímat. Vyjmuté vzorky se potom analyzují ge3 lovou elektroforézou v závislosti na čísle cyklu. Jak je zřejmé z tohoto popisu, taková optimalizace je složitá a zdlouhavá, poněvadž vyžaduje četné manipulační stupně se vzorky, jakož i následnou elektroforetickou analýzu.

Jakákoliv zkouška, které se má používat ve velkém měřítku (například v klinickém měřítku), by měla být nejen spolehlivá, nýbrž i co nej jednodušší, aby to usnadnilo její automatizaci. Existuje proto potřeba vyvinout způsob a září zení pro sběr dat indikativních pro amplifikaci nukleové kyseliny, kterých by bylo možno například použít pro kvantitativní stanovení výchozí koncentrace vzorku. Další potřebou je optimalizace reakčních podmínek, při níž by bylo možno dosáhnout spolehlivých výsledků a která by umožnila automatizaci.

Úkolem tohoto vynálezu je odstranit výše uvedené nevýhody dosavadního stavu techniky a zejména pak vyvinout způsob detekce amplifikace nukleové kyseliny a zařízení, které by umožnilo současné monitorování většího počtu amplifikačních reakcí nukleové kyseliny v reálném čase.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je zařízení pro simultánní moni torování většího počtu amplifikaci nukleové kyseliny, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje tepelný cyklovač zahrnující tepelně vodivý člen, v němž je vytvořen větší počet zahloubení; a senzor pro simultánní detekci světla emitovaného z těchto zahloubení.

V přednostním provedení obsahuje zařízení podle vynálezu dále zdroj světla, který je opticky spojen s tepelným cyklovačem a který je uspořádán tak, že rozděluje světlo na část tepelně vodivého členu, v níž je vytvořen větší počet zahloubení.

Při jiném přednostním provedení zařízení podle vynálezu jsou zahloubení tepelně vodivého členu tepelného cyklovače vytvořena v jeho povrchu, přičemž jsou schopna pojmout reakční nádoby obsahující reakční směsi z amplifikací nukleové kyseliny; a senzorem je s tepelně vodivým členem opticky spojené zobrazovací zařízení vytvářející obraz povrchu a reakčních nádob, pokud jsou tyto nádoby uloženy v zahloubeních tepelně vodivého členu.

Při jiném přednostním provedení zařízení podle vynálezu obsahuje tepelně vodivý člen tepelného cyklovače větší počet v něm vytvořených zahloubení, která jsou přizpůsobena pro pojmutí reakčních směsí z amplifikací nukleové kyseliny, přičemž toto zařízení dále zahrnuje kryt umístěný nad tepelně vodivým členem připojený k tepelnému cyklovači; zdroj světla zajišťující emisi světla v krytu na zahloubení; dichroické zrcadlo umístěné v krytu a nad zahloubeními, které je propustné pro světlo s první vlnovou délkou a reflektivní pro světlo s druhou vlnovou délkou odlišnou od první vlnové délky; přičemž senzor je uspořádán tak, že přijímá světlo odražené od druhého povrchu dichroického zrcadla.

Při dalším přednostním provedení zařízení podle vy nálezu obsahuje,tepelně vodivý člen tepelného cyklovače větší počet v něm vytvořených zahloubení, která jsou přizpůsobena pro pojmutí reakčních směsí zamplifikací nukleové kyseliny, kteréžto reakční směsi obsahují sekvenci nukleové kyseliny a fluorescentní vazebné činidlo, přičemž toto zařízení dále zahrnuje kryt umístěný nad tepelně vodivým členem připojený k tepelnému cyklovači; zdroj světí zajišťující emisi světla v krytu; senzor umístěný v krytu; a dichroické zrcadlo umístěné v krytu a nad zahloubeními, které je propustné pro světlo s vlnovou délkou odpovídající vlnové délce světla generovaného zdrojem excitačního světla a reflektivní pro světlo s vlnovou délkou odpovídající vlnové délce fluorescence emitované z amplifikační směsinukleové kyseliny obsahující fluorescenční vazebné činidlo, pokud je směs umístěna v jednom ze zahloubení vytvořených v tepelně vodivém členu a exponována světlu ze zdroje excitačního světla, přičemž zrcadlo je orientováno tak, že vytváří mezi zahloubeními a senzorem optickou dráhu.

Při jednom z provedení zařízení podle tohoto vynálezu deteguje CCD-kamera (CCD = součástka s nábojovou vazbou) akumukaci dvouřetězcové DNA (dsDNA) současně při každé z většího počtu řetězových reakcí vyvolaných polymerasou s využitím zvýšení fluorescence detegovatelného fluorescentního barviva, které bylo napočátku přidáno ke každé z amplifikačních reakčních směsí. Fluorescence pochází z duplexu DNA s navázaným fluorescentním barvivém. Při tomto provedení se s výhodou nemusí používat vodičů z optických vláken, což odstraňuje problémy s připojením vláknové optiky k jednotlivým reakčním směsím.

Podle dalšího aspektu tohoto vynálezu je optický systém, který přenáší excitační světlo ze zdroje na několik reakčních směsí, které jsou amplifikovány v tepelném cyklovači zařízení podle vynálezu, uspořádáno tak, že dodává excitační světlo reakčním směsím rovnoměrným způsobem. Optický systém tedy umožňuje, aby bylo excitační světlo v podstatě rovnoměrně rozděleno přes tepelný výměník tepelného cyklovače, takže každá amplifikační reakční směs obdrží v podstatě stejné množství excitačního světla.

Za použití tohoto zařízení je možno nasbírat fluorescenční data a použít je pro kvantitativní stanovení počástečního množství cílové sekvence nukleové kyseliny. Při přednostním provedení tohoto kvantitativního stanovení je k dispozici větší počet amplifikačních reakčních směsí. Jedna amplifikační reakční směs obsahuje neznámou koncentraci specifické sekvence nukleové kyseliny. Zbývající reakční směsi obsahují stejnou specifickou sekvenci nukleové kyseliny. v různých, ale známých koncentracích. Amplifikační reakční směsi se známými a neznámou koncentrací nukleové kyseliny se podrobí paralelnímu tepelnému cyklování. Fluorescence emitovaná z reakčních směsí se monitoruje v reálném čase a měří se počet cyklů, kterých je zapotřebí pro každou reakční směs, aby vydávala fluorescenci o určité intenzitě. Počet cyklů, kterých je zapotřebí, aby směs s neznámou koncentrací nukleové kyseliny dosáhla této hodnoty, se porovnává s počtem cyklů, kterých je zapotřebí, aby směsi se známými koncentracemi nukleové kyseliny dosáhly této hodnoty. Tím se zjistí počáteční množství této specifické sekvence nukleové kyseliny ve směsi o neznámé koncentraci.

Zjistilo se, že je možno dosáhnout citlivosti k rozmezí koncentrace cílové nukleové kyseliny odpovídající přinejmenším šesti řádům, poněvadž se amplifikace monitorují v reálném čase. Kromě toho je možno dosáhnout citlivosti na tak nízký počet, jako je 100 ssDNA na pozadí 40 000 buněčných ekvivalentů komplexní genomové DNA.

Vynález s výhodou dále zajišťuje způsob zpracování fluorescenčních dat za účelem spolehlivé analýzy účinku různých reakčních podmínek na kinetiku amplifikace. Vzhledem k tomu, že se současně monitoruje větší počet amplifikaci, je možno účinek mnoha různých reakčních proměnných stanovit rychle. To je užitečné při optimalizaci amplifikačních reakcí pro dosažení optimálních výtěžků a účinnosti.

Ί

Monitorování v reálném čase poskytuje též výhodu v tom, že je možno detegovat i případy, při nichž dochází k částečné inhibici PCR, což může značně ovlivnit schopnost přesného kvantitativního stanovení. Jak je to ukázáno na obr. 10D, tyto případy je možno detegovat na základě jejich reakčního profilu, takže je možno tyto vzorky repurifikovať a znovu zkoušet. Kromě toho je možno detegovat i případy totální inhibice, které by jinak mohly vést k falešnému závěru, že ve vzorku není přítomna žádná cílová nukleová fi>

kyselina, poněvadž lze očekávat, že při dostatečném počtu cyklů budou PCR reakční směsi bez cílové DNA poskytovat fluorescenci díky nespecifickým amplifikačním produktům. Pokud taková fluorescence není pozorována v očekávaném cyklu, je možno soudit na přítomnost inhibitorů.

Další výhodou tohoto vynálezu je, že odpadá nutnost přídavných zdlouhavých manipulací pro stanovení výtěžku mnoha reakcí po skončení amplifikace. Odpadá tedy například nutnost následné hybridizace nebo elektroforézy na gelu.

Přestože má provedení tohoto vynálezu, při němž se nepoužívá vláknové optiky (viz obr. 2 a 3) četné výhody, jak je to uvedeno výše, senzor, kterým je přednostně videokamera, musí být umístěn v dostatečné vzdálenosti od reakčních směsí v tepelně vodivém členu, aby se minimalizovala paralaxa. V souladu s tím je také světelný zdroj podstatně vzdálen od reakčních směsí v tepelně vodivém členu, což usnadňuje dosažení rovnoměrného osvětlení a zabraňuje interferenci s viděním senzoru. Takové upořádání však obvykle vyžaduje značný prostor, což má za následek, že pro zařízení je třeba vyhradit celou temnou komoru. Mnohé klinické laboratoře však nemají temné komory, ani dostatečný prostor, který by pro zřízení temné komory mohly vyhradit. Vhodné prostředí pro optické dráhy excitačního světla a fluorescenčních emisí mohou sice poskytnout místnosti pro rentgen, které se v klinických laboratořích vyskytují, ale prostor v těchto místnostech bývá obvykle plně obsazen rentgenem.

Podle dalšího provedení tohoto vynálezu zahrnuje zařízení určitou konfiguraci excitačního světla a registrace fluorescence umožňující složení optických drah excitačního světla a fluorescentních emisí s cílem dosáhnou!; kompaktnějšího a zjednodušeného uložení optických drah ve světlotěsném prostředí. Při takovém provedení je možno zařízení snadno používat na stole, aniž by bylo nutno pro něj vyhradit temnou komoru.

Při tomto provedení zahrnuje zařízení pro současné monitorování většího počtá amplifikací nukleové kyseliny tepelný cyklovač obsahující tepelně vodivý člen, který zahrnuje větší počet v něm vytvořených zahloubení pro pojmutí amplifikačních směsi nukleové kyseliny. Nad tepelně vodivým členem je umístěn kryt vytvářející světlotěsnou komoru. Světelný zdroj je uspořádán tak, že emituje světlo ve světlotěsné komoře vytvořené krytem a excituje amplifikační směsi umístěné ve světlotěsné komoře. V krytu a nad zahloubeními je umístěno dichroické zrcadlo.

Dichroické zrcadlo je propustné pro světlo s první vlnovou délkou a reflektivní pro světlo s druhou vlnovou délkou odlišnou od první vlnové délky. V přednostním provedení je zrcadlem dichroické zrcadlo s nízkým průchodem. Zrcadlo je zkonstruováno tak, že je průhledné nebo propustné pro světlo s vlnovou délkou odpovídající vlnové délce světla generovaného světelným zdrojem a reflektivní pro světlo s vlnovou délkou odpovídající vlnové délce fluorescence emitované amplifikačními směsmi, pokud jsou tyto směsi exponovány excitačnímu světlu.

Alternativně se může použít dichroického zrcadla s vysokým průchodem. V tomto případě je zrcadlo reflektivní pro světlo odpovídající vlnové délce světla generovaného světelným zdrojem a transparentní nebo propustné pro světlo s vlnovou délkou odpovídající vlnové délce fluorescence emitované amplifikačními směsmi, pokud jsou tyto směsi exponovány excitačnímu světlu. V krytu je také uspořádán senzor pro registraci fluorescence emitované z amplifikačních směsí. Při uspořádání s dichroickým zrcadlem s nízkým průchodem je senzor uspořádán tak, že na něj dopadá fluorescence odražená zrcadlem. Při uspořádání s vysokým průchodem je umístění senzoru a světelného zdroje obrácené.

Při tomto uspořádání může být jak zdroj excitačního světla, tak senzor umístěn poměrně blízkou tepelně vodivého členu, například ve vzdálenosti v rozmezí od asi 150 do asi 300 mm, což umožňuje, že optické dráhy excitačního světla a fluorescenčních emisí budou zaujímat poměrné malý prostor. Kompaktnost tohoto uspořádání umožňuje umístění optických drah do krytu připojeného k teplotnímu cyklovači za vzniku světlotěsné či temné komory pro excitační světlo a světlo emitované amplifikačními směsmi. Potom je zařízení v podstatě možno používat kdekoliv, aniž by bylo nutno mu vyhradit temnou komoru. Kryt také s výhodou zabraňuje tomu, aby se vnější světlo, jako například světlo emitované monitory použitými v zařízení a světelnými emisními diodami (LED) spojenými s teplotním cyklovačem a počítačovým vybavením, dostalo na senzor.

- Další výhodou umístění senzoru v těsné biízkosti k tepelně vodivému členu, v němž mají být umístěny amplifikační směsi nukleové kyseliny, je možnost snížení požadavků na citlivost senzoru. Jelikož je senzor přesunut blíže k tepelně vodivému členu, zvyšuje se intenzita světla emitovaného reakčními směsmi a dopadajícího na senzor. Když se v důsled10 ku toho použije senzoru typu CCD kamery, jako je tomu v přednostním provedení, může se poměrně nákladná chlazená CCD kamera, které je obvykle zapotřebí, když jsou požadavky na citlivost vyšší, nahradit méně nákladnou CCD kamerou s přijatelnou odpovědí na nízkou intenzitu světla a nízkým teplotním šumem.

Také těsná blízkost zdroje světla a zahloubení s reakčními směsmi je výhodná. Přesunutím světelného zdroje do větší blízkosti zahloubení s reakčními směsmi se zvyšuje intenzita excitačního světla dopadajícího na reakční směsi umístěné v zahloubeních, čímž se zvyšuje intenzita fluorescentních emisí. Tím se mohou detegovat menší koncentrace cílové sekvence v časnějším stadiu tepelného cyklování.

Kromě toho, určité části zvýšené fluorescence je možno použít pro zlepšení rozlišení vlnové délky za použití filtru s průchodem užšího pásma. Tím je možno detegovat širší rozmezí vlnových délek a je možno odlišit značky s velmi blízkými vlnovými délkami.

Podle dalšího aspektu tohoto provedení je světelný zdroj spojen se závěrkou zajišťující přerušovanou expozici reakčních směsí excitačnímu světlu. Časování závěrky je přednostně provedeno tak, že jsou směsi exponovány excitačnímu světlu v průběhu fáze tepelné hybridizace/prodlužování, kdy obvykle dochází k maximální fluorescenci. Tato konfigurace umožňuje snížit expozici směsi nebo vzorku excitačnímu světlu, která může být díky těsné blízkosti zdroje světla a tepelně vodivého členu velmi značná. Minimalizací expozice vzorku excitačnímu světlu, kterým je obvykle ultrafialové světlo, ale kterým může být i světlo s jinou vlnovou délkou, zlepšuje závěrka výkonnost systému zvýšením stability vzorku. Intenzivní excitační světlo může jinak způsobit fotodeaktivaci vzorku, která bývá obvykle označována názvem bělení.

Podle dalšího aspektu tohoto provedení vynálezu je mezi dichroickým zrcadlem a senzorem umístěna polní čočka minimalizující paralaxu v poli, které leží mezi nimi.

Dalším výhodným znakem tohoto vynálezu je zahřívané okénko, které je umíštěno bezprostředně nad tepelně vodivým členem. Toto okénko může být ve skutečnosti umístěno přímo na zkumavkách obsahujících amplifikační směsi. Zahřívané okénko brání tepelným ztrátám ze zkumavek, zlepšuje zachování požadované profilu teploty směsi při tepelném cyklování a minimalizuje reflux, přičemž umožňuje průchod světla. V přednostním provedení je zahřívané okénko udržováno při teplotě denaturace, která obvykle leží v rozmezí od 95 do 105°C.

K senzoru je přednostně připojen filtr nebo kolečko s filtry, aby byl senzor schopen selektivně detegovat světlo různých vlnových délek. Filtr nebo filtry mohou též bránit dopadu excitačního světla na senzor. Za použití většího počtu filtrů, které mohou být umístěny v kolečku, se může filtr například snadno vyměnit v průběhu specifické fáze tepelné hybridizace/prodlužování, aby bylo možno monitorovat emise s různými vlnovými délkami, například z různých homogenních nukleasových prób (jak je to popsáno dále). Tak je možno monitorovat emise s různými vlnovým délkami a tedy různé sekvence nukleové kyseliny v daném vzorku a stanovit přítomnosti cílové sekvence.

Vysoká citlivost tohoto systému kromě toho umožňuje velmi přesnou detekci fluorescence, která vzniká za použití homogenního zkušebního systému, jako je systém popsaný v US patentu č. 5 210 015 (Gelfand et al.). V tomto^c zkušebním systému se používá 5' až 3' nukleasové aktivity nukleová kyselina polymerasy pro vyštěpení tepelně hybridizovaných značených oligonukleotidů z hybridizovaných duplexů próba12 cílová nukleová kyselina a pro uvolnění značených oligonukleotidových fragmentů pro detekci. Tato zkouška je obzvláště užitečná pro detekci většího počtu cílových nukleových kyselin ve stejné amplifikační reakční směsi. Takové próby jsou také užitečné při potvrzování přítomnosti cílové nukleové kyseliny, za současné přítomnosti nespecifických amplifikačních produktů.

Při homogenní zkoušce se používá próby, jejíž fluorescence je normálně zhášena přenosem fluorescenční energie nebo FET na druhou známku. 5'-nukleasová aktivita DNA polymerasy oddělí fluorofor od próby a zhášedla a tím --------. odstraní FET a regeneruje fluorescenci. Pro detekci této změny, kterou lze sledovat za použití monitorovacího zařízení podle vynálezu v uspořádání s dichroickým zrcadlem, není potřeba žádného zpracování. Pokud jsou próby značeny různými fluorofory, může se jich použít pro detekci většího počtu cílových nukleových kyselin.

Následuje vysvětlení některých pojmů, kterých se používá v tomto popisu. Připojené definice mají za cíl zlepšit porozumění vynálezu a nikoliv vynález omezit.

Pod pojmem cílová sekvence nukleové kyseliny se rozumí purifikovaná nebo částečně purifikovaná nukleová kyselina, která má být amplifikována.

Pod pojmem amplifikační reakční směs se rozumí vodný roztok obsahující různá činidla použitá pro amplifikaci cílové nukleové kyseliny. Tato činidla zahrnují enzymy, vodné pufry, soli, amplifikační primery, cílovou nukleovou kyselinu a nukleosidtrifosfáty. V závislosti na kontextu se může jednat buď o úplnou nebo o neúplnou amplifikační reakční směs.

Pod označením primer se rozumí oligonukleotid, který je schopen působit jako iniciátor syntézy DNA, pokud se tepelně hybridizuje k templátové nukleové kyselině za podmínek, při nichž se iniciuje syntéza prodlouženého produktu z primeru, tj. za přítomnosti čtyř různých nukleotidtrifosfátú a DNA polymerasy ve vhodném pufru (charakteri zovaném hodnotou pH, iontovou silou, kofaktory, atd) a při vhodné teplotě.

Pod označením templát se rozumí část cílové sekvence nukleové kyseliny, s níž se primer tepelně hybridizuje.

Ve výše uvedené části popisu byly uvedeny některé nevýhody dosavadního stavu techniky a výhody, které vynález přináší.

Další znaky, výhody a různá provedení vynálezu budou odborníkům zřejmá z následujícího popisu, který se opírá o přiložené výkresy a z připojených nároků.

Přehled obr, na výkresech

Na obr. 1 je graficky znázorněno kontinuální monitorování PCR v reálném čase.

Na obr. 1A je znázorněn zvětšená část grafu z obr. 1 ležící uvnitř křivky 1A.

- ==' Na obr. 2 je znázorněn perspektivní pohled na ' — amplifikační zařízení podle vynálezu.

Na obr. 3 je znázorněna zvětšená část zařízení z obr.. 1 tvořená tepelným cyklovačem, blokem tepelného výměníku a krytem.

Na obr. 4 je znázorněn blokový diagram zařízení z obr. 2.

Na obr. 5 jsou uvedeny příklady digitalizovaných obrazů charakterizujících větší počet reakčních směsí.

Na obr. 6 je znázorněna soustava pixelů sloužící pro zprůměrování za účelem získání jediné hodnoty fluorescence .

Na obr. 7 je znázorněn posun mezicyklový posun fluorescence..

Na obr. 8A je znázorněn větší počet profilů fluorescence.

Na obr. 8B jsou uvedeny hodnoty fluorescence z obr. 8A po normalizaci.

Na obr. 8C je znázorněna gelová elektroforéza amplifikačních produktů reprezentovaných profily z obr. 8A a 8B.

Na obr. 9 je znázorněn lineární vztah mezi logaritmem výchozího počtu templátových kopií a počtem cyklů, kterých je zapotřebí pro dosažení zvolené hodnoty fluorescence .

Na _Ob_r. 10A až 10D jsou znázorněny účinky reakčních podmínek.

Na obr. 11 až 13 jsou uvedeny zjednodušená bloková schémata stupňů prováděných při zjišťování hodnoty fluorescence .

Na obr. 14 je znázorněn perspektivní pohled na amplifikační zařízení podle vynálezu, na němž je ilustrová no v částečném řezu další provedení uspořádání zdroje exci tačního světla a detektoru emisí/fluorescence.

Na obr. 15 je v částečném řezu znázorněn zvětšený pohled na uspořádání zdroje excitačního světla a detektoru emisí/fluorescence z obr. 14.

Na obr. 16 je uvedena křivka závislosti propustnosti na vlnové délce, která je reprezentativní pro dichroické zrcadlo zkonstruované podle vynálezu.

Na obr. 17 je uveden půdorys zahřívaného okénka, které vyhřívá vrchní část nádob s reakčními směsmi podle vynálezu.

Předložený vynález zahrnuje amplifikaci nukleové kyseliny a detekci, monitorování a kvantitativní stanovení amplifikačních produktů. Pro usnadnění porozumění sběru amplifikačních dat a systému zpracování podle tohoto vynálezu je nejprve uveden přehled amplifikačních procesů nukleové kyseliny, které se obzvlášť hodí pro tento vynález .

Odborníkům v tomto oboru je zřejmé, že vynález vyžaduje amplifikaci dupexové formy nukleové kyseliny. Existují dobře známé metody amplifikace nukleových kyselin. Způsob, jakým se amplifikace provádí, není pro tento vynález rozhodujícía vynález je možno provádět za použití jakékoliv metody, při níž se vytvářejí duplexy nukleových kyselin. Přehled různých metod je uveden v publikaci Bio/Technology 8: 290 až 293, duben 1990. Jako neomezující příklady vhodných metod je možno uvést PCR, LCR, ζ)β a 3SR. Přestože 3SR a <2β nezahrnují tepelné cyklování, výsledek amplifikace je také možno monitorovat pomocí fluorescentního detekčního zařízení, které je popsáno dále, a analyzovat způsobem podle vynálezu. Každá z těchto metod je dále krátce charakterizována.

PCR amplifikace DNA zahrnuje opakované cykly tepelné denaturace DNA, tepelné hybridizace oligonukleotidových primerů k sekvencím, které lemují segment DNA, který má být amplifikován, a prodlužování tepelně hybridizovaných primerů pomocí DNA polymerasy. Primery se hybridizují k protilehlým řetězcům cílové sekvence a jsou orientovány tak, aby syntéza DNA působením polymerasy probíhala přes oblasti mezi dvěma primery, přičemž v každém následujícím cyklu se v podstatě zdvojnásobí množství DNA syntetizované v předchozím cyklu. Výsledkem je exponenciální akumulace specifického cílového fragmentu v poměru přibližně 2n, vztaženo na cyklus, kde n je počet cyklů. Úplný přehled této technologie je popsán v PCR Technology: Principles and Applications, Ed. Erlich, H. A., Stockton Press, New York 1989.

Pokud se používá PCR ve spojení s tímto vynálezem, používá se přednostně Taq DNA polymerasy, přestože toto použití není hlavním znakem tohoto vynálezu. Taq polymerasa je tepelně stálá a je účinná při vysokých teplotách. Způsoby výroby Taq polymerasy jsou uvedeny v US patentu č.4 884 818. Při PCR se však může používat i jiných tepelné stálých DNA polymeras izolovaných z jiných druhů Thermus nebo polymeras, které z druhu Thermus nepocházejí. Polymerasu je možno izolovat například z Thermus thermophilus nebo Thermotoga maritima. Použít se může i DNApolymeras, které nejsou tepelné stálé, jako je například T4 DNA polymerasa, T7 DNA polymerasa, E. coli DNA polymerasa I nebo Klenow fragment E. coli. Způsoby získávání tepelně stálých DNA polymeras jsou uvedeny v mezinárodních patentových přihláškách s publikačním číslem WO-A-91/09 950 a WO-A-92/03 556. Všechny výše a

- 17 dále uvedené citace představují náhradu za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu.

Ligasová řetězová reakce je popsána, v mezinárodní patentové přihlášce s publikačním číslem WO 89/09835. Při tomto postupu se používáligasy pro připojení oligonukleotidových segmentů, které se hybridizují k cílové nukleové kyselině. Výsledkem řetězové reakce probíhající působením ligasy (LCR) je amplifikace původní cílové molekuly a mohou se tak získat miliony kopií.DNA produktu. V důsledku toho má LCR za následek čistý nárůst dvouřetězcové DNA. Detekční metody podle tohoto vynálezu jsou aplikovatelné jak na LCR, tak na PČŘ. LCR obvykle vyžaduje určitý prostředek pro detekci DNA produktu, jako je oligonukleotidová próba. Pokud se LCR používá ve spojení s metodami detekce amplifikačních produktů podle vynálezu, tento prostředek není nutný a výsledek LCR je okamžitě detegovatelný.

Při jiném amplifikačním postupu, 0β, se používá Q-beta replikasy, což je replikasa z RNA bakteriofágu <2β.

Při tomto amplifikčním postupu se nejprve modifikovaný rekombinantní genom bakteriofágu se sekvencí specifickou pro cílovou sekvenci liguje ke zkoušené nukleové kyselině. Po obohacení duplexů vytvořených mezi bakteriofágovou próbou a nukleovou kyselinou ve vzorku se přidá Οβ replikasa, která po rozpoznání zachyceného rekombinantního genomu začne produkovat velký počet kopií.

Systém ζ)β nevyžaduje sekvence primeru a nezahrnuje stupeň tepelné denaturace, jako amplif ikační systémy PCR a LCR. Reakce probíhá při jedné teplotě, obvykle 37'C. Přednostním templátem je substrát pro 0β replikasu, midvariant1 RNA. Pomocí tohoto systému se dosáhne velmi vysokého nárůstu templátů. Přehled tohoto amplifikačního systému je uveden v mezinárodní patentové přihlášce s publikačním čís18 lem WO 87/06270 a v Lizardi et al., 1988 Bio/Technology 6: 1197 až 1202.

Systém 3SR představuje obměnu amplifikačního systému založeného na transkripci in vitro. Amplifikační systém založený na transkripci (TAS) zahrnuje použití příměrů kódujících promotorovou sekvenci a také komplementární sekvenci k cílovému řetězci, a je schopen produkovat kopie DNA cílového řetězce a kopie RNA z kopií DNA za použití RNA polymerasy (viz například příklad 9B US patentu č. 4 683 202 a evropskou patentovou přihlášku s publikačním číslem EP-A-0310 229). v systému 3SR se používá 3 enzymů pro isotermální replikaci cílových nukleových kyselin.

Tento systém zahajuje svou činnost tím, že se T7 RNA DNA primer naváže na cíl z jednořetězcové RNA. Prodloužením primeru pomocí reversní transkriptasy se vytvoří cDNA a působením RNAseH se z heteroduplexu uvolní cDNA. K cDNA se připojí druhý primer a zpracováním pomocí reversní transkrip tasy vznikne dvouřetězcová cDNA. Jeden (nebo oba) primery kódují promotor, například promotor pro T7 RNA polymerasu, takže dvouřetězcová cDNA je transkripčním templátem pro RNA polymerasu.

cDNA, které jsou schopny transkripce, poskytnou pozitivní kopie RNA původního cíle. Tyto transkripty se potom reversní transkriptasou převedou na dvouřetězcovou cDNA obsahující dvouřetězcové promotory, popřípadě na obou koncích v invertní opakující se orientaci. Tyto DNA mohou poskytnout RNA, které mohou znovu vstoupit do cyklu.

Úplnější popis systému 3SR je uveden v Guatelli et al.,

1990, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87: 1874 až 1878 a v evropské pantentové přihlášce s publikačním číslem EP-A-0 329 822 Systém TAS je také popsán v Gingeras et al., Innis et al. eds., 1990, PCR Protocols, Academie Press, San Diego, USA.

Podle vynálezu se amplifikace nukleové kyseliny monitoruje detekcí fluorescence, která je emitována, když se fluorescentní barvivo, jako například interkalační fluorescentní barvivo, které je přítomno v reakční směsi, naváže na dvouřetězcovou nukleovou kyselinu během každé fáze tepelně hybridizace/prodlužování, když je směs cyklována mezi dvěma teplotami (tepelné cyklování).

Zvýšení fluorescence ukazuje, že došlo k pozitivní amplifikaci cílové nukleové kyseliny. Jako neomezující příklady vhodných interkalačních činidel nebo barviv je možno uvést ethidiumbromid, propidiumbromid, proflavin, akridino-_________ vou oranž, akriflavin, fluorkumarin, ellipticin, duanomycin, chlorochin, distamycin D, chromomycin, homidium, mithramycin, rutheniumpolypyridyly, anthramycin, methidiumbromid,

2-[2-(4-hydroxyfenyl)-6-benzimidazol-6-(l-methyl-4-piperazyl)benzimidazoltrihydrochlorid apod.

Fluorofory a chromofory vázající DNA popsané v tomto oboru, které se hodí pro použití při 5' až 3' nukleasové zkoušce popsané v US patentu č. 5 210 015, jsou též vhodné při provádění tohoto vynálezu. Vhodné donorní fluorofory a zhášedla se volí tak, aby se emisní spektrum donorního fluoroforu překrývalo s absorpčním spektrem zhášedla.

Za ideálních podmínek by měly -fluorofory vykazovat vysokou hodnotu Stokesova posunu (velký rozdíl mezi vlnovou délkou pro maximální absorpci a vlnovou délkou pro maximální emisi), za účelem minimalizace interference rozptýleného excitačního světla.

Jako neomezující příklady vhodných značek, které jsou dobře známy v tomto oboru, je možno uvést fluorescein a o

jeho deriváty, jako je FAM, HEX, TET a JOE; rhodamin a jeho deriváty, jako je červeň Texas Red, ROX a TAMRA; žluť Lucifer Yellow a deriváty kumarinu, jako je 7-dimethylaminoku20 marin-4-acetát, 7-hydroxy-4-methylkumarin-3-acetát a 7-amino-4-methylkumarin-3-acetát (AMCA). FAM, HEX, TET, JOE, ROX a TAMRA jsou výrobky firmy Perkin Elmer, Applied Biosystems Division (Foster City, Kalifornie, USA). Červeň Texas Red a mnohé jiné vhodné sloučeniny uvádí na trh firma Molecular Probes (Eugene, Oregon, USA). Jako příklady chemiluminiscentních a bioluministentních sloučenin, které mohou být vhodné jako donory energie, je možno uvést luminol (aminoftalhydrazid) a jeho deriváty a Luciferasy.

Na obr. 1 je znázorněna fluorescentní stopa indikativní pro amplifikaci DNA v případě jediné řetězové re-_________ akce vyvolané polymerasou (PCR) zahrnující cyklování teploty reakční směsi mezi dvěma teplotami, například 94 °C a 50°C. Reakční směs zahrnuje interkalační fluorescentní barvivo, které se váže k DNA, ethidiumbromid (EtBr). Toto barvivo se interkaluje nebo váže k dvouřetězcovému PCR produktu a v průběhu každé fáze tepelné hybridizace/prodlužování fluoreskuje. V důsledku toho se výsledná fluorescence zvyšuje se zvyšujícím se množstvím dvouřetězcové DNA.

Jak je to znázorněno na obr. 1, intenzita fluorescence stoupá a klesá nepřímo úměrně s teplotou. Intenzita fluorescence je minimální při teplotě denaturace (94°C) a maximální při teplotě tepelné hybridizace/prodlužování (50°C). Intenzita fluorescence při 50’C tedy vykazuje cyklus-dependentní nárůst, který obráží zvyšování množství dvouřetězcové DNA. Když se tepelný cyklovač vrátí po dokončení. 30 cyklů na teplotu 25’C, stoupne fluorescence na konečnou hodnotu, která je více než třikrát vyšší než “’ počáteční fluorescence při 25’C. Naproti tomu minima fluorescence při denaturační teplotě významně nerostou, pravděpodobně proto, že při této teplotě nemá EtBr k dispozici žádnou dsDNA, na kterou by se mohl navázat.

Tato data byla pořízena za použití svétlovodú z optických vláken a spektra-fluorometru způsobem popsaným v patentové přihlášce USA SN 07/695 201. Svétlovodú z vláknové optiky se používá pro dodání excitačního světla přímo do zkumavky obsahující reakční směs, kterážto zkumavka je umístěna v vyhřívacím/chladicím bloku tepelného cýklovače. Stejného svétlovodú se používá pro vracení fluorescentních emisí do spektra-fluorometru, kde se odečítá hodnota odpovídající emitované fluorescenci. Za použití tohoto uspořádání je možno monitorovat tvorbu amplifikačních produktů při probíhající reakci (viz data uvedená na obr. 1). Vzhledem k tomu, že signál generovaný vazebným činidlem je možno detegovat bez otevření reakční zkumavky, lze jej monitorovat po celou dobu před, v průběhu a po amplifikačním postupu.

Zařízení pro detekci jediné PCR, kterým byla pořízena data z obr. -1, lze charakterizovat takto: SpexFluorolog-2-fluorometr s příslušenstvím z vláknové optiky (Spex katalogové číslo 1950) se nastaví tak, aby bylo emitováno excitační světlo při 500 nm s šířkou pásma přibližně

3,4 nm. Pro odloučení světla druhého řádu'se používá odřezávajícího filtru GG 435 nm (zakoupen od firmy Melles Grist lne.). Emitované světlo se deteguje při 570 nm s šířkou pásma přibližně 13,6 nm. Pro odstranění excitačního světla se používá filtru OG 530 (mezní vlnová délka 530 nm).

Reakční zkumavka je z polypropylenu, má objem 0,5 ml a obsahuje 60 ng humánní mužské DNA. Vrchní část zkumavky se odřízne pro připojení svétlovodú. Světlovodný kabel se přilepí k vrchní části reakční zkumavky epoxidovým lepidlem. Emitované světlo se zachycuje přes olejovou krycí vrstvu ve zkumavce. Zkumavka se ovine černým materiálem a umístí do tepelného cýklovače. Tepelný cyklovač se naprogramuje tak, aby vykonal 30 jednominutových cyklů s teplotou v rozmezí od 94 do 50’C, po nichž následuje kontinuální inkubace při 25 °C. Fluorometr a tepelný cyklovač se spustí současně. Použije se těchto parametrů fluorometru: časové snímání s intergrační dobou 5 sekund, emisní signál se uvádí do poměru s intenzitou excitačního světla, aby se vyloučily změny způsobené variacemi intenzity světelného zdroje.

Jak již bylo uvedeno výše, je předmětem vynálezu také zařízení pro současnou detekci amplifikace ve větším počtu amplifikačních reakčních směsí v reálném čase. Každá reakční směs obsahuje cílovou sekvenci nukleové kyseliny.

Tak například za použití tepelného cyklovače (například----tepelného cyklovače obchodně dostupného od firmy Perkin Elmer Cetus Instruments), který obsahuje vyhřívací a chladicí blok, do něhož lze umístit až 48 zkumavek, je možno provádět například 48 amplifikačních reakcí pomocí PCR a amplifikační produkty ve všech 48 vzorcích je možno součas ně detegovat, aniž by bylo nutno manipulovat se vzorky, otevírat zkumavky nebo přerušovat cyklování. Počet současně monitorovaných reakcí je omezen pouze kapacitou vyhřívacího a chladicího bloku. Když se tedy použije vyhřívacího a chladicího bloku z 96 jamkami, může se současně monitorovat 96 amplifikačních reakcí a detegovat 96 amplifikač nich produktů.

Toto provedení je sice popsáno ve spojení s PCR, přičemž signály generované specifickým fluorescentním vazebným činidlem jsou indikativní pro amplifikaci cílové sekvence DNA v určitých vzorcích, ale podobně jako při výš popsaném postupu, lze stejného provedení vynálezu použít i pro monitorování jiných amplifikačních postupů nebo postupů za použití jiných vazebných činidel (viz výše uvedepý přehled, a také US patent č. 5 210 015, Gelfand et al. ) .

V prvním provedení zařízení pro detekci většího počtu amplifikačních reakčních směsí přesunuje vhodný optický systém excitační světlo ze zdroje do většího počtu reakčních zkumavek, které jsou uloženy v tepelném cyklovači, přičemž se měří světlo emitované z každé zkumavky. Takový optický systém může zahrnovat větší počet vláknových světlovodů, které současně přenášejí signály ze všech tepelně cyklovaných zkumavek s reakčními směsmi s PCR. Pro odečítání fluorescence z reakčních zkumavek je zapotřebí pouze jednoho fluorometru, poněvadž odečtení příslušné hodnoty z každého světlovodu se může rychle provádět po jednom, například době, kdy je reakční směs PCR zahřívána na sta,-_____ novenou teplotu (například v intervalu tepelné hybridizace/prodlužování, jako je interval mezi dobou a a c v obr.

1A. Odborníkům v tomto oboru je zřejmé, že takový detekční systém není nutně omezen na určitý tepelný cyklovač nebo určitou reakční nádobu.

Zařízení pro detekci amplifikace obsahuje světlovody z vláknové optiky pro přenášení excitačního světla a fluorescentních emisí. Za předpokladu, že reakční jímky nebo zkumavky apod. jsou světelně utěsněny, aby se zabránilo vnějším zdrojům světla ovlivňovat detekci fluorescence, může se pro zakrytí reakčních směsí použít jakékoliv misky, trubkového uzávěru nebo víčka, které obsahuje světlovod z vláknové optiky, nebo k němuž je takový světlovod možno připojit. V jednom provedení tohoto vynálezu se mohou víčka reakčních zkumavek sejmout pro úpravu vláknové optiky. Když se však použije reakčních nádob, které mají čirý nebo průsvitný uzávěr, není nutno do zkumavek vkládat světlovodný kabel. Je zřejmé, že výhodné jsou zvláště reakční nádoby (zkumavky), k nimž je možno připojit světlovodový kabel, aniž by tento kabel byl ve fyzickém kontaktu se složkami amplifikační reakční směsi.

Na obr. 2 je znázorněno další provedení zařízení pro současnou detekci amplifikace většího počtu cílových sekvencí nukleové kyseliny v reálném čase. Toto detekční zařízení je označeno vztahovou značkou 10. Při tomto provedení se s výhodou odstraňuje potřeba světlovodů z vláknové optiky pro přivádění excitačního světla a odvádění fluorescentních emisí, jak to bylo popsáno výše, a tím se odstraní problémy, které souvisejí s připojováním vláknové optiky ke zkumavkám. Pod pojmem zkumavky se ve výše a dále uvedeném popisu rozumějí reakční nádoby libovolného tvaru a uspořádání. Detekční zařízení 10 je, podobně jako zařízení uvedené výše, pro zjednodušení popisováno v sou------vislosti s PCR amplifikací cílové sekvence DNA za použití fluorescentního vazebného činidla, jako generátoru signálu. Přirozeně však amplifikační postup není omezen na použití právě tohoto konkrétního amplifikačního postupu a tohoto generátoru signálu amplifikace nukleové kyseliny.

Detekční zařízení 10 obecně zahrnuje tepelný cyklovač 12 pro vyhřívání a chlazení zkumavek 26 (do nichž byla předložena nukleová kyselina nebo nukleové kyseliny pro amplifikací), laterálně umístěné lampy 14., jakožto zdroj excitačního světla, zobrazovací zařízení 16 (které zahrnuje CCD-kameru 16a, regulátor 16b kamery a chladič 16c kamery), obrazový procesor, kterým může být personální počítač s deskou s plošnými spoji pro namátkové vzorkování rámu, jako je PC VISION PLUS (obchodně dostupná od firmy ITEX lne.) a propojovací deskou s plošnými spoji IEEE 488 Interface Card. Tyto prvky jsou znázorněny v blokovém diagramu na obr. 4. Přestože má v přednostním provedení tepelný cyklovač 12 konvenční konstrukci, je dále uveden souhrn určitých znaků tepelného cyklovače 12 pro lepší porozumění tomuto vynálezu.

Tepelný-cyklovač 12 obsahuje tepelný výměník 22 pro vyhřívání a chlazení zkumavek 26. Tepelný výměník 22 je tvo25 řen tepelně vodivým blokem, přednostně z hliníku, v němž je vytvořen větší počet zahloubení 24. Zahloubení 24 mají takovou velikost, aby do nich bylo možno vložit daný počet zkumavek 26 (například Eppendorfovýchtrubiček o objemu 0,5 ml). Úkolem tepelného výměníku 22 je podpírat zkumavky 26 a působit jako výměník tepla při sdílení tepelné energie směrem do kapalin umístěných ve zkumavkách a z nich ven, aby bylo možno reakční složky inkubovat při různých teplotách po dobu nastavenou obsluhou. Tepelný cyklovač 12 tedy také zahrnuje systém pro vyhřívání a chlazení tepelného výměníku a prostředek, jako například počítačový systém pro regulaci vyhřívacího a chladicího systému, kterým. se tepelný výměník a tedy i zkumavky konvenčním způsobem zahřívají a chladí. Obsluha pomocí uživatelského rozhraní 28 (displej/klávesnice) naprogramuje počítač nebo regulační zařízení pro regulaci vyhřívání a chlazení tepelného výměníku a zkumavek, aby se dosáhlo požadovaného teplotního profilu, například profilu ilustrovaného na obr. 1.

Tepelný výměník (tepelně vodivý blok), zařízení pro vyhřívání a chlazení tepelného výměníku, prostředek pro regulaci vyhřívání a chlazení tepelného výměníku, jakož i celý tepelný cyklovač mohou mít konstrukci podle US patentu č. 5 038 852. Vhodné tepelné cyklovače jsou obchodně dostupné a jedná se například o tepelný cyklovač GeneAmp TCR systém 9600 thermal cycler (Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA), který je znázorněn na obr. 2.

Je samozřejmé, že pro vyhřívání a chlazení naplněných zkumavek je možno používat ijiných zařízení, aniž by to představovalo únik z rozsahu tohoto vynálezu. Jedinou nutnou podmínkou je, aby použité zařízení pro vyhřívání a chlazení zkumavek bylo schopno přivést obsah zkumavek na požadovanou teplotu a při této teplotě jej udržet při dodržení požadovaného profilu teplota/čas. Pro účely amplifikace nukleové kyseliny by tedy takové zařízení mělo být schopno cyklovat teplotu amplifikační reakční směsi od teploty denaturace Tj (která může ležet v rozmezí od asi 80 do asi 105°C, s výhodou od 90 do 100’C) do teploty tepelné hybridizace/prodlužpvání T₂ (která může ležet v rozmezí od asi 30 do asi 90'C a přednostně od asi 50 do asi 70^OC), přičemž teplota Tj musí být větší než teplota T₂, jak je to zřejmé odborníkům v tomto oboru.

K tepelnému výměníku 22 je, jak je to obvyklé v tomto oboru, posunovatelně připojen krycí blok 27 obsahující držadlo 27a. který slouží pro zakrývání a odkrývání tepelného výměníku 22. V průběhu amplifikačního a detekčního postupu podle vynálezu za použití detekčního zařízení znázorněného na obr. 2 je krycí blok 27 udržován v zadní poloze (viz obr. 3). To umožňuje, aby se do CCD-kamery 16a dostaly fluorescenční signály emitované z amplifikačních směsí ve zkumavkách.

Tepelný cyklovač 12 je také vybaven prostředkem pro přenos výstupních dat ukazujících teplotní profil tepelného výměníku nebo amplifikační reakční směsi (číslo cyklu, teploty a čas) do obrazového procesoru 20 vedením 30. Tak například tepelný cyklovač GeneAmp PCR System 9600 Thermal Cycler může být pro přenos těchto dat vybaven obvodem RS 232. Tato výstupní data může obsluha za provozu sledovat na displeji 28a (ze svítivých diod LED).

____CCD-kamera 16a je umístěna nad tepelným výměníkem 2 a zkumavkami, aby mohla shromažďovat fluorescentní signály emitované z amplifikačních reakčních směsí vrchním koncem zkumavek v průběhu tepelného cyklování zajišťovaného tepelným cykJLovačem 12. Je důležité, aby byla CCD-kamera 16a umístěna co nejdále, v praktické vzdálenosti, od tepelného výměníku 22 pro snížení účinku paralaxy na fluorescentní obraz zachycený CCD-kamerou 16a. Naproti tomu musí být CCD-kamera 16a umístěna dostatečně blízko tepelnému výměníku a zkumavkám, za účelem minimalizace šumu pozadí z jiných světelných zdrojů, a také proto, aby mohla kamera zachytit dostatečné množství světla ze zkumavek 26.. Zjistilo se, že optimální vzdálenost d mezi tepelným výměníkem 22 a čočkou 46 kamery, která je obrácena k tepelnému výměníku, leží v rozmezí od asi 15 do asi 152 cm, v závislosti na použité čočce. Když se například použije 70mm čočky, je vzdálenost d přednostně asi 61 cm. Před čočkou je umístěn pásmový interferenční filtr 48 (omezující vlnový rozsah prošlého fluorescentního záření), přednostně filtr 600 nm, aby se-------— omezila detekce na požadovanou vlnovou délku, poněvadž zajímavá fluorescence má vlnovou délku přibližně 600 nm.

Podle uspořádání znázorněného na obr. 2 je CCDkamera 16a připevněna k běžnému kopírovacímu stojanu 32, který slouží pro polohování kamery nad tepelným výměníkem 22 a zkumavkami 26. Kopírovací stojan 32 obsahuje vertikální nosník 34., který je upevněn v držáku 36.. Držák 36 je připevněn k montážní podložce 38 podpírající detekční zařízení 10. K vertikálnímu nosníku 34 je posunovatelně připojen posunovatelný člen 40 zajišťující pohyb ve svislém směru. Posunovatelný člen 40 je Opatřen otočným knoflíkem 42 , který při pootočení spolupracuje s posunovatelným členem 40 a uzamyká ho v určené poloze, jak je to běžné v tomto oboru. Držák 44 kamery je jedním koncem zajištěn v posunovatelném členu 40 a druhým v CCD-kameře 16a. Prostřednictvím posunovatelného členu 40 je tedy možno CCD-kameru 16a umístit ďo požadované výšky nad tepelným výměníkem a zkumavkami.

Jako kamery 16a se přednostně používá běžné chlazené CCD-kamery řízené počítačem. CCD-kamerou 16a se několikakanálovým potrubím 50 cirkuluje chladicí kapalina.

Kamera se přednostně chladí, aby se dosáhlo vyšší kvality obrazů s menším šumem. Jednou vhodnou kamerou je CCD-kamera, která je obchodně dostupná od firmy Photometrics (Tuscon, Arizona, USA) pod označením Star 1. V této kameře se používá termoelektricky chlazené CCD soustavy s rozlišovací schopností 12 bit/pixel. Tato kamera také umožňuje měnit expoziční dobu za účelem změny citlivosti k detegované fluorescenci. CCD-kamera 16a je spojena s obrazovým procesorem 20 vedením 58 bus (IEEE 488 bus), aby mohl obrazový procesor 20 regulovat expozici obrazu zkumavek a dobu, v níž se obrazy snímají.

Následující popis se vztahuje k obr. 4. Dvě lampy 14 (UV lampy) jsou laterálně umístěny vzhledem k optické dráze mezi CCD kamerou 16a a tepelným výměníkem 22. Důležité je pouze, aby lampy 14 byly dostatečně blízko čočce 46 kamery, aby jejich kryty neinterferovaly s optickými drahami mezi všemi zkumavkami a čočkou 46 kamery. Za tím účelem mohou být lampy 14 zavěšeny z držáku 44 kamery pomocí držáku 52 lampy. Lampy 14 jsou také rovnoběžné s tepelným výměníkem, aby se excitační světlo rovnoměrným způsobem dostalo do každé zkumavky. Lampy 14 jsou opatřeny přívodními kabely 54. které jsou opatřeny zástrčkou vhodnou pro umístění ve standardní zásuvce ve zdi, do které se přivádí elektrický proud o napětí 115 V. Přívodní kabely 54 slouží pro přívod elektrické energie do lamp. Vlnová délka záření, které lampy 14 (UV lampy) vydávají, se volí podle požadavků fluorescentního činidla schopného vázat se k nukleové kyselině. Tak například pro excitaci ethidiumbromidu je vhodná vínová délka 302 nm. Jako vhodnou 302nm obchodně dostupnou středopásmovou UV lampu je možno uvést výrobek firmy U.V.Products lne. (San Gabriel, CA, USA) o názvu Chroma-Vue. · ·

Obraz snímaný CCD-kamerou 16a se vedením 56 přenáší do obrazového procesoru 20. Pokud se používá systému Star 1, je vedení 56 tvořeno kabelem RS170. Obrazový procesor 20 obsahuje desku s plošnými spoji pro namátkové vzorkování rámu při vytváření digitálních obrazů z dat přicházejících z kamery vedením 56. Přestože má CCD-kamera 16a 12-bitový digitální výstup, pokud je obrazový procesor 20 8-bitovým obrazovým procesorem, používá se analogického výstupu kamery. V takovém případě zahrnuje obrazový procesor 20 desku s plošnými spoji pro namátkové vzorkování rámu pro vytváření 8-bitových digitálních obrazů z analogického signálu přivedeného vedením 56, aby mohl obrazový procesor 20 manipulovat s těmito obrazy ve formě digitálních dat.

K obrazovému procesoru 20 je také připojeno vedení 30, kterým se přenášejí výstupní data z tepelného cyklovače, tj. data vztahující se k teplotnímu profilu, době a pořadí právě prováděného amplifikačního cyklu. Potom je možné obrazový procesor 20 naprogramovat tak, aby vyslal spouštěcí signál vedením 58 bus do řídícího zařízení 1.8 kamery, které řídí otevírání uzávěrky CCD-kamery 16a v předem určených dobách v průběhu amplifikace. Obrazový procesor 20 obsahuje desku s plošnými spoji IEEE 488 bus pro komunikaci s vedením bus 58 (IEEE 488), za účelem řízení CCD-kamery 16a. Obrazový procesor 20 je také vybaven konvenčním uživatelským rozhraním (klávesnice 60 a/nebo myš 64) a monitorem 62.. Celkový přehled provozu detekčního zařízení 10 je uveden dále.

Do bloku tepelného výměníku 22 se umístí větší počet zkumavek 26, z nichž každá obsahuje reakční směs (například nukleovou kyselinu nebo kyseliny, které mají být amplifikovány, tepelně stálý enzym pro katalýzu polymerace, specifické oligonukleotidové primery a čtyři různé nukleotidtrifosfáty) (viz obr. 3). Zkumavky mohou být uzavřeny běžnými víčky, bariérovou vrstvou minerálního oleje nebo utěsněny materiálem Ampliwax^^R^. Tepelný cyklovač se aktivuje a začne se uvádět energie do excitačních lamp, které jsou nasměrovány na zkumavky. V odpovědi na signál z regulátoru 16b kamery zachytí CCD-kamera 16a obraz všech zkumavek 26. který reflektuje různou úroveň fluorescence v první tepelně hybridizační prodlužovací fázi cyklu. Tento analogový obraz se zašle do obrazového procesoru, kde pomocí desky s plošnými spoji pro namátkové vzorkování rámu dojde k digitalizaci, poněvadž toto zařízení obsahuje analog/digitální konvertor.

Na obr. 5 jsou znázorněny části tří takových digitalizovaných obrazů pořízených v průběhu 6 simultánních amplifikací. Procesor zprůměruje intenzitu světla emitovaného z každé zkumavky během již zmíněné tepelně hybridizační/prodlužovací fáze a normalizuje tyto hodnoty intenzity za účelem stanovení jediné hodnoty fluorescence pro každou zkumavku. Způsob normalizace je blíže popsán dále v souvislosti s popisem obr. 8A až 8C. Výše uvedený postup se opakuje v každém cyklu amplifikačního postupu. Normalizované hodnoty fluorescence se uchovají v počítači pro následnou analýzu a grafické zpracování. Tyto normalizované hodnoty fluorescence se dále zpracovávají za účelem stanovení počátečního množství sekvence cílové nukleové kyseliny (tj. počtu výchozích templátú cílové nukleové kyseliny před amplifikací) nebo za účelem analýzy vlivu podmínek amplifikační reakce na kinetiku reakce. Podrobnější diskuse vztahující se k získávání hodnot fluorescence a zpracovatelským stupňům je uvedena dále.

Nejprve bude probráno časování expozice každé kamery emitované fluorescenci. Vzhledem k tomu, že k maximální fluorescenci dochází v tepelně hybridizační/prodlužovací fázi každého cyklu amplifikačního postupu, při němž se provádí tepelné cyklování (viz například interval a - c v obr. IA) a tato fluorescence je měřítkem úrovně amplifikace nukleové kyseliny, pokud se pořizuje CCD-kamerou 16a pouze jeden obraz v daném cyklu, mělo by se tak dít v této fázi cyklu, poněvadž právě tehdy se získá nejsilnější signál a signály v tomto intervalu nejlépe charakterizují množství produkovaného materiálu.

Poněvadž však i jiná data pořízená v průběhu reakce mohou být užitečná pro analýzu celkového průběhu amplifikace, je třeba chápat, že může být žádoucí v jednom cyklu poříz ovát větší počet obrazů ne ž_ jeden_Ta k například může být každý obraz snímán 20 sekund po dosažení teploty tepelně hybridizačního/prodlužovacího stupně, jak je to naznačeno vztahovou značkou b v obr. ΙΑ. V tomto příkladu se postupuje takto: po dosažení teploty tepelné hybridizace 68°C vyšle obrazový procesor 20 signál, 20 sekund poté, co byl o dosažení teploty 68°C zpraven prostřednictvím vedení 30 (RS232), které přenáší data z tepelného cyklovače 12 ♦

Výše uvedený signál je obrazovým procesorem 20 vyslán do regulátoru 16a kamery a tento regulátor zajistí otevření závěrky (není znázorněno). Expoziční doba se může měnit od jedné aplikace k druhé, což je odborníkům v tomto oboru zřejmé. Signál pro otevření závěrky kamery může být samozřejmě nahrazen manuálním otevřením, které udělá obsluha sledující teplotní a časová data na displeji 28a.

CCD-kamera sečte světlo, které obdrží v průběhu expozice a vytvoří obraz, který je indikativní pro fluorescence všech zkumavek v tepelném výměníku v daném časovém intervalu. Tento obraz je zaslán vedením 56 do obrazového procesoru 20.. Monitor 62, který je připojen k obrazovému procesoru 20 může ukazovat tři okna 64A až 64C displeje.

Okno 64A displeje může monitorovat pohled kamery a poskytovat menu během provozu kamery pro takové funkce, jako je řízení expozice kamery. Okno 64B displeje ukazuje digitální obraz a usnadňuje manuální volbu části obrazu, která ná být dále zpracovávána (například zprůměrována způsoben uvedenýn dále). Okno 64C displeje ukazuje instrukční řádek operačního systénu počítače.

Obrazový procesor digitalizuje obraz, a tento obraz se ukáže v oknu 64B displeje, kterého se používá tak, že uživatel nůže přiřadit skupinu pixelů oblasti obrazu zahrnující jediný obraz zkunavky. To může provést zakreslenín čtverečků okolo částí digitalizovaného obrazu zkunavky 26

--------v oknu 64B displeje pomocí myši. Alternativně se může použít progranu, který prohlédne fluorescenci každého pixelu a na základě toho stanoví, které pixely patří k určité zkunavce, což je odborníkůn v oboru počítačové grafiky zřejné.

Posledně uvedený postup je ilustrován na obr. 6, kde soustava pixelů 6x6 zahrnuje obraz jediné zkunavky 26. Je třeba chápat, že tato soustava byla zvolena pouze jako ilustrativní příklad a že je nožno použít soustav o jiné velikosti, aniž by to znanenalo únik z rozsahu tohoto vynálezu. Hodnota pixelu 5 označuje nevýznamnou fluorescenci, která odpovídá fluorescenci emitované horním povrchem tepelného výměníku, zatímco hodnota 200 označuje maximum fluorescence detegované v soustavě pixelů 6x6. Posledně uvedená hodnota odpovídá fluorescenci emitované ze středu zkumavky zobrazované v pixelech. Hodnoty pixelu 100 odpovídají fluorescenci emitované částí tepelného výměníku a zkumavky. Je samozřejmé, že tyto specifické hodnoty pixelu nutně nemusí představovat skutečné hodnoty, nýbrž jsou uvedeny pouze jako příklady.

Obrazový procesor 20 potom zprůměruje pixelové hodnoty v soustavě přiřazené oblasti zahrnující jedinou zkumavku za vzniku jedné hodnoty fluorescence pro zkumavku v cyklu amplifikačního procesu nukleové kyseliny. Získání jediné hodnoty fluorescence pro každou zkumavku se však muže provést i jinými způsoby, jako například sečtením pixelových hodnot. Čtverec vymezující soustavu 6 x 6 a zahrnující první zkumavku se potom přesune tak, aby zahrnoval následující zkumavku. V této poloze se zprůměrovací stupeň pixelových hodnot opakuje, přičemž se získá jediná hodnota fluorescence. Obdobně se postupuje dále, tak dlouho, dokud každá zkumavka v cyklu 1 nemá přiřazenu jedinou hodnotu fluorescence. Alternativně se mohou hodnoty fluorescence pro jednotlivé zkumavky 26 v daném cyklu získávat paralelním postupem—Tento postup výpočtu hodnoty fluorescence pro------každou zkumavku se opakuje každý cyklus, až do dokončení amplifikačního postupu.

Na počátku, tj . když se do bloku tepelného výměníku 22 vkládají zkumavky 26 , vloží se do jednoho zahloubení 24 také kontrolní zkumavka 26C. Úkolem kontrolní zkumavky je zajistit konstantní zdroj fluorescence, vzhledem k němuž je možno detegovat variace měření od cyklu k cyklu, k nimž například dochází menšími změnami teploty nebo kolísáním intenzity excitačního světla. Tak je možno hodnotu fluorescence získanou pro každou zkumavku korigovat, aby byly výše uvedené variace kompenzovány. Korekce se provádí následujícím způsobem: do kontrolní zkumavky 26C se předloží samotné fluorescenční barvivo, jako například ethidiumbromid (EtBr). Vzhledem k tomu, že kontrolní zkumavka neobsahuje žádnou nukleovou kyselinu, nedochází v průběhu tepelného cyklování k amplifikací fluorescence látky v ní obsažené. Kontrolní _ zkumavka bude tedy emitovat po expozici excitačnímu světlu v průběhu amplifikačního postupu v podstatě konstantní množství fluorescence a bude tak sloužit jako základní linie. To je ilustrováno na obr. 7, kde je graficky znázorněna závislost intenzity fluorescence kontrolní zkumavky proti několika cyklům.

Následuje popis obr. 7. Hodnotou i_Q je označena počáteční fluorescence kontrolní zkumavky, která tedy tvoří základní linii. V cyklu 2 začne zaznamenávaná intenzita fluorescence kontrolní zkumavky 26 klesat, což ukazuje, že došlo k posunu ve fluorescenci. Plná čára 72 v cyklu 4 odpovídá zdánlivé hodnotě intenzity, tak například v cyklu 4, kdy kamera sbírá data z tepelně hybridizační/prodlužovací fáze čtvrtého cyklu, je zdánlivá hodnota fluorescence kontrolní zkumavky i_A4. Pro tento cyklus se tedy stanoví korekční faktor i₀/i_A4. Každá z hodnot fluorescence získaná pro jednotlivou zkumavku se vynásobí tímto korekčním faktorem, a tak se získá skutečná hodnota fluorescence. Výše uvedený postup se opakuje v každém cyklu. Korekční faktor se obecně charakterizuje jako poměr Íq/í^, kde i_Q představuje počáteční hodnotu fluorescence kontrolní zkumavky a i^ představuje zdánlivou hodnotu fluorescence kontrolní zkumavky v průběhu cyklu číslo n. Každá hodnota fluorescence získaná pro zkumavku, například při zprůměrování (které je popsáno výše) se násobí tímto korekčním faktorem. To se opakuje v každém cyklu.

Normalizace a kvantitativní stanovení bude popsáno v souvislosti s daty generovanými ve specifickém příkladu, který slouží pouze pro ilustraci. Výše uvedená data jsou ilustrována na obr. 8A. Je třeba zdůraznit, že vynález není omezen na PCR nebo na konkrétní amplifikační reakční směsi a na takové znaky, jako je uvedený počet amplifikaci, tepelný cyklovač, teplotní profil nebo interval, v němž se fluorescenčni obrazy snímají. Tyto skutečnosti jsou odbor- .. . níkům v tomto oboru zřejmé. Potřebné je pouze monitorovat amplifikační reakční směsi, které se liší v počáteční koncentraci cílové sekvence nukleové kyseliny za účelem kvantitativního stanovení počáteční koncentrace této cílové sekvence v amplifikační reakční směsi. Tato koncentrace je na počátku neznámá, jak je to podrobněji popsáno dále.

Na obr. 8A jsou uvedeny hodnoty fluorescence získané z osmi simultánně minitorovaných PCR amplifikací za použití způsobu podle vynálezu. Používá se 55 cyklů tepelného cyklování a monitorování se provádí pomocí CCD-kamery. Tyto hodnoty tedy reprezentují hodnoty získané pro každou zkumavku (například zprůměrováním odpovídajících pixelových soustav), která je korigována na výskyt variací při měření (například posun), jak to bylo uvedeno výše. V tomto příkladu 7 reakčních směsí obsahuje známé koncentrace specifické cílové sekvence DNA (tj. známé množství výchozího vzorku) pro usnadnění kvantitativního stanovení neznámého ________výchozího množství^ve^vzorku,^které je podrobněji popsáno____ dále. Osmá směs neobsahuje cílovou DNA a slouží jako kontrolní reakční směs poskytující informace o pozadí. Sedm amplifikací známého vzorku se iniciuje za použití zřeďovací série jednořetězcové HIV templátové DNA.

Před ředěním se PCR reakční směsi předloží do 100 μΐ lOmM Tris-HCl, pH 8,3, který obsahuje 50mM chlorid draselný, 3mM chlorid hořečnatý, 2,5 U Taq DNA polymerasy (Perkin Elmer, Norwalk, CT), ΙΟΟμΜ každého z dNTP (Promega Corp., Madison, WI), 4 μg/ml ethidiumbromidu (Bio Rad, Richmond, CA), 100 pmol každého z HIV specifických (oblast gag) oligonukleotidových primerů SK145 a SK431 (Perkin Elmer, Norwalk, CT) a 300 ng humánní placentární DNA (Sigma, St. Louis, MO) . Jako cílové templátové nukleové kyseliny se používá subklonu M13 oblasti gag HIV.

»

Vychází se z 10⁸ templátů a sériovým ředěním _f (vždy desetinásobně) se dospěje až ke koncentraci 10² templátů. V těchto koncentracích se templátů použije na reakci s HlV-specifickými primery za vzniku 142 bp PCR produktu. Profily fluorescence na obr. 8A generované za použití těchto počátečních koncentrací jsou označeny vztahovými značkami ΙΟ⁸, 10⁷ až 10.². Také se monitoruje kontrolní amplifikace bez přidání templátu. Profil fluorescence této směsi je znázorněn čarou označenou vztahovou značkou 0. Pro simulaci stanovení lymfocytové DNA pomocí PCR pro integrované genomy HIV obsahují všechny reakční směsi 300 ng nebo 40 000 buněčných ekvivalentů humánní genomové DNA.

Tepelné cyklování zahrnuje 55 cyklů v tepelném cyklovači GeneAmp PCR System 9600 (Perkin Elmer Norwalk, CT) s dvouminutovým programem: 94’C - 15 sekund (denaturace), 68’C - 30 sekund (tepelná hybridizace/prodlužování). Pro zajištění hořkěhó^startu7Γ který j_e v tomto oboru obvyklý pro zlepšení specifičnosti reakce (viz Chou, Q., Russel, Μ., Birch, D. E., Raymond, J. a Bloch, W., Prevention of pre-PCR mis-priming and primer dimerization improves low-copy-number simplifications, Nucleic Acids Research 20: 1717 až 1723, 1992) se používá počátečního setrvání při 75°C, během kterého se přidá chlorid hořečnatý (ve 12μ1 objemu) poté, co vzorky dosáhnou této teploty, fluorescentní obrazy v každém teplotním cyklu se snímají CCD kamerou v době 20 sekund celkem 30sekundového setrvání při teplotě hybridizace, přičemž expoziční doba je asi 1 sekunda. Jak již bylo uvedeno výše, nepoužívá se vyhřívacího krycího bloku 27, který je přesunut dále od zkumavek, aby to umožnilo snímání obrazu.

Jak je to zřejmé o obr. 8A, fluorescence z každé zkumavky se mění v počátečních tepelných cyklech jen málo a potom stoupá, když se vytvoří detegovatelná množství PCR produktu. Čím více výchozíchtemplátových kopií je přítomno v reakční směsi, tím dříve dojde k takovému nárůstu fluorescence. V této souvislosti je vhodné si všimnout křivky označené vztahovou značkou 10⁸, která představuje křivku fluorescence odpovídající fluorescenci emitované z reakční směsi s nejvyšší výchozí' koncentrací templátu, tj. 10 templátu. Z obr. 8A je zřejmé, že křivka 10⁸ stoupá jako první, což lze očekávat.

Existují však značné variace v počátečních hodnotách fluorescence získaných z různých amplifikačních směsí, přestože by tyto hodnoty měly být stejné. Měly by být stejné proto, že množství jednořetězcové DNA je tak malé, že zrněný tohoto množství ve zkumavce mají zanedbatelný vliv na celkovou fluorescenci očekávanou u jednotlivé zkumavky. Předpokládá se, že zdrojem těchto variací je nehomogenita nebo nerovnoměrnost osvětlení, paralaxa a různý útlum fluorescence, k němuž dochází díky uzávěrům zkumavek. Monitorování amplifikačních reakcí, při němž se víčka zkumavek nahradí bariérovou vrstvou pro páry, vytvořenou minerálním olejem nebo těsnicí látkou Ampliwax^^, se tyto variace sníží, ale neodstraní.

Pro kompenzaci nehomogenity paralaxy osvětlení a různého útlumu, tedy variací projevujících se v obr. 8A, stanovuje obrazový procesor pro každou amplifikaci normalizační faktor. Tento faktor je stanoven na základě dat sebraných v cyklu 1 a představuje poměr průměrné počáteční fluorescence všech reakcí k pozorované počáteční fluorescenci každé z reakcí. Procesor vynásobí všechny hodnoty fluorescence z každé amplifikace příslušným normalizačním faktorem. Výsledek této normalizace je zřejmý z obr. 8B. V případě reakce, při níž je na počátku v reakční směsi obsazeno 10° templátovych kopii, je tento poměr (normalizační faktor), definován jako součet všech 8 hodnot fluorescence v cyklu 1 vydělený číslem 85, což je počáteční hodnota fluorescence reakční směsi 10⁸. Hodnoty fluorescence pro reakci označenou IQ⁸ se potom vždy násobí tímto faktorem za vzniku normalizované křivky uvedené v obr. 8B. Podobným způsobem se normalizuje každý křivka. Normalizace je založena na předpokladu, že zdroj variace obrazu zeslabuje nebo zesiluje fluorescentní signál proporcionálně v celém rozsahu intenzit signálu.

Jak je zřejmé z obr. 8B, všechny reakce vykazují stejnou počáteční fluorescenci a pro většinu reakčních profilů je charakteristický pravidelný odstup, který je konsistentní se zařazením v sérii ředění. Profily jsou velmi podobné, pokud se týče jejich tvaru, a jsou téměř rovnoběžné. Časná, či logaritmická fáze účinné PCR reakce zahrnuje zdvojnásobení počtu kopií DNA v každém cyklu. Předvídá se, že každé desetinásobné zředění výchozího templátu bude vyžadovat 3,3 2—pří dávného cyklu pro přivedenijvýtěžku PCR pro-____ duktu na danou koncentraci. Normalizované hodnoty, tedy pro značnou část rozsahu úrovně fluorescence vypadají tak, jak lze očekávat. Z obr. 8B je zřejmé, že jednotlivá zředění poskytují výtěžky posunuté o zhruba 3 cykly, s výjimkou případu, kdy je v reakční směsi obsaženo 10² kopií a kdy tam nejsou kopie žádné. Je také zřejmé, že tento cyklový posun přetrvává i po logaritmické fázi PCR. Na rozdíl od toho, počet cyklů oddělujících jednotlivá zředění v případě, že normalizace nebyla provedena (obr. 8A) se mění v širokém rozsahu.

Za použití normalizovaných dat fluorescence, jako jsou data uvedená na obr. 8B, je možno kvantitativně stanovit počáteční množství cílové nukleové kyseliny nebo lze analyzovat vliv různých reakčních podmínek na kinetiku amplifikační reakce. Nejprve je blíže popsáno kvantitativní stanovení počátečního množství cílové nukleové kyseliny.

Obr. 9 ukazuje lineární vztah mezi logaritmem výchozího počtu templátových kopií a počtem cyklů, které je třeba provést, aby amplifikace podle obr. 8B dospěla na zvolenou úroveň fluorescence 190.

Čára znázorněná na obr. 9 představuje regresní přímku sestrojenou z bodů odpovídajících reakčním směsím, které na počátku obsahovaly 10⁸ až 10³ kopií (r² > 0,99).

Bod odpovídající obsahu počátečních kopií 10² vykazuje statisticky významnou odchylku od této přímky (počet 0 kopií nelze umístit dologaritmického grafu). Kromě bodu odpovídajícího obsahu 10² počátečních kopií se od regresní přímky nejvíce odchyluje bod odpovídající počátečnímu obsahu kopií 10⁵, který za použití rovnice proložené přímky předvídá hodnotu o 13 % nižší než je známý počáteční počet kopií. Podobných výsledků se dosahuje, když se zvolená hladina fluorescence na obr. 8B pohybuje libovolně v rozmezí od 125 do 225.

Důvod odchylky datového bodu odpovídajícího obsahu 10² kopií od linearity je zřejmý z analýzy amplifikačních produktů elektroforézou (obr. 8C). Specifičnost amplifikace je taková, že když se vyjde z 10⁸ až 10⁵ templátových kopií, získá se jako jediný pozorovatelný produkt produkt očekávané velikosti. Pokud je přítomno 10⁴ výchozích kopií, je menší nespecifický amplifikační produkt ztěží viditelný. Tento produkt je více zastoupen, pokud se použije 10³ kopií a když se použije 10² kopií, získá se stejné množství nespecifického produktu a HIV specifického produktu. V kontrolní reakční směsi, k níž templát nebyl přidán, vzniká pouze nespecifický produkt.

Vzhledem k tomu, že fluorescence specifického produktu je nerozlišitelná od fluorescence nespecifického produktu, je základní čára citlivosti při tomto stanovení dána počtem cyklů, při němž se syntetizuje tak velké množství nespecifického produktu, že jakákoliv přídavná syntéza specifického produktu má na reakční profil jen malý účinek. Pokud je stanovení koncentrace založeno na interpolaci mezi soustavou standardů, tj. zkumavek obsahujících známé koncentrace výchozí cílové sekvence nukleové kyseliny, může tato základní čára odpovídat podstatně většímu počtu cyklů než je počet, při němž odchylka od linearity začíná.

V praxi se zjistilo, že variace reakčního profilu mezi jednotlivými vzorky při menší výchozí koncentraci než je 10² templátů komplikuje reprodukovatelné kvantitativní stanovení pod touto úrovní (data nejsou uvedena).

Pro kvantitativní stanovení počátečního množství cílové nukleové kyseliny ve vzorku se normalizovaných dat fluorescence získaných za použití soustavy standardů nej-prve_použije pro stanovení vztahu mezi počátečním množstvím cílové nukleové kyseliny a počtem cyklů, kterých je zapotřebí (viz například obr. 9) pro dosažení libovolně zvolené úrovně fluorescence, která leží v rozmezí detekční schopnosti přístroje. Tato hodnota fluorescence (arbitrary fluorescence value - AFV) se přednostně volí v oblasti reakčního profilu, která je, jak je zřejmé z obr. 8B u různých standardů rovnoběžná. To obecně platí v případě, že je AFV volena v rozmezí od 0,1 do 0,5-násobku maximální hodnoty fluorescence získané za použití standardu používajícího nejvyšší počáteční známou koncentraci cílové nukleové kyseliny.

Po volbě AFV při každé standardní amplifikací se zvolí získaná korigovaná a normalizovaná hodnota fluorescence, která je nejbližší AFV. Za použití této hodnoty a hodnot fluorescence pro'čtyři předchozí a čtyři následující cykly se sestrojí regresní přímka, která uvádí do vztahu počet cyklů (může se jednat o zlomek) s fluorescencí. Do rovnice této regresní křivky se potom dosadí hodnota AFV a získá se tak hodnota počtu cyklů potřebných pro dosažení hodnoty AFV pro tento standardní vzorek.

Poté, co se tedy nejprve stanoví pro každý standard počet cyklů, který je třeba provést, aby se dospělo k AFV, sestrojí se regresní křivka na základě dat závislosti počátečního množství cílové nukleové kyseliny na počtu potřebných cyklů pro dosažení AFV. Pro stanovení počátečního obsahu cílové nukleové kyseliny v neznámém vzorku, který byl amplifikován spolu se standardními vzorky, se nyní stanoví počet potřebných cyklů pro dosažení hodnoty AFV stejným způsobem, jako to bylo učiněno u standardních vzorků. Tento počet cyklů (může se jednat o zlomek) se potom dosadí do rovnice proložené regresní přímky a z rovnice se vypočítá hodnota počátečního množství cílové nukleové kyseliny______ v neznámém vzorku. Tento postup je možno opakovat v případě všech neznámých vzorků. Výše popsané manipulace s daty je možno snadno a rychle provádět pomocí vhodně naprogramovaného mikroprocesoru.

Tohoto způsobu kvantitativního stanovení nukleové kyseliny je možno používat nejen za použití fluorescentních dat vznikajících při sekvenčně nespecifické vazbě barviv, nýbrž ho lze použít i za použití fluorescence vznikající při sekvenčně specifické vazbě oligonukleotidových prób, jako je například vazba, které se používá v homogenních amplifikačních/detekčních systémech popsaných v US patentu číslo 5 210 015. Tyto próby vyžadují alternativní zdroje světla a filtry, jak je to popsáno ve výše citovaném patentu. Použití většího počtu sekvenčně specifických prób, z nichž každá poskytuje odlišitelnou fluorescenci, by mělo umožnit simultánní detekci a kvantitativní stanovení většího počtu cílových sekvencí nukleové kyseliny v jedné amplifikační reakční směsi.

Následuje popis obr. 10A až 10D, které analyzují účinek různých reakčních podmínek na PCR. Obecně lze tyto účinky monitorovat přidáváním, odebíráním nebo měněním slo42 žek standardní PCR a pozorováním změn reakčního profilu. Na obr. 10A je znázorněna titrace Taq DNA polymerasy. Devět replikovaných vzorků PCR s obsahem 10⁸ cílových HIV templátú se iniciuje za použití určitého rozmezí koncentrace Taq polymerasy, které je uvedeno obr. 10A.

V případě množství enzymu v rozmezí od 1 do 10 U na reakční směs se fluorescence stává detegovatelnou při všech reakcích přibližně ve stejném cyklu. To ukazuje, že tyto rozdíly v koncentrací enzymu mají jen malý účinek na účinnost amplifikace v časných cyklech. Rozdíly v hladině

PCR-produktu se však stávají zřejmými-v pozdějších cyklech,----takže například v cyklu 50 je vyrobeno téměř dvojnásobné množství DNA v reakční směsi obsahující 10 U enzymu ve srovnání s reakční směsí obsahující 1 U enzymu. Z elektroforézy na gelu (není znázorněna) není zřejmý žádný důkaz tvorby nespecifického non-HIV PCR produktu při těchto reakcích. Za použití pouze 0,5 U Taq polymerasy dochází k náhlé nepřítomnosti detegovatelného produktu. Jelikož PCR je proces, při němž narůstá koncentrace DNA exponenciálně, není snad překvapující, že existuje určitá prahová hodnota koncentrace enzymu, pod níž amplifikace vůbec neproběhne.

Také je možno monitorovat účinek měnících se koncentrací primeru na kinetiku amplifikace. Za obr. 10B jsou znázorněny profily PCR pro detekci HIV templátú (10⁸ počátečních kopií ssDNA) za použití koncentrace každého primeru v rozmezí od 2μΜ do 0,05μΜ. Pro každou PCR se použije _r konstantní hladiny enzymu (2,5 U). Je dobré si povšimnout, že v rozmezí koncentrace primeru 0,05 až 0,4μΜ stoupá koncentrace DNA v reakční směsi na určitou hodnotu a potom zůstává konstantní. Pokud se provede odhad koncentrace finálního produktu za použití dat z obr. 4 a za předpokladu, že koncentrace 142 bp PCR produktu je 10,6 pmol/ug, získá se za použití koncentrace primeru 0,05, 0,10 a 0,20μΜ koncentrace produktu 0,05, 0,10 a 0,20μΜ. V tomto rozmezí je zjevně koncentrace primeru faktorem omezujícím výtěžek DNA produktu. Naproti tomu, při koncentraci primeru 0,8μΜ a vyšší, stoupá koncentrace DNA kontinuálně s každým tepelným cyklem (viz obr. 6A) a zvyšující se množství primeru má na tento profil malý účinek. Na základě porovnání s daty z příkladu 6A je možno učinit závěr, že tyto reakce jsou nyní omezené koncentrací enzymu, a nikoliv primeru.

Výsledky měnící se koncentrace chloridu draselného za použití stejného zkušebního systému HIV s ΙμΜ primeru a

2,5 U enzymu ve 100 μΐ reakční směsi jsou uvedeny na obr. 10C. Aktivita Taq DNA polymerasy je ve značném rozsahu inhibována vysokými koncentracemi chloridu draselného. S tím je konsistentní zjištění, je při koncentracích chloridu draselného 125mM nebo vyšších není ve směsi přítomen žádný detegovatelný PCR produkt. Za použití aktivované DNA z lososového sperma, jako templátu, optimální aktivita Taq DNA polymerasy existuje při 50 až 90mM chloridu draselného. Tato zkouška ukazuje, že výtěžek produktu je nejvyšší při 50, 75 a lOOmM chloridu draselného, přičemž při nulové koncentraci chloridu draselného se vytvoří pouze přibližné polovina tohoto produktu.

Je možné, že tento rozdíl je důsledkem tepelné hybridizace destabilizujícího primeru s nízkou iontovou silou, přestože je s takovým předpokladem nekonsistentní pozorování, že účinnost amplifikace za použití OmM chloridu draselného je až přibližně do 20. cyklu stejná jako účinnost amplifikace za použití 50 až lOOmM chloridu draselného. Teprve v pozdějších cyklech začne výtěžek produktu klesat, podobně jako je tomu v případě výsledků dosažených za použití menšího množství polymerasy (obr. 6A). Pokud by byla destabilizována tepelná hybridizace primeru, dalo by se očekávat, že bude účinnost amplifikace snížena ve všech cyklech.

Konečně se také studují PCR systémy, k nimž se v různé koncentraci přidá známý inhibitor PCR, hematin. Hematin se přidá ke stejnému HIV zkušebnímu systému, jakého bylo použito výše, s výjimkou toho, že se použije koncentrace primeru 0,2μΜ. Jak je zřejmé z obr. 10D, při koncentraci hematinu 0,2μΜ a vyšší se nezíská žádný detegovatelný DNA produkt. Při koncentraci Ο,ΙμΜ je detegovatelnost produktu odložena o 3 až 4 cykly, což naznačuje, že na rozdíl od výsledku získaných s nulovou koncentrací chloridu draselného nebo sníženým množstvím enzymu, dochází k poškození účinnosti amplifikace jak v časných, tak pozdějších amplifikačnich cyklech. Tento rozdíl v reakčních profilech ukazuje, že je možno odlišit zčásti inhibované PCR reakce od reakcí neinhibovaných.

Na obr. 11 až 13 jsou znázorněny blokové diagramy ilustrující stupně prováděné detekčním zařízením podle vynálezu. Na obr. 11 jsou ilustrovány stupně, které detekční zařízení provádí při získávání hodnot fluorescence, zatímco obr. 12 a 13 ukazují subrutiny pro zprůměrování fluorescence a normalizaci hodnot fluorescence.

Následuje popis obr. 11. Postup se zahájí a získají se hodnoty fluorescence z cyklu 1. Potom procesor vypočítá pro každý vzorek normalizační faktor. Všechny hodnoty fluorescence v tomto cyklu se normalizují vynásobením každé hodnoty fluorescence příslušným normalizačním faktorem. Potom procesor pošle tyto normalizované hodnoty na výstup a získají se hodnoty fluorescence v následujícím cyklu. Tento postup seopakuje tak dlouho, dokud se nezpracují všechny fluorescentní obrazy.

Následuje popis obr. 12. Zahájí se činnost tepelného cyklovače a do zdroje excitačního světla se přivede energie, přičemž regulátor kamery čeká na spouštěcí signál.

Když regulátor kamery obdrží spouštěcí signál z procesoru, vyšle tento signál do kamery, aby došlo k otevření uzávěrky na dobu n sekund, během které kamera sečte pixelové hodnoty indikativní pro fluorescenci. Analogový obraz je zaslán do obrazového procesoru, v němž deska s plošnými spoji pro namátkové vzorkování rámu digitalizuje obraz. V tomto okamžiku je možno digitalizovaný obraz uchovat pro pozdější zpracování, nebo ho lze zpracovávat v reálném čase. Při zpracování v reálném čase přidělí obrazový procesor skupinu pixelů oblasti zahrnující jednu zkumavku a zprůměruje všechny hodnoty v této oblasti za vzniku jediné hodnoty fluorescence, která je uložena v paměti. Procesor tyto____ stupně opakuje tak dlouho, dokud se pro každou zkumavku v tomto cyklu nezíská jediná hodnota fluorescenence. Potom procesor pošle na výstup hodnoty pro tento cyklus uložené v paměti. Předcházející postup se opakuje v každém cyklu.

Na obr. 13 je uvedena subrutina stupně způsobu stanovení normalizačního faktoru z obr. 11. Nejprve se stanoví průměr všech počátečních hodnot ve stupni 1. Potom se tento průměr dělí každou hodnotou fluorescence v cyklu 1 a přitom se získají normalizační faktory pro všechny amplifikační reakční směsi. Těchto normalizačních faktorů se potom používá ve všech zbývajících cyklech. Přestože blokové diagramy nezahrnují korekce od cyklu k cyklu, procesor je také může zajistit.

Na obr. 14 a 15 je znázorněno další provedení zařízení pro emisi excitačního světla a pro detekci fluorescenčních’ emisí''' pro použití vespojení s detekčním zařízením 10. Toto zařízení 100 pro excitaci a detekci fluorescence se obecně skládá z krytu 102, kterým jsou světlotěsně zakryta zahloubení 24 , zdroje světla, lampy 14’ , pro dodávání excitačního světla reakčním vzorkům umístěným v zahloubeních, senzoru, kamery 16a *, pro detekci fluorescence emitované z reakčních vzorků a dichroického zrcadla 104 pro oddělení excitačního světla od fluorescentních emisí, aby byly kamerou 16a * detegovány pouze fluorescentní emise. Fluorescentní a amplifikační data se zpracovávají výše uvedeným způsobem.

Kryt 102 se skládá z vrchní stěny 106, bočních stěn 108 a 110, přední stěny 112 a zadní stěny 114. Kryt 102 je připojen k vrchnímu povrchu tepelného cyklovače 12 takovým způsobem, že objímá tepelný výměník 22, a tedy zahloubení 24. které jsou v něm vytvořena (přičemž tato zahloubení mají takové rozměry, aby mohly pojmout větší počet zkumavek 26 se vzorky amplifikované nukleové kyseliny). Kryt 102 je zkon-_ struováň tak, že vytváří pro vzorky umístěné ve zkumavkách 26 a pro optické dráhy mezi zdrojem světla, lampou 14’ a vzorky a pro optické dráhy mezi vzorky a senzorem světlotěsnou komoru. Kryt je tedy světlotěsně připojen k tepelnému cyklovači 12.. Stěny krytu, který je v podstatě zhotoven z neprůhledného materiálu, neobsahují žádné otvory s výjimkou otvoru 116 pro lampu 14'a otvoru 118 pro čočkový kus .

120 kamery 16a¹. Kromě toho jsou stěny krytu přednostně zhotoveny z materiálu s poměrně nízkou tepelnou vodivostí, jako například z plastu, aby se ztížil přenos tepla z tepelného výměníku 22 a vzorků ve zkumavkách 26. Jedním vhodným materiálem pro stěny krytu je polykarbonát.

Zařízení 100 pro excitaci a detekci fluorescence obsahuje mechanismus umožňující přístup do vnitřku krytu 102 a ke vzorkům v tepelném výměníku 22. Pro zajištění tohoto přístupu může být přední stěna 112 (viz obr. 14 a 15) kloubově připevněna k vrchní stene 106 kloubem 122. Přestože je znázorněna určitá konkrétní konfigurace krytu 102, je třeba chápat, že je možno použít i jiných konfigurací pro vytvoření světlotěsně komory pro světelné dráhy excitačního světla a fluorescentních emisí, jakož i pro prvky umístěné v krytu 102, které jsou podrobněji popsány dále.

- 47 Zdroj světla, lampa 14.', se podstatně liší svou konfigurací od lampy 14.. Lampa 14' se skládá z kondenzačního stínítka 14a* a žhavicího vlákna, tedy žárovky 14b'. Žárovka 14b' emituje světlo obdobným konvenčním způsobem, jako lampa 14., Lampa 14.' je zvolena tak, aby poskytovala světlo s vlnovou délkou odpovídající vlnové délce světla potřebného pro excitaci fluorescentního vazebného činidla, které je přítomno ve zkoušeném vzorku. Když se například jako fluorescentního vazebného činidla použije ethidiumbromidu, je lampa 14.' přednostně zvolena tak, aby emitovala UV záření o vlnové délce přibližně 302 nm. Vhodný světelný zdroj pro poskytování 302nm UV světla je obchodně dostupný od firmy U.V.Products Inc. (CA, USA) pod označením UVM-57 (302 nm).

Je však třeba si uvědomit, že ethidiumbromid může být excitován při vlnové délce přibližně 480 nm stejně dobře jako při vlnové délce asi 302 nm. Kromě toho, jiné fluorofory, jako jiná barviva vázající DNA nebo 5'nukleasové homogenní zkušební próby popsané výše, mohou být excitovány při vlnových délkách, které nejsou v rozmezí UV záření. Alternativně lze tedy použít světelného zdroje emitujícího 480nm světlo. Světelné zdroje emitující světlo o vlnové délce 480 nm však obvykle emitují také spektrum viditelného světla.

V důsledku toho se za použití takového tepelného zdroje zařazuje filtr, kterým se oddělí pouze požadovaná vlnová délka 480 nm. Obecně se může použít jakéhokoliv světelného zdroje, pokud se z jeho pomocí může reakčním směsím dodat světlo o požadované vlnové délce. Jako příklady vhodných světelných zdrojů - je možno uvést monochromometry a lasery.

Lampa 14.' je umístěna v krytu 102 tak, aby excitační světlo procházelo otvorem 116 pro lampu vystředěným nad zahloubeními 24., za účelem minimalizace nerovnoměrného rozdělení světla, na vzorky umístěné v zahloubeních 24.· Lampa 14 ¹ muže být umístěna i jinak. Tak například může být lampa 14 ' úplně obsažena v krytu 102. čímž se eliminuje otvor 116 pro lampu. Prvek emitující světlo, například žárovka 14b¹ je však přednostně umístěn rovnoběžně s vrchním povrchem tepelného výměníku 22 a vystředěn nad zahloubeními pro zvýšení rovnoměrnosti rozdělení světla nad výměníkem tepla z důvodů, které byly uvedeny výše. Pokud se pro oddělení vhod né vlnové délky používá filtru, může být tento filtr například upevněn ke krytu 102 v otvoru 116 pro lampu v optické dráze mezi lampou a vzorky umístěnými v zahloubeních 24.

__Dichroické zrcadlo 104, kterým je přednostne dichroické zrcadlo s nízkým průchodem, je umístěno přímo nad tepelným výměníkem 22, přednostně v úhlu asi 45’ vzhledem k vrchnímu povrchu tepelného výměníku, pro přizpůsobení orientace lampy 14.' a kamery 16a¹ . V provedení, které je znázorněno, je dichroickým zrcadlem 104 dichroické zrcadlo s nízkým průchodem, které je zkonstruováno tak, aby bylo propustné nebo průhledné pro světlo s vlnovou délkou odpovídající vlnové délce emitované ze zdroje excitačního světla, tedy lampy 14', a reflektivní vůči světlu s vlnovou délkou odpovídající vlnové délce světla emitovaného vzorky v zahloubeních 24., když jsou tyto vzorky vystaveny excitačnímu světlu (viz obr. 15).

Transmisivní a reflektivní charakteristiky dichroického zrcadla se přirozeně volí podle konkrétní aplikace. Tak například za použití ethidiumbromidu, jako fluorescentního vazebného činidla, může být vlnová délka excitačního světlá asi 302 nebo 480 nm, jak to bylo uvedeno výše. V obou případech je vlnová délka emisí přibližně 600 nm. Dichroické zrcadlo tedy může být zkonstruováno tak) že je propustné pro světlo o vlnové délce asi 3.02 nebo 480 nm nebo propustné jak pro světlo s vlnovou délkou 302 nm, tak pro světlo’s vlnovou délkou 480 nm. V obou příI

- 49 pádech je dichroické zrcadlo zkonstruováno tak, aby bylo reflektivní pro světlo s vlnovou délkou asi 600 nm.

Na obr. 16 je znázorněna křivka závislosti propustnosti na vlnové délce, která je reprezentativní pro vhodné dichroické zrcadlo v případě použití ethidiumbromidu jako fluorescentního vazebného činidla. V tomto příkladu je dichroické zrcadlo vysoce propustné pro světlo s vlnovou délkou v rozmezí od asi 300 do asi 510 nm (hodnota 510 nm představuje mezní vlnovou délku) a stává se vysoce reflektivním při vlnové délce blížící se hodnotě 600 nm. Dichroického zrcadla s vlastnostmi ilustrovanými na obr. 16 se___ také může používat v kombinaci s jinými fluorescentními vazebnými činidly, jako je fluorescein. Fluorescein má excitační vlnovou délku asi 495 nm a emisní vlnovou délku asi 522 nm. Pokud se týče stupně prostupnost (transmisivity) a odrazivosti (reflektivity), poskytuje zrcadlo ilustrované na obr. 16, které je schopno propustit asi 85 % excitačního světla a odrazit asi 98 % emitované fluorescence na kameru 16a', dobré výsledky při detekci amplifikace nukleové kyseliny za použití ethidiumbromidu způsobem podle tohoto vynálezu.

Dále uvedené údaje slouží pouze pro ilustraci a nijak neomezují rozsah vynálezu. Specifikace jednoho vhodného dichroického zrcadla pro oddělování excitačního a emitovaného světla za použití ethidiumbromidu, jako fluorescentního vazebného činidla, jsou následující: UV transmise, 510nm mezní hodnota, krátký průchod: transmise > 80 % průměr 300 až 500 nm a > 65 % absolutní @ 3 00 nn; ref léktivita > 90 % abs. 525-610 nm; povrchový povlak z tvrdého žáruvzdorného oxidu; substrát - tavený křemík Corning 7940 Fused Silicon; a Chamfer 0,010 x 45’, všechny okraje. Jako výrobce vhodných dichroických zrcadel je možno uvést firmu Omega Optical lne. (VT) a Janoš Optical lne. (VT) .

Přestože bylo popsáno zařízení s nízkým průchodem, může se alternativně použít i dichroického zrcadla s vysokým průchodem. Pokud se však použije dichroického zrcadla s vysokým průchodem, musí se polohy lampy 14' a kamery 16a' zaměnit, což je odborníkům v tomto oboru zřejmé.

Následuje další popis obr. 14 a 15. Dichroické zrcadlo 104 je kloubově upevněno k výstupku 126 kloubem 128 tak, aby bylo možno zrcadlo otočit pro přístup k tepelnému výměníku 22. Výstupek 126 vyčnívá z vrchní stěny 106 a je zkonstruován tak, aby zabraňoval nebo minimalizoval prostup světla z lampy 14¹ přes kloub 128 do kamery 16a.

Podle přednostního provedení obsahuje zařízení 100 pro excitaci a detekci fluorescence závěrku 124 (viz obr.

15) omezující expozici reakčních vzorků excitačnímu světlu.

Jak je to schematicky znázorněno na obr. 15, závěrka 124 může být posunovatelně připevněna k vrchní stěně 106 tak, aby se mohla pohybovat mezi první polohou (znázorněnou plnou čarou), v níž je otvor 116 pro lampu otevřen a druhou polohou (znázorněnou přerušovanou čarou), v níž závěrka zakrývá otvor 116 pro lampu. Závěrka může být přidržována v uzavřené poloze pružinou a její přechod do otevřené polohy může být zajišťován solenoidem, jak je to běžné v tomto oboru. Závěrka může být řízena například tak, aby se otevřela pouze během tepelně hybridizační/prodlužovacx fáze každého cyklu PCR, tj . když je očekávána maximální fluorescence.

Tímto způsobem závěrka zlepšuje výkonnost systému zvyšováním stability vzorku. Vzhledem k tomu, že lampa je při tomto provedení umístěna blížek~reakčním vzorkům, na vzorky . dopadá excitační světlo s poměrně vysokou intenzitou, které může způsob degradaci vzorku nebo fotodeaktivaci, jinak známou pod pojmem bělení. Závěrka minimalizuje dobu, po kterou je vzorek světlu exponován a tím odstraňuje nebo podstatně snižuje problém s bělením.

Přestože je v provedeni znázorněném na obr. závěrka upevněna k krytu 102. může být upevněna i k lampě 14¹ umístěné přímo nad tepelně vodivým blokem tepelného výměníku 22, a tedy nad samotnými vzorky, nebo může být upevněna i jiným způsobem za účelem regulace expozice vzorků excitačnímu světlu. Také se může použít jiných mechanismů regulace doby expozice.

Mezi dichroickým zrcadlem 104 a čočkovým kusem 120 kamery 16a¹ je umístěna polní čočka 130 (plano-konvexní čočka). Polní čočka 130 odchyluje paprsky odražené ze zrcadla 104 dovnitř, aby v podstatě všechny emitované fluorescence ze vzorků a tepelného výměníku 22 přímo směřovaly na čočkový kus 120♦ Polní čočka 130 je přednostně posunovatelně upevněna na krytu 102. aby jí bylo možno pohybovat směrem k čočkovému kusu 120 nebo v obráceném směru, v závislosti na vlnové délce emisí vydávaných vzorkem, jak je to odborníkům v tomto oboru zřejmé.

Ke kameře může být připojen jeden filtr nebo větší počet filtrů, jako například kolečko s filtry umožňující detekci pouze určité nebo určitých vlnových délek. V provedení znázorněném na obr. 15 je kolečko 132 s filtry upevněno k čočkovému kusu 120, jak je to v tomto oboru běžné, aby bylo možno detegovat a monitorovat větší počet značek nebo cílů. Filtry je možno vyměňovat otáčením kolečka 132 s filtry, takže detekce je omezena pouze na požadovanou vlnovou délku. Stupeň výměny filtrů se může provádět při každé tepelně hybridizační/prodlužovací fázi nebo po proběhnutí předem-určeného počtu cyklů, vzávislosti na konkrétní aplikaci. Alternativně se může použít kamery rozlišující vlnové délky, jako je spektrální zobrazovací zařízení (spectral imager).

Pro zlepšení podmínek tepelného cyklování může být zařízení 100 pro excitaci a detekci fluorescence vybaveno zahřívaným průhledným nebo propustným okénkem 134 (viz obr. 15). Okénko 134 by mělo být přinejmenším dostatečně propustné, aby umožňovalo účinnou excitaci vzorků a detekci doprovodné fluorescence. Zahřívané okénko 134 může být vytvořeno například z křemene a může být umístěno na zkumavkách 26 nebo těsně nad nimi. Úkolem zahřívaného okénka 134 je zajišťovat zachování teplotního profilu při tepelném cyklování reakčních směsí, aby byl předem zvolený profil co nejpřesněji dodržován, a minimalizovat reflux. Zahřívané okénko 134 se přednosttně udržuje při teplotě v rozmezí od 95 do 105“C, zvláště pak při teplotě asi 100'C. Okénko se tedy přednostně udržuje při teplotě odpovídající teplotě denaturace. Okénko 134 se může zahřívat niklchromovým drátem nebo jiným zahřívacím prvkem v souladu s běžnou praxí.

Na obr. 17 je znázorněno zahřívané okénko 134 obsahující jako topný článek niklchromový drát. Je třeba také uvést, že přestože je zahřívané okénko 134 znázorněno tak, že zakrývá tepelný výměník pouze s devíti zahloubeními, je tomu tak pouze pro zjednodušení výkresu. Niklchromový drát 136 může být uložen v okénku 134 nebo připevněn k jeho povrchu. Drát je přednostně uspořádán tak, aby nepřesahoval zahloubení 24 v tepelném výměníku, a tedy neinterferoval s optickými drahami excitačního a emisního světla. Drát je také připojen ke konvenčnímu regulátoru 138 teploty, který udržuje teplotu zahřívaného okénka 134 na požadované hodnotě.

K procesoru je přednostně připojen dispej, ukazující zjištěná data, například okolnost, zdaje cílová sekvence přítomna a jaká je její koncentrace. Kromě kontinuálního monitorování amplifikačních reakcí (diskutovaného výše) může být v průběhu amplif ikaci na displeji také

- 53 sledován prostředek pro zobrazování detegovaných amplifikací. To umožňuje snížení doby tepelného cyklování. Když je například možno v již poměrně časném stadiu konstatovat, že reakční směs obsahuje cílovou sekvenci, vzorek je možno vyjmout a na jeho místo umístit jiný. Tím se zvýší výkonnost zařízení. To je zvláště výhodné v tom-případě, že se do tepelného výměníku může vložit až 96 zkumavek s různými reakčními směsmi (například některé pro zkoušení genetických chorob, některé pro zkoušení HIV atd.) nebo když se směsi vkládají do tepelného výměníku v různé době.

Ve výše uvedeném popisu jsou podrobně popsána konkrétní provedení tohoto vynálezu. Je zřejmé, že oď těchto provedení je možno se odchýlit a že je možno vynález různým způsobem obměňovat či modifikovat, aniž by to představovalo únik z rozsahu tohoto vynálezu. Pro rozsah vynálezu jsou rozhodující následující patentové nároky, které je třeba vykládat na podkladě ekvivalentů.

Claims (24)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Zařízení pro simultánní monitorování většího počtu amplifikaci nukleové kyseliny, vyznačuj i cí se tím, že obsahuje tepelný cyklovač zahrnující tepelně vodivý člen, v němž je vytvořen větší počet zahloubení; a senzor pro simultánní detekci světla emitovaného z těchto zahloubení.
2. 2. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím,že dále obsahuje zdroj světla, který je opticky spojen s tepelným cyklovačem a který je uspořádán taký že rozděluje světlo na část^tepelně vodivého členu^—v níž je vytvořen větší počet zahloubení.
3. 3. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že dále obsahuje prostředek pro stanovení průměrné hodnoty světla detegovaného senzorem ve vztahu ke každému zahloubení emitujícímu světlo.
4. 4. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že dále obsahuje prostředek pro cyklování teploty tepelně vodivého členu podle předem zvoleného profilu závislosti teploty na čase v průběhu většího počtu cyklů u většího počtu amplifikačních reakčních směsí nukleové kyseliny, z nichž každá obsahuje fluorescentní vazebné činidlo a je umístěna v jiném zahloubení, přičemž světelný zdroj zajišťuje v podstatě rovnoměrný světelný tok na část tepelně vodivého členu a větší počet reakčních směsí a senzor je opt_icky_spojen s tepelně vodivým členem za _účelem_ simultánní detekce tímto světelným tokem excitované fluorescence emitované z každé amplifikační reakční směsi.

   ' 6' „ /

   7)
5. 5. Zařízení podle nároku 4, vyznačující se tím, že dále obsahuje prostředek pro stanovení průměrné hodnoty intenzity fluorescence pro každou excitovanou reakční směs založené na fluorescenci, která pro ni byla detegována.
6. 6. Zařízení podle nároku 5, vyznačující se t í m , že dále obsahuje prostředek pro stanovení normalizovaných hodnot intenzity fluorescence z průměrných hodnot fluorescence.
7. 7. Zařízení podle nároku 1, vyznačující-s e-1—í. m ,—že—zahloubení tepelné vodivého členu tepelného cyklovače jsou vytvořena v jeho povrchu, přičemž jsou schopna pojmout reakční nádoby obsahující reakční směsi z amplifikací nukleové kyseliny; a senzorem je s tepelně vodivým členem opticky spojené zobrazovací zařízení vytvářející obraz povrchu a reakčních nádob, pokud jsou tyto nádoby uloženy v zahloubeních tepelně vodivého členu.
8. 8. Zařízení podle nároku 7, vyznačující se t í m , že obsahuje zdroj světla, který je uspořádán tak, že dodává světlo na povrch tepelně vodivého členu.
9. 9. Zařízení podle nároku 8, vyznačující se tím, že světelný zdroj je uspořádán tak, že rozděluje světlo podél povrchu tepelně vodivého členu v podstatě rovnoměrně.
10. 10. Zařízení podle nároku 8, v y z n a č u jí -. cí se tím, že jako světelný zdroj obsahuje UV lampu
11. 11. Zařízení podle nároku 7, vyznačující se tím, že jako zobrazovací zařízení obsahuje CCD-zobrazovací zařízení.
12. 12. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se t í m , že tepelně vodivý člen tepelného cyklo vače obsahuje větší počet v něm vytvořených zahloubení, která jsou přizpůsobena pro pojmutí reakčních směsí z amplifikací nukleové kyseliny, přičemž toto zařízení dále zahrnuje kryt umístěný nad tepelně vodivým členem připojený k tepelnému cyklovači; zdroj světla zajištující emisi světla v krytu na zahloubení; dichroické zrcadlo umístěné v krytu a nad zahloubeními, které je propustné pro světlo s první vlnovou délkou a reflektivní pro světlo s druhou vlnovou délkou odlišnou od první vlnové délky; přičemž senzor je uspořádán tak, že přijímá světlo odražené od druhého povrchu dichroického zrcadla.
13. 13. Zařízení podle nároku 12, vyznačují cí se tím, že dichroické zrcadlo je propustné pro světlo s vlnovou délkou odpovídající vlnové délce světla generovaného excitačním světelným zdrojem a reflektivní pro světlo s vlnovou délkou odpovídající vlnové délce fluorescence emitované z amplifikační směsi nukleové kyseliny, kdy je tato směs umístěna v jednom ze zahloubení a exponována světlu ze světelného zdroje.
14. 14. Zařízení podle nároku 12, vyznačují cí se tím, že dichroické zrcadlo je propustné pro světlo s vlnovou délkou v rozmezí od asi 200 do asi 550 nm.
15. 15. Zařízení podle nároku 12, vyznačují cí se tím, že kryt je vytvořen z neprůhledného materiálu a je zkonstruován tak, že vytváří světlotěsnou komo ru, v níž je uspořádáno dichroické zrcadlo a senzor.
16. 16. Zařízení podle nároku 12, vyznačují cí se tím, že dichroické zrcadlo svírá s horním povrchem tepelně vodivého členu úhel asi 45°.
17. 17. Zařízení podle nároku 12, vyznačující se t ί b , že senzor zahrnuje součástku s nábojovou vazbou.
18. 18. Zařízení podle nároku 12, vyznačující se tím, že dále obsahuje závěrku připojenou k světelnému zdroji nebo krytu, umožňující expozici zahloubení zdroji světla v předem zvolených intervalech.
19. 19. Zařízení podle nároku 12, vyznačující se tím, že dále obsahuje okénko z transparentního materiálu, k němuž je připojen zahřívací prvek, přičemž toto okénko je umístěno nad zahloubeními a pod dichroickým zrcadlem.
20. 20. Zařízení podle nároku 12, vyznačující se t í m , že dále obsahuje polní čočku uspořádanou mezi dichroickým zrcadlem a senzorem.
21. 21. Zařízení podle nároku 12, vyznačující se tím, že dále obsahuje kolečko s filtry připojené k senzoru.
22. 22. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že tepelně vodivý člen tepelného cyklovače obsahuje větší počet v něm vytvořených zahloubení, která jsou přizpůsobena pro pojmutí reakčních směsí z amplifikaci nukleové kyseliny, kteréžto reakční směsi obsahují sekvenci nukleové kyseliny a fluorescentní vazebné činidlo, přičemž toto zařízení dále zahrnuje kryt umístěný nad tepelně vodivým členem připojený k tepelnému cyklovači; zdroj světla zajišťující emisi světla v krytu; senzor umístěný v krytu; a dichroické zrcadlo umístěné v krytu a nad zahloubeními, které je propustné pro světlo s vlnovou délkou odpovídající vlnové délce světla generovaného zdrojem excitačního světla a reflektivní pro světlo s vlnovou délkou odpovídající vlnové délce fluorescence emitované z amplifikační směsi nukleové kyseliny obsahující fluorescenční vazebné činidlo, pokud je směs umístěna v jednom ze zahloubení vytvořených v tepelně vodivém členu a exponována světlu ze zdroje excitačního světla, přičemž zrcadlo je orientováno tak, že vytváří mezi zahloubeními a senzorem optickou dráhu.
23. 23. Zařízení podle nároku 22, vyznačující se tím, že dichroické zrcadlo je jedním ze svých dvou povrchů v podstatě obráceno ke světelnému zdroj i a druhým k zahloubením a senzoru.
24. 24. Způsob kvantitativního stanovení množství specifické sekvence nukleové kyseliny ve vzorku, vyznačující se tím, že se vytvoří větší počet amplifikačních reakčních směsí, z nichž každá obsahuje specifickou sekvenci nukleové kyseliny v odlišné, ale známé koncentraci a fluorescentní vazebné činidlo; vytvoří se amplifikační reakční směs obsahující neznámou koncentraci specifické sekvence nukleové kyseliny a fluorescenční vazebné činidlo; amplifikační reakční směsi se známou a neznámou koncentrací nukleové kyseliny se paralelně podrobí většímu počtu tepelných cyklů; stanoví se počet cyklů, kterého je zapotřebí k tomu, aby každá reakční směs vykazovala fluorescenci s určitou hodnotou intenzity; a porovná se počet cyklů, kterého je zapotřebí k tomu, aby směs s neznámou koncentrací nukleové kyseliny dosáhla této hodnoty s počtem cyklů, kterých je zapotřebí pro větší počet směsí se známými koncentracemi nukleové kyseliny k tomu, aby., tyto směsi dosáhly této hodnoty, za účelem zjištění počátečního množství specifické sekvence nukleové kyseliny vesměsi s neznámou koncentrací.