JPH0484751A

JPH0484751A - 遺伝子の検出方法

Info

Publication number: JPH0484751A
Application number: JP2200607A
Authority: JP
Inventors: Atsushi Tada; 淳多田; Tetsuo Ohashi; 鉄雄大橋; Koichi Yamagata; 浩一山形; Yoshinari Shirasaki; 良成白崎; Manami Okada; 岡田　まなみ; Shigeru Fukushima; 福島　繁; Hirohisa Abe; 浩久阿部
Original assignee: Shimadzu Corp
Current assignee: Shimadzu Corp
Priority date: 1990-07-27
Filing date: 1990-07-27
Publication date: 1992-03-18

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は特定の塩基配列を持つＤＮＡあるいはＲＮＡを
検出する方法に関するものであり、ウィルスや細菌によ
る疾患、遺伝病の診断、あるいは種の同定、親子鑑別な
どに用いられる。

〔従来の技術〕

ウィルスや細菌による病気の診断を遺伝子レベルで行う
試みが行なわれている。遺伝子レベルで病気の原因菌を
つきとめるための方法の１つとして、ハイブリダイゼー
ション法が知られている。

即ち、従来、遺伝子の検出の際には目的ＤＮＡやＲＮＡ
を細菌、ウィルス、白血球などから超音波破砕などの物
理学的方法、プロテネースにのような酵素やＳＤＳのよ
うな界面活性剤を用いて化学的な方法で抽出する。次い
でフェノール、クロロホルム処理、エタノール沈澱でＤ
ＮＡ　（ＲＮＡ）を精製した後、Ｎａ０ｆ（のようなア
ルカリで変性させて１本鎖ＤＮＡ　（ＲＮＡ）にする。

そしてこの目的の１本鎖ＤＮＡ　（ＲＮＡ）をメンブラ
ンフィルタ−にトロセルロース、ナイロン）上に固定す
る方法は、フィルターハイブリダイゼーション法として
広く知られている。そして、このＤＮＡ　（ＲＮＡ）を
固定したフィルターに放射性同位元素、酵素、ビオチン
、蛍光物質などでラベルしたオリゴヌクレオチドプロー
ブを加えると、オリゴヌクレオチドか対象ＤＮＡ　（Ｒ
ＮＡ）と相補的配列を持つ場合には、両者の間に水素結
合が生じて２本鎖を形成する。相補鎖を持たなかったり
過剰のオリゴヌクレオチドプローブは洗浄によってフィ
ルターから除去される。その後、放射活性、酵素活性、
蛍光強度の測定等によって目的ＤＮＡ（ＲＮＡ）の検出
を行なう。

次に、遺伝子増幅法を用いた方法がある。この方法はポ
リメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ（Ｓａｉｋｉ
、　Ｒ，Ｋ、　ｅｔ　ａｌ、　　５ｃｉｅｎｃｅ　２３
９．４８７−４９１　（１９８８））とよばれる。

この方法は、ごく微量の遺伝子（ＤＮＡ）から目的とす
るＤＮＡ領域だけを数時間のうちに約１００万倍に増幅
させることができる。すなわち、増幅させたい遺伝子領
域を挟んで十鎖、−鎖に対するＤＮＡブライマー（１８
〜３０ヌクレオチド）を合成し、ＤＮＡポリメラーゼに
よりＤＮＡ断片の合成を繰り返し行なうと、■サイクル
ごとにＤＮＡは２倍に増幅されｎサイクル後には、２°
倍に増幅される。この際、ＤＮＡブライマーとして、目
的遺伝子に特異的な配列を選ぶことで選択性の高いポリ
メラーゼ反応か起こり２つのプライマーにはさまれた２
本鎖ＤＮＡ断片が生成する。

この２本鎖断片の検出法では、ＰＣＲ反応で増幅したＤ
ＮＡ　（増幅ＤＮＡ）を先に述べたフィルターハイブリ
ダイゼーション法に持ち込むのか一般的な方法である。

その他の方法としては、あらかじめ各々のブライマーに
ビオチンをラベルしてＰＣＲ反応を行なった後、ラベル
したＤＮＡプローブと液相でハイブリダイゼーションを
行ない、次いてアビジンを固定したアフィニティマトリ
ックスを用いて検出する方法（Ａｎｎ−Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ　５ｙｖａｎｅｎ　ｅｔ
　ａｌ、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１６．
１１３２７−１１３３８　（１９８８））　、オリゴヌ
クレオチドプローブに複数のビオチンを標識し目的ＲＮ
Ａと液相でハイブリダイゼーションを行なった後、アビ
ジンを固定したアフイニテイマトリックスと酵素標識抗
ＲＮＡ−ＤＮＡ抗体を添加して検出する方法（Ｃ１ｉｆ
ｆｏｒｄ　Ｏ，Ｙｅｈｌｅ　ｅｔ　ａｌ、　Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ　１
．１７７−１９３　（１９８７））などがある。

また、増幅ＤＮＡを直接、電気泳動法で分析する方法が
知られている。この方法は、アクリルアミドゲル担体中
で、ラジオアイソトープでラベルした、あるいはラベル
していないＤＮＡ断片を泳動させ、そのゲルのオートラ
ジオグラフィーをとる、あるいは、薄層シリカゲルプレ
ート上におき、ＵＶランプでゲルを照らし写真をとる。

または、アガロースゲル担体中でＤＮＡ断片を泳動し、
その後、エチジウムブロマイドでＤＮＡを染色し、泳動
漕からゲルをトランスイルミネーター（紫外光を発する
）上におき、写真をとる方法である（Ｔ、Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ　ｅｔ　ａｌ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　（
１９８２））。

また、ＤＮＡの配列を決定できる方法として、ＤＮＡシ
ーケンサ−が知られている（Ｓｍｉｔｈ、　Ｌ。

Ｍ、ｅｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ　３２１．６７４−６
７９　（１９８６））。この方法は蛍光標識したＤＮＡ
ブライマーをシーケンスしたいＤＮＡ配列につなぎアク
リルアミドゲルに泳動し、アルゴンレーザーを用いてＤ
ＮＡ由来の蛍光強度を測定する方法である。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、前記のフィルターを用いる方法では、フ
ィルターにＤＮＡ　（ＲＮＡ）を固定するための操作、
ＤＮＡ　（ＲＮＡ）を熱や紫外線によって固定する操作
及び相補鎖を形成しなかったオリゴヌクレオチドプロー
ブの洗浄などの煩雑な操作がつきまとう。さらにＤＮＡ
プローブかフィルター表面に非特異的に吸着して検出感
度の低下やバックグランドの上昇を招くという不都合も
あった。

ＰＣＲ法の検出法については、アフィニティーマトリッ
クスを用いる方法においてもフィパルター法に較べて操
作性が優れるものの、アフィニティーマトリックスの添
加の操作及び二本鎖を形成しなかったオリゴヌクレオチ
ドプローブを除くための操作（Ｂ／Ｆ分離）が必要とな
る。従来の電気泳動法では、電気泳動後、エチジウムブ
ロマイドで染色しなければならず、また、そのゲルをト
ランスイルミネーター上におかなければならないため、
手間と時間、また、安全性の面でも問題がある。また、
上述方法では、臨床検査で要求される多検体処理を行な
うことが困難であるという問題もある。また、出力結果
が写真であるため、結果の解析が人の目によるためあい
まいさがつきまとうという問題がある。

また、ＤＮＡシーケンサ一方式を増幅ＤＮＡの検出法に
そのまま適応すると、ＰＣＲ反応に関与しない蛍光色素
付きのＤＮＡブライマーが泳動ゲルに入ってくるため、
レーザー光源を用いても十分な感度をかせぐことができ
ない。また本方式では電気泳動しながらデータを取り込
むため数多くのサンプルをこなすことができないという
問題がある。

そこで、本発明は、これらの問題点を克服し、短時間に
多検体処理を可能とし、手間をかけずに結果が客観的な
出力結果として出てくる遺伝子（ＤＮＡ、ＲＮＡ）の検
出方法を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、鋭意研究した結果、電気泳動によるＤＮ
Ａ断片由来の蛍光を有するバンドを画像として取り込み
、該画像をデータ処理することにより目的遺伝子（核酸
）の有無を迅速に短時間にかつ多検体を自動的に検査で
きる方法を見い出し、本発明を完成させた。

即ち、本発明の要旨は、遺伝子増幅法で増幅させたＤＮＡ電気泳動法により泳動
したＤＮＡに蛍光物質を付着させる工程、該蛍光物質を
励起させることにより発する蛍光を画像として取り込む
工程及び取り込んだ画像を処理する工程を有することを
特徴とする遺伝子の検出方法に関する。

ここで、遺伝子増幅法で増幅させたＤＮＡを電気泳動法
により泳動したＤＮＡに蛍光物質を付着させる工程とは
、通常アガロースゲル、アクリルアミドゲル等の担体中
でＤＮＡ断片を泳動させることによりなされるものであ
り、電気泳動担体支持体として、例えば、使いすてゲル
トレーを用い、これにあらかじめエチジウムブロマイド
等の蛍光物質を含ませておいたゲル上で電気泳動させる
工程をいう。ここで用いられるＤＮＡ断片は、ＰＣＲに
よって増幅したものを用い、また、遺伝子かＲＮＡの場
合は、常法により逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成し
、このｃＤＮＡを用いてＰＣＲを行なえばよい。また、
蛍光物質としては、エチジウムブロマイドの他にアクリ
ジンオレンジ等を用いることもできる。

蛍光物質を励起させることにより発する蛍光を画像とし
て取り込む工程とは、励起光源として、通常紫外線を発
光する放電管（水銀ランプ）等を用い、これによりゲル
トレー中のゲルを励起せしめ、ゲルより発する蛍光を、
ＣＯＤ　（電荷結合素子）により画像として取り込む工
程をいう。

取り込んだ画像を処理する工程とは、取り込んだ画像を
データ処理器により画像処理をする工程をいう。

これらの工程により得られた結果から、被検試料中のＤ
ＮＡ断片の泳動距離を測定し、標準となる遺伝子の泳動
距離とが一致するか否かにより被検試料中に目的とする
遺伝子が存在するか否かを判定することができる。

〔実施例〕

以下に本発明の一実施例を図面により説明する。

遺伝子の検出に用いる装置の概要は、第１図のような構
成となる。ゲル泳動そう１にセットされたトレー付ゲル
１３（第２図）は、ゲル１３１をセットしである。ゲル
は、アガロース濃度１〜４％が適当であるが、本実施例
では、数百ｂｐｓのＤＮＡ断片を検出しようとしている
ため２％のものを用いた。ゲルには、エチジウムブロマ
イドを０．５〜１μｇ／−含むようにした。このトレー
をゲル泳動そう１にセットした。検出すべき対象は、サ
ルモネラ菌とした。モデル系として、正常人フン便０゜
０５ｇをリン酸緩衝液に懸濁したものにサルモネラ菌（
ＩＦＯ１２５２９）　　（１０’　コ／Ｉｇ　　人フン
便）をまぜたもの（サンプルｌ）、まぜないもの（サン
プル２）を２通り作り、常法に従いＤＮＡを抽出する操
作を行なった。

その後、サンプル１、サンプル２およびポジティブコン
トロールとして、あらかじめ従来のフェノール、クロロ
ホルムを用いる精製法で調製したサルモネラ菌のＤＮＡ
溶液（サンプル３）を用いてＰＣＲ反応を行なった。

ＰＣＲ反応の条件は、１０ｘバツフアーｌＯμｌ、ｄＮ
ＴＰ１６ｔｔｌ　（各１．２５ｍＭ）　、サルモネラ菌
に特異的な配列をもつブライマー（ａ）及び（ｂ）５μ
Ｉ！（５０Ｄ／μｌ）、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼｌμ
ｌ（５ｕｎｉｔ／ｍｌ）を加えて反応液１００μｌを調
製した。ブライマー（ａ）、（ｂ）としては次のものを
用いた。

ブライ７−（ａ）：５°ＴＡＣＣＧＣＣＡＴＡＣＧＴＣ
ＴＧＡＧＣ３プライマー（ｂ）　：　５’　ＧＧＣＧＡ
ＧＣＡＧＴＴＴＧＴＣＴＧＴＣ３’この反応液の入った
容器に、ミネラルオイル（ＳＩＧＭＡ社）を５０μｌ加
えて反応液を調製した。

各バッファーの組成を次に示す。ｌＯｘバッファー　：
　５００　ｍＭ　　ＫＣＩ　、　１００　ｍＭ　　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩ、　１５ｍＭ　　ＭｇＣ１，、（０，１％
ゼラチン’）　、ｄＮＴＰ溶液：ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、
ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの混合物をさす。反応条件は、以下
に示す通りである。

熱変性　　　　　　９４°Ｃ１分アニーリング　　　３７℃　　　　１分重合反応　　　
　　６０°Ｃ１分とし４２サイクル行なった。

次に、あらかじめ５μｇ／−のエチジウムブロマイド（
ＥｔＢｒ）を含むアガロースゲル（２％Ｗ／Ｖ）にコム
（１３２）をセットした使い捨てアガロースゲルトレー
を電気泳動そうにセットし、ＰＣＲ後のサンプル１．２
．３各１０μｌに５０％グリセロール、０．２５％ブロ
ムフェノールブルー、０．２５％キシレンシアツールを
含む水溶液２μｌを加えてウェルにアプライした。用い
たゲルトレーは、７ｃｍＸｌＯｃｍである。電源３を用
いてＤＣｌｏｏＶをかけ４０分泳動した。その後、トレ
ーをゲルトレー装着部５にセットし、放電管（２５４ｒ
＋ｎ＋　、あるいは３０２ｎｍにメインピークをもつ）
にカットフィルター（ＨＯＹＡ、　Ｕ−３４０）をつけ
た光源４でゲルトレー中のゲルを励起した。

ゲルより発する光を画像として取り込む手段としては、
フィルター６　（ケンコー、ＭＣ−ＵＶ及びＭＣ−Ｙ２
）で励起光由来の迷光をカットし、カラーＣＯＤカメラ
（キャノン　Ｃ１−２０，３８万画素（７７４ＨＸ４８
８■）で、ゲルより発する蛍光を画像として取り込んだ
。

次に、取り込んだ画像を処理する手段としては、以下の
ように行なった。即ち、その画像を直接モニターテレビ
（カラー）で直接観察した。この際、赤色のバンド状Ｄ
ＮＡが観察された。

サンプル３では、１バンドのみが現れ、サンプルｌでは
、サンプル３と同じ泳動距離にバンドが現れ、サンプル
２では、その位置にバンドが出現しなかった。その画像
をデータ処理器、パソコン（日本電気ＰＣシリーズ）に
画像を送り、画像処理した。

検出は、ウェル（スタート点）からサンプル３をＰＣＲ
したサンプル（ポジティブコントロール）の泳動距離を
まず測った（Ｒ，とする）。次いでサンプル２．３をＰ
ＣＲしたサンプルの泳動距離（それぞれＲＡ、Ｒ１とす
る）を測った。Ｒ０＝ＲＡならば目的遺伝子が存在する
ことがわかるが、実際サンプルｌでは、Ｒｏ　”　ＲＡ
となった。

サンプル３では、Ｒ１１≠Ｒ３であった。このことから
目的遺伝子の検出が行なえた。

〔発明の効果〕

本発明によればラジオアイソトープを用いずに、目的遺
伝子の検出を従来の写真法にくらべ短時間で多検体を１
時間に１００検体以上の速度で処理できる。さらに定性
的に結果を出すことができる。

画像（データ）の記録が、磁気テープあるいは、フロッ
ピーディスクとして残されるため、任意にデータを取り
出せたり長期保存が可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、遺伝子の検出に用いた装置の検出部について
の概略構成を示した図である。第２図は、前処理部、遺伝子増幅部及び検出部を組み合
わせた遺伝子の検出装置についての概略構成を示した図
である。第３図は、第１図の５に装着するトレー付きゲルの断面
図を示した図である。ｌ・・・電気泳動そう、２・・・電極、３・・・電源、
４・・・光源（フィルターを含む）、５・・・ゲルトレ
ー装着部、６・・・フィルター　７・・・カメラ（画像
取り込む個体映像デバイス）、８・・・データ処理器及
びパーソナルコンピューター　９・・・画像保存器及び
デイスプレー、１０・・・前処理部、１１・・・遺伝子
増幅部、１２・・・検出部、１３・・・トレー付きゲル
、−１３１・・・ゲル、１３２・・・コム。第１図第２図第３図

Claims

【特許請求の範囲】

（１）遺伝子増幅法で増幅させたＤＮＡを電気泳動法に
より泳動したＤＮＡに蛍光物質を付着させる工程、該蛍
光物質を励起させることにより発する蛍光を画像として
取り込む工程及び取り込んだ画像を処理する工程を有す
ることを特徴とする遺伝子の検出方法。
（２）請求項（１）記載の遺伝子増幅法で増幅させたＤ
ＮＡが、逆転写酵素を用いて合成されたｃＤＮＡを遺伝
子増幅法により増幅させたものであることを特徴とする
請求項（１）記載の遺伝子の検出方法。