CN105954505B - 基于细胞活性传感器的贝类腹泻性毒素的检测装置及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于细胞活性传感器的贝类腹泻性毒素的检测装置及方法，该装置包括：电源适配器、广角镜头、智能移动设备、暗室、底座、细胞培养板、培养板装载台、冷光片、单片机、加热器、温度传感器、CO2传感器、电磁阀、橡胶气管和CO2气瓶。该方法首先进行细胞培养；接种细胞，并加入混合了细胞活性试剂盒和毒素的新鲜培养基；放入装置进行长时监测，计算归一化细胞活性指数NCVI；通过遍历及最小二乘法拟合出检测贝类腹泻性毒性的最佳标定曲线；通过分析待测样品溶液的NCVI曲线，计算出待测样品的贝类腹泻性毒素。本发明实现了毒素对细胞活性的作用变化的实时监测，具有高通量、同时同步、长时监测、操作简便和成本低廉等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种高通量同时检测贝类腹泻性毒素的装置及技术，尤其涉及基于细胞活性传感器的贝类腹泻性毒素的高通量同时同步检测装置及方法。
背景技术
贝类腹泻性毒素是贝类从浮游藻类中聚集的有害有机物质存于体内蓄积而成，是一类毒性很强的非蛋白毒素，食用后能使人中毒，甚至死亡。目前国内贝类腹泻性毒素检测方法通常使用方法是小鼠生物检测法，液相色谱质谱联用方法、Elisa试剂盒检测方法和细胞传感器方法。小鼠生物检测法个体差异性大导致毒性难以估计，液相色谱质谱联用方法操作繁琐并且设备庞大，对实验员具有高要去。Elisa试剂盒检测方法在分子水平上，能够特异性地检测贝类腹泻性毒素，但无法直观地反映对生物体的影响。细胞传感器在细胞水平上反映了生物体对毒素反映的影响。目前所报道的细胞阻抗传感器和细胞乐普波传感器在贝类腹泻性毒素的检测上具有灵敏度高、检测范围广等优点。但还存在系统复杂度高、细胞培养方案不普及和成本高等不足。因此，海洋水产品毒素检测领域迫切需要一种能够高通量、同时同步、系统便携、操作简便、检测成本低廉并且能够反映毒素对生物体反映的贝类腹泻性毒素检测装置及方法。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于细胞活性传感器的贝类腹泻性毒素的高通量同时同步检测装置及方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种基于细胞活性传感器的贝类腹泻性毒素的高通量检测装置，该装置包括：电源适配器、广角镜头、智能移动设备、暗室、底座、96孔细胞培养板、96孔细胞培养板装载台、冷光片、单片机、加热器、温度传感器、CO2传感器、电磁阀、橡胶气管和CO2气瓶；其中，暗室与底座通过隔板分离；单片机和电源适配器固定在底座内；暗室中具有可抽拉的96孔检测板装载台，96孔细胞培养板通过卡槽固定在96孔细胞培养板装载台顶部，冷光片通过卡槽固定在96孔细胞培养板装载台底部；电源适配器、加热器、温度传感器、CO2传感器、电磁阀和冷光片均与单片机连接，由单片机控制冷光片发光、暗室内的温度和CO2浓度；电磁阀通过橡胶气管和CO2气瓶连接，CO2气瓶向暗室提供CO2；在暗室的顶部开有圆孔，广角镜头固定在暗室顶部的圆孔正下方；智能移动设备通过卡槽固定在暗室顶部外侧，且其摄像头可通过暗室的圆孔透过广角镜头，对暗室内的96孔细胞培养板进行图像采集。
一种基于细胞活性传感器的贝类腹泻性毒素的高通量同时同步检测的方法，该方法包括以下步骤：
(1)样品前处理，制备贝类腹泻性毒素待测样品溶液，包括以下子步骤：
(1.1)取贝类生物，除去贝壳，用双蒸水洗净贝肉后均质器均质；
(1.2)称取1g均质后的样品加入6ml体积浓度为80％的甲醇水溶液，得到混合溶液；
(1.3)在4℃下，将步骤(1.2)得到的混合溶液以3500r/min离心10分钟，收集上清液；
(1.4)在步骤(1.3)残留的贝肉组织中加2ml体积浓度为80％的甲醇水溶液，在4℃下，以3500r/min离心10分钟，收集上清液，加入到步骤(1.3)收集的上清液中；
(1.5)重复步骤(1.4)，待收集的上清液达到10ml时，用0.45um的滤膜过滤，得到滤液；
(1.6)取20ul滤液，用样品稀释缓冲液PBS稀释到1ml，然后取100ul作为待测样品溶液；
(2)细胞培养：选用肝癌细胞HepG2进行培养。HepG2的培养基为含有体积分数为10％FBS的DMEM培养基。上述培养基中均添加了体积分数为1％的青霉素-链霉素溶液。所有的细胞于37℃，体积分数为5％CO2的饱和湿度培养箱中培养。待细胞融合度达到80-90％时，使用含体积分数为0.02％的胰酶将其消化下来，将HepG2细胞接种在96孔细胞培养板的培养孔内。
(3)加入显色剂：在96孔细胞培养板的培养孔内接种固定密度的细胞。培养24小时后，选用细胞增殖及细胞活性检测试剂盒作为显色剂，按照说明书，将其与不同浓度的贝类腹泻性毒素，并进一步与新鲜培养基混合。然后，将混合了试剂盒溶液的新鲜培养基加入培养孔中；
(4)长时监测细胞活性对贝类腹泻性毒素的响应：将96孔细胞培养板固定在96孔细胞培养板装载台上。单片机控制冷光片发光，并根据温度传感器反馈的温度信息采用PID控制算法控制加热器对暗室的室内空间加热，实现37℃环境温度的恒温控制，同时根据CO2传感器的反馈，控制电磁阀，实现暗室的室内体积分数为5％CO2的气体环境。
(5)确定检测贝类腹泻性毒素的最佳标定曲线：通过智能移动设备连续采集96孔细胞培养板的图像；每一次采集到图像后，对采集的图像进行处理，然后再进行下一次采集。其中，对图像的处理过程包括以下子步骤：
(5.1)切割出96孔检测板上的微孔所对应的子图像，子图像的孔内像素范围为10×10；
(5.2)将子图像转换至颜色孔间RGB，提取子图像中每个像素的B分量，并计算子图像像素B分量平均值；
(5.3)计算细胞活性指数CVI，根据公式CVI＝255–C，其中，C为步骤(5.2)中所计算的子图像像素B分量平均值；
(5.4)计算归一化细胞活性指数NCVI，根据公式NCVI＝CVIt/CVI0，其中，CVIt为各时间点所计算出的CVI值，CVI0为0时间点所计算出的CVI值。
基于上述处理过程，每次采集得到的图像对应单个时间点的检测，将每个时间点的细胞活性传感器响应不同毒素浓度的归一化细胞活性指数NCVI连接，绘出细胞活性指数NCVI对时间的连续图谱。然后，遍历所有时间点，根据最小二乘法拟合曲线算法，拟合出每个时间点的归一化细胞活性指数NCVI关于已知密度的细胞浓度以10为底的对数的标定曲线。从所有的拟合标定曲线中，选出拟合优度和斜率最大的标定曲线，即检测贝类腹泻性毒素的最佳标定曲线；
(6)检测未知浓度的贝类腹泻性毒素的浓度：将步骤(1)得到的待测样品溶液加入到96孔细胞培养板的培养孔中，重复步骤(3)-步骤(5.4)，得到该待测样品溶液的归一化细胞活性指数NCVI，然后根据步骤(5)确定的最佳标定曲线的时间点，获得待测样品溶液在该时间点的归一化细胞活性指数NCVI，带入步骤(5)得到的检测贝类腹泻性毒素的最佳标定曲线，计算出待测样品溶液的贝类毒素含量，根据步骤(1)的稀释倍数，即可得到1ml待测样品溶液的贝类腹泻性毒素。
本发明的有益效果是：本发明实现了毒素对细胞活性的作用变化的实时监测，具有高通量、同时同步、长时监测、操作简便和成本低廉等优点。本发明较现有的贝类腹泻性毒素检测方法上，具有操作步骤简单，成本低廉，高通量同时同步，长时监测贝类腹泻性毒素等优点，并且在细胞培养方法上具有普及性。根据以上优点，本发明的装置及方法可成为海洋毒素检测分析领域的新工具，并广泛应用于该领域。
附图说明
图1是本发明贝类腹泻性毒素的高通量同时同步检测装置整体结构图；
图2是本发明所使用的细胞活性传感器的细胞培养板结构图；
图3是本发明细胞活性传感器监测贝类腹泻性毒素影响的算法流程图；
图4是本发明监测不同OA浓度的归一化细胞活性指数NCVI谱线图；
图5是本发明确定的检测贝类腹泻性毒素的最佳标定曲线的结果图；
图中，电源适配器1、广角镜头2、智能移动设备3、暗室4、底座5、96孔细胞培养板6、96孔细胞培养板装载台7、冷光片8、单片机9、加热器10、温度传感器11、CO2传感器12、电磁阀13、橡胶气管14和CO2气瓶15。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述，但并不是限制本发明。
如图1、2所示，本发明基于细胞活性传感器的贝类腹泻性毒素的高通量检测装置，包括：电源适配器1、广角镜头2、智能移动设备3、暗室4、底座5、96孔细胞培养板6、96孔细胞培养板装载台7、冷光片8、单片机9、加热器10、温度传感器11、CO2传感器12、电磁阀13、橡胶气管14和CO2气瓶15；其中，暗室4与底座5通过隔板分离；单片机9和电源适配器1固定在底座5内；暗室4中具有可抽拉的96孔检测板装载台7，96孔细胞培养板6通过卡槽固定在96孔细胞培养板装载台7顶部，冷光片8通过卡槽固定在96孔细胞培养板装载台7底部；电源适配器1、加热器10、温度传感器11、CO2传感器12、电磁阀13和冷光片8均与单片机9连接，由单片机9控制冷光片8发光、暗室4内的温度和CO2浓度；电磁阀13通过橡胶气管14和CO2气瓶15连接，CO2气瓶15向暗室4提供CO2；在暗室4的顶部开有圆孔，广角镜头2固定在暗室4顶部的圆孔正下方；智能移动设备3通过卡槽固定在暗室4顶部外侧，且其摄像头可通过暗室4的圆孔透过广角镜头2，对暗室4内的96孔细胞培养板6进行图像采集。
一种应用上述装置检测贝类腹泻性毒素的方法，包括以下步骤：
(1)样品前处理，制备贝类腹泻性毒素待测样品溶液，包括以下子步骤：
(1.1)取贝类生物，除去贝壳，用双蒸水洗净贝肉后均质器均质；
(1.2)称取1g均质后的样品加入6ml体积浓度为80％的甲醇水溶液，得到混合溶液；
(1.3)在4℃下，将步骤(1.2)得到的混合溶液以3500r/min离心10分钟，收集上清液；
(1.4)在步骤(1.3)残留的贝肉组织中加2ml体积浓度为80％的甲醇水溶液，在4℃下，以3500r/min离心10分钟，收集上清液，加入到步骤(1.3)收集的上清液中；
(1.5)重复步骤(1.4)，待收集的上清液达到10ml时，用0.45um的滤膜过滤，得到滤液；
(1.6)取20ul滤液，用样品稀释缓冲液PBS稀释到1ml，然后取100ul作为待测样品溶液；
(2)细胞培养：选用肝癌细胞HepG2进行培养。HepG2的培养基为含有体积分数为10％FBS的DMEM培养基。上述培养基中均添加了体积分数为1％的青霉素-链霉素溶液。所有的细胞于37℃，体积分数为5％CO2的饱和湿度培养箱中培养。待细胞融合度达到80-90％时，使用含体积分数为0.02％的胰酶将其消化下来，将HepG2细胞接种在96孔细胞培养板6的培养孔内。
(3)加入显色剂：在96孔细胞培养板6的培养孔内接种5000个/孔的细胞。培养24小时后，选用细胞增殖及细胞活性检测试剂盒CCK-8作为显色剂，按照说明书，将其与不同浓度的贝类腹泻性毒素，这里选用了浓度为10、25、50、100、200、400和800ppb等的大田软海绵酸OA进行混合，并进一步与新鲜培养基混合，配制成含有体积分数为10％CCK-8试剂和10％大田软海绵酸OA毒素的新鲜培养基。然后，将混合了试剂盒溶液的新鲜培养基加入培养孔中；
(4)长时监测细胞活性对贝类腹泻性毒素的响应：将96孔细胞培养板6固定在96孔细胞培养板装载台7上。单片机9控制冷光片8发光，并根据温度传感器11反馈的温度信息采用PID控制算法控制加热器10对暗室4的室内空间加热，实现37℃环境温度的恒温控制，同时根据CO2传感器12的反馈，控制电磁阀13，实现暗室4的室内体积分数为5％CO2的气体环境。
(5)确定检测贝类腹泻性毒素的最佳标定曲线：通过智能移动设备3连续采集96孔细胞培养板6的图像。每一次采集到图像后，对采集的图像进行处理，然后再进行下一次采集。其中，对图像的处理过程包括以下子步骤：
(5.1)切割出96孔检测板上的微孔所对应的子图像，子图像的孔内像素范围为10×10；
(5.2)将子图像转换至颜色孔间RGB，提取子图像中每个像素的B分量，并计算子图像像素B分量平均值；
(5.3)计算细胞活性指数CVI，根据公式CVI＝255–C，其中，C为步骤(5.2)中所计算的子图像像素B分量平均值；
(5.4)计算归一化细胞活性指数NCVI，根据公式NCVI＝CVIt/CVI0，其中，CVIt为各时间点所计算出的CVI值，CVI0为0时间点所计算出的CVI值。
基于上述处理过程，每次采集得到的图像对应单个时间点的检测，将每个时间点的细胞活性传感器响应不同毒素浓度的归一化细胞活性指数NCVI连接，绘出细胞活性指数NCVI对时间的连续图谱。然后，遍历所有时间点，根据最小二乘法拟合曲线算法，拟合出每个时间点的归一化细胞活性指数NCVI关于已知密度的细胞浓度以10为底的对数的标定曲线。从所有的拟合标定曲线中，选出拟合优度和斜率最大的标定曲线，即检测贝类腹泻性毒素的最佳标定曲线；
(6)检测未知浓度的贝类腹泻性毒素的浓度：将步骤(1)得到的待测样品溶液加入到96孔细胞培养板的培养孔中，重复步骤(3)-步骤(5.4)，得到该待测样品溶液的归一化细胞活性指数NCVI，然后根据步骤(5)确定的最佳标定曲线的时间点，获得待测样品溶液在该时间点的归一化细胞活性指数NCVI，带入步骤(5)得到的检测贝类腹泻性毒素的最佳标定曲线，计算出待测样品溶液的贝类毒素含量，根据步骤(1)的稀释倍数，即可得到1ml待测样品溶液的贝类腹泻性毒素。
图4为本发明监测不同OA浓度的归一化细胞活性指数NCVI谱线图，从图中可以看出，细胞活性传感器对不同浓度毒素的响应随时间的变化情况，证明了本发明方法能够长时监测毒素对细胞活性的作用。图5为本发明确定的检测OA的最佳标定曲线的结果图，包含拟合优度最大和斜率最大的曲线。由于斜率最大曲线拟合优度过低，因此，选择拟合优度最大的时间点为最佳时间点，该时间点的标定曲线为最佳标定曲线。从图中可以看出，本发明方法的得出的最佳标定曲线公式为NCVI＝-1.8775lg[C]+7.1240，NCVI为细胞活性指数，C为待测样品的OA含量。实验结果证明本发明方法能够准确检测待测样品贝类腹泻性毒素。
Claims (1)
1.一种基于细胞活性传感器的贝类腹泻性毒素的高通量同时同步检测的方法，该方法在高通量检测装置上实现，所述高通量检测装置包括：电源适配器、广角镜头、智能移动设备、暗室、底座、96孔细胞培养板、96孔细胞培养板装载台、冷光片、单片机、加热器、温度传感器、CO2传感器、电磁阀、橡胶气管和CO2气瓶；其中，暗室与底座通过隔板分离；单片机和电源适配器固定在底座内；暗室中具有可抽拉的96孔检测板装载台，96孔细胞培养板通过卡槽固定在96孔细胞培养板装载台顶部，冷光片通过卡槽固定在96孔细胞培养板装载台底部；电源适配器、加热器、温度传感器、CO2传感器、电磁阀和冷光片均与单片机连接，由单片机控制冷光片发光、暗室内的温度和CO2浓度；电磁阀通过橡胶气管和CO2气瓶连接，CO2气瓶向暗室提供CO2；在暗室的顶部开有圆孔，广角镜头固定在暗室顶部的圆孔正下方；智能移动设备通过卡槽固定在暗室顶部外侧，且其摄像头可通过暗室的圆孔透过广角镜头，对暗室内的96孔细胞培养板进行图像采集；其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)样品前处理，制备贝类腹泻性毒素待测样品溶液，包括以下子步骤：
(1.1)取贝类生物，除去贝壳，用双蒸水洗净贝肉后均质器均质；
(1.2)称取1g均质后的样品加入6ml体积浓度为80％的甲醇水溶液，得到混合溶液；
(1.3)在4℃下，将步骤(1.2)得到的混合溶液以3500r/min离心10分钟，收集上清液；
(1.4)在步骤(1.3)残留的贝肉组织中加2ml体积浓度为80％的甲醇水溶液，在4℃下，以3500r/min离心10分钟，收集上清液，加入到步骤(1.3)收集的上清液中；
(1.5)重复步骤(1.4)，待收集的上清液达到10ml时，用0.45um的滤膜过滤，得到滤液；
(1.6)取20ul滤液，用样品稀释缓冲液PBS稀释到1ml，然后取100ul作为待测样品溶液；
(2)细胞培养：选用肝癌细胞HepG2进行培养；HepG2的培养基为含有体积分数为10％FBS的DMEM培养基；上述培养基中均添加了体积分数为1％的青霉素-链霉素溶液；所有的细胞于37℃，体积分数为5％CO2的饱和湿度培养箱中培养；待细胞融合度达到80-90％时，使用含体积分数为0.02％的胰酶将其消化下来，将HepG2细胞接种在96孔细胞培养板的培养孔内；
(3)加入显色剂：在96孔细胞培养板的培养孔内接种固定密度的细胞；培养24小时后，选用细胞增殖及细胞活性检测试剂盒CCK-8作为显色剂，按照说明书，将其与不同浓度的贝类腹泻性毒素，并进一步与新鲜培养基混合；然后，将混合了试剂盒溶液的新鲜培养基加入培养孔中；
(4)长时监测细胞活性对贝类腹泻性毒素的响应：将96孔细胞培养板固定在96孔细胞培养板装载台上；单片机控制冷光片发光，并根据温度传感器反馈的温度信息采用PID控制算法控制加热器对暗室的室内空间加热，实现37℃环境温度的恒温控制，同时根据CO2传感器的反馈，控制电磁阀，实现暗室的室内体积分数为5％CO2的气体环境；
(5)确定检测贝类腹泻性毒素的最佳标定曲线：通过智能移动设备连续采集96孔细胞培养板的图像；每一次采集到图像后，对采集的图像进行处理，然后再进行下一次采集；其中，对图像的处理过程包括以下子步骤：
(5.1)切割出96孔检测板上的微孔所对应的子图像，子图像的孔内像素范围为10×10；
(5.2)将子图像转换至颜色孔间RGB，提取子图像中每个像素的B分量，并计算子图像像素B分量平均值；
(5.3)计算细胞活性指数CVI，根据公式CVI＝255–C，其中，C为步骤(5.2)中所计算的子图像像素B分量平均值；
(5.4)计算归一化细胞活性指数NCVI，根据公式NCVI＝CVIt/CVI0，其中，CVIt为各时间点所计算出的CVI值，CVI0为0时间点所计算出的CVI值；
基于上述处理过程，每次采集得到的图像对应单个时间点的检测，将每个时间点的细胞活性传感器响应不同毒素浓度的归一化细胞活性指数NCVI连接，绘出细胞活性指数NCVI对时间的连续图谱；然后，遍历所有时间点，根据最小二乘法拟合曲线算法，拟合出每个时间点的归一化细胞活性指数NCVI关于已知密度的细胞浓度以10为底的对数的标定曲线；从所有的拟合标定曲线中，选出拟合优度和斜率最大的标定曲线，即检测贝类腹泻性毒素的最佳标定曲线；
(6)检测未知浓度的贝类腹泻性毒素的浓度：将步骤(1)得到的待测样品溶液加入到96孔细胞培养板的培养孔中，重复步骤(3)-步骤(5.4)，得到该待测样品溶液的归一化细胞活性指数NCVI，然后根据步骤(5)确定的最佳标定曲线的时间点，获得待测样品溶液在该时间点的归一化细胞活性指数NCVI，带入步骤(5)得到的检测贝类腹泻性毒素的最佳标定曲线，计算出待测样品溶液的贝类毒素含量，根据步骤(1)的稀释倍数，即可得到1ml待测样品溶液的贝类腹泻性毒素。
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