CN109182443A - 一种监测腐败菌繁殖的传感器制备方法及快速检测腐败菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种监测腐败菌繁殖的传感器制备方法及快速检测腐败菌的方法，利用智能手机采集传感器阵列图像，并进行提取处理响应信号，结合模式识别区分优势腐败菌，包括S1：将智能手机固定在有稳定照明光源的拍摄位置，设置测光方式、感光度、曝光时间和白平衡的参数；S2：在相同的位置和参数条件下，先采集传感器阵列反应前的图像，再将传感器阵列与样品反应，每隔a天后采集传感器阵列图像用于后期处理和分析；S3:对图像预处理；S4:提取传感器阵列的特征信号；S5:借助主成分分析PCA对特征信息X进行预处理，用预处理后的数据建立线性判别LDA、K最近邻算法KNN、人工神经网络BPNN和支持向量机模型SVM预测优势腐败菌的类别。

Description

一种监测腐败菌繁殖的传感器制备方法及快速检测腐败菌的 方法

技术领域

本发明属于食品安全智能检测领域，具体涉及一种利用手机采集嗅觉可视化传感器 数据、处理数据和显示识别结果的腐败菌快速检测方法，可以应用于食品腐败菌的检测。

背景技术

肉制品加工的杀菌中，虽然可以杀灭酶和致病菌，对细菌孢子很难死，在后续加工和贮藏过程中容易出现新鲜度下降、变质等问题，导致真空包装水晶肴肉货架期短，销 售区域半径受到很大限制，制约了生产企业的发展。肉制品变质主要是由于少数部分优 势腐败菌群的生产繁殖引起，因此寻求一种快速、在线、非接触式的肉制品优势腐败菌 分析方法显得尤为重要。目前常用于区分不同的优势腐败菌的方法主要是PCR诊断法， 这些方法能够准确检测肉品的品质及微生物的致腐能力，但是会破坏样本，耗时耗力， 试验周期长，不能及时反馈检测结果。由于不同优势腐败菌的代谢能力、消耗营养物质 的种类是有差异的，导致不同优势腐败菌产生的代谢产物，如挥发性成分等也是不同的， 因此可以通过分析挥发性成分种类、含量来区分不同的优势腐败菌。挥发性成分是一种 比较直观的肴肉品质指标，但是由于它“看不见，摸不着”的特性，导致很难对其定性定 量分析，尤其是在肴肉变质初期各种腐败菌总数较低、挥发性成分浓度较低，很难被人 的嗅觉直接感知出来，当人的嗅觉能察觉到肉制品有异味时已经腐败，此时对于肉制品 的保藏和加工已经没有意义了，因此需要用更快速无损、在运输和加工过程中实时监测 的方法检测并且区分出不同优势腐败菌，在猪肉的保藏过程中，快速区分不同的优势腐 败菌，采用具有针对性的保藏手段，这对于提高保藏效果有重要的意义。

嗅觉可视化技术是根据可视化传感器与待检测挥发性成分反应前后的颜色变化对 气体进行定性定量的分析，以实现挥发性成分的“可视化”检测，是一种理想的肉品贮藏特性监测工具，但是由于传统的信号采集(扫描仪或者CCD相机)、信号处理(计算机 和模式识别方法)方式和设备的限制，嗅觉可视化技术目前还未走向实际应用、走进人 们的日常生活。随着智能手机的普及，很多监测手段由大型化、实验室化，逐渐变为便 携化和日常化，本发明将Android智能手机和嗅觉可视化传感器结合，制备一种可以用 于现场实时监测肴肉腐败菌繁殖情况的便携检测方法。该技术的研究可以为嗅觉可视化 从实验室推向市场应用提供可能，也可以使消费者能够参与到肉制品变质过程的监控中。

发明内容

针对上述现有技术中利用工业相机采集数据和计算机处理数据的检测方法大型化 的缺点，本发明将智能手机和嗅觉可视化传感器结合，公开一种可以用于现场实时监测肉制品腐败菌繁殖情况的便携式快速检测方法。

本发明公开一种监测腐败菌繁殖情况的嗅觉可视化传感器制备方法，利用毛细管点 样法将气敏材料固定在传感器载体上，制成3×3的可视化传感器阵列。

所述气敏材料为对优势腐败菌代谢产生有机酸、胺和含硫化合物具有灵敏响应的气 敏材料，具体包含6种卟啉或金属卟啉和3种pH指示剂；

上述6种卟啉或者金属卟啉，具体为四苯基卟啉、四苯基氯化铁、四苯基氯化锰、四苯基卟吩锌、四苯基卟吩铜、四苯基卟吩钴；

上述卟啉使用氯苯或者乙醇溶解，使用的浓度为0.01mol/L-0.09mol/L；

上述3种pH指示剂，具体为甲基红、中性红、百里酚酞；

上述pH指示剂使用氯仿溶解，使用的浓度为0.01mol/L-0.2mol/L；

所述传感器载体具有良好疏水性的C2反相硅胶板或疏水滤纸；

上述传感器载体的尺寸为5cm×5cm至7cm×7cm的正方形；

上述毛细管点样法，采用100mm×0.3mm或100mm×0.5mm型号的毛细管；

上述毛细管点样法，每次点样气敏材料溶液的用量为0.01μL-0.09μL；

所述腐败菌为乳杆菌、肠杆菌、耶尔森菌和嗜冷杆菌。

本发明还公开一种利用上述传感器制备方法获得的传感器、并基于智能手机的肉制 品腐败菌的快速检测方法，利用智能手机采集传感器阵列图像，并进行提取处理响应信号，结合模式识别区分优势腐败菌的方法，具体分为以下几个步骤：

S1:设置图像采集参数。先将智能手机固定在有稳定照明光源的拍摄位置，打开应用软件设置测光方式、感光度、曝光时间和白平衡的相机参数；

S2:采集传感器阵列图像。在相同的位置和参数条件下，先采集传感器阵列反应前的图像，再将传感器阵列与样品进行反应，每隔a天后采集传感器阵列图像用于后期处 理和分析；

S3:图像预处理。为了得到可视化传感器阵列中气敏材料的位置，先对图像尺寸作等比例缩放，并转化为灰度值为32的灰度值图像。利用中值滤波的5×5模板对灰度值 图像进行去除噪声，用于增强图像效果利于后期处理；再通过Sober算子检测图像的边 缘，得到指示信息图像的边缘，接着借助轮廓提取算法检测出气敏材料的轮廓；最后用 自适应阈值选取法分割出气敏材料的图形位置；

S4:提取传感器阵列的特征信号。提取气敏材料上每个像素点的R、G、B平均值和ΔL、Δa、Δb、ΔE，传感器与样品反应后的R、G、B均值与反应前均值相减并取绝对值 得到ΔR、ΔG、ΔB，将ΔR、ΔG、ΔB、ΔL、Δa、Δb和ΔE作为传感器的特征信号X；

S5:模式识别区分腐败菌。获得到的特征信号X内部的向量之间存在一定的信息冗余，为提高模型的预测性能，借助主成分分析(PCA)对特征信息X进行预处理，用预 处理后的数据建立线性判别(LDA)、K最近邻算法(KNN)、人工神经网络(BPNN)和 支持向量机模型(SVM)预测优势腐败菌的类别。

上述步骤S3中等比例缩放，指将图片压缩至400-700像素大小。

本发明的有益效果在于：

针对传统技术中利用工业相机采集数据和计算机处理数据的检测设备大型化的缺 点，本发明公开一种基于智能手机的肉制品腐败菌的快速检测方法。首先优选出对食品优势腐败菌繁殖中产生的酸、胺和含硫化合物敏感的色敏材料制备可视化传感器阵列， 该传感器阵列能根据不同优势腐败菌产生的挥发性物质产生不同的颜色变化，能实现食 品中腐败菌的可视化表征，将人通过感官很难识别的细菌微观变化通过可视化阵列鲜明 快速的呈现出来；利用智能手机采集反应前后的传感器阵列图像，将反应后图像与反应 前图像R、G、B信号差值的绝对值和ΔL、Δa、Δb、ΔE作为建模特征变量，借助模式识 别方法识别出食品贮存过程中优势腐败菌类别，智能手机的便携性和人性化的软件设计 让腐败菌的检测过程简单便捷。综上所述，本发明公开的腐败菌快速检测方法具有实时 监测、便携化和智能化的优点。

附图说明

图1：4℃下肴肉中4种腐败菌和空白组细菌总数变化情况；

图2：冷藏条件下猪肉挥发成分的种类和百分含量对比图；

图3：可视化传感器阵列；

图4：嗅觉可视化传感器阵列对4种不同优势腐败菌接种后肴肉样本和空白组肴肉样本的反应后的差值图像(a)乳杆菌，(b)肠杆菌，(c)耶尔森菌属，(d)嗜冷杆菌； (e)表示空白组肴肉样本的反应后的差值图像；

图5：腐败菌检测系统APP应用界面。

具体实施方式

为进一步说明本发明，以下结合附图及实施例进行具体示例描述。实施例及相应附 图用于进一步解释说明本发明，并不用于限制本发明，本领域技术人员在无实质创造性工作而基于本发明改型形成的其他实施例，均在本发明的保护范围之内。

实施例1：传感器阵列的制备

将每块肴肉进行表面灭菌，经培养计数，每块肴肉样本的细菌总数均小于10CFU/g， 证明灭菌效果良好。将灭菌后的100包，分为5组，每组20块，取其中4组分别放置 在乳杆菌(Lactobacillus sakei)，肠杆菌(Enterococcus faecium)，耶尔森菌(Yersiniaintermedia)和嗜冷杆菌(Psychrobacterglacincola)菌液中浸泡15s后沥干，剩余1组 肴肉样本块作为对照组，所有样本用真空包装袋包装后置于4℃冷藏保存。每隔5d取 每组样本进行腐败菌总数检测、挥发性成分检测、嗅觉可视化检测。

1.腐败菌总数检测

接种不同种类的微生物后，肴肉样品在4℃贮藏期间的细菌总数变化如图1所示。由图可知，贮藏期内各试验组的微生物数量均呈现不断上升的趋势，但其生长速度各有 不同。在初期接种数量基本一致的条件下，Lactobacillus sakei和Enterococcus faecium的生长最为迅速，接种20d以后总数即超过了107CFU/g，后期生长速率趋缓，存末期总 数接近108CFU/g；Yersinia intermedia初期生长较为缓慢，但后期经过环境适应以后则 呈现出快速生长的态势，在第25d时细菌总数超过107CFU/g；Psychrobacterglacincola 的生长速率相对缓慢，在第30d时细菌总数达到107CFU/g左右。

2.不同腐败菌产生挥发性成分的检测

在4℃冷藏条件下，从对照组和接种不同优势腐败菌的样本总体情况来看，1～5d时肴肉的挥发成分共有23种物质，由图2可知，醛、酮和酯类物质为主要挥发性成分， 约占挥发性成分的80％以上，这些成分也是肴肉的主要风味成味物质。随着贮藏时间的 延长，优势腐败菌代谢肴肉的蛋白质、脂肪产生代谢产物，肴肉的挥发性成分发生了改 变，酸、胺类和含硫化合物挥发性成分逐渐增加，到贮藏末期35d时，这三种物质占 到了挥发性成分总含量的60％以上。进一步分析接种不同优势腐败菌的肴肉样本挥发性 成分的变化情况，随着贮藏时间的延长，接种Psychrobacterglacincola菌的肴肉样本产 生的含硫化合物较多，接种Lactobacillus sakei和Enterococcus faecium的实验组，胺类 和含量硫化合物挥发性成分增加速度比较快，接种Yersinia intermedia的实验组酸类物 质增加速度较快。这是由于Lactobacillus sakei和Enterococcus faecium代谢蛋白质的能 力较强，产生的胺类物质较多，而Yersinia intermedia代谢脂肪能力较强，产生的酸类 物质较多。

3.嗅觉可视化传感器阵列的构建和检测

根据GC-MS的分析结果，选择对4种优势腐败菌代谢产生的特征挥发性成分具有灵敏响应的气敏材料，分别为6种卟啉或金属卟啉和3种pH指示剂；其中6种卟啉或 者金属卟啉具体为四苯基卟啉、四苯基氯化铁、四苯基氯化锰、四苯基卟吩锌、四苯基 卟吩铜、四苯基卟吩钴；3种pH指示剂，具体为甲基红、中性红、百里酚酞。为了减 少环境湿度对传感器精度的影响，因此选择具有良好疏水性的C2反相硅胶板作为传感 器阵列的载体，其微小的孔径可以帮助吸附气体分子加快检测速度。将C2反相硅胶板 平板裁剪成5cm×5cm至7cm×7cm的正方形平板备用；将每种卟啉或金属卟啉分别溶 于氯苯或者乙醇中配制成浓度为0.01mol/L-0.09mol/L的溶液，pH指示剂溶于氯仿中 配制成0.01mol/L-0.2mol/L的溶液，经超声处理10min后密封静置与4℃的冰箱中备用。 使用100mm×0.3mm或者100mm×0.5mm(长×直径)的毛细管取微量的卟啉和pH指 示剂溶液逐一固定到反相硅胶平板上制成3×3的可视化传感器阵列，每次点样的量为 0.01μL-0.09μL，如图3所示，最后将传感器阵列置于50℃的氮气条件下烘干备用。

实施例2

本实施例提供一种基于手机的肉制品优势腐败菌的快速检测方法，利用智能手机采 集传感器阵列图像，并进行提取处理响应信号，结合模式识别区分优势腐败菌的方法，具体分为以下几个步骤：

1.设置图像采集参数。先将智能手机固定在有稳定照明光源的拍摄位置,距离传感器 阵列10cm，打开应用软件设置测光方式为支持矩阵模式、感光度ISO为500、曝光时 间为0.04s和白平衡的相机参数；

2.采集传感器阵列图像。在相同的位置和参数条件下，先采集传感器阵列反应前的 图像，再将传感器阵列与样品进行反应，每隔5天后采集传感器阵列图像用于后期处理和分析；

3.图像预处理。由于手机的运算能力和内存容量有限，需要对图像尺寸作等比例缩 放，使得长和宽为400-600像素，提高后期处理速度。为了消除图像中的毛刺和噪声造成的影响，需要先将图像转化为灰度值为32的灰度值图像，利用中值滤波的5×5模板 对灰度值图像进行去除噪声，用于增强图像效果利于后期图像分割处理；为了得到可视 化传感器阵列中气敏材料的位置，通过Sober算子检测图像的边缘，得到气敏材料的边 缘，接着借助轮廓提取算法检测出气敏材料的轮廓，最后用自适应阈值选取法从反相硅 胶板背景中分割出气敏材料的图形位置；

4.提取传感器阵列的特征信号。本实施例中传感器阵列图像是一个3×3的传感器阵 列，提取气敏材料上每个像素点的R、G、B、平均值和ΔL、Δa、Δb、ΔE，传感器与样 品反应后的R、G、B均值与反应前均值相减并取绝对值得到ΔR、ΔG、ΔB，将ΔR、ΔG、 ΔB、ΔL、Δa、Δb和ΔE作为传感器的特征信号X；则每一个传感器阵列有3×3×7的表征 向量组成，则每个样本的响应信号是一个由56个特征值组成的向量X₅₆，本实施例的 100个样本共得到100组(3×3×7)实验数据向量。图3为传感器阵列与染有不同腐败 菌肴肉样本产生的挥发性成分接触后的响应信号生成的可视化图像，从图中可以明显看 出，对于5组样本，传感器阵列的特征响应信号是不同的，对同一组样本而言，在不同 的贮藏阶段气敏传感器阵列的特征响应值也是不同的，并且随着时间的推移，肴肉变质 程度的加深，产生的挥发性程度逐渐浓烈，但是此时人的嗅觉仍然无法察觉出肴肉的新 鲜度状况，而传感器阵列的特征响应信号特征点的亮度不断加深，即传感器阵列上特征 点颜色变化程度不断加深。

5.模式识别区分优势腐败菌。获得到的特征信号X内部的向量之间存在一定的信息 冗余，为提高模型的预测性能，借助主成分分析(PCA)对特征信息X进行预处理，用 预处理后的数据建立线性判别(LDA)、K最近邻算法(KNN)、人工神经网络(BPNN) 和支持向量机模型(SVM)预测优势腐败菌的类别。

实施例3

本实例将结合手机APP的腐败菌检测系统软件具体进行说明：

1.打开“腐败菌检测系统”APP，登录系统后起始界面如图5(a)所示，点击“扫描设置”， 完成手机相机相关参数(如：测光方式、感光度、曝光时间为和白平衡等相机参数)设置。

2.点击“模型选择”，可以加载已建立好的模型，用于实施例2步骤5中的模式识别区分优势腐败菌定性判别，同时，在服务器端可以建立新的识别模型或优化已有模型， 并且该新的模型或优化的模型能够被重新加载，以到达快速、准确检测目标物的目的。

3.点击“图像采集”转到如图5(b)所示的界面，在该界面可实现“反应前图像采集”、 “反应后图像采集”、“图像处理与数据获取”、“保存数据”和“历史数据记录”等功能。点 击“反应前图像采集，此时采集与样品反应前的传感器阵列的图像并保存至智能手机的储存设备中。点击“反应后图像采集”，相机在与上一次拍摄相同的参数下采集与样品反 应后的传感器阵列的图像并保存至智能手的储存设备中，如图4所示。“图像预处理与 差值图像获取”，此功能是执行图像预处理、分割气敏材料图像并提取特性信息计算出 可视化的差值图像。点击“保存数据”或“历史数据记录”可分别实现数据保存和查看历史 数据的功能。

4.点击“数据处理与分析”，将转到如图5(c)所示的界面，在打开的界面中再点击“数 据预处理”，智能手机将在该界面中显示实施例2步骤5中PCA预处理后的三维分布图，并把预处理后的数据上传到云端服务器，由云端服务器对数据进行下一步分析。点击“模型分析预测”将调用云服务器已建立好的数据模型(如LDA、KNN、BPNN、SVM等)进 行处理，并输出模型识别率至手机界面中。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明， 它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或 变更均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种监测腐败菌繁殖的传感器制备方法，其特征在于，利用毛细管点样法将气敏材料固定在传感器载体上，制成3×3的可视化传感器阵列；所述气敏材料为对优势腐败菌代谢产生有机酸、胺和含硫化合物具有灵敏响应的气敏材料，包含6种卟啉或金属卟啉和3种pH指示剂；

所述6种卟啉或者金属卟啉，具体为四苯基卟啉、四苯基氯化铁、四苯基氯化锰、四苯基卟吩锌、四苯基卟吩铜、四苯基卟吩钴；所述卟啉使用氯苯或者乙醇溶解，使用的浓度为0.01mol/L-0.09mol/L；所述3种pH指示剂，分别为甲基红、中性红、百里酚酞；所述pH指示剂使用氯仿溶解，使用的浓度为0.01mol/L-0.2mol/L；

所述传感器载体为C2反相硅胶板或疏水滤纸。

2.根据权利要求1所述的一种监测腐败菌繁殖的传感器制备方法，其特征在于，所述毛细管点样法，采用100mm×0.3mm或100mm×0.5mm型号的毛细管，每次点样气敏材料溶液的用量为0.01μL-0.09μL。

3.根据权利要求1所述的一种监测腐败菌繁殖的传感器制备方法，其特征在于，所述传感器载体的尺寸为5cm×5cm至7cm×7cm的正方形。

4.根据权利要求1所述的一种监测腐败菌繁殖的传感器制备方法，其特征在于，所述腐败菌为乳杆菌、肠杆菌、耶尔森菌和嗜冷杆菌。

5.一种利用如权利要求1-4任一项所述制备方法得到的传感器快速检测腐败菌的方法，其特征在于，利用智能手机采集传感器阵列图像，并进行提取处理响应信号，结合模式识别区分优势腐败菌，包括：

步骤S1:设置图像采集参数；先将智能手机固定在有稳定照明光源的拍摄位置，设置测光方式、感光度、曝光时间和白平衡的相机参数；

步骤S2:采集传感器阵列图像；在相同的位置和参数条件下，先采集传感器阵列反应前的图像，再将传感器阵列与样品进行反应，每隔a天后采集传感器阵列图像用于后期处理和分析；

步骤S3:图像预处理；为了得到可视化传感器阵列中气敏材料的位置，先对图像尺寸作等比例缩放，并转化为灰度值为32的灰度值图像；利用中值滤波的5×5模板对灰度值图像进行去除噪声，用于增强图像效果利于后期处理；再通过Sober算子检测图像的边缘，得到指示信息图像的边缘，接着借助轮廓提取算法检测出气敏材料的轮廓；最后用自适应阈值选取法分割出气敏材料的图形位置；

步骤S4:提取传感器阵列的特征信号；提取气敏材料上每个像素点的R、G、B平均值和ΔL、Δa、Δb、ΔE，传感器与样品反应后的R、G、B均值与反应前均值相减并取绝对值得到ΔR、ΔG、ΔB，将ΔR、ΔG、ΔB、ΔL、Δa、Δb和ΔE作为传感器的特征信号X；

步骤S5:模式识别区分腐败菌；获得到的特征信号X内部的向量之间存在信息冗余，为提高模型的预测性能，借助主成分分析PCA对特征信息X进行预处理，用预处理后的数据建立线性判别LDA、K最近邻算法KNN、人工神经网络BPNN和支持向量机模型SVM预测优势腐败菌的类别。

6.根据权利要求5所述的快速检测腐败菌的方法，其特征在于，步骤S3中等比例缩放，是指将图片压缩至400-700像素大小。

7.根据权利要求5所述的快速检测腐败菌的方法，其特征在于，所述快速检测腐败菌的方法还包括样品制备方法：将每个待测食品进行表面灭菌，经培养计数，每个待测食品样本的细菌总数均小于10CFU/g，将灭菌后的100份待测食品，分为5组，每组20份，取其中4组分别放置在乳杆菌，肠杆菌，耶尔森菌和嗜冷杆菌菌液中浸泡15s后沥干，剩余1组样本作为对照组，所有样本用真空包装袋包装后置于4℃冷藏保存；每隔5d取每组样本进行腐败菌总数检测、挥发性成分检测、嗅觉可视化检测。

8.根据权利要求5所述的快速检测腐败菌的方法，其特征在于，所述快速检测腐败菌的方法采用基于智能手机安装的APP实现。

9.根据权利要求8所述的快速检测腐败菌的方法，其特征在于，基于智能手机安装的APP实现快速检测腐败菌的具体方法如下：

第1步，打开APP，点击“扫描设置”按钮，完成手机相机相关参数如：测光方式、感光度、曝光时间为和白平衡的参数设置；

第2步，点击“模型选择”，加载已建立好的模型，用于步骤S5中的模式识别区分优势腐败菌定性判别，同时，在服务器端可以建立新的识别模型或优化已有模型，该新的模型或优化的模型能够被重新加载；

第3步，点击“图像采集”，在该界面实现“反应前图像采集”、“反应后图像采集”、“图像处理与数据获取”、“保存数据”和“历史数据记录”功能；

点击“反应前图像采集，此时采集与样品反应前的传感器阵列的图像并保存至智能手机的储存设备中；

点击“反应后图像采集”，相机在与上一次拍摄相同的参数下采集与样品反应后的传感器阵列的图像并保存至智能手的储存设备中；

点击“图像预处理与数据获取”，执行图像预处理、分割气敏材料图像并提取特性信息计算出可视化的差值图像；

点击“保存数据”或“历史数据记录”可分别实现数据保存和查看历史数据的功能；

第4步，点击“数据处理与分析”，在打开的界面中再点击“数据预处理”，智能手机将在该界面中显示步骤S5中PCA预处理后的三维分布图，并把预处理后的数据上传到云端服务器，由云端服务器对数据进行下一步分析；点击“模型分析预测”将调用云服务器已建立好的数据模型进行处理，并输出模型识别率至手机界面中。