CN113405992B

CN113405992B - 络合比色阵列微流控纸芯片结合智能手机检测重金属离子的方法

Info

Publication number: CN113405992B
Application number: CN202110691303.2A
Authority: CN
Inventors: 沈晓芳; 于丽洪; 庞月红
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-06-22
Filing date: 2021-06-22
Publication date: 2022-11-22
Anticipated expiration: 2041-06-22
Also published as: CN113405992A

Abstract

本发明公开了络合比色阵列微流控纸芯片结合智能手机检测重金属离子的方法，属于分析检测技术领域。本发明筛选了合适的络合试剂(TMK、PAR、BCP、CDI、XO、DPC)组成阵列，并将络合阵列包埋于纸基微流控芯片中，构建了微流控纸芯片检测Hg²⁺、Cd²⁺、Pb²⁺和Cu²⁺这四种重金属离子，然后利用普通智能手机拍照结合RGB(红绿蓝)标准化颜色系统，实现信号的采集和数据分析，利用LDA对重金属离子的标准溶液(训练集)建立数据库和模型，并对实际水样中阵列对于重金属离子的区分能力来与数据库和模型进行比对，可以实现离线式快速判别重金属离子的存在与否。

Description

络合比色阵列微流控纸芯片结合智能手机检测重金属离子的方法

技术领域

本发明涉及络合比色阵列微流控纸芯片结合智能手机检测重金属离子的方法，属于分析检测技术领域。

背景技术

20世纪50年代，日本由于Hg²⁺和Cd²⁺污染引起的水俣病和骨痛病等事件的发生，重金属污染被越来越多的关注。同时50年代后由于环境问题，环境学这门新的学科逐渐诞生和发展，无论是国外的环境保护生态学还是国内的污染生态学，重金属研究都是作为环境生态的污染物研究的首位。重金属在各生态体系中的存在对生物体产生严重的影响，并且其难降解和随着食物链富集的特点极具危险性。因此，重金属的研究对环境生态及生物体的健康都十分重要。

目前重金属检测方法主要可以分为传统检测和快速检测两大类，其中借助精密仪器检测可以准确得知样品中的重金属含量，具有灵敏性好、准确度高等优点，十分适合于痕量检测，但同时也需要昂贵的仪器、复杂的前处理和专业的技术人员。快速检测方法是近年来备受关注，它们可以实现对重金属离子的快速现场检测，具有快速、操作简单和样品前处理不复杂等优点，但是无法达到精密仪器检测的灵敏和准确，大多时候只能实现定性半定量。

随着我国经济和发展和工业化水平的提高，尤其在不发达地区，大量工厂废水直接或检测排放进入环境水中，而这些地区不具备实验室检测的条件。近年来我国也爆发过多起重金属污染事件，例如湖南大埔县的儿童血铅超标事件，镉大米事件和日照等地土壤污染事件等。由此可见我国重金属污染形势依然需要预防和整治，所以对重金属离子污染情况进行快速监测是十分必要的，因此建立快速现场检测重金属离子的方法是十分必要的。

阵列检测与传统的检测方法最主要的区别就是，阵列利用多种传感元件与多种分析物同时相互作用，来识别复杂混合物的整体变化，而不是识别其中的特定元素。因此对于复杂分析物中的识别尤为强大。另外由于统计学和化学计量学在化学分析方面的发展，以及对于许多复杂的传感无法用传统的方法解决的认知，基于阵列的丰富数据输出的传感器正在被分析界广泛接受和使用。尤其是比色阵列中，传感器涉及分析物与染料的相互识别，并产生裸眼可见的颜色变化，方法快捷简便，信号获取直观。在我们前期研究中发现络合比色阵列能够同时区分多种重金属离子(申请号202011387904.6)，然而检测依赖于相关专业仪器和实验室条件，无法实现便携化现场检测。

而纸基微流控近十年来发展迅速，尤其是在生命科学领域的运用。微流控纸基检测平台可以实现低成本、便携、简单的分析检测、集富集分离和检测于一体的纸上实验室。在滤纸上构建微流控主要是区分亲疏水通道，将不同的疏水性材料固化在纸上。借助纸基检测有几个显著优势：1)不需要外部动力就可以实现一定距离的液体自输送；2)滤纸由纤维素构成，纤维素含量多且致密，可贮存微量的物质；3)成本低，且易运输和保存。将纸基结合微流控对于比色阵列的呈现是十分有利的。因此将络合阵列与纸基微流控相结合，以探索实现重金属离子的现场化检测的可能性。

发明内容

为了实现上述目的，本发明筛选了合适的络合试剂组成阵列，并将络合阵列包埋于纸基微流控芯片中，构建了微流控纸芯片检测Hg²⁺、Cd²⁺、Pb²⁺和Cu²⁺这四种重金属离子，然后利用普通智能手机拍照结合RGB(红绿蓝)标准化颜色系统，实现信号的采集和数据分析，利用LDA对重金属离子的标准溶液(训练集)建立数据库和模型，并对实际水样中阵列对于重金属离子的区分能力来与数据库和模型进行比对，可以实现离线式快速判别重金属离子的存在与否。

本发明的第一个目的是提供一种络合比色阵列微流控纸芯片结合智能手机检测重金属离子的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)制备纸芯片设备：纸芯片上包含中心加样区、与中心加样区分别相通的六条通路、与六条通路相通的废液区，所述通路用于包埋络合试剂，其中，所述中心加样区、六条通路和废液区为亲水性质的通道，纸芯片其余区域为疏水性质的通道；

(2)获取已知类型金属离子的线性判别分析(LDA)图谱：分别取六种络合试剂溶液滴加在步骤(1)得到的纸芯片上的通路区域，待其扩散充满六个通路后干燥备用，分别将不同浓度的含有重金属离子的溶液滴加至中心加样区与步骤(1)得到的纸芯片上的络合剂阵列反应，发生显色反应，对反应前后的显色照片的RGB值数据进行收集，然后对收集到的图谱数据进行分析获得的已知类型金属离子的LDA图谱；

(3)检测待测水样中的重金属离子：分别取六种络合试剂溶液滴加在步骤(1)得到的纸芯片上的通路处，待其扩散充满六个通路后干燥备用，将过滤后待测水样滴加至中心加样区，静置使得其与步骤(1)得到的纸芯片上的络合剂阵列反应，利用智能手机对反应前后纸芯片拍照，利用软件对照片取色以获取RGB值，将RGB值进行LDA分析并与步骤(2)得到的已知类型金属离子的LDA图谱进行比对，即可判断待测水样中是否包含重金属离子。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，所述纸芯片所用纸材料包括滤纸、硝酸纤维素膜、聚二甲基硅氧烷(PDMS)等，优选为Whatman滤纸。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，所述亲水性质的通路用于保证液体的流动，所述疏水性质的通路可利用疏水性的蜡来实现疏水性，目的是阻断液体流向，控制流向。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，所述络合试剂包括六种，分别为硫代米氏酮(TMK)溶液、4-(2-吡啶偶氮)-1,3-苯二酚(PAR)溶液、浴铜灵(BCP)溶液、镉试剂(CDI)碱性溶液、二甲酚橙(XO)溶液、二苯碳酰二肼(DPC)溶液。

在本发明的一种实施方式中，所述硫代米氏酮(TMK)溶液的浓度为1～5mmol/L，优选为4mmol/L，溶剂为95％的乙醇水。

在本发明的一种实施方式中，所述4-(2-吡啶偶氮)-1,3-苯二酚(PAR)溶液的浓度为1～5mmol/L，优选为4mmol/L，溶剂为95％的乙醇水。

在本发明的一种实施方式中，所述浴铜灵(BCP)溶液的浓度为1～5mmol/L，优选为4mmol/L，溶剂为95％的乙醇水。

在本发明的一种实施方式中，所述镉试剂(CDI)碱性溶液的浓度为1～5mmol/L，优选为2mmol/L，溶剂为0.2mol/L氢氧化钾-乙醇。

在本发明的一种实施方式中，所述二甲酚橙(XO)溶液的浓度为1～5mmol/L，优选为3mmol/L，溶剂为水。

在本发明的一种实施方式中，所述二苯碳酰二肼(DPC)溶液的浓度为1～20mmol/L，优选为15mmol/L，溶剂为水。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，所述制备纸芯片设备可以通过以下方式实现：首先将蜂蜡加热融化成液体，将一张滤纸充分浸入其中数秒，取出后晾干备用，将浸泡过蜡的滤纸与空白滤纸叠放，然后将高温的具有与纸芯片相应图案的金属模块加热至150℃，快速按压两张滤纸数秒后移开，分开两张滤纸，可以在下层滤纸上得到相应的亲疏水性质的通路。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，所述重金属离子包括Pb²⁺，Cd²⁺，Hg²⁺和Cu²⁺的一种或几种，不同浓度的含有重金属离子的溶液的浓度可以为2，10，20，50，100，500μmol/L。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，所述取色用的软件可以为Photoshop软件；所述获取RGB值优选获取反应区域中央5×5像素点的RGB值；用于LDA分析的软件为IBMSPSS Statistics 22。

本发明还提供了一种检测水样中重金属离子的装置，所述装置包括纸芯片和六种络合试剂，其中，所述纸芯片上包含中心加样区、与中心加样区分别相通的六条通路、与六条通路相通的废液区，所述通路用于包埋络合试剂，其中，所述中心加样区、六条通路和废液区为亲水性质的通道，纸芯片其余区域为疏水性质的通道；所述六种络合试剂分别为硫代米氏酮(TMK)溶液、4-(2-吡啶偶氮)-1,3-苯二酚(PAR)溶液、浴铜灵(BCP)溶液、镉试剂(CDI)碱性溶液、二甲酚橙(XO)溶液、二苯碳酰二肼(DPC)溶液，所述六种络合试剂分别扩充至六个通路中。

本发明还提供了上述水样检测装置在检测土壤、废水、湖水和自来水中重金属离子方面的应用。

本发明相对于现有技术，具有以下的优点和效果：

本发明构建了基于络合比色阵列的微流控纸芯片，结合智能手机拍照，应用于识别水样中的四种单一重金属离子，准确率达到100％，检测限为2μmol/L。同时实现了四种重金属离子多元混合物的区分传感，具有较好的抗干扰性。基于此，进一步传感实际水样发现成功识别湖水和自来水中的Cd2+，Cu2+，Hg2+和Pb2+，对实现重金属离子的现场检测具有重要意义。该方法极大降低了操作难度，利用手机即可完成信号采集，脱离了实验室环境限制，有望实现现场检测。另外阵列试剂和样品试剂量均在微升级别，有效降低了成本和相关污染。

附图说明

图1微流控纸基检测流程示意图。

图2金属模块设计(A)三视图和(B)3D示意图。

图3微流控纸芯片设备制造示意图。

图4(A)不同浓度CDI 20μmol/LCd²⁺反应后欧氏距离；(B)不同浓度DPC与50μmol/LHg²⁺反应后欧氏距离(内插图为络合试剂及与离子反应后照片)。

图5(A)不同浓度TMK与50μmol/LHg²⁺反应后欧氏距离；(B)不同浓度PAR与50μmol/LCu²⁺和50μmol/LPb²⁺反应后欧氏距离(内插图为络合试剂及与离子反应后照片)。

图6不同浓度(A)XO与50μmol/LPb²⁺及(B)BCP与50μmol/LCu²⁺反应后欧氏距离(内插图为络合试剂及与离子反应后照片)。

图7(A)纸基阵列示意图，(B)微流控纸基阵列与500μmol/LCd²⁺，Cu²⁺，Hg²⁺，Pb²⁺反应后照片。

图8 2～500μmol/L浓度范围的重金属离子与阵列反应后LDA分析图。

图9纸基络合阵列对不同浓度多金属离子混合物响应的LDA图。

图10纸基络合阵列与水中可能存在的13种离子在500μmol/L反应的照片。

图11基于LDA纸基阵列与四种浓度(A)1.5μmol/L，(B)2μmol/L，(C)2.5μmol/L，(D)5μmol/L重金属离子反应识别图。

图12湖水和自来水中分别存在1μmol/L四种重金属离子时LDA分析图。

图13(A)络合阵列与200μmol/LCd²⁺，Cu²⁺，Hg²⁺，Pb²⁺反应后照片，其中1-6分别为CDI,DPC,TMK,VBB,XO,BCP六种络合试剂检测溶液；(B)本发明的络合阵列与200μmol/LCd²⁺，Cu²⁺，Hg²⁺，Pb²⁺反应后照片。

图14对比例1中六种络合试剂检测单一重金属离子的LDA图

图15其他络合试剂(A)双硫腙和(B)铬黑T与200μmol/LCd²⁺，Cu²⁺，Hg²⁺，Pb²⁺反应后照片。

具体实施方式

白蜂蜡，粉状蜡用色素，Whatman滤纸Grade 1。

配制浓度为10mmol/L的金属离子储备液，溶剂为乙醇水(1：1)，分别是硝酸镉、硝酸铅、硝酸铜、氯化汞四种溶液。

图1为本发明微流控纸基检测流程示意图，下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1制备纸芯片设备

(1)纸芯片设备的设计：络合阵列由六种试剂组成，因此除了中心的加样区，需设计六通路包埋络合试剂，同时在通路终端设置废液区，以承接过多未被络合的样液。加样区、通道及废液区为亲水性质，可以保证液体的流动，其余区域覆盖疏水性的蜡以阻断液体流向，控制流向。

(2)冲压金属模块的设计：在疏水性、蜡覆盖的区域，采用冲压的方法得到，即将高温的具有相应图案的金属模块冲压一张蜡纸，蜡因高温熔化后印至下层空白滤纸上，从而得到具有相应通道的微流控纸芯片。因此需要设计具有相应通道图案的金属模块，金属模块底部凹陷部分为亲水区域，凸起部分为蜡覆盖的区域，在冲压时可以将蜡融化压至下方滤纸上，另外增加把手以方便拿取，由于图案特殊，3D打印制得该金属模块，设计图如图2所示。

(3)纸芯片的制造：首先将蜂蜡加热融化成液体，将一张滤纸充分浸入其中数秒，镊子夹出后晾干备用。将浸泡过蜡的滤纸与空白滤纸叠放，然后将金属模块加热至150℃左右，快速按压两张滤纸数秒后移开，分开两张滤纸，可以在下层滤纸上得到相应的亲疏水通道(图3)。

实施例2纸基络合阵列试剂浓度的选择

为了保证纸基络合阵列在可调范围内具有显著的颜色变化以有利于进一步分析显色效果，本实施例对纸基络合阵列的显色条件进行了优化。

选取欧氏距离作为本实施例条件优化的主要指标(欧氏距离，又称为欧几里得距离，为距离定义，指的是m维空间中两个点的真实距离)。本实验中的欧氏距离是指以RGB色彩模式为三维空间，反应前后的不同颜色可以看作是三维空间中两个不同的点，而欧氏距离则反映了这两个点之间的真实距离，距离越大，颜色差别越大，对应的反应进行的越充分，而相应的肉眼观察效果越好。

纸基阵列与重金属离子反应显色，其中最重要的影响因素是组成阵列的六种试剂的浓度，由于络合试剂本身带有颜色，若浓度过高，即使反应充分进行也可能导致反应后的复合物颜色被掩盖无法识别的情况，然而浓度过低，可能导致复合物颜色过浅不利于阵列对于低浓度重金属离子的检测，因此，选择合适组成阵列的实际浓度对重金属离子的区分检测至关重要。

(1)CDI试剂纸上显色浓度优化：由于Cd²⁺与CDI反应最为显著，因此，以20μmol/LCd²⁺与其反应对CDI试剂浓度进行优化。

将不同浓度的CDI溶液(1，2，3，4，5mmol/L，溶剂为0.2mol/L氢氧化钾-乙醇)分别取20μL滴加在Whatman Grade 1滤纸上，静置待其扩散完全且溶剂挥发后，在纸上形成数个颜色较为均匀的圆环，然后在络合物扩散形成的圆环中央滴加10μL浓度为50μmol/L的Cd²⁺离子溶液，静置五分钟后拍照，计算反应前后欧氏距离。如图4A所示，随着CDI浓度的增加，欧氏距离值逐渐减小，而视觉上其反应后呈现的颜色却越来越深。这是由于CDI与离子溶液反应时，纸上颜色先变为浅黄色数秒后开始变为复合物的粉紫色，由于新形成的颜色越来越深，而CDI本身颜色较深，所以会出现随着试剂浓度增加欧氏距离越来越小的情况，结合肉眼所见的颜色变化，最终选择2mmol/L作为CDI试剂的最佳浓度。

(2)DPC试剂纸上显色浓度优化

配制1，5，10，15，20mmol/L不同浓度的DPC溶液(溶剂为水)按上面所述方法与50μmol/LHg²⁺反应，待五分钟后二者反应完全颜色稳定，计算反应前后的欧氏距离。DPC滴于Whatman滤纸上呈现出浅粉色，与高浓度Hg²⁺反应后呈现紫色，由于本实验中所用重金属离子浓度较低，所以DPC与离子结合后呈现不太明显的浅紫色，如图4B所示，随着DPC浓度的增加，反应前后的欧氏距离值逐渐增加，颜色差别也越来越大，当DPC浓度达到15mmol/L时，数值稳定不再增加，因此选择15mmol/L作为DPC的最佳浓度进行后续的检测。

(1)TMK试剂纸上显色浓度优化

配制1，2，3，4，5mmol/L不同浓度的TMK溶液(溶剂为95％的乙醇水)，按照上面所述方法滴于纸上，后滴加50μmol/LHg²⁺与其反应，计算反应前后两点的欧氏距离。如图5A所示，随着TMK浓度的增加，其反应前后欧氏距离逐渐增加，3mmol/L后增加幅度趋于平缓，颜色逐渐稳定，因此最种选择4mmol/L作为TMK最终浓度，进行后续的检测。

(4)PAR试剂纸上显色浓度优化

由于PAR对Cu²⁺，Pb²⁺两种离子反应均较明显，所以选择这两种离子对PAR浓度优化。配制1，2，3，4，5mmol/L不同浓度的PAR溶液(溶剂为95％的乙醇水)，按照上面所述方法将其滴于纸上，后分别滴加50μmol/LCu²⁺和50μmol/LPb²⁺与阵列反应，计算反应前后两点的欧氏距离。如图5B所示，PAR在浓度为4mmol/L时，与两种离子反应前后的欧氏距离均达到最大值，说明其在此浓度下的反应前后颜色差距最大，更有利于观察和后续的分析，故选择浓度为4mmol/L。当浓度超过4mmol/L时，欧氏距离反而呈现下降趋势，原因是较高浓度的RAR试剂本身具有较深的颜色，从而导致反应前后颜色差别不够明显和欧氏距离值变小的情况。

(5)XO试剂纸上显色浓度优化

配制1，2，3，4，5mmol/L不同浓度的XO溶液(溶剂为水)，按照上面所述方法将其滴于纸上，后分别滴加50μmol/LPb²⁺与阵列反应，计算反应前后两点的欧氏距离。从图6A可以看出，XO随着浓度的增加欧氏距离呈现曲折上升的趋势，而当其浓度为3mmol/L时欧氏距离值较大而且颜色差别比较明显，与更高浓度表现相当，因此选择3mmol/L为XO最佳浓度实现重金属离子的显色。

(6)BCP试剂纸上显色浓度优化

配制1，2，3，4，5mmol/L不同浓度的BCP溶液(溶剂为95％的乙醇水)，按照上面所述方法将其滴于纸上，后分别滴加50μmol/LCu²⁺与阵列反应，计算反应前后两点的欧氏距离。由于BCP本身无色，而反应后的络合物颜色也较浅，所以欧氏距离整体呈现比较平缓的趋势，而在其浓度达到4mmol/L时，欧氏距离出现峰值，因此选择4mmol/L作为BCP的最佳浓度(图6B)。

实施例3获取已知类型金属离子的LDA图谱

将实施例2确定浓度的六种络合试剂滴于纸基充分干燥后所得的检测阵列如图7A所示，自正上方顺时针旋转依次为CDI，DPC，TMK，PAR，XO和BCP，此时纸上呈现的颜色即络合试剂干燥后本身的颜色。将空白试剂和500μmol/L Cd²⁺，Cu²⁺，Hg²⁺，Pb²⁺四种离子溶液分别与纸芯片反应，结果示意图如图7B所示。可以发现，每种离子都可以与阵列多种试剂发生反应产生肉眼可见的颜色变化，而且每种离子与阵列发生反应的试剂及颜色都不相同，具有特征图谱，这为利用阵列图谱指征检测多种重金属离子提供了可能。

采集反应前后的颜色，以RGB色彩模式对其进行具体的数值化表示。统计不同离子的多个浓度与纸芯片反应后的颜色RGB值，将整个阵列六种试剂的RGB值分别标记为R1，G1，B1；R2，G2，B2；……，R6，G6，B6；对应整个阵列的六个维度的RGB值，共同构成一个样品对应的指纹图谱，通过由小到大多个浓度的不同离子的反应以保证所采集的数据足够充分，每组实验多个平行以保证反应数据的准确性。将采集得到的数据进行LDA分析，即可获得的已知类型金属离子的LDA图谱。

获得的LDA图谱如图8所示，可以发现经LDA降维聚类后，不同浓度的各种离子分为不重叠的四个区域，分别代表Cd²⁺，Cu²⁺，Hg²⁺，Pb²⁺四种离子，这也说明本发明制备得到的纸基络合阵列不仅可以对单种重金属离子进行检测，也可以有效实现对多种重金属离子的区分检测。

实施例4利用纸基络合阵列检测单一重金属离子

分别取0.4μL六种络合试剂溶液滴加在六个通路处，待其扩散充满通路后干燥备用。随机分别将2，10，20，50，100，500μmol/L的Pb²⁺，Cd²⁺，Hg²⁺和Cu²⁺与纸基检测阵列反应。利用智能手机对反应前后纸芯片拍照，利用Adobe Photoshop CC 2015.5对照片取色，取反应区域中央5×5像素点RGB值。数据输入软件IBM SPSS Statistics 22进行LDA分析，观察该数据模型下四种离子反应图谱，分析纸基检测阵列对于多种重金属离子的区分检测的可行性。如图8所示，四种离子区分效果良好。进一步利用未知样品对模型进行验证，结果见表1，可见，对于单一重金属金属离子，本发明方法预测未知样品准确率为100％。

表1 LDA模型检测未知样品的预测情况

实施例5利用纸基络合阵列检测多种重金属离子

当两种或以上的重金属离子同时存在于溶液中时，以其浓度相等为代表，本实施例验证本发明的纸基络合阵列对多重离子存在的情况进行区分检测的准确率。

配制各离子浓度均为100μmol/L的混合离子溶液，共包括Cd²⁺和Cu²⁺，Cd²⁺和Hg²⁺，Hg²⁺和Cu²⁺，Cd²⁺和Pb²⁺，Pb²⁺和Cu²⁺，Pb²⁺和Hg²⁺，Cd²⁺、Hg²⁺和Cu²⁺，Cu²⁺、Cd²⁺和Pb²⁺，Cd²⁺、Pb²⁺和Hg²⁺，Pb²⁺、Cd²⁺、Hg²⁺和Cu²⁺十种离子混合模式，每种离子溶液取20μL滴加在提前制备好的纸基微流控中央加样区域，置于水平面待其扩散完全，五分钟后手机拍照，每种类离子混合溶液三个平行。

十种可能的离子混合情况的反应数据经LDA处理后，结果如图9所示，可见，较为清晰的被划分为十个区域，证明纸基络合阵列溶液中不同离子混合情况有不同的反应图谱，而且在LDA分析中可以清晰的将其划分为不同区，说明本发明方法可以实现对离子的混合液的区分检测。

同样对LDA模型准确性进行验证，结果见表2，可见准确率可以达到93.3％，证明本发明方法对于混合离子同样有良好的区分效果。

表2混合离子LDA模型检测未知样品的预测情况

注：标*处为预测错误样本

实施例6本发明的纸基络合阵列的抗干扰能力测试

选择Na⁺，Cl^-，K⁺，SO₄ ^2-，NO₂ ^-，Fe³⁺，Zn²⁺，Mg²⁺，Ca²⁺等多种环境水样中常见的金属离子及非金属离子，分别配制500μmol/L的干扰离子溶液，分别取20μL干扰离子溶液滴加在提前制备好的纸基微流控中央加样区域，置于水平面待其扩散完全，五分钟后手机拍照，每种类离子混合溶液三个平行。

将反应数据经LDA处理后，结果如图10所示，可以看出，在干扰离子的浓度高至500μmol/L的情况下，阵列对这些离子几乎没有响应，只有Zn²⁺对阵列中的XO产生一定的颜色反应，但是影响较小。说明本发明的纸基络合阵列的抗干扰能力较强、选择性高。

实施例7本发明的纸基络合阵列与其他检测方法的比较

为了测试所构建的纸基络合检测阵列对于重金属离子的检测限量，进一步对重金属离子在不同浓度下与纸基阵列的反应情况进行分析，如图11所示，为重金属离子在1.5，2，2.5，5μmol/L四种不同浓度下的区分情况，可以看出，当浓度为1.5μmol/L时，其中的两种离子Cu2+和Hg2+所聚集区域出现一定的重叠，而当四种重金属离子浓度高于2μmol/L时，相同离子聚集在同一区域内，与其他离子可以完全区分，彼此之间没有重叠，得到充分的识别。表明该纸基检测阵列可以对浓度不低于2μmol/L的四种重金属离子实现区分检测。

另外由于此实验在低浓度的重金属离子存在的情况下进行，因此增加了对照组以防止出现浓度过低颜色不明显，无法与空白区分开来的情况。从图11A可以看出即使所有重金属浓度低至1.5μmol/L时，也与空白组有非常明显的区别。

将本发明纸基络合阵列的检测限与其他同类方法对比，结果如表3所示，可以发现与纸基吡啶阵列相比，本方法检出限仅为其检测限的1/25，与LDHs试纸条和纸基AuNPs阵列方法相比灵敏度基本相当，却无需材料的合成修饰以及复杂方法的构建。因此，本方法与同类方法相比，灵敏度相对较高且方法更为简单。

表3本方法与其他方法灵敏度和特异性对比

LDHs：Anion-intercalated layered double hydroxides，阴离子夹层双氢氧化物。

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实施例8本发明的纸基络合阵列对实际样品的检测

取校园(江南大学)内协同创新大楼自来水和小蠡湖湖水，将两种水样过0.22μm滤膜后得到实际样品待测液，置于4℃冰箱中冷藏备用。取两种水样后加标2μmol/L的重金属离子，将其分别滴加在已准备好的纸基络合阵列检测设备上，同样等待5min后手机拍照。数据经LDA处理如图12所示，其中实际样品水样与对照组表现出明显的不同，这可能是由于实际水样中本身存在一些其他的金属离子和阴离子等。水样中存在的诸多种类离子且重金属离子通常是痕量存在，因此在这种情况下实现对实际水样中的多种重金属离子的快速方便检测是有难度的。而本实验利用多维传感的比色纸基便携检测设备，能有效区分实际水样中存在的多种目标重金属离子，无论是基质较为简单的自来水样还是略复杂的环境湖水。证明纸基微流控络合阵列在实际检测应用中具有极大的潜力。

对比例

对比例1：

配制30μM镉试剂与2％的TritonX-100混合溶液，0.5mM DPC溶液，50μMTMK溶液、100mM KI、0.8mM抗坏血酸和70μMVBB混合溶液，50μM XO和5mM邻菲罗啉混合溶液，0.5mMBCP混合60mM的盐酸羟胺溶液这六种溶液，滴于本发明的微流控纸芯片上，干燥后，滴加200μmol/LPb²⁺,Cd²⁺,Hg²⁺和Cu²⁺混合离子溶液，5min后颜色稳定，手机拍照取色。

反应前后照片如图13(A)所示，1-6分别为CDI,DPC,TMK,VBB,XO,BCP六种络合试剂检测溶液，显色效果显然不如本发明中调整优化后的络合阵列(图13B)。

按照实施例4的方式利用本对比例制备得到的纸基络合阵列检测单一重金属离子，如图14结果发现不能对四种重金属离子实现准确的区分检测，无法建立可以实现准确区分四种单一重金属离子的检测模型。

对比例2：双硫腙体系

配制1mM双硫腙溶液，滴加在纸芯片六个通路处，加样区滴加200μmol/LPb²⁺,Cd²⁺,Hg²⁺和Cu²⁺混合离子溶液，5min后颜色稳定，手机拍照取色。如图15所示，发现无明显颜色变化。

对比例3：铬黑T体系

配制1mM铬黑T溶液，滴加在纸芯片六个通路处，加样区滴加200μmol/LPb²⁺,Cd²⁺,Hg²⁺和Cu²⁺混合离子溶液，5min后颜色稳定，手机拍照取色。如图15所示，发现无明显颜色变化。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种络合比色阵列微流控纸芯片结合智能手机检测重金属离子的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)制备纸芯片设备：纸芯片上包含中心加样区、与中心加样区分别相通的六条通路、与六条通路相通的废液区；所述通路用于包埋络合试剂，其中，所述中心加样区、六条通路和废液区为亲水性质的通道，纸芯片的其余区域为疏水性质的通道；

(2)获取已知类型金属离子的线性判别分析(LDA)图谱：分别取六种络合试剂溶液滴加在步骤(1)得到的纸芯片上的通路区域，待其扩散充满六个通路后干燥备用，其中所述六种络合试剂分别为硫代米氏酮溶液、4-(2-吡啶偶氮)-1,3-苯二酚溶液、浴铜灵溶液、镉试剂碱性溶液、二甲酚橙溶液、二苯碳酰二肼溶液，所述硫代米氏酮溶液的浓度为4mmol/L，溶剂为95％的乙醇水；所述4-(2-吡啶偶氮)-1,3-苯二酚溶液的浓度为4mmol/L，溶剂为95％的乙醇水；所述浴铜灵溶液的浓度为4mmol/L，溶剂为95％的乙醇水；所述镉试剂碱性溶液的浓度为2mmol/L，溶剂为0.2mol/L氢氧化钾-乙醇；所述二甲酚橙溶液的浓度为3mmol/L，溶剂为水；所述二苯碳酰二肼溶液的浓度为15mmol/L，溶剂为水；分别将不同浓度的Cd²⁺，Cu² ⁺，Hg²⁺，Pb²⁺四种重金属离子的溶液滴加至中心加样区与步骤(1)得到的纸芯片上的络合剂阵列反应，发生显色反应，对反应前后的显色照片的RGB值数据进行收集，然后对收集到的图谱数据进行分析获得的已知类型金属离子的LDA图谱；

(3)检测待测水样中的重金属离子：分别取六种络合试剂溶液滴加在步骤(1)得到的纸芯片上的通路处，待其扩散充满六个通路后干燥备用，将过滤后待测水样滴加至中心加样区，静置使得其与步骤(1)得到的纸芯片上的络合剂阵列反应，利用智能手机对反应前后纸芯片拍照，利用软件对照片取色以获取RGB值，将RGB值进行LDA分析并与步骤(2)得到的已知类型金属离子的LDA图谱进行比对，即可判断待测水样中是否包含Pb²⁺，Cd²⁺，Hg²⁺和Cu²⁺的一种或几种重金属离子以及有效实现对Pb²⁺，Cd²⁺，Hg²⁺和Cu²⁺的区分检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，取色用的软件为Photoshop软件，用于LDA分析的软件为IBM SPSS Statistics 22。

3.权利要求1～2任一项所述的方法在检测土壤、废水、湖水和自来水中Pb²⁺，Cd²⁺，Hg²⁺和Cu²⁺方面的应用。

4.一种检测水样中Pb²⁺，Cd²⁺，Hg²⁺和Cu²⁺的装置，其特征在于，所述装置包括纸芯片和六种络合试剂，其中，所述纸芯片上包含中心加样区、与中心加样区分别相通的六条通路、与六条通路相通的废液区，所述通路用于包埋络合试剂，其中，所述中心加样区、六条通路和废液区为亲水性质的通道，纸芯片其余区域为疏水性质的通道；所述六种络合试剂分别为硫代米氏酮溶液、4-(2-吡啶偶氮)-1,3-苯二酚溶液、浴铜灵溶液、镉试剂碱性溶液、二甲酚橙溶液、二苯碳酰二肼溶液，所述六种络合试剂分别扩充至六个通路中；所述硫代米氏酮溶液的浓度为4mmol/L，溶剂为95％的乙醇水；所述4-(2-吡啶偶氮)-1,3-苯二酚溶液的浓度为4mmol/L，溶剂为95％的乙醇水；所述浴铜灵溶液的浓度为4mmol/L，溶剂为95％的乙醇水；所述镉试剂碱性溶液的浓度为2mmol/L，溶剂为0.2mol/L氢氧化钾-乙醇；所述二甲酚橙溶液的浓度为3mmol/L，溶剂为水；所述二苯碳酰二肼溶液的浓度为15mmol/L，溶剂为水。

5.权利要求4所述的一种检测水样中Pb²⁺，Cd²⁺，Hg²⁺和Cu²⁺的装置在检测土壤、废水、湖水和自来水中Pb²⁺，Cd²⁺，Hg²⁺和Cu²⁺方面的应用。