CN108949848B - 一种利用海洋细菌发酵制备海绵酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及海洋微生物发酵领域，尤其涉及一种利用海洋细菌发酵制备腹泻性贝类毒素软海绵酸的方法。所述的方法包括以下步骤：（1）菌株活化；（2）种子液的准备；（3）发酵罐培养发酵；（4）发酵液的提取；（5）粗提物的纯化即得软海绵酸。与现有技术相比，本发明具有以下优点：（1）本发明采用海洋细菌发酵产生软海绵酸发酵周期短，仅为40~42小时，可节省能耗。（2）本发明采用海洋细菌发酵产生软海绵酸，产率较高，可达50~68μg/L。（3）本发明方法步骤简单、工作量小，周期较短，所用试剂与材料均为微生物发酵试验常用试剂，对人体无害，对环境友好，成本低，具有较高的市场前景与经济价值。
Description
技术领域
本发明涉及海洋微生物发酵领域，尤其涉及一种利用海洋细菌发酵制备腹泻性贝类毒素软海绵酸的方法。
背景技术
软海绵酸（Okadaic acid，OA）是腹泻性贝类毒素（diarrhetic shellfishpoisoning，DSP）导致腹泻的主要作用成分，属高毒性、脂溶性、热稳定聚醚类海洋生物毒素。OA是分布最广，发病率最高的海洋毒素之一。可对肠道、肝脏、神经、胎盘等多种器官与组织造成不可逆损伤，且中毒后无特效药救治。OA是细胞特异性蛋白磷酸酶PP1和PP2A强抑制剂，具有长期致畸性，是一种强肿瘤促进剂或原始致癌剂。其长期毒性效应对海洋生态环境、贝类水产品养殖及其出口贸易、人体生命健康构成严重威胁，是世界性研究热点。OA作为研究真核生物细胞调节极有价值的工具药物及引起DSP毒性的巨大威胁引起各国高度关注。目前，软海绵酸可通过涡鞭毛藻如利马原甲藻、蛎甲藻的规模培养及产物提取制备获得，但该方法不仅培养周期长、成本高，且需要特殊的藻培养设备。而与蛎甲藻相比，海洋细菌具有易培养、代谢调控相对简单等特性，因此，利用海洋细菌发酵产生及制备软海绵酸，是一种经济、高效的替代方法。
发明内容
本发明是为了克服现有技术中软海绵酸的获得方法中培养周期长、成本高，且需要特殊的藻培养设备的问题，提供了一种具有产量高、周期短、成本低的一种利用海洋细菌发酵制备海绵酸的方法。
本发明通过以下技术方案实现：
一种利用海洋细菌发酵制备海绵酸的方法，所述的海洋细菌为糖螺菌（Saccharospirillaceae sp.）LZ-5，收藏编号为CCTCC AB 2017232，购买自中国典型培养物保藏中心，所述的方法包括以下步骤：
（1）菌株活化：将糖螺菌（Saccharospirillaceae sp.）LZ-5接种于斜面培养基中，培养活化菌株；
（2）种子液的准备：挑取活化后的单菌落接种于种子罐中的液体种子培养基，扩培菌株待用；
（3）发酵罐培养发酵：将发酵培养基装入发酵罐中，将步骤（2）中的种子液接入发酵培养基中，发酵得到发酵液；
（4）发酵液的提取：将发酵液离心经板框过滤，获得菌体沉淀，用甲醇水溶液提取，合并提取液，旋蒸浓缩，得到粗提物；
（5）粗提物的纯化：将上述步骤得到的全部粗提物，经制备色谱洗脱，收集，旋转蒸发，获得白色粉末，即得软海绵酸。
本发明中的软海绵酸采用糖螺菌发酵法制备得到，其与现有技术相比，本发明的步骤较为简单，整体制备过程时间大大减少，有效的提高石房蛤毒素的制备效率与产量。因而能够有效的合成软海绵酸，为研究软海绵酸素的作用效果提供了有效的途径。
作为优选，所述的步骤（1）中的培养基配方如下：硫酸铵0.5~1.0g、蛋白胨0.2~0.8g、海藻酸钠0.3~0.8g、磷酸铁0.3~0.8g、琼脂2g，加天然海水至100ml，pH6.9~7.3。
本发明中的糖螺菌（Saccharospirillaceae sp.）LZ-5为海洋细菌，因此在培养过程中需加入一定量的天然海水，以促进其活性。
作为优选，所述的步骤（1）中培养温度为26~29℃，培养时间为1~3天。
作为优选，所述的步骤（2）中液体种子培养基配方如下：蛋白胨 5g，酵母膏 1.5g，磷酸二氢钾 0.05g，海水 1000 mL，pH 7.0~7.6。
作为优选，所述的步骤（2）中种子罐通气量55~70L/min，搅拌转速130~160转/min，28℃培养10~14小时，取培养物进行镜检，待种子液的OD600 达到0.6 ~0.8，光镜观察菌体生长良好，无杂菌污染时待用。
作为优选，所述的步骤（3）中发酵培养基的配方如下：蛋白胨 4.5g，酵母膏5.05g，葡萄糖 2.15g，硫酸铵 1.35g，磷酸二氢钾 0.25g，氯化钠 0.52g，氯化亚铁0.005g，脯氨酸 0.05g，海水1000 mL，pH 7.2~7.5。
作为优选，所述的步骤（3）中发酵培养基的装入量为发酵罐装液量体积百分比的35~50%，种子液按体积百分比2.5%~3.5% 的接种量接入发酵培养基中。
作为优选，所述的步骤（3）中发酵罐为平叶涡轮搅拌型发酵罐，发酵过程中保持罐压0.15~0.19MPa，搅拌速率为150-160 转/min，控制通气量90~135L/min，发酵温度为27~31℃，发酵时间为40-42小时。
作为优选，所述的步骤（4）中甲醇水溶液的浓度为80~95%，甲醇水溶液提取次数为3次。
作为优选，所述的海绵酸的产率为50~68 μg/L。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
（1）本发明采用海洋细菌发酵产生软海绵酸发酵周期短，仅为40~42小时，可节省能耗。
（2）本发明采用海洋细菌发酵产生软海绵酸，产率较高，可达50~68 μg/L。
（3）本发明方法步骤简单、工作量小，周期较短，所用试剂与材料均为微生物发酵试验常用试剂，对人体无害，对环境友好，成本低，具有较高的市场前景与经济价值。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
实施例1
一种利用海洋细菌发酵制备海绵酸的方法，所述的海洋细菌为糖螺菌（Saccharospirillaceae sp.）LZ-5，收藏编号为CCTCC AB 2017232，购买自中国典型培养物保藏中心，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
（1）菌株活化：将糖螺菌（Saccharospirillaceae sp.）LZ-5接种于斜面培养基中，26℃下培养1天活化菌株，所述的步骤（1）中的培养基配方如下：硫酸铵0.5g、蛋白胨0.2g、海藻酸钠0.3g、磷酸铁0.3g、琼脂2g，加天然海水至100ml，pH6.9。
（2）种子液的准备：配制种子培养基1L，加入5L容积种子罐中，蒸汽加热，121℃灭菌30分钟，冷却至28℃，挑取活化后的单菌落，火焰法接种于种子罐中的液体种子培养基中，，种子罐通气量55L/min，搅拌转速130转/min，28℃培养10小时，取培养物进行镜检，待种子液的OD600 达到0.6，光镜观察菌体生长良好，无杂菌污染时待用，所述液体种子培养基配方如下：蛋白胨 5g，酵母膏 1.5g，磷酸二氢钾 0.05g，海水 1000 mL，pH 7.0。
（3）发酵罐培养发酵：配制发酵培养基，按照发酵罐装液量体积百分比的35%装入平叶涡轮搅拌型发酵罐，通蒸汽加热，121℃灭菌30分钟，降温至27℃，种子液按体积百分比2.5%的接种量接入发酵培养基中，发酵过程中保持罐压0.15MPa，搅拌速率为150 转/min，控制通气量90L/min，发酵温度为27℃，发酵时间为40小时，所述的发酵培养基的配方如下：蛋白胨 4.5g，酵母膏 5.05g，葡萄糖 2.15g，硫酸铵 1.35g，磷酸二氢钾 0.25g，氯化钠0.52g，氯化亚铁 0.005g，脯氨酸 0.05g，海水1000 mL，pH 7.2。
（4）发酵液的提取：发酵液板框过滤，获得菌体沉淀，用浓度为80~95%甲醇水溶液提取，将提取液通过0.45微米滤膜过滤，对沉淀进行二次提取，得到二次提取液；将二次澄清液经0.45微米滤膜过滤后，加入浓度为80%甲醇水溶液溶液进行三次提取，合并三次提取液，旋蒸浓缩，得到粗提取。
（5）粗提物的纯化：将上述步骤得到的全部粗提物，经制备色谱洗脱，收集，旋转蒸发，获得白色粉末，即得软海绵酸产率为50 .36μg/L。
实施例2
一种利用海洋细菌发酵制备海绵酸的方法，所述的海洋细菌为糖螺菌（Saccharospirillaceae sp.）LZ-5，收藏编号为CCTCC AB 2017232，购买自中国典型培养物保藏中心，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
（1）菌株活化：将糖螺菌（Saccharospirillaceae sp.）LZ-5接种于斜面培养基中，29℃下培养3天活化菌株，所述的步骤（1）中的培养基配方如下：硫酸铵1.0g、蛋白胨0.8g、海藻酸钠0.8g、磷酸铁0.8g、琼脂2g，加天然海水至100ml，pH7.3。
（2）种子液的准备：配制种子培养基1L，加入5L容积种子罐中，蒸汽加热，121℃灭菌30分钟，冷却至28℃，挑取活化后的单菌落，火焰法接种于种子罐中的液体种子培养基中，种子罐通气量70L/min，搅拌转速160转/min，28℃培养14小时，取培养物进行镜检，待种子液的OD600 达到0.8，光镜观察菌体生长良好，无杂菌污染时待用，所述液体种子培养基配方如下：蛋白胨 5g，酵母膏 1.5g，磷酸二氢钾 0.05g，海水 1000 mL，pH 7.6。
（3）发酵罐培养发酵：配制发酵培养基，按照发酵罐装液量体积百分比的35%装入平叶涡轮搅拌型发酵罐，通蒸汽加热，121℃灭菌30分钟，降温至27~31℃，种子液按体积百分比3.5%的接种量接入发酵培养基中，发酵过程中保持罐压0.19MPa，搅拌速率为160 转/min，控制通气量135L/min，发酵温度为31℃，发酵时间为42小时，所述的发酵培养基的配方如下：蛋白胨 4.5g，酵母膏 5.05g，葡萄糖 2.15g，硫酸铵 1.35g，磷酸二氢钾 0.25g，氯化钠 0.52g，氯化亚铁 0.005g，脯氨酸 0.05g，海水1000 mL，pH7.5。
（4）发酵液的提取：发酵液板框过滤，获得菌体沉淀，用浓度为95%甲醇水溶液提取，将提取液通过0.45微米滤膜过滤，对沉淀进行二次提取，得到二次提取液；将二次澄清液经0.45微米滤膜过滤后，加入浓度为95%甲醇水溶液溶液进行三次提取，合并三次提取液，旋蒸浓缩，得到粗提取。
（5）粗提物的纯化：将上述步骤得到的全部粗提物，经制备色谱洗脱，收集，旋转蒸发，获得白色粉末，即得软海绵酸产率为68 μg/L。
实施例3
一种利用海洋细菌发酵制备海绵酸的方法，所述的海洋细菌为糖螺菌（Saccharospirillaceae sp.）LZ-5，收藏编号为CCTCC AB 2017232，购买自中国典型培养物保藏中心，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
（1）菌株活化：将糖螺菌（Saccharospirillaceae sp.）LZ-5接种于斜面培养基中，26~29℃下培养2天活化菌株，所述的步骤（1）中的培养基配方如下：硫酸铵0.8g、蛋白胨0.5g、海藻酸钠0.6g、磷酸铁0.4g、琼脂2g，加天然海水至100ml，pH7.1。
（2）种子液的准备：配制种子培养基1L，加入5L容积种子罐中，蒸汽加热，121℃灭菌30分钟，冷却至28℃，挑取活化后的单菌落，火焰法接种于种子罐中的液体种子培养基中，，种子罐通气量60L/min，搅拌转速150转/min，28℃培养12小时，取培养物进行镜检，待种子液的OD600 达到0.8，光镜观察菌体生长良好，无杂菌污染时待用，所述液体种子培养基配方如下：蛋白胨 5g，酵母膏 1.5g，磷酸二氢钾 0.05g，海水 1000 mL，pH 7.4。
（3）发酵罐培养发酵：配制发酵培养基，按照发酵罐装液量体积百分比的35%装入平叶涡轮搅拌型发酵罐，通蒸汽加热，121℃灭菌30分钟，降温至28℃，种子液按体积百分比3%的接种量接入发酵培养基中，发酵过程中保持罐压0.16MPa，搅拌速率为155 转/min，控制通气量110L/min，发酵温度为28℃，发酵时间为41小时，所述的发酵培养基的配方如下：蛋白胨 4.5g，酵母膏 5.05g，葡萄糖 2.15g，硫酸铵 1.35g，磷酸二氢钾 0.25g，氯化钠0.52g，氯化亚铁 0.005g，脯氨酸 0.05g，海水1000 mL，pH 7.4。
（4）发酵液的提取：发酵液板框过滤，获得菌体沉淀，用浓度为90%甲醇水溶液提取，将提取液通过0.45微米滤膜过滤，对沉淀进行二次提取，得到二次提取液；将二次澄清液经0.45微米滤膜过滤后，加入浓度为90%甲醇水溶液溶液进行三次提取，合并三次提取液，旋蒸浓缩，得到粗提取。
（5）粗提物的纯化：将上述步骤得到的全部粗提物，经制备色谱洗脱，收集，旋转蒸发，获得白色粉末，即得软海绵酸产率为57.68μg/L。
实施例4
一种利用海洋细菌发酵制备海绵酸的方法，所述的海洋细菌为糖螺菌（Saccharospirillaceae sp.）LZ-5，收藏编号为CCTCC AB 2017232，购买自中国典型培养物保藏中心，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
（1）菌株活化：将糖螺菌（Saccharospirillaceae sp.）LZ-5接种于斜面培养基中，28℃下培养1~3天活化菌株，所述的步骤（1）中的培养基配方如下：硫酸铵0.6g、蛋白胨0.7g、海藻酸钠0.7g、磷酸铁0.7g、琼脂2g，加天然海水至100ml，pH7.1。
（2）种子液的准备：配制种子培养基1L，加入5L容积种子罐中，蒸汽加热，121℃灭菌30分钟，冷却至28℃，挑取活化后的单菌落，火焰法接种于种子罐中的液体种子培养基中，，种子罐通气量65L/min，搅拌转速155转/min，28℃培养12小时，取培养物进行镜检，待种子液的OD600 达到0.6 ~0.8，光镜观察菌体生长良好，无杂菌污染时待用，所述液体种子培养基配方如下：蛋白胨 5g，酵母膏 1.5g，磷酸二氢钾 0.05g，海水 1000 mL，pH 7.5。
（3）发酵罐培养发酵：配制发酵培养基，按照发酵罐装液量体积百分比的35%装入平叶涡轮搅拌型发酵罐，通蒸汽加热，121℃灭菌30分钟，降温至29℃，种子液按体积百分比2.5%的接种量接入发酵培养基中，发酵过程中保持罐压0.18MPa，搅拌速率为155 转/min，控制通气量120L/min，发酵温度为29℃，发酵时间为41小时，所述的发酵培养基的配方如下：蛋白胨 4.5g，酵母膏 5.05g，葡萄糖 2.15g，硫酸铵 1.35g，磷酸二氢钾 0.25g，氯化钠0.52g，氯化亚铁 0.005g，脯氨酸 0.05g，海水1000 mL，pH7.3。
（4）发酵液的提取：发酵液板框过滤，获得菌体沉淀，用浓度为90%甲醇水溶液提取，将提取液通过0.45微米滤膜过滤，对沉淀进行二次提取，得到二次提取液；将二次澄清液经0.45微米滤膜过滤后，加入浓度为90%甲醇水溶液溶液进行三次提取，合并三次提取液，旋蒸浓缩，得到粗提取。
（5）粗提物的纯化：将上述步骤得到的全部粗提物，经制备色谱洗脱，收集，旋转蒸发，获得白色粉末，即得软海绵酸产率为59.62 μg/L。
实施例5
一种利用海洋细菌发酵制备海绵酸的方法，所述的海洋细菌为糖螺菌（Saccharospirillaceae sp.）LZ-5，收藏编号为CCTCC AB 2017232，购买自中国典型培养物保藏中心，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
（1）菌株活化：将糖螺菌（Saccharospirillaceae sp.）LZ-5接种于斜面培养基中，29℃下培养1天活化菌株，所述的步骤（1）中的培养基配方如下：硫酸铵1.0g、蛋白胨0.2g、海藻酸钠0.3g、磷酸铁0.8g、琼脂2g，加天然海水至100ml，pH7.2。
（2）种子液的准备：配制种子培养基1L，加入5L容积种子罐中，蒸汽加热，121℃灭菌30分钟，冷却至28℃，挑取活化后的单菌落，火焰法接种于种子罐中的液体种子培养基中，，种子罐通气量65L/min，搅拌转速155转/min，28℃培养13小时，取培养物进行镜检，待种子液的OD600 达到0.8，光镜观察菌体生长良好，无杂菌污染时待用，所述液体种子培养基配方如下：蛋白胨 5g，酵母膏 1.5g，磷酸二氢钾 0.05g，海水 1000 mL，pH 7.5。
（3）发酵罐培养发酵：配制发酵培养基，按照发酵罐装液量体积百分比的35%装入平叶涡轮搅拌型发酵罐，通蒸汽加热，121℃灭菌30分钟，降温至30℃，种子液按体积百分比2.5%的接种量接入发酵培养基中，发酵过程中保持罐压0.16MPa，搅拌速率为155 转/min，控制通气量120L/min，发酵温度为30℃，发酵时间为42小时，所述的发酵培养基的配方如下：蛋白胨 4.5g，酵母膏 5.05g，葡萄糖 2.15g，硫酸铵 1.35g，磷酸二氢钾 0.25g，氯化钠0.52g，氯化亚铁 0.005g，脯氨酸 0.05g，海水1000 mL，pH 7.4。
（4）发酵液的提取：发酵液板框过滤，获得菌体沉淀，用浓度为90%甲醇水溶液提取，将提取液通过0.45微米滤膜过滤，对沉淀进行二次提取，得到二次提取液；将二次澄清液经0.45微米滤膜过滤后，加入浓度为90%甲醇水溶液溶液进行三次提取，合并三次提取液，旋蒸浓缩，得到粗提取。
（5）粗提物的纯化：将上述步骤得到的全部粗提物，经制备色谱洗脱，收集，旋转蒸发，获得白色粉末，即得软海绵酸产率为60.28μg/L。
Claims (7)
1.一种利用海洋细菌发酵制备海绵酸的方法，所述的海洋细菌为糖螺菌（Saccharospirillaceae sp.）LZ-5已于2017年10月18日保藏于中国典型培养物中心CCTCC，其保藏编号为：CCTCC AB 2017232，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
（1）菌株活化：将糖螺菌（Saccharospirillaceae sp.）LZ-5接种于斜面培养基中，培养活化菌株；培养基配方如下：硫酸铵0.5~1.0g、蛋白胨0.2~0.8g、海藻酸钠0.3~0.8g、磷酸铁0.3~0.8g、琼脂2g，加天然海水至100ml，pH6.9~7.3；
（2）种子液的准备：挑取活化后的单菌落接种于种子罐中的液体种子培养基，扩培菌株待用；液体种子培养基配方如下：蛋白胨 5g，酵母膏 1.5g，磷酸二氢钾 0.05g，海水 1000mL，pH 7.0~7.6；
（3）发酵罐培养发酵：将发酵培养基装入发酵罐中，将步骤（2）中的种子液接入发酵培养基中，发酵得到发酵液；发酵培养基的配方如下：蛋白胨4.5g，酵母膏5.05g，葡萄糖2.15g，硫酸铵1.35g，磷酸二氢钾0.25g，氯化钠0.52g，氯化亚铁0.005g，脯氨酸 0.05g，海水1000 mL，pH 7.2~7.5；
（4）发酵液的提取：将发酵液离心经板框过滤，获得菌体沉淀，用甲醇水溶液提取，合并提取液，旋蒸浓缩，得到粗提物；
（5）粗提物的纯化：将上述步骤得到的全部粗提物，经制备色谱洗脱，收集，旋转蒸发，获得白色粉末，即得软海绵酸。
2.根据权利要求1所述的一种利用海洋细菌发酵制备海绵酸的方法，其特征在于，所述的步骤（1）中培养温度为26~29℃，培养时间为1~3天。
3.根据权利要求1所述的一种利用海洋细菌发酵制备海绵酸的方法，其特征在于，所述的步骤（2）中种子罐通气量55~70L/min，搅拌转速130~160转/min，28℃培养10~14小时，取培养物进行镜检，待种子液的OD600 达到0.6 ~0.8，光镜观察菌体生长良好，无杂菌污染时待用。
4.根据权利要求1所述的一种利用海洋细菌发酵制备海绵酸的方法，其特征在于，所述的步骤（3）中发酵培养基的装入量为发酵罐装液量体积百分比的35~50%，种子液按体积百分比2.5%~3.5% 的接种量接入发酵培养基中。
5.根据权利要求1所述的一种利用海洋细菌发酵制备海绵酸的方法，其特征在于，所述的步骤（3）中发酵罐为平叶涡轮搅拌型发酵罐，发酵过程中保持罐压0.15~0.19MPa，搅拌速率为150-160 转/min，控制通气量90~135L/min，发酵温度为27~31℃，发酵时间为40-42小时。
6.根据权利要求1所述的一种利用海洋细菌发酵制备海绵酸的方法，其特征在于，所述的步骤（4）中甲醇水溶液的浓度为80~95%，甲醇水溶液提取次数为3次。
7.根据权利要求1所述的一种利用海洋细菌发酵制备海绵酸的方法，其特征在于，所述的海绵酸的产率为50~68 μg/L。
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