CN110521738A - 一种防治辣椒疫霉的复合生防制剂及其防治方法 - Google Patents

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袁志辉
张斌
刘小文
何福林
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Abstract

本发明属于植物病害的生物防治领域，具体涉及一种防治辣椒疫霉的复合生防制剂及其制备和使用方法。本发明制备的复合生防制剂包括如下成分：银杏内生解淀粉酶芽孢杆菌、银杏外种皮提取物、银杏内生解淀粉酶芽孢杆菌代谢物及蒸馏水。在具有广谱抗菌活性的银杏内生真菌淀粉芽孢杆菌菌液1.5份、银杏外种皮提取物1份、银杏内生解淀粉酶芽孢杆菌代谢物0.5份及蒸馏水7份的重量份的情况下，复合生防制剂对辣椒疫霉防治率最高。本发明制备的复合生防制剂速效性好；将三种作用机制完全不同的生防制剂成分进行复配，可增加了靶位点，使辣椒疫霉菌不易产生抗药性；成本较低且安全环保。

Description

一种防治辣椒疫霉的复合生防制剂及其防治方法
技术领域
本发明属于植物病害的生物防治领域，具体涉及一种防治辣椒疫霉的复合生防制剂及其制备方法和使用方法。
背景技术
辣椒疫霉病由鞭毛菌亚门真菌辣椒疫霉引起。病菌主要以卵孢子、厚桓孢子在病残体或土壤及种子上越冬其中土壤病残体带菌率高，是主要浸染源。条件适宜时，越冬后的病菌经雨水飞溅或灌溉水传到茎基部或近地面植株上，引起发病。因此，辣椒疫霉病成为发病周期短、流行速度迅猛的毁灭性病害。高温、高湿、降雨日数多、雨量大，有利于病害发生。
目前防治方法主要包括：农业防治、化学防治以及生物防治。农业防治主要包括合理倒茬以及科学种植。合理倒茬是农业生产中不可忽视的耕作措施，合理的耕作制度与布局，对辣椒的生长非常有利。化学防治包括土壤用药和田间用药；但是化学用药容易产生残留造成环境污染，而且拮抗菌的产生使得化学防治效果越累越差。生物防治主要采用拮抗微生物，环境友好性强，不会产生污染。现有技术的单一菌剂比较多见，例如链霉菌、枯草芽孢杆菌等，但是单一菌株往往存在防治效果低下、药效慢等缺陷，目前多个科研院所已经进行复合生防制剂的研究。开发一种利用复合生防制剂防治辣椒疫霉病的方法是我们需要解决的技术问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种防治辣椒疫霉的微生物菌剂及其防治方法，以解决化学农药在防治辣椒疫霉方面存在的成本高、安全性差、污染严重等问题。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供一种防治辣椒疫霉的复合生防制剂，由以下重量份的原料组成：银杏内生解淀粉酶芽孢杆菌0.8-2.0份、银杏外种皮提取物0.6-1.5份、银杏内生解淀粉酶芽孢杆菌代谢物0.3-1.0份及蒸馏水5.0-10.0份。
进一步地，由以下重量份的原料组成：具有广谱抗菌活性的银杏内生真菌淀粉芽孢杆菌菌液1.5份、银杏外种皮提取物1份、银杏内生解淀粉酶芽孢杆菌代谢物0.5份及蒸馏水7份。
进一步地，所述银杏内生真菌具有广谱抗菌活性的解淀粉酶芽孢杆菌的保藏号为CCTCC AB 2012028。
第二方面，本发明还提供一种上述复合生防制剂的制备方法，包括以下制备步骤：
S1-菌种活化：将银杏内生解淀粉酶芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)在种子培养基中培养至菌密度OD600值为0.6-0.8，得到菌液；
S2-扩大培养：在100重量份培养基中接种2-5重量份的银杏内生真菌淀粉芽孢杆菌的菌株，37℃下培养，直至培养基内银杏内生解淀粉酶芽孢杆菌的活菌数为2-20×107个/克；
S3-扩大培养：将斜面培养活化后的银杏内生解淀粉酶芽孢杆菌接至PDA固体平板25-35℃培养72-120小时，再转接至PDA液体培养基25-35℃活化48-72小时，按体积比3-10％接种量，转接入液体产酶培养基中，pH至6-9，25-35℃下，培养72小时至120小时；向容器中按配比添加蒸馏水，在室温下密封一段时间；
S4-配制菌剂：在25-30℃条件下曝气培养，曝气量为0.16-0.20m/min，当各微生物菌数为1×108-1×1010个/mL时，使用储罐收集菌种的菌液；
S5-代谢物提取：通过溶剂萃取、沉淀、吸附或色谱法提取银杏内生真菌解淀粉芽孢杆菌菌液中的代谢物并对其冷冻干燥；
S6-银杏外种皮提取物制备：将被乙醇浸泡过的银杏外种皮置于煮提锅中常规加水煎煮2-3次并分别过滤，将滤液合并减压浓缩，得到浓缩液，将浓缩液转移至容器中，将容器置于磁力搅拌器的基座上，将乙醇缓慢加入浓缩液中，使乙醇浓度达到60-80(V/V)，在加入乙醇的同时开动磁力搅拌器搅拌，静置后将沉淀物再用高浓度乙醇洗涤数次后冷冻干燥；
S7-复合生防制剂制备：室温下，依次按配比在所述菌液内添加银杏外种皮提取物、银杏内生解淀粉酶芽孢杆菌代谢物，震荡均匀；
进一步地，在步骤S1中，所述种子培养基的配方为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15-20g，蒸馏水1000mL，在121℃灭菌30min，所述种子培养基的pH值为7.0-7.2。
进一步地，在步骤S2中，所述100重量份培养基的配方为：葡萄糖30-35g/L，酵母提取物30g/L，硫酸锰0.05g/L，氯化钙0.042g/L，硫酸铵1.2g/L，硫酸镁3g/L，磷酸0.4g/L，磷酸钾0.6g/L，所述100重量份培养基的pH为7.0-7.2。
进一步地，在步骤S4中，所述储罐密闭，置于环境温度低于20℃的条件下保存。
第三方面，本发明还提供上述复合生防制剂的使用方法，所述使用方法为：在辣椒苗移植前，将所述的生防制剂用于浸泡于辣椒苗根部，然后进行栽培。
进一步地，所述复合生防制剂的使用量为1.0-1.5g/株辣椒。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的制备方法，优势在于银杏内生解淀粉酶芽孢杆菌及其代谢物与银杏外种皮提取物两者作用靶标不一样，银杏内生解淀粉酶芽孢杆菌及其代谢物作用在于抑制病菌菌丝的正常生长和增强辣椒防病基因的表达，而银杏外种皮提取物作用在于通过酚酸的强氧化性作用直接杀死辣椒疫霉。两者复配能够增强对辣椒疫霉的防治效果，且能够减少辣椒疫霉对制剂的抗性，使辣椒不易产生抗药性且生产成本低，适合推广和工业化大规模生产。
本发明提供的使用方法，优势在于，只在辣椒苗根部浸泡复合生防制剂可以节约成本，而且与浸泡整个植株的效果产生的差异性不大。
本发明提供的生物制剂，优势在于，没有化学防治所带来的环境污染和药物残留等问题，有利于作物的无公害生产，农民可以不用或减少其他防治疫霉病以及提高抗逆性措施，这不仅可为农民种植减轻负担，而且有利于提高产品品质和产量，增加农业收入。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面对本发明的实施例作进一步描述。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中，大田实验在永州市道县附近水稻田进行；供试土壤为酸性水稻土；供试病原菌为辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)It263，保存于湖南农业科学院植物保护研究所；辣椒品种为湘椒5号，购于长沙新万农种业公司；所用的解淀粉芽孢杆菌(Metarhizium anisopliae)菌株CCTCCAB2012028购自中国典型培养物保藏中心。
以下通过实施例对本发明作进一步阐述，但不作为对本发明的限定。
实施例1
一种防治辣椒疫霉的复合生防制剂，按照如下重量比配制成：
银杏内生解淀粉酶芽孢杆菌1.5份；
银杏外种皮提取物1份；
银杏内生解淀粉酶芽孢杆菌代谢物0.5份；
蒸馏水7份。
实施例2
一种防治辣椒疫霉的复合生防制剂，按照如下重量比配制成：
银杏内生解淀粉酶芽孢杆菌0.8份；
银杏外种皮提取物0.6份；
银杏内生解淀粉酶芽孢杆菌代谢物0.3份；
蒸馏水5份。
实施例3
一种防治辣椒疫霉的复合生防制剂，按照如下重量比配制成：
银杏内生解淀粉酶芽孢杆菌2份；
银杏外种皮提取物1.5份；
银杏内生解淀粉酶芽孢杆菌代谢物1份；
蒸馏水8份。
制备例
一种防治辣椒疫霉的微生物菌剂的制备方法，包含如下步骤：
S1-菌种活化：先将银杏内生解淀粉酶芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)在种子培养基中培养至菌密度OD600值为0.6-0.8，得到菌液。
S2-扩大培养：在100重量份培养基中接种2-5重量份的银杏内生真菌淀粉芽孢杆菌的菌株，37℃下培养，直至培养基内银杏内生解淀粉酶芽孢杆菌的活菌数为2-20×107个/克；
S3-扩大培养：将斜面培养活化后的银杏内生解淀粉酶芽孢杆菌接至PDA固体平板25-35℃培养72-120小时，再转接至PDA液体培养基25-35℃活化48-72小时，按体积比3-10％接种量，转接入液体产酶培养基中，pH至6-9，25-35℃下，培养72小时至120小时；向容器中按配比添加蒸馏水，在室温下密封一段时间；
S4-配制菌剂：在25-30℃条件下曝气培养，曝气量为0.16-0.20m/min，当各微生物菌数为1×108-1×1010个/mL时，使用储罐收集菌种的菌液；
S5-代谢物提取：通过溶剂萃取、沉淀、吸附或色谱法提取银杏内生真菌解淀粉芽孢杆菌菌液中的代谢物并对其冷冻干燥；
S6-银杏外种皮提取物制备：将被乙醇浸泡过的银杏外种皮置于煮提锅中常规加水煎煮2-3次并分别过滤，将滤液合并减压浓缩，得到浓缩液，将浓缩液转移至容器中，将容器置于磁力搅拌器的基座上，将乙醇缓慢加入浓缩液中，使乙醇浓度达到60-80(V/V)，在加入乙醇的同时开动磁力搅拌器搅拌，静置后将沉淀物再用高浓度乙醇洗涤数次后冷冻干燥；
S7-复合生防制剂制备：室温下，依次按配比在所述菌液内添加银杏外种皮提取物、银杏内生解淀粉酶芽孢杆菌代谢物，震荡均匀。
实验例1
本发明提供的复合生防制剂对辣椒疫霉的防治效果
本实验例供试药剂：高效菌剂由实施例1、实施例2、实施例3通过制备例所述的制备方法制备，分别得到高效菌剂1、高效菌剂2、高效菌剂3。
本实验例设8个处理，分别是：A：银杏内生解淀粉酶芽孢杆菌、B：银杏外种皮提取物、C：银杏内生解淀粉酶芽孢杆菌的代谢物、D：高效菌剂1、E：高效菌剂2、F：高效菌剂3以及CK：空白对照。
本实验例试验土壤：辣椒疫霉菌经固体培养5天后，接入V8液体培养基中，25℃培养5天，倾出液体培养基，菌丝称重，按8g/公斤土壤的量接入到土壤中。
本实验例处理方法如下：将各个处理添加到100倍重量的水中，然后添加占各个处理2倍重量的葡萄糖、占各个处理生物制剂1倍重量的尿素，200rpm搅拌3min，对照组用无菌水加终浓度为0.05％的Tween-80处理，然后置于30℃活化3h，再将辣椒幼苗浸入上述液体30min，取出辣椒幼苗，移栽到试验田中，21天后取样统计发病程度。
表1不同处理下的辣椒发病情况
植株总鲜重/g 根鲜重/g 发病率/％ 防治率/％
A 101 21 35 65
B 89 20 60 40
C 97 15 54 46
D 133 38 10 90
E 117 26 15 85
F 108 21 16 84
CK 84 17 92 8
如表1所示，银杏内生解淀粉酶芽孢杆菌对辣椒疫霉菌防治率为65％，银杏外种皮提取物对辣椒疫霉菌的防治率为60％，银杏内生解淀粉酶芽孢杆菌的代谢物对辣椒疫霉菌的防治率为54％，实施例1所得高效菌剂1对辣椒疫霉菌的防治率可达到90％，实施例2所得高效菌剂2对辣椒疫霉菌的防治率可达到85％，实施例3所得高效菌剂3对辣椒疫霉菌的防治率达到84％。
本发明提供的微生物菌剂中的成分具有良好的协同效果，银杏外种皮提取物中含有丰富的银杏酚酸，多项结果表明银杏酚酸具有很好的抑菌能力，酚酸的烷基侧链在抑菌中起了重要作用；银杏内生解淀粉酶芽孢杆菌及其代谢物粗提物能够导致辣椒疫霉菌菌丝畸形，并抑制其游动孢子囊的形成。荧光定量PCR的结果表明，银杏内生解淀粉酶芽孢杆菌及其代谢物粗提物能够诱导辣椒系统抗性，诱导辣椒防病相关基因的表达，显著增强防病基因CaPR4(辣椒病程相关蛋白4)的表达，从而起到抑制辣椒疫霉的作用。银杏内生解淀粉酶芽孢杆菌及其代谢物与银杏外种皮提取物两者作用靶标不一样两者复配能够增强对辣椒疫霉的防治效果，且能够减少辣椒疫霉对制剂的抗性，以一定比例配合施用效果优于单施其中某一种菌的发酵液。其中实施例1所得高效菌剂1对辣椒疫霉菌的防治率最高，施用效果最好。
实验例2
不同浸泡时间对辣椒发病情况影响的测定
本实验例试验土壤：辣椒疫霉菌经固体培养5天后，接入V8液体培养基中，25℃培养5天，倾出液体培养基，菌丝称重，按8g/公斤土壤的量接入到土壤中。
本实验例设两个处理，分别是实施例1实验组和空白对照组，实验组分别为浸泡根部30min，浸泡根部60min和浸泡根部90min。本实验例处理方法如下：将实施例1所得高效菌剂1添加到100倍重量的水中，然后添加占各个处理2倍重量的葡萄糖、占各个处理生物制剂1倍重量的尿素，200rpm搅拌3min，然后置于30℃活化3h，再将辣椒幼苗浸入上述液体，每个处理20株幼苗，移栽到试验田，21天后取样统计发病程度。
表2不同浸泡时间对辣椒发病率的影响
组别 发病率/％ 多重比较
实验组1 12.4 a
实验组2 12.3 a
实验组3 11.5 a
对照组1 98.3 a
对照组2 97.9 a
对照组3 99.6 a
如表2所示，在复合生防制剂浓度为2×109个/mL时，浸泡时间30min、60min和90min发病率分别为12.4％，12.3％，11.5％。经过处理后的辣椒幼苗发病率比阴性对照组有明显的降低，浸泡时间长短对于辣椒发病率无明显差异。本发明制备的复合生防制剂速效性好，从成本考虑，不必延长浸泡时间。
以上数据说明，本发明提供的复合生防制剂可对辣椒疫霉进行有效的防治。将三种作用机制完全不同的生防制剂成分进行复配，增加了靶位点，使辣椒疫霉菌不易产生抗药性。本发明提供的复合生防制剂速效性好，不必延长浸泡时间降低生产成本；还能减轻对环境的污染，促进农业的可持续发展。

Claims (8)

1.一种防治辣椒疫霉的复合生防制剂，其特征在于，由以下重量份的原料组成：银杏内生解淀粉芽孢杆菌0.8-2.0份、银杏外种皮提取物0.6-1.5份、银杏内生解淀粉芽孢杆菌代谢物0.3-1.0份及蒸馏水5.0-8.0份。
2.根据权利要求1所述的一种防治辣椒疫霉的复合生防制剂，其特征在于，由以下重量份的原料组成：银杏内生解淀粉芽孢杆菌1.5份、银杏外种皮提取物0.6份、银杏内生解淀粉芽孢杆菌代谢物0.4份及蒸馏水7份。
3.根据权利要求1或2所述的一种防治辣椒疫霉的复合生防制剂，其特征在于，所述银杏内生解淀粉酶芽孢杆菌的保藏号为CCTCC AB 2012028，所述铜绿假单胞菌的保藏号为CCTCC AB 205067。
4.根据权利要求1所述的一种防治辣椒疫霉的复合生防制剂，其特征在于，所述复合生防制剂的制备包括以下步骤：
S1-菌种活化：将银杏内生解淀粉芽孢杆菌在种子培养基中培养至菌密度OD600值为0.6-0.8，得到菌液；
S2-扩大培养：在100重量份培养基中接种2-5重量份的银杏内生真菌淀粉芽孢杆菌的菌株，37℃下培养，直至培养基内银杏内生解淀粉酶芽孢杆菌的活菌数为2-20×107个/克；
S3-扩大培养：将斜面培养活化后的银杏内生解淀粉酶芽孢杆菌接至PDA固体平板25-35℃培养72-120小时，再转接至PDA液体培养基25-35℃活化48-72小时，按体积比3-10％接种量，转接入液体产酶培养基中，pH至6-9，25-35℃下，培养72小时至120小时；向容器中按配比添加蒸馏水，在室温下密封一段时间；
S4-配制菌剂：在25-30℃条件下曝气培养，曝气量为0.16-0.20m/min，当微生物菌数为1×108-1×1010个/mL时，使用储罐收集菌种的菌液；
S5-代谢物提取：通过溶剂萃取、沉淀、吸附或色谱法提取银杏内生真菌解淀粉芽孢杆菌菌液中的代谢物并对其冷冻干燥；
S6-银杏外种皮提取物制备：将乙醇浸泡过的银杏外种皮置于煮提锅中常规加水煎煮2-3次并分别过滤，将滤液合并减压浓缩，得到浓缩液，将浓缩液转移至容器中，将容器置于磁力搅拌器的基座上，将乙醇缓慢加入浓缩液中，使乙醇浓度达到60-80(V/V)，在加入乙醇的同时开动磁力搅拌器搅拌，静置后将沉淀物再用高浓度乙醇洗涤数次后冷冻干燥；
S7-复合生防制剂制备：室温下，依次按配比在所述菌液内添加银杏外种皮提取物、银杏内生解淀粉酶芽孢杆菌代谢物，震荡均匀。
5.根据权利要求1所述的一种防治辣椒疫霉的复合生防制剂，其特征在于，在步骤S1中，所述种子培养基的配方为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15-20g，蒸馏水1000mL，在121℃灭菌30min，所述种子培养基的pH值为7.0-7.2。
6.根据权利要求1所述的一种防治辣椒疫霉的复合生防制剂，其特征在于，在步骤S2中，所述100重量份培养基的配方为：葡萄糖30-35g/L，酵母提取物30g/L，硫酸锰0.05g/L，氯化钙0.042g/L，硫酸铵1.2g/L，硫酸镁3g/L，磷酸0.4g/L，磷酸钾0.6g/L，所述100重量份培养基的pH为7.0-7.2。
7.根据权利要求1所述的一种防治辣椒疫霉的复合生防制剂的制备方法，其特征在于，在步骤S4中，所述储罐密闭，置于环境温度低于20℃的条件下保存。
8.一种防治辣椒疫霉的复合生防制剂的防治方法，其特征在于，在辣椒苗移植前，将权利要求1所述复合生防制剂用于浸泡辣椒苗根部，然后进行栽培，所述复合生防制剂的使用量为1.0-1.5g/株辣椒，浸泡时间为30min。
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