CN109251946B - 一种利用海洋硅藻共栖细菌发酵制备遗忘性贝毒软骨藻酸的方法 - Google Patents

一种利用海洋硅藻共栖细菌发酵制备遗忘性贝毒软骨藻酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及海洋微生物发酵技术领域，解决了通过硅藻培养提取的方法制备软骨藻酸培养周期长、成本高的问题，公开了一种利用海洋硅藻共栖细菌发酵制备遗忘性贝毒软骨藻酸的方法。该制备方法为先进行菌株活化，然后接种到种子培养液中进行培养，再接种到发酵液中进行发酵得到遗忘性贝毒软骨藻酸发酵液，最后对菌株进行浸泡提取，纯化得到遗忘性贝毒软骨藻酸。本发明通过细菌发酵的方法制备软骨藻酸具有发酵时间短，成本低，代谢调控相对简单。

Description

一种利用海洋硅藻共栖细菌发酵制备遗忘性贝毒软骨藻酸的 方法
技术领域
本发明涉及海洋微生物发酵技术领域，尤其是涉及一种利用海洋硅藻共栖细菌发酵制备遗忘性贝毒软骨藻酸的方法。
背景技术
软骨藻酸(Domoic acid,DA)属于记忆缺失性贝类毒素(Amnesic shellfishposoning，ASP)的主要毒素成分，是一种相对罕见的神经毒性氨基酸。近三十年来，海洋环境污染日趋加重，赤潮频繁发生，软骨藻酸作为一种兴奋性脯氨酸衍生物和神经毒素，主要由形成赤潮的一种硅藻多列拟菱形藻产生，其最早是在1987年加拿大因食用紫贻贝而造成的食物中毒事件中被发现，软骨酸藻可影响人和动物的消化道、心血管系统、中枢神经系统、它对与内脏功能有关的脑干区域具有兴奋作用，对与记忆有关的脑区域具有明显的神经毒性作用，中毒者主要表现为腹痛、腹泻、呕吐，同时伴有严重的记忆缺失、意识混乱、平衡失调等症状，严重者处于昏迷状态。永久性丧失部分记忆乃至死亡是此类中毒的典型特征。DA在有害赤潮检测、神经生物学、医学诊断、生化战剂等研究中均有重要应用。目前，软骨藻酸的获得主要通过产毒硅藻的规模培养及产物提取制备而来。该方法不仅培养周期长、成本高，且需要特殊的藻培养设备。
发明内容
本发明是为了克服现有技术通过硅藻培养提取的方法制备软骨藻酸培养周期长、成本高的问题，提供一种利用海洋硅藻共栖细菌发酵制备遗忘性贝毒软骨藻酸的方法，通过细菌发酵的方法制备软骨藻酸具有发酵时间短，成本低，代谢调控相对简单。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种利用海洋硅藻共栖细菌发酵制备遗忘性贝毒软骨藻酸的方法，包括以下步骤：
1)菌株活化：将斜面菌种接种到摇瓶种子液培养基中，在30-32℃下培养12-15h，得到活化菌株种子液；
2)种子液准备：向种子培养液中通入蒸汽加热，121-123℃灭菌25-35min，冷却至30-31℃，采用火种接种法将活化菌株种子液接种到种子培养液中，通气搅拌，通气量为40-50L/min，搅拌速率为160-180r/min，30-33℃下恒温培养15-18h，得到种子液；
3)发酵：向发酵液中通入蒸汽加热，121-123℃灭菌25-35min，冷却至30-31℃，将步骤2)得到的种子液接种到发酵液中，通气搅拌，通气量为40-60L/min，搅拌转速140-160r/min，30-33℃下恒温培养48-52h，得到遗忘性贝毒软骨藻酸发酵液；
4)提取：将遗忘性贝毒软骨藻酸发酵液进行板框过滤得到菌体，加入甲醇溶液，静置10-20min，过滤，得到一次提取液和过滤菌体；将过滤菌体加入甲醇溶液中，静置10-20min，过滤，得到二次提取液和过滤菌体；将过滤菌体加入甲醇溶液中，静置10-20min，过滤，得到三次提取液，将一次提取液、二次提取液和三次提取液合并，旋蒸浓缩，得到遗忘性贝毒软骨藻酸粗提物；
5)纯化：将遗忘性贝毒软骨藻酸粗提物进行洗脱，收集遗忘性贝毒软骨藻酸组分，旋转蒸发，除去溶剂，得到白色粉末，即为遗忘性贝毒软骨藻酸。
作为优选，所述步骤1)中菌种为海洋硅藻共栖细菌Ponticoccus sp.LZ-7。
作为优选，所述步骤1)中摇瓶种子液培养基包括以下质量百分数的组分：
酵母膏3-6％，蛋白胨2-5％，葡萄糖0.5-1％，余量为天然海水。
作为优选，所述步骤2)中活化菌株种子液接种量为10～15％。
作为优选，所述步骤2)中种子培养液包括以下质量百分数的组分：
酵母膏3-6％，蛋白胨2-5％，葡萄糖0.5-1％，余量为天然海水。
作为优选，所述步骤3)中种子液接种量为2-5％。
作为优选，所述步骤3)中发酵液包括以下质量百分数的组分：
酵母膏5-10％，蛋白胨3-6％，葡萄糖3-6％，精氨酸0.05-0.1％，氯化钾0.2-0.3％，氯化钙0.02-0.05％，余量为天然海水。
作为优选，所述步骤4)中甲醇溶液的体积浓度为75-85％。
因此，本发明具有如下有益效果：(1)使用海洋硅藻共栖细菌Ponticoccus sp.LZ-7为生产菌种，该菌种发酵软骨藻酸产率较高，可达5.5-5.8μg/L，其发酵时间为48-52小时，节省能耗。(2)本发明方法步骤简单、工作量小，周期较短，所用试剂与材料均为微生物发酵试验常用试剂，对人体无害，对环境友好，成本低，具有较高的市场前景与经济价值。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案做进一步说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的，实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
本发明所使用的海洋硅藻共栖细菌Ponticoccus sp.LZ-7购买于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，分离自东海产毒尖刺拟菱形藻(Pseudonitzschia pungens)，保藏编号：CCTCCNO：2017233。
实施例1
一种利用海洋硅藻共栖细菌发酵制备遗忘性贝毒软骨藻酸的方法，包括以下步骤：
1)菌株活化：将斜面菌海洋硅藻共栖细菌Ponticoccus sp.LZ-7种接种到摇瓶种子液培养基中，其中摇瓶种子液培养基包括以下质量百分数的组分：酵母膏4％，蛋白胨3.5％，葡萄糖0.8％，余量为天然海水；在31℃下培养13h，得到活化菌株种子液；
2)种子液准备：向种子培养液中通入蒸汽加热，122℃灭菌30min，冷却至30.5℃，种子培养液包括以下质量百分数的组分：酵母膏4.5％，蛋白胨3％，葡萄糖0.8％，余量为天然海水；采用火种接种法将活化菌株种子液接种到种子培养液中，活化菌株种子液接种量为13％，通气搅拌，通气量为45L/min，搅拌速率为170r/min，31.5℃下恒温培养17h，得到种子液；
3)发酵：向发酵液中通入蒸汽加热，122℃灭菌30min，冷却至30.5℃，发酵液包括以下质量百分数的组分：酵母膏8％，蛋白胨5％，葡萄糖4.5％，精氨酸0.08％，氯化钾0.25％，氯化钙0.03％，余量为天然海水；将步骤2)得到的种子液接种到发酵液中，种子液接种量为3％，通气搅拌，通气量为50L/min，搅拌转速150r/min，31.5℃下恒温培养50h，得到遗忘性贝毒软骨藻酸发酵液；
4)提取：将遗忘性贝毒软骨藻酸发酵液进行板框过滤得到菌体，加入甲醇溶液，静置15min，过滤，得到一次提取液和过滤菌体；将过滤菌体加入甲醇溶液中，静置15min，过滤，得到二次提取液和过滤菌体；将过滤菌体加入甲醇溶液中，静置15min，过滤，得到三次提取液，将一次提取液、二次提取液和三次提取液合并，旋蒸浓缩，得到遗忘性贝毒软骨藻酸粗提物，其中甲醇溶液的体积浓度为80％；
5)纯化：将遗忘性贝毒软骨藻酸粗提物进行洗脱，收集遗忘性贝毒软骨藻酸组分，旋转蒸发，除去溶剂，得到白色粉末，即为遗忘性贝毒软骨藻酸。
实施例2
一种利用海洋硅藻共栖细菌发酵制备遗忘性贝毒软骨藻酸的方法，包括以下步骤：
1)菌株活化：将斜面菌海洋硅藻共栖细菌Ponticoccus sp.LZ-7种接种到摇瓶种子液培养基中，其中摇瓶种子液培养基包括以下质量百分数的组分：酵母膏4％，蛋白胨3％，葡萄糖0.6％，余量为天然海水；在30.5℃下培养13h，得到活化菌株种子液；
2)种子液准备：向种子培养液中通入蒸汽加热，121.5℃灭菌26min，冷却至30.5℃，种子培养液包括以下质量百分数的组分：酵母膏4％，蛋白胨2.5％，葡萄糖0.6％，余量为天然海水；采用火种接种法将活化菌株种子液接种到种子培养液中，活化菌株种子液接种量为11％，通气搅拌，通气量为42L/min，搅拌速率为165r/min，31℃下恒温培养16h，得到种子液；
3)发酵：向发酵液中通入蒸汽加热，121.5℃灭菌26min，冷却至30.5℃，发酵液包括以下质量百分数的组分：酵母膏6％，蛋白胨4％，葡萄糖3.5％，精氨酸0.06％，氯化钾0.2％，氯化钙0.03％，余量为天然海水；将步骤2)得到的种子液接种到发酵液中，种子液接种量为3％，通气搅拌，通气量为42L/min，搅拌转速145r/min，31℃下恒温培养49h，得到遗忘性贝毒软骨藻酸发酵液；
4)提取：将遗忘性贝毒软骨藻酸发酵液进行板框过滤得到菌体，加入甲醇溶液，静置12min，过滤，得到一次提取液和过滤菌体；将过滤菌体加入甲醇溶液中，静置12min，过滤，得到二次提取液和过滤菌体；将过滤菌体加入甲醇溶液中，静置12min，过滤，得到三次提取液，将一次提取液、二次提取液和三次提取液合并，旋蒸浓缩，得到遗忘性贝毒软骨藻酸粗提物，其中甲醇溶液的体积浓度为75％；
5)纯化：将遗忘性贝毒软骨藻酸粗提物进行洗脱，收集遗忘性贝毒软骨藻酸组分，旋转蒸发，除去溶剂，得到白色粉末，即为遗忘性贝毒软骨藻酸。
实施例3
一种利用海洋硅藻共栖细菌发酵制备遗忘性贝毒软骨藻酸的方法，包括以下步骤：
1)菌株活化：将斜面菌海洋硅藻共栖细菌Ponticoccus sp.LZ-7种接种到摇瓶种子液培养基中，其中摇瓶种子液培养基包括以下质量百分数的组分：酵母膏5％，蛋白胨4.5％，葡萄糖0.8％，余量为天然海水；在31.5℃下培养14h，得到活化菌株种子液；
2)种子液准备：向种子培养液中通入蒸汽加热，122.5℃灭菌32min，冷却至31℃，种子培养液包括以下质量百分数的组分：酵母膏5％，蛋白胨4.5％，葡萄糖0.8％，余量为天然海水；采用火种接种法将活化菌株种子液接种到种子培养液中，活化菌株种子液接种量为14％，通气搅拌，通气量为48L/min，搅拌速率为175r/min，32℃下恒温培养17h，得到种子液；
3)发酵：向发酵液中通入蒸汽加热，122.5℃灭菌32min，冷却至31℃，发酵液包括以下质量百分数的组分：酵母膏9％，蛋白胨5％，葡萄糖5.5％，精氨酸0.08％，氯化钾0.3％，氯化钙0.04％，余量为天然海水；将步骤2)得到的种子液接种到发酵液中，种子液接种量为4.5％，通气搅拌，通气量为55L/min，搅拌转速155r/min，32℃下恒温培养50h，得到遗忘性贝毒软骨藻酸发酵液；
4)提取：将遗忘性贝毒软骨藻酸发酵液进行板框过滤得到菌体，加入甲醇溶液，静置18min，过滤，得到一次提取液和过滤菌体；将过滤菌体加入甲醇溶液中，静置18min，过滤，得到二次提取液和过滤菌体；将过滤菌体加入甲醇溶液中，静置18min，过滤，得到三次提取液，将一次提取液、二次提取液和三次提取液合并，旋蒸浓缩，得到遗忘性贝毒软骨藻酸粗提物，其中甲醇溶液的体积浓度为85％；
5)纯化：将遗忘性贝毒软骨藻酸粗提物进行洗脱，收集遗忘性贝毒软骨藻酸组分，旋转蒸发，除去溶剂，得到白色粉末，即为遗忘性贝毒软骨藻酸。
实施例4
一种利用海洋硅藻共栖细菌发酵制备遗忘性贝毒软骨藻酸的方法，包括以下步骤：
1)菌株活化：将斜面菌海洋硅藻共栖细菌Ponticoccus sp.LZ-7种接种到摇瓶种子液培养基中，其中摇瓶种子液培养基包括以下质量百分数的组分：酵母膏6％，蛋白胨5％，葡萄糖1％，余量为天然海水；在32℃下培养15h，得到活化菌株种子液；
2)种子液准备：向种子培养液中通入蒸汽加热，123℃灭菌35min，冷却至31℃，种子培养液包括以下质量百分数的组分：酵母膏6％，蛋白胨5％，葡萄糖1％，余量为天然海水；采用火种接种法将活化菌株种子液接种到种子培养液中，活化菌株种子液接种量为15％，通气搅拌，通气量为50L/min，搅拌速率为180r/min，33℃下恒温培养18h，得到种子液；
3)发酵：向发酵液中通入蒸汽加热，123℃灭菌35min，冷却至31℃，发酵液包括以下质量百分数的组分：酵母膏10％，蛋白胨6％，葡萄糖6％，精氨酸0.1％，氯化钾0.3％，氯化钙0.05％，余量为天然海水；将步骤2)得到的种子液接种到发酵液中，种子液接种量为5％，通气搅拌，通气量为60L/min，搅拌转速160r/min，33℃下恒温培养52h，得到遗忘性贝毒软骨藻酸发酵液；
4)提取：将遗忘性贝毒软骨藻酸发酵液进行板框过滤得到菌体，加入甲醇溶液，静置20min，过滤，得到一次提取液和过滤菌体；将过滤菌体加入甲醇溶液中，静置20min，过滤，得到二次提取液和过滤菌体；将过滤菌体加入甲醇溶液中，静置20min，过滤，得到三次提取液，将一次提取液、二次提取液和三次提取液合并，旋蒸浓缩，得到遗忘性贝毒软骨藻酸粗提物，其中甲醇溶液的体积浓度为85％；
5)纯化：将遗忘性贝毒软骨藻酸粗提物进行洗脱，收集遗忘性贝毒软骨藻酸组分，旋转蒸发，除去溶剂，得到白色粉末，即为遗忘性贝毒软骨藻酸。
实施例5
一种利用海洋硅藻共栖细菌发酵制备遗忘性贝毒软骨藻酸的方法，包括以下步骤：
1)菌株活化：将斜面菌海洋硅藻共栖细菌Ponticoccus sp.LZ-7种接种到摇瓶种子液培养基中，其中摇瓶种子液培养基包括以下质量百分数的组分：酵母膏3％，蛋白胨2％，葡萄糖0.5％，余量为天然海水；在30℃下培养12h，得到活化菌株种子液；
2)种子液准备：向种子培养液中通入蒸汽加热，121℃灭菌25min，冷却至30℃，种子培养液包括以下质量百分数的组分：酵母膏3％，蛋白胨2％，葡萄糖0.5％，余量为天然海水；采用火种接种法将活化菌株种子液接种到种子培养液中，活化菌株种子液接种量为10％，通气搅拌，通气量为40L/min，搅拌速率为160r/min，30℃下恒温培养15h，得到种子液；
3)发酵：向发酵液中通入蒸汽加热，121℃灭菌25min，冷却至30℃，发酵液包括以下质量百分数的组分：酵母膏5％，蛋白胨3％，葡萄糖3％，精氨酸0.05％，氯化钾0.2％，氯化钙0.02％，余量为天然海水；将步骤2)得到的种子液接种到发酵液中，种子液接种量为2％，通气搅拌，通气量为40L/min，搅拌转速140r/min，30℃下恒温培养48h，得到遗忘性贝毒软骨藻酸发酵液；
4)提取：将遗忘性贝毒软骨藻酸发酵液进行板框过滤得到菌体，加入甲醇溶液，静置10min，过滤，得到一次提取液和过滤菌体；将过滤菌体加入甲醇溶液中，静置10min，过滤，得到二次提取液和过滤菌体；将过滤菌体加入甲醇溶液中，静置10min，过滤，得到三次提取液，将一次提取液、二次提取液和三次提取液合并，旋蒸浓缩，得到遗忘性贝毒软骨藻酸粗提物，其中甲醇溶液的体积浓度为75％；
5)纯化：将遗忘性贝毒软骨藻酸粗提物进行洗脱，收集遗忘性贝毒软骨藻酸组分，旋转蒸发，除去溶剂，得到白色粉末，即为遗忘性贝毒软骨藻酸。
经检测本发明利用海洋硅藻共栖细菌Ponticoccus sp.LZ-7在30-33℃下恒温培养发酵48-52h后，该菌种发酵软骨藻酸产率较高，可达5.5-5.8μg/L发酵液。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (4)

1.一种利用海洋硅藻共栖细菌发酵制备遗忘性贝毒软骨藻酸的方法，其特征在于，
包括以下步骤：
1）菌株活化：将斜面菌种接种到摇瓶种子液培养基中，在30-32℃下培养12-15h，得到活化菌株种子液；
菌种为海洋硅藻共栖细菌Ponticoccus sp. LZ-7，已于2017年10月18日保藏于中国典型培养物中心CCTCC，其保藏编号为：CCTCC AB 2017233；
摇瓶种子液培养基包括以下质量百分数的组分：酵母膏3-6%，蛋白胨2-5%，葡萄糖0.5-1%，余量为天然海水；
2）种子液准备：向种子培养液中通入蒸汽加热，121-123℃灭菌25-35min，冷却至30-31℃，采用火种接种法将活化菌株种子液接种到种子培养液中，通气搅拌，通气量为40-50 L/min，搅拌速率为160-180r/min，30-33℃下恒温培养15-18h，得到种子液；
种子培养液包括以下质量百分数的组分：
酵母膏3-6%，蛋白胨2-5%，葡萄糖0.5-1%，余量为天然海水；
3）发酵：向发酵液中通入蒸汽加热，121-123℃灭菌25-35min，冷却至30-31℃，将步骤2）得到的种子液接种到发酵液中，通气搅拌，通气量为40-60L/min，搅拌转速140-160r/min，30-33℃下恒温培养48-52h，得到遗忘性贝毒软骨藻酸发酵液；
发酵液包括以下质量百分数的组分：
酵母膏5-10%，蛋白胨3-6%，葡萄糖3-6%，精氨酸0.05-0.1%，氯化钾0.2-0.3%，氯化钙0.02-0.05%，余量为天然海水；
4）提取：将遗忘性贝毒软骨藻酸发酵液进行板框过滤得到菌体，加入甲醇溶液，静置10-20min，过滤，得到一次提取液和过滤菌体；将过滤菌体加入甲醇溶液中，静置10-20min，过滤，得到二次提取液和过滤菌体；将过滤菌体加入甲醇溶液中，静置10-20min，过滤，得到三次提取液，将一次提取液、二次提取液和三次提取液合并，旋蒸浓缩，得到遗忘性贝毒软骨藻酸粗提物；
5）纯化：将遗忘性贝毒软骨藻酸粗提物进行洗脱，收集遗忘性贝毒软骨藻酸组分，旋转蒸发，除去溶剂，得到白色粉末，即为遗忘性贝毒软骨藻酸。
2.根据权利要求1所述的一种利用海洋硅藻共栖细菌发酵制备遗忘性贝毒软骨藻酸的方法，其特征在于，所述步骤2）中活化菌株种子液接种量为10-15%。
3.根据权利要求1所述的一种利用海洋硅藻共栖细菌发酵制备遗忘性贝毒软骨藻酸的方法，其特征在于，所述步骤3）中种子液接种量为2-5%。
4.根据权利要求1所述的一种利用海洋硅藻共栖细菌发酵制备遗忘性贝毒软骨藻酸的方法，其特征在于，所述步骤4）中甲醇溶液的体积浓度为75-85%。
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