CN103320362A - 一株产谷氨酸脱羧酶的菌株及用其生产γ-氨基丁酸的方法 - Google Patents
一株产谷氨酸脱羧酶的菌株及用其生产γ-氨基丁酸的方法 Download PDFInfo
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Abstract
一株产谷氨酸脱羧酶的菌株及用其生产γ-氨基丁酸的方法，属于食品生物技术领域。本发明提供了一株从泡菜中筛选而来的植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）SK30.001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2013250，并提供了一种利用该菌株发酵生产γ-氨基丁酸的方法，该方法包括：（a）在发酵培养基中对该菌株进行培养，以得到该植物乳杆菌菌体；（b）用植物乳杆菌菌体转化谷氨酸钠生成γ-氨基丁酸；(c)γ-氨基丁酸的分离纯化。本发明生产的γ-氨基丁酸安全可靠，是一种很有市场潜力的功能性产品，被广泛的应用于食品、化妆品、医药等行业。本发明能高效地生产γ-氨基丁酸，适于进行大规模生产，为γ-氨基丁酸的工业化制备提供了新的方法。
Description
技术领域
本发明涉及能够生产谷氨酸脱羧酶的一种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SK30.001的筛选和利用该菌株发酵转化生产γ-氨基丁酸的方法，属于食品生物技术领域。
背景技术
γ-氨基丁酸（简称GABA）是一种重要的抑制性神经递质，对哺乳动物具有重要的生理调节作用，如降血压、改善睡眠和抗心率失常等。此外，近年发现GABA 对生殖系统有调节作用。因此GABA 的市场需求与日俱增，但其天然含量很低，单纯依靠天然物质的提取远远满足不了市场的需求。
目前生产GABA 的方法主要有化学合成法和生物合成法。生物合成法又分为植物富集法和微生物发酵法。相比而言，化学合成法历史悠久反应迅速，但所使用的原料价格昂贵、毒性大，反应条件剧烈、安全性差，所用的溶剂腐蚀性强、存在安全隐患，不宜用于食品工业。植物富集法成本高、产率低、具有较大局限性，由于微生物具有生长速度快周期短、生长条件温和、代谢过程简单和分布广泛等优点，所以微生物发酵法生产GABA 不受空间、环境、资源的限制，具有成本低、无化学残留、产量高等显著优点，是生产医药及食品级GABA 的一条理想途径。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的微生物植物乳杆菌株，发酵后采用菌体转化生成γ-氨基丁酸。
本发明的另一个目的是提供一种利用上述植物乳杆菌株生产γ-氨基丁酸的方法。
本发明的再一个目的是提供一种从含γ-氨基丁酸的转化液中分离纯化γ-氨基丁酸的方法。
本发明的技术方案：从泡菜中分离得到一株产γ-氨基丁酸的菌株，根据一定法则的菌类学性质、生物化学性质的分析和16sRNA序列的测定得出其分类命名为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SK30.001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2013250。
一种利用所述的菌株CCTCC NO:M 2013250生产γ-氨基丁酸的方法，用所述的微生物植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SK30.001为出发菌株，经种子培养、液体发酵、菌体转化生产γ-氨基丁酸，及γ-氨基丁酸的分离提取。具体步骤为：
（1）种子培养
种子培养基：蛋白胨10-15 g/L，牛肉膏10-20 g/L，酵母0-10 g/L，柠檬酸氢二铵 0-3g/L，葡萄糖 20-40 g/L，吐温80 1-2 mL/L，乙酸钠0-8 g/L，磷酸氢二钾0-5 g/L，硫酸镁0-2g/L，硫酸锰0-3 g/L，去离子水配制；
种子培养条件：以植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SK30.001为出发菌株，于20-37℃，静置培养10-24h；
（2）发酵培养
发酵培养基：蛋白胨10-15 g/L，牛肉膏10-20 g/L，酵母0-10 g/L，柠檬酸氢二铵 0-3g/L，蔗糖 20-40 g/L，吐温80 1-2 mL/L，乙酸钠0-8 g/L，磷酸氢二钾0-5 g/L，硫酸镁0-2g/L，硫酸锰0-3 g/L，硫酸锌0-8g/L，去离子水配制；调pH5-7；
发酵条件：接种量1%-10%，温度30-37℃的条件下静置在发酵培养基中发酵10-24h；
（3）菌体转化：用植物乳杆菌CCTCC NO:M 2013250菌体转化谷氨酸钠生成γ-氨基丁酸；
将发酵液进行离心：2000-4000g离心5-25min，得植物乳杆菌CCTCC NO:M 2013250菌体；
转化条件：采用谷氨酸钠含量为5-20g/L，pH2-8的缓冲溶液悬浮菌体（菌体浓度1%-10%），在温度为30-60℃条件下转化10-40h，得转化液；
（4）γ-氨基丁酸的分离提取
将转化液经离心、絮凝、板框过滤、脱色、离子交换、真空浓缩和喷雾干燥后，得到纯化的γ-氨基丁酸。
所述的离心：2000-4000g离心5-25 min，收集含γ-氨基丁酸的上清液；
所述的絮凝：上清液在30-80℃下，加入100-300mg/L壳聚糖搅拌絮凝；
所述的板框过滤：将絮凝液循环压入板框过滤机压滤，直至滤液变清为止；
所述的脱色：采用活性炭脱色；滤液中加入1%的活性炭，于40℃下保持40min，过滤分离直至滤液澄清；
所述的离子交换：以1-3倍床体积流速上柱，待阳离子交换树脂吸附饱和后，采用2-5mol/L氨水洗脱；
所述的真空浓缩：采用外循环式，总固形物达到20%-50%停止；
所述的喷雾干燥：进风温度为100-200℃，出风温度为50-100℃。
本发明的有益效果：本发明涉及一株从泡菜中筛选而来的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SK30.001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2013250。在以蔗糖为碳源的发酵培养基中经10-24h的发酵，经过菌体转化，转化液中的γ-氨基丁酸浓度达到1-8g/L，为γ-氨基丁酸的工业化制备提供了新的方法。本发明生产的γ-氨基丁酸安全可靠，是一种很有市场潜力的功能性产品，被广泛的应用于食品、化妆品、医药等行业。本发明能高效地生产γ-氨基丁酸，适于进行大规模生产。
生物材料样品保藏：一株产γ-氨基丁酸的菌株，其分类命名为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SK30.001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2013250，保藏日期2013年6月5日。
具体实施方式
以下是植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SK30.001进行发酵生产γ-氨基丁酸的实施例，但本发明的技术范围并不限于所列出的几个实例，在不改变其要点的前提下，可做各种改变进行实施。另外，本发明的技术范围延及均等的范围。
实施例1植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SK30.001菌株的发酵培养
在培养基A上将上述菌株于30℃培养24小时。用该培养物接种在含有100mL的种子培养基B中，30℃下培养24h，再转接于发酵培养基C中，接种量1%-10%，30℃下发酵24。
培养基A：蛋白胨11 g/L，牛肉膏20 g/L，酵母10 g/L，柠檬酸氢二铵 1g/L，葡萄糖 20g/L，吐温80 1ml/L，乙酸钠1g/L，磷酸氢二钾2 g/L，硫酸镁0.7g/L，硫酸锰0.7g/L，琼脂2%；
种子培养基B：蛋白胨11 g/L，牛肉膏20 g/L，酵母10 g/L，柠檬酸氢二铵 1g/L，葡萄糖20g/L，吐温80 1mL/L，乙酸钠1g/L，磷酸氢二钾2 g/L，硫酸镁0.7g/L，硫酸锰0.7g/L，去离子水配制；
发酵培养基C：蛋白胨15 g/L，牛肉膏20 g/L，酵母10 g/L，柠檬酸氢二铵 3g/L，蔗糖 40 g/L，吐温80 2 mL/L，乙酸钠2 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，硫酸镁1g/L，硫酸锰0.5 g/L，硫酸锌0.5g/L，去离子水配制，调pH6.5。
实施例2
将新型γ-氨基丁酸生产菌送往中国典型培养物保藏中心测定该菌的形态特征、生理生化特性以及16sRNA基因序列分析，鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SK30.001。
实施例3 细胞转化生产γ-氨基丁酸
离心：发酵菌体2000g离心5 min。
转化条件：采用谷氨酸钠含量为8g/L，pH4.0的缓冲溶液悬浮菌体，在温度为30℃条件下转化36h，得转化液。
实施例4 γ-氨基丁酸的分离纯化
离心过滤：转化液经冷冻离心后，收集含γ-氨基丁酸的上清液。
絮凝：上清液在30℃下，加入100mg/L壳聚糖搅拌絮凝。
板框过滤：将絮凝液循环压入板框过滤机压滤，直至滤液变清为止。
脱色：滤液中加入1%的活性炭，于40℃下保持40min，过滤分离直至滤液澄清；
离子交换：以1-3倍床体积流速上柱，待阳离子交换树脂吸附饱和后，采用2mol/L氨水洗脱。
真空浓缩：采用外循环式，总固形物达到20%左右停止。
喷雾干燥：浓缩后样品喷雾干燥，进风温度为185℃，出风温度为80℃。
Claims (2)
1.一株产γ-氨基丁酸的菌株，其分类命名为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SK30.001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2013250。
2.一种利用权利要求1所述的菌株CCTCC NO:M 2013250生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于以植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SK30.001为出发菌株，经种子培养、液体发酵、菌体转化生产γ-氨基丁酸、及γ-氨基丁酸的分离提取；步骤为：
（1）种子培养
种子培养基：蛋白胨10-15 g/L，牛肉膏10-20 g/L，酵母0-10 g/L，柠檬酸氢二铵 0-3g/L，葡萄糖 20-40 g/L，吐温80 1-2 mL/L，乙酸钠0-8 g/L，磷酸氢二钾0-5 g/L，硫酸镁0-2g/L，硫酸锰0-3 g/L，去离子水配制；
种子培养条件：以植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SK30.001为出发菌株，于20-37℃，静置培养10-24h；
（2）发酵培养
发酵培养基：蛋白胨10-15 g/L，牛肉膏10-20 g/L，酵母0-10 g/L，柠檬酸氢二铵 0-3g/L，蔗糖 20-40 g/L，吐温80 1-2 mL/L，乙酸钠0-8 g/L，磷酸氢二钾0-5 g/L，硫酸镁0-2g/L，硫酸锰0-3 g/L，硫酸锌0-8g/L，去离子水配制；调pH5-7；
发酵条件：接种量1%-10%，温度30-37℃的条件下静置在发酵培养基中发酵10-24h；
（3）菌体转化：用植物乳杆菌CCTCC NO:M 2013250菌体转化谷氨酸钠生成γ-氨基丁酸；
将发酵液进行离心：2000-4000g离心5-25min，得植物乳杆菌CCTCC NO:M 2013250菌体；
转化条件：采用谷氨酸钠含量为5-20g/L，pH2-8的缓冲溶液悬浮菌体，菌体浓度1%-10%，在温度为30-60℃条件下转化10-40h，得转化液；
（4）γ-氨基丁酸的分离提取：
将转化液经离心、絮凝、板框过滤、脱色、离子交换、真空浓缩和喷雾干燥后，得到纯化的γ-氨基丁酸；
所述的离心为2000-4000g离心5-25 min，收集含γ-氨基丁酸的上清液；
所述的絮凝：上清液在30-80℃下，加入100-300mg/L壳聚糖搅拌絮凝；
所述的板框过滤：将絮凝液循环压入板框过滤机压滤，直至滤液变清为止；
所述的脱色：采用活性炭脱色；滤液中加入1%的活性炭，于40℃下保持40min，过滤分离直至滤液澄清；
所述的离子交换：以1-3倍床体积流速上柱，待阳离子交换树脂吸附饱和后，采用2-5mol/L氨水洗脱；
所述的真空浓缩：采用外循环式，总固形物达到20%-50%停止；
所述的喷雾干燥：进风温度为100-200℃，出风温度为50-100℃。
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