CN110339101A - 一种含有γ-氨基丁酸的海藻发酵液原浆及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含有γ‑氨基丁酸的海藻发酵液原浆及其制备方法与应用，所述制备方法包括以下步骤：S1、在产γ‑氨基丁酸植物乳杆菌的发酵液中添加海藻粉，并将产γ‑氨基丁酸的植物乳杆菌接种到发酵培养基上进行发酵获得含γ‑氨基丁酸的海藻发酵液；S2、对发酵液进行离心后，收集上清液，将并上清液中的含有γ‑氨基丁酸的海藻发酵液原浆提取出来。本发明方案制得的发酵液原浆可直接用于化妆品中，该方法安全性高、无污染、护肤效果好、稳定性高，制得的原浆既具有良好的抗氧化性能，同时还具有良好的保湿性能。

Description

一种含有γ-氨基丁酸的海藻发酵液原浆及其制备方法与 应用

技术领域

本发明涉及生物工程发酵技术领域，具体涉及一种含有γ-氨基丁酸的海藻发酵液原浆及其制备方法与应用。

背景技术

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)又称4-氨基丁酸、氨酪酸或哌啶酸，是一种普遍存在的非蛋白质组成的天然氨基酸。GABA作为哺乳动物中枢神经系统中一种主要的抑制性神经递质，由谷氨酸脱酸酶催化L-谷氨酸钠发生不可逆的α-脱羧反应而生成，其介导了40％以上的抑制性神经传导，具有降血压、促进睡眠、增强记忆力、抗焦虑、预防癫痫、延缓脑衰老、增强生殖功能等多种功能。自然界中的GABA分布极为广泛，在动物、植物和微生物中均有存在，目前，GABA的制备方法主要有化学合成法和生物合成法。其中，化学合成法主要是以邻苯二甲酰亚氨钾和γ-氯丁氰在强烈条件下(180℃)反应，产物与浓硫酸回流水解，再经过结晶提纯而得到，然而由于反应条件剧烈，使用的化学试剂具有毒性和腐蚀性，副产物多，缺乏安全性且制得的GABA也不能用于食品或化妆品中，因此，化学合成法制得的GABA的应用范围有限。生物合成法主要是利用生物体的谷氨酸脱羧酶催化L-谷氨酸或L-谷氨酸钠盐的α-羧基发生脱羧反应，从而生成GABA。相对而言生物发酵是一种既安全又经济的方法，其反应条件温和，安全性高，是产GABA的一条较理想的途径。同时，随着人们对以化学原料合成γ-氨基丁酸安全性问题的认识，现越来越倾向于对天然γ-氨基丁酸的开发和应用。由于植物富集的GABA含量较低，因而微生物发酵生产GABA具有工业化开发前景。

现有技术中，通常使用大肠杆菌、曲霉菌、酵母菌或乳酸菌作为GABA的生产菌株，随着绿色食品的不断开发，乳酸菌等食品安全菌株逐渐替代了大肠杆菌用于制备GABA，同时，乳酸菌也是当今国际公认的食品安全级(美国FDA评价食品添加剂安全性指标，Generally Recognized as Safe，GRAS)微生物，利用乳酸菌发酵生产GABA是一种比较安全的生产方式。

海藻种类繁多，资源丰富，是重要的海洋资源，具有生长环境洁净、生命力强、活性成分含量高等优点，不仅含有丰富的蛋白质、维生素和矿物质，还含有海藻多糖、甘露醇、高不饱和氨基酸等丰富的生理活性物质，在欧美国家已成为被广泛仍可的护肤领域的主要功能性原料，众多一线护肤品牌均开发了海藻元素类护肤品。然而，目前海藻液的提取多是基于酸、碱法，该方法不仅提取率低，更重要的是酸碱的使用带来一系列污染处理问题，提高成本的同时对环境破坏严重。

将产GABA的优良乳酸菌进行处理后用来发酵海藻，所得海藻发酵液原浆同时具备GABA的抗衰老、抗氧化性及海藻提取液的优良保湿性能，若用作绿色的化妆品原料将具有极为重要的意义。然而，现有技术中尚未有相关报道。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是：提供一种安全性高且无污染含有γ-氨基丁酸的海藻发酵液原浆的制备方法。

本发明所要解决的第二个技术问题是：提供上述方法制得的海藻发酵液原浆。

本发明所要解决的第三个技术问题是：提供上述海藻发酵液原浆的应用。

为了解决上述第一个技术问题，本发明采用的技术方案为：一种含有γ-氨基丁酸的海藻发酵液原浆的制备方法，包括以下步骤：

S1、在产γ-氨基丁酸植物乳杆菌的发酵液中添加海藻粉，并将产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌接种到发酵培养基上进行发酵获得含γ-氨基丁酸的海藻发酵液；

S2、对发酵液进行离心后，收集上清液，将并上清液中的含有γ-氨基丁酸的海藻发酵液原浆提取出来。

进一步地，所述步骤S1中将产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌接种到发酵培养基的操作为：取种子液按接种量(1-6)％(V/V)接种于含L-谷氨酸钠(1g-6g)/100ml、海藻粉2.0％～7.0％的发酵培养基中，培养温度30℃～38℃、静置培养24～72h。

进一步地，在接种发酵菌种的同时，向发酵培养基中添加磷酸吡哆醛辅酶0-0.001mol/L以促进谷氨酸向γ-氨基丁酸的转化。

进一步地，发酵培养基制备操作如下：取海藻粉2.0％～7.0％、L-谷氨酸钠(1g-6g)/100ml、氮源1.5％～3.5％、碳源1.5％～2.5％、三水合乙酸钠(CH₃COONa·3H₂O)5.0g、二水合磷酸氢二钾(K₂HPO₄·3H₂O)2.0g、七水合硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.2g、水合硫酸锰(MnSO₄·H₂O)0.25g，然后用去离子水定容到1000ml，调节pH为6.8，灭菌处理后制得发酵液。

进一步地，所述氮源包括酵母膏或尿素中的至少一种。

进一步地，所述碳源包括麸皮、蔗糖、乳糖、果糖中的至少一种。

进一步地，所述海藻粉的粒度小于50μm。

进一步地，所述海藻粉包括绿藻、红藻或褐藻中的至少一种。

进一步地，所述步骤S1还包括发酵菌种的制备步骤：取产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌进行复活后，取液体培养基溶解后的菌悬液，接种于固体培养基中，涂布培养，培养温度为18～38℃，培养时间为24～48h，挑取单菌落作为种子菌。

优选地，所述固体培养基的配制方法：取蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸氢二铵[(NH₄)₂HC₆H₅O₇]2.0g、水合葡萄糖(C₆H₁₂O₆·H₂O)20.0g、吐温80 1.0mL、三水合乙酸钠(CH₃COONa·3H₂O)5.0g、三水合磷酸氢二钾(K₂HPO₄·3H₂O)2.0g、七水合硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.2g、水合硫酸锰(MnSO₄·H₂O)0.05g、琼脂15.0g，然后用去离子水定容到1000ml，调节pH为6.8，灭菌处理后冷却至50-60℃后分装在直径9cm的平皿上，凝固后制得固体平板。

进一步地，所述步骤S1还包括种子液的培养操作：挑取固体平板上复活至第三代的菌落，接种于种子液中，培养温度为18～38℃，静置培养12～18h，培养至对数期。

优选地，所述种子液的配制方法为：取蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸氢二铵[(NH₄)₂HC₆H₅O₇]2.0g、水合葡萄糖(C₆H₁₂O₆·H₂O)20.0g、吐温80 1.0mL、三水合乙酸钠(CH₃COONa·3H₂O)5.0g、三水合磷酸氢二钾(K₂HPO₄·3H₂O)2.0g、七水合硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.2g、水合硫酸锰(MnSO₄·H₂O)0.05g，然后用去离子水定容到1000ml，调节pH为6.8，灭菌处理并冷却后分装得到种子液。

进一步地，所述步骤S2中，所述离心操作的转速为5000～8000r/min，时间为10～20min。

进一步地，所述步骤S2中所述提取操作具体为：将离心处理后得到的上清液于沸水浴中加热5～10min，使大分子蛋白质变性、沉淀，然后经过固液分离，收集液相部分即为含有γ-氨基丁酸的海藻发酵液原浆。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种安全性高、无污染的益生菌发酵制备富含γ-氨基丁酸的海藻发酵液原浆的方法，本发明方案利用食品安全菌株植物乳杆菌，安全无害，制得的海藻发酵液原浆可直接用于化妆品的制备中；制备过程温和且操作简便。

为解决上述第二个技术问题，本发明采用的技术方案为：一种通过上述方法制得的海藻发酵液原浆。

为解决上述第三个技术问题，本发明采用的技术方案为：将上述海藻发酵液原浆应用于化妆品的制备中。

本发明的有益效果在于：本发明方案制得的发酵液原浆可直接应用于化妆品开发，制备过程中添加的各物料均为安全无毒试剂，安全性高、无污染且稳定性好；本发明方案的发酵液原浆既具有GABA的抗衰老、抗氧化性，又具有海藻提取液的优良保湿性能；同时，从实施例中的数据可以看出，随着化妆品中的GABA含量的不断增加，该化妆品对机体的DPPH自由基的清除能力不断增强，由此表明，本发明方案中的发酵液原浆保留了GABA优良的自由基清除能力和抗氧化作用。

附图说明

图1为本发明实施例的植物乳杆菌的菌落分布图；

图2为本发明实施例中测得的含有GABA的海藻发酵液原浆的10倍稀释流的高效色谱图；

图3为本发明实施例中不同发酵条件下发酵液原浆中GABA含量与发酵条件的关系图；

图4为本发明实施例测得的不同添加比例发酵液原浆与DPPH清除率的关系图。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。

本发明的实施例为：一种含γ-氨基丁酸的海藻发酵液原浆，其制备方法如下：

(1)发酵菌种的准备：取产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌CICC24202(市购)冻干粉进行复活，取100μL MRS液体培养基溶解后的菌悬液，接种于固体培养基中，涂布培养，培养温度37℃，培养时间24h，挑取单菌落作为种子菌。其中，固体培养基的配制方法如下：取蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸氢二铵[(NH₄)₂HC₆H₅O₇]2.0g、葡萄糖(C₆H₁₂O₆·H₂O)20.0g、吐温80 1.0mL、乙酸钠(CH₃COONa·3H₂O)5.0g、磷酸氢二钾(K₂HPO₄·3H₂O)2.0g、硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.2g、硫酸锰(MnSO₄·H₂O)0.05g、琼脂15.0g，然后用去离子水定容到1000ml，调节pH为6.8，盖上高温灭菌膜，最后在温度121℃中高压蒸汽灭菌20min，冷却至55℃后分装在直径9cm的平板培养皿上，凝固后制得固体平板。

(2)种子液培养：挑取固体平板上复活至第三代的单一菌落，接种于种子液中，培养温度37℃、静置培养18h，培养至对数期。其中，种子液的配制方法如下：取蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸氢二铵[(NH₄)₂HC₆H₅O₇]2.0g、葡萄糖(C₆H₁₂O₆·H₂O)20.0g、吐温80 1.0mL、乙酸钠(CH₃COONa·3H₂O)5.0g、磷酸氢二钾(K₂HPO₄·3H₂O)2.0g、硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.2g、硫酸锰(MnSO₄·H₂O)0.05g，然后用去离子水定容到1000ml，调节pH为6.8，分装到若干个250ml摇瓶中，盖上高温灭菌膜，最后在温度121℃中高压蒸汽灭菌20min，冷却后分装在试管中得到种子液。

(3)发酵液培养：取上述操作步骤(2)制得的种子液按接种量3％(V/V)接种于含L-谷氨酸钠和海藻粉的发酵培养基中，植物乳杆菌的菌落分布图如图1所示，培养温度32℃、静置培养48h。发酵培养基制备：取海藻粉4.0％、L-谷氨酸钠3g/100ml、氮源2％、碳源2％、乙酸钠(CH₃COONa·3H₂O)5.0g、磷酸氢二钾(K₂HPO₄·3H₂O)2.0g、硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.2g、硫酸锰(MnSO₄·H₂O)0.05g，然后用去离子水定容到1000ml，调节pH为6.8，在温度121℃中高压蒸汽灭菌20min制得发酵液。接种发酵菌种的同时，往发酵培养液中添加磷酸吡哆醛辅酶0.0005mol/L以促进谷氨酸向γ-氨基丁酸的转化。发酵液中海藻粉为绿藻。氮源为酵母膏和尿素的混合物。碳源为麸皮。

(4)发酵液的处理：将上述(3)发酵结束后将植物乳杆菌γ-氨基丁酸发酵液进行高速离心除去菌体，所述发酵液离心转速为7000r/min，离心15min，取上清。然后将上清液置于100℃水浴中加热8min，使大分子蛋白质变性、沉淀。最后将热处理后的上清液再次进行7000rpm、15min离心，固液分离后所得液相组分为含γ-氨基丁酸的海藻发酵液原浆。

对上述操作制得的含γ-氨基丁酸的海藻发酵液原浆中的功能性成分(GABA)利用高效液相色谱仪进行检测：将分别取200μL发酵液原浆上清和GABA标准液(1mg/ml)于(可直接用带过滤膜的抢头进行取样)色谱进样瓶中，加入800μL邻苯二甲醛(O-pathaldialdehyde，OPA)衍生液进行稀释，震荡5s，过0.45μm滤膜，收集过滤后溶液于样品瓶中，准备进行高效液相色谱。

色谱分析条件：色谱柱：C18色谱柱(250×4.6mm，5μm)。流动相：流动相A为纯乙腈；流动相B为25mmol/L乙酸钠，用5％乙酸调pH至5.90。设置液相色谱流动相流速为1mL/min，保持柱温40℃，进样量5μL，检测波长334nm。洗脱梯度程序如下表1所示：

表1γ-氨基丁酸液相色谱分析的梯度洗脱程序

测得含γ-氨基丁酸的海藻发酵液原浆的10倍稀释液的高效色谱图分别如图2所示。从图3中可以看出，保留时间在11min左右时，发酵液色谱原浆样品中存在与GABA标准品对应的GABA的特征吸收峰，由此表明在本实施例制得的含有γ-氨基丁酸海藻发酵液原浆的确存在γ-氨基丁酸。利用GABA标准液制备系统浓度样品，绘制出标准曲线后，计算得出在该发酵条件下所得原浆液中GABA的浓度约为100g/L。

对比不同发酵温度及不同发酵时间对含有γ-氨基丁酸海藻发酵液原浆中GABA含量的影响：分别取18℃和32℃下发酵了24h、48h及72h后的发酵液，通过如上述操作的高效液相色谱法测定发酵液中的GABA含量，结果如图3所示，从图3中可以看出，当温度为32℃时，GABA的产量远高于18℃，且随发酵时间的延长GABA的产量呈现抛物线式增长，当发酵时间为48h时，GABA的产量近100g/L，优于24h和72h。

抗氧化性能效果测试：

通过DPPH法检测添加有上述操作制得的含γ-氨基丁酸海藻发酵液原浆的化妆品的抗氧化性：

化妆品(青春面膜)的制备：含γ-氨基丁酸海藻发酵液原浆添加量分别为0％，1％，3％，5％，10％其他成分按照以下配方量取：

A组分

去离子水 余量

卡波940 0.3份

透明质酸钠(中分子) 0.05份

甘油 4份

1，3-丙二醇 4份

B组分

角鲨烷 1份

聚二甲基硅氧烷(DC200/100) 2份

异壬酸异壬酯(LANOL 99) 4份

植物甾醇 0.5份

乙烯基聚二甲硅(EL61) 0.3份

C组分

丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物(SEPINOVEMT 10) 0.4份

D组分

KOH(10％) 0.6份

E组分

葡聚糖 1份

A631(含甘油辛酸酯、辛酰羟肟酸和1，2-戊二醇) 0.5份

己二醇 0.5份

燕麦生物碱 0.5份

γ-氨基丁酸海藻发酵液原浆 0.5─5份

总计 100份

制备操作具体为：

步骤1)：用纯热水洗净消毒乳化锅；

步骤2)：将去离子水(补加3％消耗水)加入乳化锅中，加入透明质酸钠(小分子)完全沉浸在水里，乳化锅开均质搅拌至完全分散后，投入A相剩余物料后，升温至85℃，中速(450rpm)均质4分钟，保温搅拌30分钟；

步骤3)：降温至40℃加入B相物料，搅拌均匀，检验合格后出锅，然后送检待出料，即得。

②试液的制备：分别准确称取5mg不同添加量(0％，1％，3％，5％，10％)的含γ-氨基丁酸海藻发酵液原浆的化妆品，用无水乙醇溶解，并定量转入50ml容量瓶中，用无水乙醇定量至刻度，得到不同添加量的含γ-氨基丁酸海藻发酵液原浆化妆品液。

③DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)清除率的测定：在10mL比色管中依次加入4.0mL DPPH溶液和4.0mL含γ-氨基丁酸海藻发酵液原浆化妆品液，再分别加入无水乙醇至刻度，混匀立即用1cm比色皿在517nm波长处测吸光值(A)，吸光值记为Ai，再在温室避光保存30min后测吸光值，记为Aj，对照试验为只加DPPH的乙醇溶液，其吸光值记为Ac。按下式计算自由基清除率(K)：

K(％)＝[1-(Ai-Aj)/Ac]*100％

试验重复三次，取其平均值作为最后结果，并计算三次结果的标准差，结果如下表2所示。

表2 DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)清除率的测定(抗氧化性研究)

从上表中可以看出，添加有发酵原浆的化妆品液的DPPH的清除效果稳定且清除效果远优于未添加组。

不同发酵液原浆添加比例与DPPH清除率的对应关系如图4所示，从图4中可以看出，随着发酵液原浆添加量的增加，DPPH的清除率增加，表明本发明方案原浆中的γ-氨基丁酸具有良好的自由基清除能力和良好的抗氧化作用。同时，增加率趋势呈现类似于指数增长，即随着原浆添加量的增加，DPPH的清除率增加的速度减缓。

保湿性能测试：

①含γ-氨基丁酸海藻发酵液原浆化妆品的制备：含γ-氨基丁酸海藻发酵液原浆添加量为3％，其他成分参考以下护肤品(乳液)的配方。

A组分

C14-22烷基醇/C12-20烷基葡糖苷(MONTANOV L) 1份

吐温-60(Crillet 3) 0.5份

合成角鲨烷 5份

LANOL 99 4份

异十六烷 3份

聚二甲基硅氧迷烷(DC200/100CST) 2份

B组分

去离子水 65.65份

甘油 4份

1，3-丙二醇 5份

透明质酸(HA) 0.05份

汉生胶 0.1份

甘油聚醚-26 4份

丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物(Sepinov EMT10) 0.4份

馨鲜酮 0.5份

C组分

丙烯酸钠/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物(和)异十六碳烷(和)聚山梨醇酯-80(Sepigel EG) 0.3份

D组分

高分子异聚多糖(WSK-1) 0.2份

海藻提取物 0.5份

1，2-己二醇 0.5份

P10提取物 0.3份

γ-氨基丁酸海藻发酵液原浆 3份

总计 100份

所述P10提取物包括莲(Nelumbo Nucifera)籽提取物、忍冬(Lonicera Japonica)花提取物、牛蒡(Arctium lappa)籽提取物、知母(Anemarrhena asphodeloides)根提取物、连翘(Forsythia suspensa)果提取物、库拉索芦荟(Aloe vera)叶提取物、穿心莲(Andrographis Paniculata)提取物、蜂胶提取物、积雪草(Centella asiatica)提取物和甘草(Glycyrrhiza uralensis)提取物。该乳液参照以下步骤进行制备：

步骤1)：用纯热水洗净消毒乳化锅；

步骤2)：将A相原料加入到乳化锅中，加热到80℃，搅拌均匀。

步骤3)：将B相去离子水(补加3％消耗水)加入乳化锅中，加入HA(中分子)完全沉浸在水中，乳化锅开均质搅拌至完全分散后，投入剩下的B相原料，升温至85℃，中速均质4分钟，保温搅拌30分钟；

步骤4)：将A相加入均质搅拌8分钟至乳化完全；

步骤5)：降温至60℃，加入C相搅拌均匀；

步骤6)：降温至40℃加入D相，搅拌均匀，检验合格后出锅。

②对照品的制备：分别配制10％甘油水溶液、l％透明质酸水溶液、l％羧甲基壳聚糖水溶液。

③保湿性实验：

将3％γ-氨基丁酸海藻发酵液原浆水溶液、普通海藻发酵液原浆(市购)、10％甘油水溶液、l％透明质酸、l％羧甲基壳聚糖在20℃时，置入以硅胶为干燥机的同一干燥器环境中，放置48h，每隔1h称出样品水份减少量。计算出它们的保水量：

保水量＝残存水份质量/样品质量

结果如下表3所示：

表3不同保湿剂的保水量结果表

从上表3中可以看出，本发明方案的γ-氨基丁酸海藻发酵液原浆水溶液的保湿性能远优于普通的海藻发酵原浆。

本发明方案中所用的菌种为植物乳杆菌(CICC24202)，拉丁名称：Lactobacillusplantarum。其菌落为微小圆形白色菌落，凸起，边缘整齐；细胞杆状，短链状，无芽胞，属于革兰氏阳性菌，产γ-氨基丁酸。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种含有γ-氨基丁酸的海藻发酵液原浆的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、在产γ-氨基丁酸植物乳杆菌的发酵液中添加海藻粉，并将产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌接种到发酵培养基上进行发酵获得含γ-氨基丁酸的海藻发酵液；

S2、对发酵液进行离心后，收集上清液，将并上清液中的含有γ-氨基丁酸的海藻发酵液原浆提取出来。

2.根据权利要求1所述的含有γ-氨基丁酸的海藻发酵液原浆的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中将产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌接种到发酵培养基的操作为：取种子液按接种量(1-6)％(V/V)接种于含L-谷氨酸钠和海藻粉的发酵培养基中，培养温度30℃～38℃、静置培养24～72h。

3.根据权利要求2所述的含有γ-氨基丁酸的海藻发酵液原浆的制备方法，其特征在于：在接种发酵菌种的同时，向发酵培养基中添加磷酸吡哆醛辅酶0-0.001mol/L以促进谷氨酸向γ-氨基丁酸的转化。

4.根据权利要求2所述的含有γ-氨基丁酸的海藻发酵液原浆的制备方法，其特征在于：发酵培养基制备操作如下：取海藻粉2.0％～7.0％、L-谷氨酸钠(1g-6g)/100ml、氮源1.5％～3.5％、碳源1.5％～2.5％、CH₃COONa·3H₂O 5.0g、K₂HPO₄·3H₂O 2.0g、MgSO₄·7H₂O0.2g、MnSO₄·H₂O 0.25g，然后用去离子水定容到1000ml，调节pH为6.8，灭菌处理后制得发酵液。

5.根据权利要求1所述的含有γ-氨基丁酸的海藻发酵液原浆的制备方法，其特征在于：所述步骤S1还包括发酵菌种的制备步骤：取产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌进行复活后，取液体培养基溶解后的菌悬液，接种于固体培养基中，涂布培养，培养温度为18～38℃，培养时间为24～48h，挑取单菌落作为种子菌。

6.根据权利要求5所述的含有γ-氨基丁酸的海藻发酵液原浆的制备方法，其特征在于：所述固体培养基的配制方法：取蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、C₆H₁₂O₆·H₂O 20.0g、吐温80 1.0mL、CH₃COONa·3H₂O 5.0g、K₂HPO₄·3H₂O 2.0g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、MnSO₄·H₂O 0.05g、琼脂15.0g，然后用去离子水定容到1000ml，调节pH为6.8，灭菌处理后冷却至50-60℃后分装在直径9cm的平皿上，凝固后制得固体平板。

7.根据权利要求1所述的含有γ-氨基丁酸的海藻发酵液原浆的制备方法，其特征在于：所述步骤S1还包括种子液的培养操作：挑取固体平板上复活至第三代的菌落，接种于种子液中，培养温度为18～38℃，静置培养12～18h，培养至对数期；优选地，所述种子液的配制方法为：取蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、C₆H₁₂O₆·H₂O20.0g、吐温-80 1.0mL、CH₃COONa·3H₂O 5.0g、K₂HPO₄·3H₂O 2.0g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、MnSO₄·H₂O 0.05g，然后用去离子水定容到1000ml，调节pH为6.8，灭菌处理并冷却后分装得到种子液。

8.根据权利要求1所述的含有γ-氨基丁酸的海藻发酵液原浆的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中所述提取操作具体为：将离心处理后得到的上清液于沸水浴中加热5～10min，使大分子蛋白质变性、沉淀，然后经过固液分离，收集液相部分即为含有γ-氨基丁酸的海藻发酵液原浆。

9.一种通过如权利要求1-8任一项所述的方法制得的含有γ-氨基丁酸的海藻发酵液原浆。

10.一种如权利要求9所述的含有γ-氨基丁酸的海藻发酵液原浆在化妆品的制备的应用。