CN107475151B - 一株高产γ-氨基丁酸的乳酸菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明筛选出了一株高产γ‑氨基丁酸副短乳酸杆菌（Lactobacillus parabrevis）HX12‑19，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCCM2017307。本发明副短乳杆菌HX12‑19从食品材料中分离筛选获得，安全性高，可用于食品等领域；采用传统发酵和生物转化分段控制，充分利用生物酶转化得到产物γ‑氨基丁酸，大大提高生产效率，降低成本，发酵产率可达235 g/L，具备生产竞争力；产品采用结晶方式进行精制，纯度可达98%，适用于工业化生产。

Description

一株高产γ-氨基丁酸的乳酸菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株乳酸菌及该菌种在生产γ-氨基丁酸方面的应用，属于微生物发酵工程领域。
背景技术
γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid，简称GABA），广泛分布于原核和真核生物中。2009年9月，我国卫生部批准γ-氨基丁酸为新资源食品。
GABA具有抗高血压、促睡眠、增进脑机能及肝功能等功能，在化妆品中还可以起到抗皱、美白、保湿等功效。GABA在国外广泛应用于化妆品、药品、保健品、食品中。随着近年来欧、美等发达国家在原料上提出了以绿色健康为主题的开发倾向，含有安全性高的功能因子GABA的食品和化妆品会更加的受到消费者的欢迎。
GABA的天然含量很低，单纯依靠天然物质的提取远远满足不了市场的需求。同化学合成法和自然富集法相比，微生物发酵法不受空间、环境、资源的限制，具有成本低、无化学残留、产量高等显著优点，是生产GABA的理想途径。
目前发酵法生产的GABA产品以20-90%居多，且产品多成黄色，有气味，纯度高的产品分离纯化复杂，成本较高。随着GABA逐渐被国内消费者认知，应用安全菌生产天然原料GABA，绿色安全，符合消费者的需求。而市场上发酵法生产的高纯度的GABA产品成本较高，不能满足未来市场需求，因此，筛选高产菌种，改进生产工艺是当务之急。
发明内容
为解决发酵产率低、分离纯化难的问题，本发明提供了一株从自然界中筛选的乳酸菌及利用该菌种发酵生产高纯度GABA的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一株副短乳杆菌(Lactobacillus parabrevis)HX12-19，保藏于中国典型培养物保藏中 心(CCTCC)，保藏单位地址为中国武汉，保藏编号 为：CCTCCM2017307，保藏日期为2017年6月6日。
所述菌株的16s rRNA序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
一种上述副短乳杆菌的发酵培养基，包括以下组分：蛋白胨8.0-12.0 g/L，酵母粉8.0-12.0 g/L，味精（谷氨酸钠≥95%）8.0-12.0g/L，葡萄糖8.0-12.0 g/L，吐温80 0.5-1.5mL/L，乙酸钠4.0-6.0 g/L，磷酸氢二钾1.5-2.5 g/L，硫酸镁0.4-0.8g/L，硫酸锰0.2-0.4 g/L。
一种发酵法制备高纯度γ-氨基丁酸的方法，采用以下步骤：
（1）种子液制备：将副短乳杆菌HX12-19接入种子培养基，摇瓶发酵至一定菌体密度，获得种子液；
（2）发酵：将种子液接入发酵罐培养基，通气搅拌培养，当菌体达一定密度时，结束发酵，获得发酵液；
（3）转化：离心收集菌体，进行转化反应，间断添加底物并调节pH值，获得转化液；
（4）脱色：升温并保持一段时间，快速降温后添加活性炭，吸附、过滤；
（5）结晶：蒸发结晶获得结晶液，分离固液，用乙醇洗涤固体；
（6）干燥：将洗涤后的固体进行真空干燥得γ-氨基丁酸产品。
所述步骤（1）的液体培养基为副短乳杆菌发酵培养基，pH值为4-6；发酵时间为7-9h，菌体密度为OD600＞0.8。
所述步骤（2）的液体培养基为副短乳杆菌发酵培养基，培养期间用磷酸调控pH值为4-6；培养温度为30±2℃；培养时间为18-22 h；菌体密度为OD600＞2.7。
所述步骤（3）中，底物为L-谷氨酸或谷氨酸钠；用磷酸调控pH值为4-6；转化温度为30±2℃。
所述步骤（4）快速升温至70-90℃，保持0.5-2h，快速降温至60-65℃，活性炭添加量为0.5-1%（w/v）；吸附时间为1-3h。
所述步骤（5）结晶所采用的方式是真空蒸发结晶，蒸发温度为50-90℃；乙醇浓度为90%-100%（v/v）。
所述步骤（6）真空干燥的温度为小于60℃；干燥至失重小于2%；所述γ-氨基丁酸产品，纯度大于98%。
一种上述副短乳杆菌HX12-19在生产高纯度γ-氨基丁酸中的应用。
本发明具有以下优点：
本发明的乳酸菌菌株HX12-19从食品材料上分离筛选获得，安全性高，可用于食品等领域；菌株发酵产率高，具备生产竞争力，可适用于工业化大生产；本发明利用乳酸菌菌株HX12-19采用传统发酵和生物转化分段控制，充分利用生物酶转化得到产物GABA，大大提高生产效率，降低成本；产物采用结晶方式进行精制，可得到高纯度的产品。
附图说明
图1为菌株HX12-19 的16S rDNA系统发育树。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 菌株的分离纯化与鉴定
富集培养：分别取少量新鲜蔬菜、自制酸菜、蔬菜地土样、购买的酸菜、新鲜牛奶等样品加入含有味精（谷氨酸钠≥95%）的乳酸菌培养基（MRS培养基，成分 g/L：蛋白胨10.0，牛肉浸粉 4.0，酵母浸粉4.0，葡萄糖20.0，磷酸氢二钾2.0，柠檬酸三铵2.0，乙酸钠5.0，硫酸镁0.2，硫酸锰0.05，吐温-801.0）中，30℃静止培养2天。
定性检测：纸层析法（或薄层层析法），将经过稀释处理的发酵液点样到定性滤纸（或硅胶预制板）上，用层析液展开。层析液采用正丁醇：冰醋酸：水（60:15:25），添加0.4%的茚三酮。展开结束后自然晾干，85 ºC显色10 min，分别对培养两天后的富集液进行稀释、定性检测，与标样比较。
分离单菌落：对有GABA生成的富集液，先进行镜检，判断细菌种类，进而稀释涂布，涂布平板培养基为含有10g/L CaCO3的MRS固体培养基（成分 g/L：蛋白胨10.0，牛肉浸粉8.0，酵母浸粉4.0，葡萄糖20.0，磷酸氢二钾2.0，柠檬酸三铵2.0，乙酸钠5.0，硫酸镁0.2，硫酸锰0.05，吐温-801.0，琼脂 15.0），30℃培养2天，挑取若干有溶钙圈的疑似乳酸菌（湿润光滑，边缘整齐，小圆）的菌落，接种含味精（谷氨酸钠≥95%）的培养基中，30℃，静止2天，定性检测并比较GABA产量大小。采集自酸菜的菌种HX12-19 GABA最高，菌体形态为短杆状，革兰氏染色显阳性，16s rRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示，根据MEGA5.0软件构件系统发育树见图1，与GenBank中副短乳杆菌（Lactobacillus parabrevis）的同源性为97%。
实施例2 制备高纯度γ-氨基丁酸
（1）种子液制备：将HX12-19菌种接入培养基，摇瓶发酵，获得种子液；
（2）发酵：将培养9h，OD600＞0.8的种子液接入10L发酵罐中的液体培养基（10L），培养基成分为：蛋白胨10.0 g/L，酵母粉10.0 g/L，葡萄糖10.0 g/L，吐温80 1.0 mL/L，乙酸钠5.0 g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.2g/L，味精（谷氨酸钠≥95%）10.0g/L。通气搅拌培养当培养18h，OD600=2.9，结束发酵，获得发酵液；
（3）转化：离心收集菌体，加纯化水至5L左右，添加谷氨酸钠，温度控制为30±2℃，开启搅拌，进行反应。反应期间随着pH值得不断升高，间断添加磷酸和谷氨酸钠，将pH值控制在4.0-6.0间，当pH值变化率小于0.1/h时停止反应，取样测定γ-氨基丁酸浓度，根据体积计算总量M1。
（4）脱色：将转化液快速加热至90℃，蛋白质变性1h后，快速降温至65℃，添加1%活性炭，吸附1h后过滤。
（5）结晶：蒸发结晶获得结晶液，控制结晶的温度在55℃-70℃之间，分离固液，用95%乙醇洗涤固体。
（6）干燥：将洗涤后的固体进行真空干燥得γ-氨基丁酸产品S1。
实施例3 制备高纯度γ-氨基丁酸
（（1）种子液制备：将HX12-19菌种接入培养基，摇瓶发酵，获得种子液；
（2）发酵：将培养8h，OD600＞0.8的种子液接入10L发酵罐中的液体培养基（10L），培养基成分为：蛋白胨10.0 g/L，酵母粉10.0 g/L，葡萄糖10.0 g/L，吐温80 1.0 mL/L，乙酸钠5.0 g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.3g/L，味精（谷氨酸钠≥95%）10.0g/L。通气搅拌培养当培养20h，OD600=3.1，结束发酵，获得发酵液；
（3）转化：离心收集菌体，加纯化水至5L左右，添加谷氨酸钠，温度控制为30±2℃，开启搅拌，进行反应。反应期间随着pH值得不断升高，间断添加磷酸和谷氨酸钠，将pH值控制在4.0-6.0间，当pH值变化率小于0.1/h时停止反应，取样测定γ-氨基丁酸浓度，根据体积计算总量M2。
（4）脱色：将转化液快速加热至80-85℃，蛋白质变性1.5h后，快速降温至60-65℃，添加0.8%活性炭，吸附1.5h后过滤。
（5）结晶：蒸发结晶获得结晶液，控制结晶的温度在55℃-70℃之间，分离固液，用95%乙醇洗涤固体。
（6）干燥：将洗涤后的固体进行真空干燥得γ-氨基丁酸产品S2。
实施例4 制备高纯度γ-氨基丁酸
（1）种子液制备：将HX12-19菌种接入培养基，摇瓶发酵，获得种子液；
（2）发酵：将培养7h，OD600＞0.8的种子液接入10L发酵罐中的液体培养基（10L），培养基成分为：蛋白胨10.0 g/L，酵母粉10.0 g/L，葡萄糖10.0 g/L，吐温80 1.0 mL/L，乙酸钠5.0 g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.2g/L，味精（谷氨酸钠≥95%）10.0g/L。通气搅拌培养当培养22h，OD600=3.3，结束发酵，获得发酵液；
（3）转化：离心收集菌体，加纯化水至5L左右，添加L-谷氨酸，温度控制为30±2℃，开启搅拌，进行反应。反应期间随着pH值得不断升高，间断添加磷酸和L-谷氨酸，将pH值控制在4.0-6.0间，当pH值变化率小于0.1/h时停止反应，取样测定γ-氨基丁酸浓度，根据体积计算总量M3。
（4）脱色：将转化液快速加热至75-80℃，蛋白质变性2h后，快速降温至60-65℃，添加0.5%活性炭，吸附2h后过滤。
（5）结晶：蒸发结晶获得结晶液，控制结晶的温度在55℃-70℃之间，分离固液，用100%乙醇洗涤固体。
（6）干燥：将洗涤后的固体进行真空干燥得γ-氨基丁酸产品S3。
实施例5 产品质量检验
5.1含量测定
采用高效液相色谱法测定γ-氨基丁酸含量。
仪器：高效液相色谱仪、分析天平、超声波溶解器、微孔过滤器、容量瓶、针头过滤器(0.22μm)色谱柱：Hypersil ODS C18，5μm，4.6×250mm
试剂：甲醇、乙腈、邻苯二醛（OPA）、结晶乙酸钠、冰醋酸、γ-氨基丁酸标准品：纯度≥99.0%、硼酸、氢氧化钠。
步骤如下：
（1）标准溶液的制备：精密称取0.5g γ-氨基丁酸标准品，用水溶解定容至100mL，混合均匀后取10mL定容至100mL，用0.22μm滤膜过滤，收集滤液，作为标准溶液。
（2）样品溶液的制备：精密称取0.5-2.0g样品，用水溶解定容至100mL，混合均匀后取10mL定容至100mL，用0.22 μm滤膜过滤，收集滤液，作为待测样品溶液。
（3）0.4mol/L硼酸缓冲液的制备：称取2.47g硼酸，加水约80mL，用氢氧化钠调pH值10.2，用水定容至100mL。
（4）衍生试剂的制备：称取0.1g邻苯二醛（OPA）用1mL乙腈溶解，加130 μL巯基乙醇，用0.4 mol/L硼酸缓冲液定容至10 mL。
（5）柱前衍生化：
应用自动进样器进行柱前衍生，柱前衍生步骤为
步骤 动作目的 瓶号 吸量（uL） 吸样速度（ul/min）
1 吸缓冲液 1 5 200
2 洗针 2 200
3 吸样品 2 200
4 洗针 2 200
5 混合三次
6 吸OPA 3 2 200
7 洗针 2 200
8 混合15次
9 吸水 4 31 200
10 混合5次
11 进样
（6）色谱分析条件：流动相即A相：称取7.5g结晶乙酸钠，用水溶解定容至1000 mL，滴加5%的醋酸调pH值至7.20±0.02，过滤，备用。B相：色谱纯乙腈过滤，备用。运行方法时流动相配比为：75%的A相+25%的B相。流速：1.0 mL/min。检测波长：338 nm。柱温：40℃。
（7）试样测定：进行色谱分析，记录色谱峰的保留时间和峰面积，得到峰面积和标准溶液的浓度（以干品计）面积比值，重复操作6次，相对标准偏差应小于3%。
取已制备好的试样按照上述步骤（5）和（6）进行测定，每个样品制备两份，每份测定两次，记录色谱峰的保留时间和峰面积，试样与标准溶液的保留时间应保持一致。以外标法计算出相应的γ-氨基丁酸的浓度。
分析结果的计算：样品中γ-氨基丁酸的的含量按下式计算，计算结果保留小数点后一位有效数字：
式中：
X1-样品中γ-氨基丁酸的含量；
Ai-样品中γ-氨基丁酸的峰面积；
mS-γ-氨基丁酸标准品的质量，单位为克（g）；
nS—γ-氨基丁酸标准品的干燥失重；
C—γ-氨基丁酸标准品纯度；
VS—γ-氨基丁酸标准品的稀释体积，单位为毫升（mL）；
AS—γ-氨基丁酸标准品的峰面积；
m—称取样品的质量，单位为克（g）；
n—样品的干燥失重；
V—样品的稀释体积，单位为毫升（mL）。
表1 γ-氨基丁酸的含量
样品 转化总量g（M） 发酵产率g/L 含量%
S1 2105 210.5 98.4
S2 2356 235.6 98.6
S3 2144 214.4 99.1
由上表数据可知，通过副短乳杆菌HX12-19发酵生产γ-氨基丁酸，发酵产率可到235.6g/L，为已报道天然菌最高产率，此方法生产的γ-氨基丁酸纯度大于98%，具有产业化应用价值。
<110> 华熙福瑞达生物医药有限公司,山东华熙海御生物医药有限公司
<120> 一株高产γ-氨基丁酸的乳酸菌及其应用
<130> 20170720
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1468
<212> DNA
<213> Lactobacillus parabrevis
<400> 1
gcgggggggc atgatataat gcaagtcgaa cgagcttccg ttgaatgacg tgcttgcact 60
gatttcaaca ttgaagcgag tggcgaactg gtgagtaaca cgtgggtaac ttgcccagaa 120
gagggggata acacttggaa acaggtgcta ataccgcata acaacagaaa ccgcatggtt 180
tctgtttgaa agatggtttc ggctatcact tctggatgga cccgcggcgt attagttagt 240
tggtgaggta aaggcccacc aagacaatga tacgtagccg acctgagagg gtaatcggcc 300
acattgggac tgagacacgg cccaaactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccac 360
aatggacgaa agtctgatgg agcaatgccg cgtgagtgaa gaagggtttc ggctcgtaaa 420
actctgttgt taaagaagaa cactcttgag agtaactgtt caggagttga cggtatttaa 480
ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt 540
gtccggattt attgggcgta aagcgagcgc aggcggtttt ttaagtctga tgtgaaagcc 600
ttcggcttaa ccggagaagt gcatcggaaa ctgggagact tgagtgcaga agaggacagt 660
ggaactccat gtgtagcggt ggaatgcgta gatatatgga agaacaccag tggcgaaggc 720
ggctgtctag tctgtaactg acgctgaggc tcgaaagcat gggtagcaaa caggattaga 780
taccctggta gtccatgccg taaacgatga gtgctaggtg ttggagggtt tccgcccttc 840
agtgccgcag ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt acgaccgcaa ggttgaaact 900
caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagctacg 960
cgaagaacct taccaggtct tgacatacta tgcaaatcct agagatagga cgttcccttc 1020
ggggacatgg atacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt 1080
aagtcccgca acgagcgcaa cccttattat cagttgccag cattaagttg ggcactctgg 1140
tgagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt 1200
atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg acggtacaac gagtcgcgaa gtcgtgaggc 1260
taagctaatc tcttaaagcc gttctcagtt cggattgtag gctgcaactc gcctacatga 1320
agttggaatc gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg 1380
tacacaccgc ccgtcacacc atgagagttt gtaacaccca aagccggtga gataaccttc 1440
gggagtcagc cgtctaaggt gatccagc 1468

Claims (9)

1.一株副短乳杆菌（Lactobacillus parabrevis）HX12-19，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCCM2017307。
2.一种如权利要求1所述的副短乳杆菌HX12-19在生产高纯度γ-氨基丁酸中的应用。
3.一种发酵法制备高纯度γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，采用以下步骤：
（1）种子液制备：将副短乳杆菌HX12-19接入种子培养基，摇瓶发酵至一定菌体密度，获得种子液；
（2）发酵：将种子液接入发酵罐培养基中，通气搅拌培养，当菌体达一定密度时，结束发酵，获得发酵液；
（3）转化：离心收集菌体，进行转化反应，间断添加底物并调节pH值，获得转化液；
（4）脱色：升温并保持一段时间，快速降温后添加活性炭，吸附、过滤；
（5）结晶：蒸发结晶获得结晶液，分离固液，用乙醇洗涤固体；
（6）干燥：将洗涤后的固体进行真空干燥得γ-氨基丁酸产品；
所述副短乳杆菌HX12-19，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCCM2017307；
步骤（1）与步骤（2）的培养基为副短乳杆菌发酵培养基，包括以下组分：蛋白胨8.0-12.0 g/L，酵母粉8.0-12.0 g/L，味精 8.0-12.0g/L，葡萄糖 8.0-12.0 g/L，吐温80 0.5-1.5mL/L，乙酸钠 4.0-6.0 g/L，磷酸氢二钾 1.5-2.5 g/L，硫酸镁 0.4-0.8g/L，硫酸锰0.2-0.4 g/L；所述味精中谷氨酸钠≥95%；
步骤（3）中，底物为L-谷氨酸或谷氨酸钠。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（1）的发酵时间为7-9h，菌体密度为OD600＞0.8。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2）培养期间用磷酸调控pH值为4-6；培养温度为30±2℃；培养时间为18-22 h；菌体密度为OD600＞2.7。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，用磷酸调控pH值为4-6；转化温度为30±2℃。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（4）快速升温至70-90℃，保持0.5-2h，快速降温至60-65℃，活性炭添加量为0.5-1%（w/v）；吸附时间为1-3h。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（5）结晶所采用的方式是真空蒸发结晶，蒸发温度为50-90℃；乙醇浓度为90%-100%（v/v）。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（6）真空干燥的温度为小于60℃；干燥至失重小于2%；所述γ-氨基丁酸产品纯度大于98%。
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