CN109837222A - 一种乳酸杆菌培养基及其制备方法和乳酸杆菌的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种动物饲料生产用乳酸杆菌发酵培养基及制备方法和乳酸杆菌培养方法。本发明乳酸菌培养基以大豆提取液和骨粉作为氮源，糖蜜和葡萄糖作为氮源，辅以乙酸钠、柠檬酸二铵、硫酸镁、硫酸锰、吐温‑80、抗坏血酸等营养因子，同时在培养过程中采用调节pH值法减少酸对乳酸杆菌生长过程中的抑制作用，以达到即可降低成本，又可提高产能的效果，同时对水产致病菌嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)还有一定的抑菌作用。

Description

一种乳酸杆菌培养基及其制备方法和乳酸杆菌的培养方法

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种乳酸杆菌培养基及其制备方法和乳酸杆菌的培养方法。

背景技术

乳酸菌是目前世界公认的益生菌，而乳酸杆菌是乳酸菌中最大的一个属，应用也是最为广泛，普遍应用于食品保健、产品发酵以及动物饲料中。乳酸杆菌通过发酵碳水化合物、蛋白质、氨基酸、脂类等产生多种代谢产物，其中大部分产物如乳酸、挥发性酸、过氧化氢、双乙酰及细菌素均具有一定的抗菌作用，还可以增强机体的抵抗力；乳酸杆菌在动物的肠道内也大量存在，起到调节微生物区系平衡的作用，同时对肠道的生长发育也有一定的贡献作用。

MRS培养基是一种适用于乳酸菌富集的培养基，特别适合乳酸杆菌的生长。MRS培养基不仅是菌种生长迅速而且产量较高，一般菌浓可达到几亿级别，但是MRS作为实验室基础研究时最为好用，如果进行工业化大规模生产就会使成本升高造成不必要的浪费，且高成本势必会导致相关产品高售价，所以不合适大规模生产和商业化推广。

目前已有许多科研人员使用中药、水果或者蔬菜等作为培养基来扩大乳酸菌的生长，但是这些材料原本为人类食用物资，如果大规模生产可能会产生使用竞争，从而导致资源的浪费或短缺，或是物价上涨，影响社会秩序。

足见，寻找替代产品已变得很重要。

发明内容

鉴于此，有必要针对上述问题提供一种饲用乳酸杆菌液体发酵培养基及培养方法，配方中使用大豆提取液和骨粉作为氮源，糖蜜和葡萄糖作为碳源，同时在培养过程中采用调节pH值法减少酸对生长的抑制作用，以达到即可降低成本，又可提高产能的效果，同时还有一定的抑菌作用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种乳酸杆菌发酵培养基，其氮源包括：大豆提取液、骨粉；碳源包括：糖蜜、葡萄糖。

进一步的，所述乳酸杆菌发酵培养基，每1升包括组分：大豆提取液25-40g、骨粉20-30g、糖蜜10-15g、葡萄糖10-15g。

进一步的，每升所述培养基中还包括抗坏血酸0.5-3g。

进一步的，所述乳酸杆菌发酵培养基，每1升包括组分：大豆提取液25-40g、骨粉20-30g、糖蜜10-15g、葡萄糖10-15g、抗坏血酸0.5-3g、乙酸钠8-12g、柠檬酸二铵2-3g、MgSO₄·7H₂O 0.2-0.5g、MnSO₄·H₂O 0.2-0.5g、吐温-80 0.1-1ml。

进一步的，所述乳酸杆菌发酵培养基，每1升包括组分：大豆提取液30g、骨粉25g、糖蜜10g、葡萄糖12g、抗坏血酸2g、乙酸钠8g、柠檬酸二铵3g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、MnSO₄·H₂O0.2g、吐温-80 1ml。

进一步的，所述抗坏血酸为L-抗坏血酸。

进一步的，所述发酵培养基中的大豆提取液的质量以豆粕计，即25-40g大豆提取液为市售豆粕25-40g加入蒸馏水中煮沸打浆过滤所得的所有滤液；蒸馏水用量为：所配培养基总体积的3/5。

进一步的，所述培养基以NaOH调节至pH值6.0-6.5。

进一步的，所述的乳酸菌发酵培养基中，制备大豆提取液所用市售豆粕的蛋白含量大于38％，骨粉蛋白含量不低于20％。

所述的乳酸杆菌发酵培养基的制备方法，包括如下制备步骤：

1)根据总体积，计算出个组分需要量；

2)根据1)中所得数据，取豆粕制备大豆提取液；

3)根据1)中所得数据，取骨粉、糖蜜、葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸二铵、MgSO₄·7H₂O、MnSO₄·H₂O、吐温-80，加入到2)所得的滤液中，混匀，灭菌；

4)根据1)中所得数据，称取抗坏血酸，溶解于适量蒸馏水水中，过滤除菌；

5)在溶液3)中加入溶液4)，混匀；

6)用蒸馏水将混合液5)定容至总体积，调节pH值，即得。

所述的乳酸杆菌发酵培养基的制备方法，其制备步骤如下：

1)根据总体积，计算出个组分需要量；

2)制备大豆提取液：按步骤1)所得数据取豆粕；取蒸馏水：每克豆粕小于20ml；将所述豆粕加入蒸馏水中煮沸打浆，四层纱布过滤，滤液待用，该滤液即为大豆提取液；

3)取骨粉、糖蜜、葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸二铵、MgSO₄·7H₂O、MnSO₄·H₂O、吐温-80，加入到2)所得的滤液中，混匀，121℃灭菌15分钟或115℃灭菌20min；

4)称取抗坏血酸，溶于蒸馏水水中，用一次性无菌0.22μm滤膜过滤除菌；

5)将灭菌后的溶液3)冷却至25-30℃，加入溶液4)，混匀；

6)用蒸馏水将混合液5)定容至总体积，以NaOH调节至pH值6.0-6.5，即得。

进一步的，所述的乳酸杆菌发酵方法主要包括如下步骤：

1)将保存于-80℃的乳酸杆菌菌种(分离与水产动物肠道)在MRS琼脂平板上三区划线活化两次，挑取单菌落接种于装有MRS肉汤的EP管中，30℃静置培养16-18h，以1-3％接种量转接于MRS液体培养基，30℃静置培养12-16h即为种子液；

2)以3％～5％的接种量将步骤1)中所得的种子液接种于上述发酵培养基中，30℃静置；

3)7-10h后测定pH值，用NaOH调节pH值至6.0以上，再添加2)质量5％-10％的浓度为20％的葡萄糖溶液，混匀，继续发酵；

4)重复步骤3)，静置培养至OD₅₉₅吸光值达到稳定状态，即三次测定所得值相互之间差异小于0.2，即得到发酵产品。

本发明有益效果：

本发明所提供的饲用乳酸杆菌液体培养基，配方中以大豆提取液和骨粉作为氮源，糖蜜和葡萄糖作为碳源，同时在培养过程中采用调节pH值法以减少酸对菌体生长的抑制作用，以期达到提高生长菌浓的目的，此方法采用了低成本原料，不仅可以提高其生长性能，同时对水产致病菌嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)也起到了一定的抑制作用。本发明的方案适用于乳酸杆菌在大规模生产过程中使用的培养基及其培养方法。

附图说明

图1为四种乳酸菌的在实例1中的生长曲线；其中A曲线为本发明培养基的生长曲线；B曲线为对照MRS培养基生长曲线。

图2为在实例2中淀粉乳杆菌和干酪乳杆菌的生长曲线图；其中A曲线为本发明培养基的生长曲线；B曲线为对照MRS培养基生长曲线。

图3为在实例3中唾液乳杆菌和发酵乳杆菌的生长曲线图；其中A曲线为本发明培养基的生长曲线；B曲线为对照MRS培养基生长曲线。

注：上述各附图中横坐标表示时间(h)，纵坐标表示OD₅₉₅值。

具体实施方式

为了更好地说明本发明所解决的问题、所采用的技术方案和所达到的效果，现结合具体实施例和相关资料进一步阐述。需要说明的是，本发明内容包含但不限于以下实施例及其组合实施方式。

本发明实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购等途径获得的常规产品。

实施例1

本发明的培养基

配制1升本发明的培养基，按如下组分及用量取料：大豆提取液30g、骨粉25g、糖蜜10g、葡萄糖12g、抗坏血酸2g、乙酸钠8g、柠檬酸二铵3g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、MnSO₄·H₂O0.2g、吐温-80 1ml、蒸馏水适量、NaOH适量。

配制方法：

1)按上述备料；

2)取30g豆粕，加600ml蒸馏水，煮沸打成浆，用四层纱布过滤，滤液待用，该滤液即为30g大豆提取液；

3)取骨粉25g、糖蜜10g、葡萄糖12g、乙酸钠8g、柠檬酸二铵3g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、MnSO₄·H₂O 0.2g、吐温-80 1ml，加入到2)所得的滤液中，混匀，121℃灭菌15分钟；

4)称取L-抗坏血酸2g，溶于10ml蒸馏水水中，用0.22μm的一次性无菌滤膜过滤除菌；

5)将灭菌后的溶液3)冷却至室温，加入溶液4)，混匀；

6)用蒸馏水将混合液5)定容至1L，以NaOH调节至pH值6.2。

对比培养基配方：

MRS液体培养基1升：蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母粉5.0g、葡萄糖20.0g、吐温80 1.0mL、柠檬酸氢二铵2.0g、无水乙酸钠5.0g、K₂HPO₄ 2.0g、MnSO₄·H₂O 0.25g、MgSO₄·7H₂O 0.58g、蒸馏水1.0L，pH值6.8。

本实施例受试菌株：

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、鸟乳杆菌(Lactobacillus aviariussubsp.Araffinosus)；菌株由本实验室人员按常规操作方法从水产动物肠道中分离所得，用20％甘油管-80℃保藏。

本实验所用指示菌：

嗜水气单胞菌ATCC 7966(T)。来源：购买于环凯试剂公司。

实验方案：

A.将上述四株保存的乳酸杆菌菌种在MRS琼脂平板上三区划线活化两次，挑取单菌落接种于装有MRS肉汤的1.5ml EP管中，30℃静置培养16h，以1％接种量转接于MRS液体培养基，30℃静置培养12h即为种子液；

B.以3％～5％的接种量将步骤A中所得的种子液接种于上述发酵的本发明培养基和对比培养基中，30℃静置；

C.7h后测定pH值，用NaOH调节pH值至6.0以上，再添加5％的20％葡萄糖溶液，混匀，继续发酵；

D.重复步骤C，静置培养至OD₅₉₅吸光值达到三次测定所得值相互之间差异小于0.2时，即得到发酵产品。

6)实验结果：

A.生长曲线测定

发酵4h后，每隔1h测定一次OD₅₉₅值，不同菌株的生长曲线如图1所示。其中A表示新培养基，B为MRS培养基(下同)。

B.乳酸杆菌活菌数的测定

培养24h后，用菌落计数法测定其活菌数，具体数值见表1。

C.酸度测定

培养24h后测定其pH值，具体数值见表1。

D.抑菌实验测定

培养24h后离心取上清液，以嗜水气单胞菌为指示菌测其抑菌效果，具体数值见表1。

表1.两种培养基生长性能比较

注：CFU为菌落形成单位。

7)成本对照

将本方案培养基配同MRS培养基成本进行对比，结果如表2所示，本方案的成本为1.25元/L左右，对照组MRS培养基的成本为3.05元/L左右，本方案培养基培养要比MRS培养基价格要低1.8元/L。

表2.两种培养基成本对比表

注：该表中价格均来自于年度行业内的相关市场统计。

实施例2：

1)本实施例的培养基配方如下：大豆提取液40g/L、骨粉20g/L、糖蜜12g/L、葡萄糖12g/L、抗坏血酸3g/L、乙酸钠8g/L、柠檬酸二铵3g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、MnSO₄·H₂O0.2g/L、吐温-80 1ml/L，以NaOH调节至pH值6.0，以水配置。具体配置方法同实施例1。

2)本实验对比培养基配方：与实施例1中对比培养基相同；

3)本实验受试菌株：

干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)

4)实验方案：与实施例1中实验方案相同。

5)实验结果：

生长曲线结果见图2。

实施例3：

1)本实施例的培养基配方如下：大豆提取液25g/L、骨粉30g/L、糖蜜15g/L、葡萄糖10g/L、抗坏血酸2g/L、乙酸钠8g/L、柠檬酸二铵3g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、MnSO₄·H₂O0.2g/L、吐温-80 1ml/L，以NaOH调节至pH值6.1，以水配置。具体配置方法同实施例1。

2)本实验对比培养基配方：与实施例1中对比培养基相同；

3)本实验受试菌株：

发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)

4)实验方案：与实施例1中实验方案相同

5)实验结果：

实验生长曲线结果见图3。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种乳酸杆菌发酵培养基，其特征在于，所述培养基氮源包括：大豆提取液、骨粉；碳源包括：糖蜜、葡萄糖。

2.根据权利要求1所述的乳酸杆菌发酵培养基，其特征在于，所述培养基，每1升包括组分：大豆提取液25-40g、骨粉20-30g、糖蜜10-15g、葡萄糖10-15g。

3.根据权利要求2所述的乳酸杆菌发酵培养基，其特征在于，每1升所述培养基中还包括抗坏血酸0.5-3g。

4.根据权利要求3所述的乳酸杆菌发酵培养基，其特征在于，每1升所述培养基中还包括组分：乙酸钠8-12g、柠檬酸二铵2-3g、MgSO₄·7H₂O 0.2-0.5g、MnSO₄·H₂O 0.2-0.5g、吐温-80 0.1-1ml。

5.根据权利要求4所述的乳酸杆菌发酵培养基，其特征在于，每1升所述培养基，包括组分：大豆提取液30g、骨粉25g、糖蜜10g、葡萄糖12g、抗坏血酸2g、乙酸钠8g、柠檬酸二铵3g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、MnSO₄·H₂O 0.2g、吐温-80 1ml。

6.根据权利要求1-5任意一项所述的乳酸杆菌发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基中的大豆提取液的质量以豆粕计：25-40g大豆提取液即为25-40g豆粕所制得的所有提取液。

7.根据权利要求1-5任意一项所述的乳酸杆菌发酵培养基，其特征在于，所述培养基以NaOH调节至pH值6.0-6.5。

8.根据权利要求1-5任意一项所述的乳酸杆菌发酵培养基，其特征在于，所述培养基中，制备大豆提取液所用豆粕的蛋白含量大于38％，骨粉蛋白含量不低于20％。

9.权利要求4-8任意一项所述的乳酸杆菌发酵培养基的制备方法，其特征在于，包括如下制备步骤：

1)根据总体积，计算出个组分需要量；

2)根据1)中所得数据，取豆粕制备大豆提取液；

3)根据1)中所得数据，取骨粉、糖蜜、葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸二铵、MgSO₄·7H₂O、MnSO₄·H₂O、吐温-80，加入到2)所得的滤液中，混匀，灭菌；

4)根据1)中所得数据，称取抗坏血酸，溶于蒸馏水中，过滤除菌；

5)在溶液3)中加入溶液4)，混匀；

6)用蒸馏水将混合液5)定容至总体积，调节pH值，即得。

10.一种乳酸杆菌的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将乳酸杆菌菌种在MRS琼脂平板上三区划线活化两次，挑取单菌落接种于装有MRS肉汤的EP管中，30℃静置培养16-18h，以1-3％接种量转接于MRS液体培养基，30℃静置培养12-16h即为种子液；

2)以3％～5％的接种量将步骤1)中所得的种子液接种于权利要求1-8任意一项所述的培养基或权利要求9的制备方法所制得的培养基中，30℃静置；

3)7-10h后测定pH值，用NaOH调节pH值至6.0以上，再添加5％-10％的浓度为20％的葡萄糖溶液，混匀，继续发酵；

4)重复步骤3)，静置培养至OD₅₉₅吸光值达到稳定状态，即三次测定所得值相互之间差异小于0.2，即得到发酵产品。