CN108949847B - 一种利用海洋细菌发酵制备膝沟藻毒素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及海洋微生物发酵技术领域，尤其涉及一种利用海洋细菌发酵制备膝沟藻毒素的方法，包括以下步骤：(1)摇瓶种子液；(2)种子液的准备；(3)发酵液培养；(4)发酵液的萃取提纯；(5)粗提物的纯化：经制备液相色谱洗脱，收集，旋转蒸发，获得白色粉末，即得膝沟藻毒素。本发明采用微生物菌株发酵产生膝沟藻毒素发酵周期短，仅为36‑40小时，可有效节省能耗；采用微生物菌株发酵产生膝沟藻毒素，产率较高，可达到6μg/L以上；方法步骤简单、工作量小，周期较短，所用试剂与材料均为微生物发酵试验常用试剂，对人体无害，对环境友好，成本低，具有较高的市场前景与经济价值。
Description
技术领域
本发明涉及海洋微生物发酵技术领域，尤其涉及一种利用海洋细菌发酵制备膝沟藻毒素的方法。
背景技术
膝沟藻毒素(gonyautoxins，GTXs)是麻痹性贝类毒素中的一种，其主要包括GTX1、GTX2、GTX3及GTX4同系物，属胍胺类神经毒素，是特异性钠离子通道阻断剂。GTXs在有害赤潮检测、神经生理学、医学诊断、药物开发、生化战剂等研究中均有重要应用。在医学诊断与药物开发方面，因其独特的化学结构和毒理作用机制，成为研究细胞Na+通道的一种重要工具药，且具有高效的镇痛、麻醉、解痉、降压、止喘等多种功效，是海洋新药开发的重要先导化合物。部分海洋甲藻、淡水蓝藻及海洋细菌均可产生GTXs。
目前，GTXs主要通过产毒海洋甲藻如微小亚历山大藻的培养及发酵代谢产物提取制备获得。该方法不仅培养周期长、成本高，且需要特殊的藻培养设备。而与甲藻相比，海洋细菌具有基因组小、易培养、遗传操作简单等特性。因此，利用海洋细菌发酵产生及制备膝沟藻毒素，是一种经济、高效的替代方法。
发明内容
本发明为了克服现有技术的不足，提供一种发酵周期短、成本低的海洋微生物发酵法产生制备膝沟藻毒素的方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种利用海洋细菌发酵制备膝沟藻毒素的方法，包括以下步骤：
(1)摇瓶种子液；取保存于固体斜面的硝酸盐还原菌(Nitratireductor sp.)LZ3-1菌种，接种于装有无菌培养液的1L锥形三角瓶中，装液量：300mL，30℃培养12小时，取培养物进行镜检，确认菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于种子罐中；
(2)种子液的准备：按摇瓶种子液的配方配制培养液5L，加入种子罐中，通蒸汽加热，121℃灭菌30分钟，冷却至30℃，用火焰法接种，将摇瓶种子液接种于种子罐中的种子培养基上，通气量60L/min，搅拌转速100/min，30℃培养16小时，取培养物进行镜检，确认菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于发酵罐中；
(3)发酵液培养：按发酵罐的配方，配制培养液20L，加入50L的发酵罐中，通蒸汽加热，121℃灭菌30分钟，冷却至30℃，将种子液通过管道接种于发酵罐中的发酵培养基上，维持通气量50-70L/min，搅拌转速160-180转/min，进行发酵培养，得到含有膝沟藻毒素的发酵液；
(4)发酵液的萃取提纯：将步骤(3)所得的发酵液经板框过滤后得细胞沉淀，加入10L的乙醇溶液进行产物提取，将提取液通过0.45微米滤膜过滤，对沉淀进行二次提取，得到二次提取液；将二次澄清液经0.45微米滤膜过滤后，加入10L的乙醇溶液进行三次提取，合并三次提取液，旋蒸浓缩，得到粗提取；
(5)粗提物的纯化：将步骤(4)得到的粗提物，经制备液相色谱洗脱，收集，旋转蒸发，获得白色粉末，即得膝沟藻毒素。
本发明方法中所用的硝酸盐还原菌(Nitratireductor sp.)LZ3-1(CCTCC AB2017227)购买自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。
作为优选，步骤(2)中，所述种子培养基的成分为：蛋白胨5g，酵母膏1g，磷酸二氢钾0.05g和天然海水1L。
作为优选，步骤(2)中，所述种子培养基的pH为7.5。
作为优选，步骤(3)中，所述发酵培养基的成分为：蛋白胨8g，酵母膏3.5g，磷酸二氢钾0.1g，氯化钠0.05g，氯化钙0.01g，精氨酸0.005g，蛋氨酸0.001g，维生素B1 0.005g和天然海水1000mL。
作为优选，步骤(3)中，所述发酵培养基的pH为7.2。
作为优选，步骤(3)中，发酵培养的温度为30℃，培养时间为36～40h。
作为优选，步骤(4)中，所述乙醇溶液的体积浓度为75％。
作为优选，步骤(4)中，所述乙醇溶液的pH为5.5。
因此，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明采用海洋细菌菌株发酵产生膝沟藻毒素，其发酵周期短，仅为36-40小时，可有效节省能耗；
(2)本发明采用海洋细菌菌株发酵产生膝沟藻毒素，产率较高，可达到6μg/L以上；
(3)本发明方法步骤简单、工作量小，周期较短，所用试剂与材料均为微生物发酵试验常用试剂，对人体无害，对环境友好，成本低，具有较高的市场前景与经济价值。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。
在本发明中，若非特指，所有设备和原料均可从市场购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。
实施例1
(1)摇瓶种子液：取保存于固体斜面的硝酸盐还原菌(Nitratireductor sp.)LZ3-1菌种，接种于装有无菌培养液的1L锥形三角瓶中，装液量：300mL，30℃培养12小时，取培养物进行镜检，确认菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于种子罐中；
(2)种子液的准备：按摇瓶种子液的配方配制培养液5L，加入种子罐中，通蒸汽加热，121℃灭菌30分钟，冷却至30℃，用火焰法接种，将摇瓶种子液接种于种子罐中的种子培养基上，种子培养基的成分为：蛋白胨5g，酵母膏1g，磷酸二氢钾0.05g和天然海水1L；种子培养基的pH为7.5；通气量60L/min，搅拌转速100/min，30℃培养16小时，取培养物进行镜检，确认菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于发酵罐中；
(3)发酵培养：按发酵罐的配方，配制培养液20L，加入50L的发酵罐中，通蒸汽加热，121℃灭菌30分钟，冷却至30℃，将种子液通过管道接种于发酵罐中发酵培养基上，发酵培养基的成分为：蛋白胨8g，酵母膏3.5g，磷酸二氢钾0.1g，氯化钠0.05g，氯化钙0.01g，精氨酸0.005g，蛋氨酸0.001g，维生素B1 0.005g和天然海水1000mL；发酵培养基的pH为7.2；维持通气量50L/min，搅拌转速160转/min，30℃培养40小时，得到含有膝沟藻毒素的发酵液；
(4)发酵液的萃取提纯：将发酵液经板框过滤后得细胞沉淀，加入10L的75％乙醇(pH 5.5)溶液进行产物提取，将提取液通过0.45微米滤膜过滤，对沉淀进行二次提取，得到二次提取液；将二次澄清液经0.45微米滤膜过滤后，加入10L的75％乙醇(pH 5.5)溶液进行三次提取，合并三次提取液，旋蒸浓缩，得到粗提取；
(5)产物纯化：将粗提物通过制备色谱进行梯度洗脱，通过与膝沟藻毒素标准品进行比对，收集膝沟藻毒素组分，旋转蒸发干溶剂，获得白色粉末，即获得膝沟藻毒素GTXs。
实施例2
(1)摇瓶种子液：取保存于固体斜面的硝酸盐还原菌(Nitratireductor sp.)LZ3-1菌种，接种于装有无菌培养液的1L锥形三角瓶中，装液量：300mL，30℃培养12小时，取培养物进行镜检，确认菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于种子罐中；
(2)种子液的准备：按摇瓶种子液的配方配制培养液5L，加入种子罐中，通蒸汽加热，121℃灭菌30分钟，冷却至30℃，用火焰法接种，将摇瓶种子液接种于种子罐中的种子培养基上，种子培养基的成分为：蛋白胨5g，酵母膏1g，磷酸二氢钾0.05g和天然海水1L；种子培养基的pH为7.5；通气量60L/min，搅拌转速100/min，30℃培养16小时，取培养物进行镜检，确认菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于发酵罐中；
(3)发酵培养：按发酵罐培养基配方，配制培养液20L，加入50L的发酵罐中，通蒸汽加热，121℃灭菌30分钟，冷却至30℃，将种子液通过管道接种于发酵罐中发酵培养基上，发酵培养基的成分为：蛋白胨8g，酵母膏3.5g，磷酸二氢钾0.1g，氯化钠0.05g，氯化钙0.01g，精氨酸0.005g，蛋氨酸0.001g，维生素B1 0.005g和天然海水1000mL；发酵培养基的pH为7.2；维持通气量70L/min，搅拌转速180转/min，30℃培养36小时，得到含有膝沟藻毒素的发酵液；
(4)发酵液的萃取提纯：将发酵液经板框过滤后得细胞沉淀，加入10L的75％乙醇(pH 5.5)溶液进行产物提取，将提取液通过0.45微米滤膜过滤，对沉淀进行二次提取，得到二次提取液；将二次澄清液经0.45微米滤膜过滤后，加入10L的75％乙醇(pH 5.5)溶液进行三次提取，合并三次提取液，旋蒸浓缩，得到粗提取；
(5)产物纯化：将粗提物通过制备色谱进行梯度洗脱，通过与膝沟藻毒素标准品进行比对，收集膝沟藻毒素组分，旋转蒸发干溶剂，获得白色粉末，即获得膝沟藻毒素GTXs。
实施例3
(1)摇瓶种子液：取保存于固体斜面的硝酸盐还原菌(Nitratireductor sp.)LZ3-1菌种，接种于装有无菌培养液的1L锥形三角瓶中，装液量：300mL，30℃培养12小时，取培养物进行镜检，确认菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于种子罐中；
(2)种子液的准备：按摇瓶种子液的配方配制培养液5L，加入种子罐中，通蒸汽加热，121℃灭菌30分钟，冷却至30℃，用火焰法接种，将摇瓶种子液接种于种子罐中的种子培养基上，种子培养基的成分为：蛋白胨5g，酵母膏1g，磷酸二氢钾0.05g和天然海水1L；种子培养基的pH为7.5；通气量60L/min，搅拌转速100/min，30℃培养16小时，取培养物进行镜检，确认菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于发酵罐中；
(3)发酵培养：按发酵罐的配方，配制培养液20L，加入50L的发酵罐中，通蒸汽加热，121℃灭菌30分钟，冷却至30℃，将种子液通过管道接种于发酵罐中发酵培养基上，发酵培养基的成分为：蛋白胨8g，酵母膏3.5g，磷酸二氢钾0.1g，氯化钠0.05g，氯化钙0.01g，精氨酸0.005g，蛋氨酸0.001g，维生素B1 0.005g和天然海水1000mL；发酵培养基的pH为7.2；维持通气量60L/min，搅拌转速170转/min，30℃培养38小时，得到含有膝沟藻毒素的发酵液；
(4)发酵液的萃取提纯：将发酵液经板框过滤后得细胞沉淀，加入10L的75％乙醇(pH 5.5)溶液进行产物提取，将提取液通过0.45微米滤膜过滤，对沉淀进行二次提取，得到二次提取液；将二次澄清液经0.45微米滤膜过滤后，加入10L的75％乙醇(pH 5.5)溶液进行三次提取，合并三次提取液，旋蒸浓缩，得到粗提取；
(5)产物纯化：将粗提物通过制备色谱进行梯度洗脱，通过与膝沟藻毒素标准品进行比对，收集膝沟藻毒素组分，旋转蒸发干溶剂，获得白色粉末，即获得膝沟藻毒素GTXs。
本发明实施例1-3制得的膝沟藻毒素GTXs的发酵产率如表1所示：
表1.发酵产率
| 发酵产率(μg/L) | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 |
| GTX1 | 2.57 | 3.33 | 2.65 |
| GTX2 | 3.15 | 4.08 | 3.65 |
| GTX3 | 0.39 | 0.95 | 0.61 |
| GTX4 | 0.37 | 1.58 | 1.23 |
| GTXs总产率 | 6.48 | 9.94 | 8.14 |
膝沟藻毒素(gonyautoxins，GTXs)是麻痹性贝类毒素中的一种，其主要包括GTX1、GTX2、GTX3及GTX4同系物，属胍胺类神经毒素，是特异性钠离子通道阻断剂。由表1可以看出，经过本发明利用海洋细菌发酵制备膝沟藻毒素的方法制得的膝沟藻毒素GTXs总产率6.48～9.94μg/L，产率较高，可达到6μg/L以上。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
Claims (6)
1.一种利用海洋细菌发酵制备膝沟藻毒素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）摇瓶种子液：取保存于固体斜面的硝酸盐还原菌（Nitratireductor sp.）LZ3-1菌种，接种于装有无菌培养液的1L锥形三角瓶中，装液量：300 mL，30℃培养12小时，取培养物进行镜检，确认菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于种子罐中；所述硝酸盐还原菌（Nitratireductor sp.）LZ3-1菌种已于2017年10月18日保藏于中国典型培养物中心CCTCC，其保藏编号为：CCTCC AB 2017227；
（2）种子液的准备：按摇瓶种子液的配方配制培养液5L，加入种子罐中，通蒸汽加热，121℃灭菌30分钟，冷却至30℃，用火焰法接种，将摇瓶种子液接种于种子罐中的种子培养基上，通气量60 L/min，搅拌转速100/min，30℃培养16小时，取培养物进行镜检，确认菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于发酵罐中；所述种子培养基的成分为：蛋白胨5g，酵母膏1g，磷酸二氢钾0.05g和天然海水1L；
（3）发酵液培养：按发酵罐的配方，配制培养液20L，加入50L的发酵罐中，通蒸汽加热，121℃灭菌30分钟，冷却至30℃，将种子液通过管道接种于发酵罐中的发酵培养基上，维持通气量50-70 L/min，搅拌转速160-180转/min，进行发酵培养，得到含有膝沟藻毒素的发酵液；所述发酵培养基的成分为：蛋白胨 8g，酵母膏 3.5g，磷酸二氢钾0.1g，氯化钠 0.05g，氯化钙 0.01g，精氨酸0.005g，蛋氨酸0.001g，维生素B1 0.005g和天然海水1000 mL；
（4）发酵液的萃取提纯：将步骤（3）所得的发酵液经板框过滤后得细胞沉淀，加入乙醇溶液进行提取，将提取液旋蒸浓缩，得到粗提物；
（5）粗提物的纯化：将步骤（4）得到的粗提物，经制备液相色谱洗脱，收集，旋转蒸发，获得白色粉末，即得膝沟藻毒素。
2.根据权利要求1所述的一种利用海洋细菌发酵制备膝沟藻毒素的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述种子培养基的pH为7.5。
3.根据权利要求1所述的一种利用海洋细菌发酵制备膝沟藻毒素的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述发酵培养基的pH为7.2。
4.根据权利要求1或3所述的一种利用海洋细菌发酵制备膝沟藻毒素的方法，其特征在于，步骤（3）中，发酵培养的温度为30℃，培养时间为36~40h。
5.根据权利要求1所述的一种利用海洋细菌发酵制备膝沟藻毒素的方法，其特征在于，步骤（4）中，所述乙醇溶液的体积浓度为75%。
6.根据权利要求1或5所述的一种利用海洋细菌发酵制备膝沟藻毒素的方法，其特征在于，步骤（4）中，所述乙醇溶液的pH为5.5。
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