CN104865250A - 一种异型性组织细胞干化学分析试剂膜及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种异型性组织细胞干化学分析试剂膜及其制备方法。该试剂膜是将异型性组织细胞分析试剂溶液预置在空白试剂膜上分两次干燥制成;所述异型性组织细胞分析试剂溶液是由供氢体、过氧化物、络合剂、稳定剂、增敏剂、调色剂、有机助溶剂和缓冲液组成;所述空白试剂膜为31ET滤纸。该试剂膜可以置入试剂检测卡内单独使用,或与便携式读数仪配合使用,用于检测肿瘤组织细胞原血红素,进而分析组织细胞有否异型性变化及其程度,其具有结构简单、使用方便、快速、稳定性好的特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种异型性组织细胞干化学分析试剂膜及其制备方法。
背景技术
干化学分析技术是指将液体检测样品直接加到干燥试剂条上,以被测样品的水分作为溶剂引起特定的化学反应,从而进行化学分析的方法。它采用反射光度法或差示电极法作为测量手段,主要具备以下特点:准确度高、速度快,一般在1~3min 内即可做出检验结果;操作简便,不需要日常校正;无须贮备任何其它试剂或配制任何溶液;它不仅可用于定性检查,目前还发展成为了半定量和定量的分析方法,已成为临床检验中一类重要的方法。目前市场上已经存在多种检测如尿蛋白、尿糖、隐血、胆红素、尿胆素原、酮体、比重、亚硝酸盐,细菌尿等的试剂带。但用于检测异型性组织细胞的干化学分析试剂膜尚未发现。
肿瘤组织无论在细胞形态和组织结构上,都与其发源的正常组织有不同程度的差异,这种差异称为异型性(atypia)。肿瘤组织异型性的大小反映了肿瘤组织的成熟程度(即分化程度,在此指肿瘤的实质细胞与其来源的正常细胞和组织在形态和功能上的相似程度)。异型性小者,说明它和正常组织相似,肿瘤组织成熟程度高(分化程度高);异型性大者,表示瘤组织成熟程度低(分化程度低)。区别这种异型性的大小是诊断肿瘤,确定其良、恶性的主要组织学依据。恶性肿瘤常具有明显的异型性。肿瘤组织细胞原血红素(The protoheme of tumor cells,TCPH)是在组织细胞异型性变过程中产生一种因果性生物标志因子,是分析检测组织细胞异型性变的一种新方法。TCPH具有氧化损伤作用,它干扰细胞的微环境,催生多种自由基,引起细胞膜脂质、脂蛋白、细胞骨架、DNA等的氧化损伤,使细胞周期中的DNA损伤检查点等失去阻滞作用,引起染色体端粒附近DNA序列丢失以及染色体的重排和基因扩增,表现为组织细胞的异型性变化。TCPH析出量与细胞异型性改变程度呈正相关。所以,分析TCPH的有无及其含量,就可以了解组织细胞异型性改变的有无及其程度。由于肿瘤性炎症的炎性渗出,TCPH与肿瘤性炎性渗液一道被排出,肿瘤组织的炎性渗液可以作为直接生物学介质来检测肿瘤组织细胞原血红素的存在,进而分析组织细胞有否异型性变。
目前,已经研发出用于检测组织细胞异型性变化的液体试剂。但是,液体试剂一般稳定性较差,不易储藏,且使用不方便,不适合于临床快速分析检测应用。本专利旨在提供一种利用干化学法检测组织渗液中可能含有的肿瘤组织细胞原血红素,进而分析组织细胞异型性变化的专用试剂膜。
发明内容
本发明的目的在于提供一种异型性组织细胞干化学分析试剂膜,该试剂膜可以置入塑料试剂检测卡内单独使用,或与便携式读数仪配合使用,用于检测肿瘤组织细胞原血红素,进而分析组织细胞有否异型性变化及其程度。其具有结构简单、使用方便、快速、稳定性好的特点。
本发明还提供了该种异型性组织细胞干化学分析试剂膜的制备方法。该制备方法简单,制备的产品稳定性好,在低温、干燥环境下可保存使用3年。
本发明采用以下技术方案:
一种异型性组织细胞干化学分析试剂膜,其特征在于,它是将异型性组织细胞分析试剂溶液预置在空白试剂膜上分两次干燥制成;所述异型性组织细胞分析试剂溶液是由供氢体、过氧化物、络合剂、稳定剂、增敏剂、调色剂、有机助溶剂和缓冲液组成;
所述供氢体为3-5g/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺;
所述过氧化物为4-8ml/L过氧化羟基异丙苯;
所述络合剂为0.92-1.05g/L乙二胺四乙酸二钠;
所述稳定剂为50-75g/L聚乙烯吡咯烷酮K30;
所述增敏剂为5-10ml/L 6-甲氧基喹啉;
所述调色剂为0.4-0.55g/L乙基橙;
所述有机助溶剂为1-2g/L十二烷基硫酸钠和无水乙醇;
所述缓冲液为0.5-2mol/L pH 3.2-6.8的磷酸盐缓冲液;
所述空白试剂膜为31ET滤纸。
优选的,所述异型性组织细胞分析试剂溶液由4g/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、5ml/L过氧化羟基异丙苯、0.99g/L乙二胺四乙酸二钠、55g/L聚乙烯吡咯烷酮K30、6ml/L 6-甲氧基喹啉、0.49g/L乙基橙、1.5g/L十二烷基硫酸钠、无水乙醇和1.75mol/L pH 5.5的磷酸盐缓冲液组成。
所述异型性组织细胞干化学分析试剂膜厚度为0.5mm,流速为180mm/30min。
所述的异型性组织细胞干化学分析试剂膜的制备方法,其特征在于,它包括以下步骤:
1) 配制磷酸盐缓冲液;
2) 取配好的磷酸盐缓冲液950ml,按量称取乙二胺四乙酸二钠加入其中,并在60℃水浴中加热使之溶解完全;
3) 将聚乙烯吡咯烷酮K30加入上述溶液,搅拌至全溶;
4) 将十二烷基硫酸钠溶入蒸馏水100ml中,配置成十二烷基硫酸钠溶液,向步骤(3)制得的混合溶液中加入50ml十二烷基硫酸钠溶液混合均匀;
5) 将空白试剂膜在步骤4)制得的溶液中浸泡1秒钟后取出,淋去多余试剂,烘干制成试剂膜半成品;
6) 将3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、乙基橙、聚乙烯吡咯烷酮K30分别加入到无水乙醇900ml中,搅拌至完全溶解;
7) 将过氧化羟基异丙苯加入到步骤6)制得的溶液中,搅拌至混合均匀;
8) 将6-甲氧基喹啉加入到步骤7)制得的混合溶液中,并加无水乙醇至1L,搅拌混合均匀;
9) 将步骤5)制得的试剂膜半成品在步骤8)制得的溶液中浸泡1秒钟后取出,淋去多余试剂,均匀地烘干,制得最终产品异型性组织细胞干化学分析试剂膜。
将所制备的试剂膜裁切成与检测卡尺寸相适应的大小后置入检测卡内,在低温、避光、干燥条件下保存。一般与便携式读数仪相配套使用的检测卡大小为1×1.2cm。
本发明制备的异型性组织细胞干化学分析试剂膜的使用方法有两种:
(1)在检测卡的检测孔处滴入组织渗液样本液50微升,1分钟内在检测孔处目测试剂膜的颜色变化,并与比色板比对得出检测结果。
(2)在检测卡的检测孔处滴入组织渗液样本液50微升,放入便携式读数仪进行测试。在反应44秒的时间点上,以反射光的光量值通过仪器设定的标准曲线读取相对应的肿瘤组织细胞原血红素的量值,并转化为组织细胞异型性变化的评价指标,以阴性、阳性表示。
本发明的有益效果如下:本发明提供的在组织细胞异型性变筛查检测过程中使用的异型性组织细胞干化学分析试剂膜,其成本低廉,结构简单,稳定性好,在低温干燥的环境下可以稳定保存3年;使用方便,可作为床旁诊断(POCT)试剂使用,亦可与便携式读数仪配套使用,从而实现快速半定量或定量测量组织渗液样本中肿瘤细胞原血红素的浓度,并转化为组织细胞异型性变化以阴性、阳性表示的评价指标,可直观的分析出组织细胞异型性大小。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。
实施例1
一种异型性组织细胞干化学分析试剂膜,它是将异型性组织细胞分析试剂溶液预置在空白试剂膜上分两次干燥制成;其中的异型性组织细胞分析试剂溶液由 3g/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、4ml/L过氧化羟基异丙苯、0.92g/L乙二胺四乙酸二钠、50g/L聚乙烯吡咯烷酮K30、5ml/L 6-甲氧基喹啉、0.4g/L乙基橙、1g/L十二烷基硫酸钠、无水乙醇、0.5mol/L pH 3.2的磷酸盐缓冲液组成;空白试剂膜为31ET滤纸。
具体制备方法如下:
1)配制0.5mol/L pH 6.8的磷酸盐缓冲液;
2)取配好的磷酸盐缓冲液950ml,称取0.92g乙二胺四乙酸二钠加入其中,并在60℃水浴中加热使之溶解完全;
3)将50g聚乙烯吡咯烷酮K30加入上述溶液,搅拌至全溶;
4)将2g十二烷基硫酸钠溶入蒸馏水100ml中,配置成十二烷基硫酸钠溶液,向步骤(3)制得的混合溶液中加入50ml十二烷基硫酸钠溶液混合均匀;
5)将空白试剂膜在步骤4)制得的溶液中浸泡1秒钟后取出,淋去多余试剂,烘干制成试剂膜半成品;
6)将3g 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、0.4g乙基橙、50g聚乙烯吡咯烷酮K30分别加入到无水乙醇900ml中,搅拌至完全溶解;
7)将4ml过氧化羟基异丙苯加入到步骤6)制得的溶液中,搅拌至混合均匀;
8)将5ml 6-甲氧基喹啉加入到步骤7)制得的混合溶液中,并加无水乙醇至1L,搅拌混合均匀;
9将步骤5)制得的试剂膜半成品在步骤8)制得的溶液中浸泡1秒钟后取出,淋去多余试剂,均匀地烘干,制得最终产品异型性组织细胞干化学分析试剂膜。
将所制备的试剂膜裁切成1×1.2cm大小后置入检测卡内,在低温、避光、干燥条件下保存。
实施例2
一种异型性组织细胞干化学分析试剂膜,它是将异型性组织细胞分析试剂溶液预置在空白试剂膜上分两次干燥制成;其中的异型性组织细胞分析试剂溶液由 4g/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、5ml/L过氧化羟基异丙苯、0.99g/L乙二胺四乙酸二钠、55g/L聚乙烯吡咯烷酮K30、6ml/L 6-甲氧基喹啉、0.49g/L乙基橙、1.5g/L十二烷基硫酸钠、无水乙醇、1.75mol/L pH 5.5的磷酸盐缓冲液组成;空白试剂膜为31ET滤纸。
具体制备方法如下:
1)配制1.75mol/L pH5.5的磷酸盐缓冲液;
2)取配好的磷酸盐缓冲液950ml,称取0.99g乙二胺四乙酸二钠加入其中,并在60℃水浴中加热使之溶解完全;
3)将55g聚乙烯吡咯烷酮K30加入上述溶液,搅拌至全溶;
4)将3g十二烷基硫酸钠溶入蒸馏水100ml中,配置成十二烷基硫酸钠溶液,向步骤(3)制得的混合溶液中加入50ml十二烷基硫酸钠溶液混合均匀;
5)将空白试剂膜在步骤4)制得的溶液中浸泡1秒钟后取出,淋去多余试剂,烘干制成试剂膜半成品;
6)将4g 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、0.49g乙基橙、55g聚乙烯吡咯烷酮K30分别加入到无水乙醇900ml中,搅拌至完全溶解;
7)将5ml过氧化羟基异丙苯加入到步骤6)制得的溶液中,搅拌至混合均匀;
8)将6ml 6-甲氧基喹啉加入到步骤7)制得的混合溶液中,并加无水乙醇至1L,搅拌混合均匀;
9)将步骤5)制得的试剂膜半成品在步骤8)制得的溶液中浸泡1秒钟后取出,淋去多余试剂,均匀地烘干,制得最终产品异型性组织细胞干化学分析试剂膜。
将所制备的试剂膜裁切成1×1.2cm大小后置入检测卡内,在低温、避光、干燥条件下保存。
实施例3
一种异型性组织细胞干化学分析试剂膜,它是将异型性组织细胞分析试剂溶液预置在空白试剂膜上分两次干燥制成;其中的异型性组织细胞分析试剂溶液由5g/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、8ml/L过氧化羟基异丙苯、1.05g/L乙二胺四乙酸二钠、75g/L聚乙烯吡咯烷酮K30、10ml/L 6-甲氧基喹啉、0.55g/L乙基橙、2g/L十二烷基硫酸钠和无水乙醇、2mol/L pH 3.2的磷酸盐缓冲液;空白试剂膜为31ET滤纸。
具体制备方法如下:
1)配制2mol/L pH3.2的磷酸盐缓冲液;
2)取配好的磷酸盐缓冲液950ml,称取1.05g乙二胺四乙酸二钠加入其中,并在60℃水浴中加热使之溶解完全;
3)将75g聚乙烯吡咯烷酮K30加入上述溶液,搅拌至全溶;
4)将6g十二烷基硫酸钠溶入蒸馏水100ml中,配置成十二烷基硫酸钠溶液,向步骤(3)制得的混合溶液中加入50ml十二烷基硫酸钠溶液混合均匀;
5)将空白试剂膜在步骤4)制得的溶液中浸泡1秒钟后取出,淋去多余试剂,烘干制成试剂膜半成品;
6)将5g 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、0.55g乙基橙、75g聚乙烯吡咯烷酮K30分别加入到无水乙醇900ml中,搅拌至完全溶解;
7)将8ml过氧化羟基异丙苯加入到步骤6)制得的溶液中,搅拌至混合均匀;
8)将10ml 6-甲氧基喹啉加入到步骤7)制得的混合溶液中,并加无水乙醇至1L,搅拌混合均匀;
9)将步骤5)制得的试剂膜半成品在步骤8)制得的溶液中浸泡1秒钟后取出,淋去多余试剂,均匀地烘干,制得最终产品异型性组织细胞干化学分析试剂膜。
将所制备的试剂膜裁切成1×1.2cm大小后置入检测卡内,在低温、避光、干燥条件下保存。
实施例4
对实施例1-3制得的成品异型性组织细胞干化学分析试剂膜进行有效性试验研究,具体内容如下:
(1)试验设备:便携式读数仪,与仪器相配套的装有实施例1-3产品试剂膜的检测卡。
(2)检测样本液:4种不同浓度肿瘤组织细胞原血红素标准液。
(3)具体操作方法:在检测卡的检测孔处滴入组织渗液样本液50微升,插入便携式读数仪进行测试。在反应44秒的时间点上,以反射光的光量值通过仪器设定的标准曲线读取相对应的肿瘤组织细胞原血红素的含量。以此测定量按设定范围以阴性(--)、可疑阳性(+-)、阳性(+)、强阳性(++)作为检测结果打印输出和数据保存。
判定标准如下:
(--)表示肿瘤组织细胞原血红素含量为10μg/L以下;
(+-)表示肿瘤组织细胞原血红素含量为10-20μg/L;
(+)表示肿瘤组织细胞原血红素含量为20-120μg/L;
(++)表示肿瘤组织细胞原血红素含量为120μg/L以上;
(4)测试结果如下表1。
表1有效性试验结果
结论:从以上数据结果中可以看出,本发明制备的一种异型性组织细胞干化学分析试剂膜对不同浓度的TCPH标准品具有不同的响应信号, TCPH析出量与细胞异型性改变程度呈正相关,因而能够直观、准确的体现细胞异型性变化程度。
实施例5
稳定性试验
实验方法:取本发明实施例2制得的试剂膜,在37℃条件下放置0天、10天、45天、90天及180天后,分别用来检测135μg/L肿瘤组织细胞原血红素标准液并记录其结果。实验设备同实施例4。
测试结果如表2。
表2 稳定性试验测试结果
上述(++)表示肿瘤组织细胞原血红素含量为120μg/L以上。
同时,本实验还研究了本发明实施例2制得的试剂膜在37℃条件下分别放置90天和180天后的重复性试验。将135μg/L肿瘤组织细胞原血红素标准液重复检测6次。测试结果如表3所示。
表3重复性试验结果
上述(++)表示肿瘤组织细胞原血红素含量为120μg/L以上。
通过以上数据可以看出,本发明提供的异型性组织细胞干化学分析试剂膜,在37℃加速实验条件下,其检测准确度仍保持非常稳定的水平,因而具有较好的稳定性,在低温、干燥环境下该试剂膜可以稳定的保存3年。此外,本发明制得的试剂膜在37℃加速实验条件下,其重复性也非常好,连续检测6次的肿瘤组织细胞原血红素含量无显著差异,这说明该异型性组织细胞干化学分析试剂膜的准确度和稳定性均较好。
Claims (4)
1.一种异型性组织细胞干化学分析试剂膜,其特征在于,它是将异型性组织细胞分析试剂溶液预置在空白试剂膜上分两次干燥制成;所述异型性组织细胞分析试剂溶液是由供氢体、过氧化物、络合剂、稳定剂、增敏剂、调色剂、有机助溶剂和缓冲液组成;
所述供氢体为3-5g/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺;
所述过氧化物为4-8ml/L过氧化羟基异丙苯;
所述络合剂为0.92-1.05g/L乙二胺四乙酸二钠;
所述稳定剂为50-75g/L聚乙烯吡咯烷酮K30;
所述增敏剂为5-10ml/L 6-甲氧基喹啉;
所述调色剂为0.4-0.55g/L乙基橙;
所述有机助溶剂为1-2g/L十二烷基硫酸钠和无水乙醇;
所述缓冲液为0.5-2mol/L pH 3.2-6.8的磷酸盐缓冲液;
所述空白试剂膜为31ET滤纸。
2.根据权利要求1所述的异型性组织细胞干化学分析试剂膜,其特征在于,所述异型性组织细胞分析试剂溶液由4g/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、5ml/L过氧化羟基异丙苯、0.99g/L乙二胺四乙酸二钠、55g/L聚乙烯吡咯烷酮K30、6ml/L 6-甲氧基喹啉、0.49g/L乙基橙、1.5g/L十二烷基硫酸钠、无水乙醇和1.75mol/L pH 5.5的磷酸盐缓冲液组成。
3.根据权利要求1或2所述的异型性组织细胞干化学分析试剂膜,其特征在于,所述异型性组织细胞干化学分析试剂膜厚度为0.5mm,流速为180mm/30min。
4.一种权利要求1或2所述的异型性组织细胞干化学分析试剂膜的制备方法,其特征在于,它包括以下步骤:
1) 配制磷酸盐缓冲液;
2) 取配好的磷酸盐缓冲液950ml,按量称取乙二胺四乙酸二钠加入其中,并在60℃水浴中加热使之溶解完全;
3) 将聚乙烯吡咯烷酮K30加入上述溶液,搅拌至全溶;
4) 将十二烷基硫酸钠溶入蒸馏水100ml中,配置成十二烷基硫酸钠溶液,向步骤(3)制得的混合溶液中加入50ml十二烷基硫酸钠溶液混合均匀;
5) 将空白试剂膜在步骤4)制得的溶液中浸泡1秒钟后取出,淋去多余试剂,烘干制成试剂膜半成品;
6) 将3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、乙基橙、聚乙烯吡咯烷酮K30分别加入到无水乙醇900ml中,搅拌至完全溶解;
7) 将过氧化羟基异丙苯加入到步骤6)制得的溶液中,搅拌至混合均匀;
8) 将6-甲氧基喹啉加入到步骤7)制得的混合溶液中,并加无水乙醇至1L,搅拌混合均匀;
9) 将步骤5)制得的试剂膜半成品在步骤8)制得的溶液中浸泡1秒钟后取出,淋去多余试剂,均匀地烘干,制得最终产品异型性组织细胞干化学分析试剂膜。
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