CN105548025A - 一种快速检测海洋双壳类生物体内类胡萝卜素含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速检测海洋双壳类生物体内类胡萝卜素含量的方法，包括以下步骤：(1)组织取样和预处理；(2)组织切片色差检测；(3)总类胡萝卜素含量TCC检测；(4)建立色差-TCC回归曲线；(5)待测海洋双壳类生物体闭壳肌的总类胡萝卜素含量TCC检测。本发明通过对海洋双壳类生物体闭壳肌组织切片进行色差检测，并将其与类胡萝卜素含量相关联，并建立色差-类胡萝卜素含量的线性回归方程，从而实现由相关的色差参数对个体类胡萝卜素含量检测。该方法不消耗样品、重复性好、实用性强且快速高效。

Description

一种快速检测海洋双壳类生物体内类胡萝卜素含量的方法
技术领域
本发明属于类胡萝卜素含量检测技术领域，具体涉及一种快速检测海洋双壳类生物体内类胡萝卜素含量的方法。
背景技术
类胡萝卜素(Carotenoids，CAR)作为一种多烯类物质因其含有多不饱和双键而具有一定的抗氧化能力，同时还具有其他多种生物学功能。有研究表明贝类体内的类胡萝卜素含量与贝类的生长生活以及性腺发育均表现出一定的关联性。如对虾夷扇贝(Patinopectenyessoensis)的研究表明在性腺发育时期闭壳肌类胡萝卜素的含量达到最高值，生殖期过后类胡萝卜素的含量随之降低；同时富含类胡萝卜素的个体在苗期、分笼养殖过程及产卵后的成活率均高于对照组，具有显著较高的抗逆性；而对华贵栉孔扇贝(ChlamysnobilisReeve)的研究则发现富含类胡萝卜素的个体具有较高的总抗氧化能力，以及类胡萝卜素含量与该物种性别、壳色和组织间存在显著相关性。此外还有研究发现三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)体内的类胡萝卜素含量与其珍珠层的色泽之间存在一定的关联，因此类胡萝卜素含量同样也关乎珍珠贝的育珠质量。综上，鉴于类胡萝卜素对双壳类生物多种生长及生理活动的影响，深入探讨CAR在双壳类生物群体内的含量水平和分布状况是非常必要的。
类胡萝卜素作为一种广受关注的天然色素广泛存在于各类软体动物中，如各类扇贝、珍珠贝、乌贼、螺等，其组织分布包括软体部及壳等部位。然而，迄今为止，对这些物种体内的CAR含量的大批量、群体水平的快速检测方法鲜有研究。现有的测定方法是采用干燥、提取和分光光度检测的流程和方法来进行的，而这种常规的方法却存在着若干缺点，比如：1、耗时长。样品的冷冻干燥处理一般需要2～3天才能完成且每次处理的样品数量有限，样品的研磨、称量、提取和检测同样费工费时，工作强度较大；2、用样量多。出于保证精确度的考虑，每次需要用的干燥样品量为0.1～0.2g，较大地消耗了实验样品；3、涉及挥发性药品。样品在提取过程中需要用到丙酮，该药品在室温下易挥发，且属于易燃物品，故对实验室环境及安全存在一定影响；4、实用性弱。每次只能够测定少量样品，不能够批量测定，实用性弱。这种常规测定总类胡萝卜素含量(Totalcarotenoidscontents，TCC)的方法已远远不能适用于大批量、多批次的双壳贝类科学研究的需要，因此，必须建立一种快速、高效并且可靠的测定TCC的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种快速检测海洋双壳类生物体内类胡萝卜素含量的方法，该方法重复性好、实用性强、快速高效，并且除了建立回归曲线需要少量样品之外不再消耗样品。
本发明方法通过使用色差仪对部分海洋双壳类生物体闭壳肌组织切片进行色差检测，获取相对红度参数(Δa)，然后将其与TCC相关联并建立Δa-TCC的线性回归方程，从而实现由相关的色差参数对个体类胡萝卜素含量的评估。
由于色差指标在检测过程中可直接施用新鲜组织样品，无需对样品进行干燥、研磨和萃取等操作，因此具有快速、高效的优势，尤其是面对大量待测样品时次优势尤为明显，实用性极强。并且，在后续检测过程中基本没有样品消耗，检测后的样品可继续用于其他多种生理生化指标的检测，因此极大提高了单个样品的利用率。此外，检测过程中避免了传统的TCC检测所需要的有机溶剂和多种大型设备，因此又具有安全、简便的特点。
本发明所要解决的上述技术问题是通过以下技术方案来实现的：一种快速检测海洋双壳类生物体内类胡萝卜素含量的方法，包括以下步骤：
(1)组织取样和预处理：选取海洋双壳类生物体闭壳肌样品若干，取样并充分冷冻后横向切片处理，获得组织切片；
(2)组织切片色差检测：将组织切片采用色差仪进行检测，色差检测结果即相对红度Δa；
(3)总类胡萝卜素含量TCC检测：采用传统方法检测步骤(2)中进行过色差检测的组织切片的总类胡萝卜素含量TCC；
(4)建立相对红度Δa-TCC回归曲线：将步骤(2)中检测的组织切片的相对红度Δa与步骤(3)中检测的组织切片的总类胡萝卜素含量TCC建立线性回归方程；
(5)待测海洋双壳类生物体闭壳肌样品的总类胡萝卜素含量TCC检测：取待测海洋双壳类生物体闭壳肌样品，测试其相对红度Δa，代入步骤(4)中建立的线性回归方程，即可获得该待测海洋双壳类生物体闭壳肌样品的总类胡萝卜素含量TCC。
在上述快速检测海洋双壳类生物体内类胡萝卜素含量的方法中：
步骤(1)中所述的海洋双壳类生物体优选为华贵栉孔扇贝或合浦珠母贝。
步骤(1)中获取的组织切片的厚度优选为2～3mm，但以保证同批次样品切片厚度均一为宜。
步骤(1)中海洋双壳类生物体闭壳肌样品的数量为15个以上。更佳为30个以上。
步骤(2)中将组织切片采用色差仪进行检测时，将组织切片置于与其大小相适配的样品槽中，同时在样品上覆盖一边缘进行过遮光处理的盖玻片，将盖玻片压紧样品以确保样品的厚度与样品槽的厚度相同，保证样品检测面平滑且检测厚度一致，减小误差，检测时将色差仪检测口紧贴于盖玻片上，避免漏光。
步骤(4)中优选采用SPSS软件将步骤(2)中检测的组织切片的相对红度Δa与步骤(3)中检测的组织切片的总类胡萝卜素含量TCC建立线性回归方程。
本发明步骤(2)中采用传统方法检测若干海洋双壳类生物体闭壳肌样品的总类胡萝卜素含量TCC的优选方式如下：
(1)选取色差检测后的样品，置于冷冻干燥机中进行充分的冷冻干燥；
(2)将干燥后的样品在研钵中充分研磨，然后称取0.1～0.2g于10mL离心管中，记录样品精确重量W，每个样品取两份；
(3)往(2)中的离心管加入丙酮(分析纯)2mL，密封后充分震荡，于避光静置8h或过夜；
(4)以5000r/min对离心管进行离心，10min，转移上清液于新的离心管里，并往下层沉淀中再次加入丙酮2mL，充分震荡，避光静置4h后以上述条件再次离心，取上清液并与第一次离心之上清液合并；
(5)使用紫外-可见光分光光度计对(4)中最后所得之上清液进行480nm处的吸光值进行检测，记录各样品对应之OD480；
(6)TCC按照公式TCC(μg/g)＝OD480·V×104/(E(1％1cm)×W)计算，公式中OD480为480nm处吸光值，V为提取液体积(mL)，W为样品重(g)，E(1％1cm)为在1cm光程长的比色杯中1g/L浓度溶质的理论吸收值，E(1％1cm)＝1900。
本发明利用色差仪作为主要检测设备，并辅以分光光度计测定样品的总类胡萝卜素含量，只需用常规方法对少量样品进行检测并建立起色差-TCC回归方程，其后大量的待测样品则无需干燥、研磨和提取等步骤，只需经过简单切片处理即可用于检测，因而能够在极短的时间内，对样品进行快速、准确的批量测定，检测过程中样品无消耗并且检测后的样品还可继续进行其他多种指标的检测，从而为双壳贝类类胡萝卜素含量进行大批量的检测提供一个简便快速的方法。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)需时短，操作简单，在建立起回归方程后，每个样品仅需数秒钟，极大缩短检测时间和流程；
(2)用样量少，每次需要用的样品少，只需少量的组织切片；
(3)重复性好，样品重复测量值间的变化较小、重复性好；
(4)实用性强，能够批量地检测大量样品，对待检样品的保存无严苛要求，并且检测过程中样品无消耗、无脱水以及无变质，检测完成后可继续用于多种理化指标的检测；
(5)本发明是一种快速测定双壳贝类闭壳肌总类胡萝素含量的方法，但又不局限于此一类物种及组织，通过这种技术可快速、高效地对多种双壳贝类等物种体内的类胡萝卜素含量进行研究，对研究类胡萝卜素在生物体内的分布、变化等具有重要的意义。
附图说明
图1是实施例1中华贵栉孔扇贝组织切片的色差检测结果-相对红度Δa-TCC回归曲线；
图2是实施例2中合浦珠母贝组织切片的色差检测结果-相对红度Δa-TCC回归曲线。
具体实施方式
以下实施例用于阐明与实施本发明，属于发明的保护范围，本技术领域的普通技术人员根据以上公开的内容均可实现本发明的目的。
实施例1
本实施例提供的快速检测海洋双壳类生物体内类胡萝卜素含量的方法，包括以下步骤：
(1)待检测动物及取样：待测定的华贵栉孔扇贝(ChlamysnobilisReeve)30个，来自于海南三亚意源水产养殖有限公司，对其活体的闭壳肌进行取样，经切片刀具处理后得到闭壳肌的横向组织切片，厚度约为3mm。
(2)组织切片色差检测：将组织切片放于深约2mm的样品槽内(组织切片的厚度是根据槽的深度确定，因为切片是柔软的，所以要求比槽的深度稍厚。其实只是要求槽的深度略小于组织切片厚度，保证压片后组织切片厚度都等于槽的深度而达到测定厚度均一的目的)，样品上覆盖一片边缘做遮光处理的盖玻片；将盖玻片压紧，确保样品的厚度与样品槽深度相同，以保证样品检测面平滑且检测厚度一致，减小误差；将色差仪检测口紧贴于盖玻片上，避免漏光。
(3)总类胡萝卜素含量(Totalcarotenoidscontents，TCC)检测：完成色差检测后，将样品放入冷冻干燥机进行充分的冷冻干燥；然后采用传统方法对其进行总类胡萝卜素的定量，具体方法如下：
①将干燥后的样品在研钵中充分研磨，然后称取0.1～0.2g于10mL离心管中，记录样品精确重量m，每个样品取两份；
②往①中的离心管加入丙酮(分析纯)2mL，密封后充分震荡，于避光静置8h或过夜；
③以5000r/min对离心管进行离心，10min，转移上清液于新的离心管里，并往下层沉淀中再次加入丙酮2mL，充分震荡，避光静置4h后以前次条件再次离心，取上清液并与第一次离心之上清液合并；
④使用紫外-可见光分光光度计对③中最后所得之上清液进行480nm处的吸光值进行检测，记录各样品对应之OD480；
⑤TCC按照公式TCC(μg/g)＝OD480·V×104/(E(1％1cm)×W)计算，公式中OD480为480nm处吸光值，V为提取液体积(ml)，W为样品重(g)，E(1％1cm)为在1cm光程长的比色杯中1g/L浓度溶质的理论吸收值，E(1％1cm)＝1900。
(4)相关性分析以及建立TCC-Δa回归曲线：通过SPSS对Δa与TCC的关联性进行Pearson相关性分析。如图1中所示，结果表明华贵栉孔扇贝体闭壳肌相对红度Δa-TCC关性为0.976，极显著，线性回归方程为y＝18.187x-10.362(R2＝0.9514)。
(5)取待测样品，检测其相对红度Δa并代入(4)中的公式计算得到其TCC计算及TCC检测如下表1。对TCC计算及TCC检测进行Pearson相关性及二阶最小二乘法分析，表1中的结果表明两组结果显著相关(0.936)，且残差平方和较小，说明两组数据拟合度较高。
表1本实施例待测样品的TCC检测和TCC计算结果
编号 TCC检测 TCC计算
1 26.484862 28.41293
2 44.56274 56.10892
3 40.92534 47.72293
4 69.151564 78.14233
5 88.76321233 101.9178
6 81.31260467 85.55352
7 36.67564433 39.22851
8 44.01713 34.35495
9 18.628078 11.09275
10 7.861374 5.030275
11 88.53284367 102.0466
12 36.19672 26.80803
13 76.14749667 89.04804
14 28.55211767 19.40636
15 35.232809 40.99723
16 16.754817 12.09921
17 25.7301015 24.4798
实施例2
本实施例提供的快速检测海洋双壳类生物体内类胡萝卜素含量的方法，包括以下步骤：
(1)待检测动物及取样：待测定的合浦珠母贝(Pinctadafucata)海洋双壳贝类来自于海南陵水的养殖种。对其活体的闭壳肌进行取样，经切片刀具处理后得到闭壳肌的横向组织切片，厚度约为3mm；
(2)组织切片色差检测：将组织切片放于深约2mm(同实例1)的样品槽内，样品上覆盖一片边缘做遮光处理的盖玻片；将盖玻片压紧，确保样品的厚度与样品槽深度相同，以保证样品检测面平滑且检测厚度一致，减小误差；将色差仪检测口紧贴于盖玻片上，避免漏光。
(3)总类胡萝卜素含量(Totalcarotenoidscontents，TCC)检测：完成色差检测后，将样品放入冷冻干燥机进行充分的冷冻干燥；然后采用传统方法对其进行总类胡萝卜素的定量，具体方法同实施例1。
(4)相关性分析以及建立TCC-Δa回归曲线：通过SPSS对Δa与TCC的关联性进行Pearson相关性分析。如图2中所示，合浦珠母贝闭壳肌色素含量-色差相关性为0.951，极显著，线性回归方程为y＝3.2838x-2.0636(R2＝0.9042)。
(5)取待测样品，检测其相对红度Δa并代入公式计算得到其TCC计算及TCC检测如下表。对TCC计算及TCC检测进行Pearson相关性及二阶最小二乘法分析，表2中的结果表明两组结果显著相关(0.984)，且残差平方和较小，说明两组数据拟合度较高。
表2本实施例待测样品的TCC检测和TCC计算结果
编号 TCC检测 TCC计算
1 10.21115663 11.56089
2 10.22135759 11.32445
3 11.3785805 12.3282
4 8.072251635 8.70398
5 16.78880746 17.22873
6 13.01585662 13.3522
7 15.38755981 14.87643
8 6.838502604 6.201725
9 9.414841451 7.899449
10 7.182044888 5.523073
11 11.93535019 9.327902
12 10.8954012 8.419384
13 10.22364217 7.769192
14 10.25766272 7.701327
15 5.444087386 3.567022
16 5.951210794 3.870227
17 6.712124441 4.061782
从实施例1-2中可以看出，本发明中Δa与TCC存在高水平的相关性，采用Δa-TCC回归曲线通过Δa对TCC进行评估是可靠的，即将同批次样品的Δa参数带入回归方程后能够在极短的时间内批量测定双壳贝类不同种类闭壳肌的TCC指标，测定速度比常规方法提高数十倍。本发明明显具有快速、高效、准确等优点，对研究类胡萝卜素在生物体内的含量等具有重要的意义。
以上实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以上实施例。本技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范围，均可实现本发明的目的。

Claims (6)

1.一种快速检测海洋双壳类生物体内类胡萝卜素含量的方法，其特征是包括以下步骤：
(1)组织取样和预处理：选取海洋双壳类生物体闭壳肌样品若干，取样并充分冷冻后横向切片处理，获得组织切片；
(2)组织切片色差检测：将组织切片采用色差仪进行检测，色差检测结果即相对红度Δa；
(3)总类胡萝卜素含量TCC检测：采用传统方法检测步骤(2)中进行过色差检测的组织切片的总类胡萝卜素含量TCC；
(4)建立相对红度Δa-TCC回归曲线：将步骤(2)中检测的组织切片的相对红度Δa与步骤(3)中检测的组织切片的总类胡萝卜素含量TCC建立线性回归方程；
(5)待测海洋双壳类生物体闭壳肌样品的总类胡萝卜素含量TCC检测：取待测海洋双壳类生物体闭壳肌样品，测试其相对红度Δa，代入步骤(4)中建立的线性回归方程，即可获得该待测海洋双壳类生物体闭壳肌样品的总类胡萝卜素含量TCC。
2.根据权利要求1所述的快速检测海洋双壳类生物体内类胡萝卜素含量的方法，其特征是：步骤(1)中所述的海洋双壳类生物体为华贵栉孔扇贝或合浦珠母贝。
3.根据权利要求1所述的快速检测海洋双壳类生物体内类胡萝卜素含量的方法，其特征是：步骤(1)中获得的组织切片的厚度为2～3mm。
4.根据权利要求1所述的快速检测海洋双壳类生物体内类胡萝卜素含量的方法，其特征是：步骤(1)中海洋双壳类生物体闭壳肌样品的数量为15个以上。
5.根据权利要求1所述的快速检测海洋双壳类生物体内类胡萝卜素含量的方法，其特征是：步骤(2)中将组织切片采用色差仪进行检测时，将组织切片置于与其大小相适配的样品槽中，同时在样品上覆盖一边缘进行过遮光处理的盖玻片，将盖玻片压紧样品以确保样品的厚度与样品槽的厚度相同，保证样品检测面平滑且检测厚度一致，减小误差，检测时将色差仪检测口紧贴于盖玻片上，避免漏光。
6.根据权利要求1所述的快速检测海洋双壳类生物体内类胡萝卜素含量的方法，其特征是：步骤(4)中采用SPSS软件将步骤(2)中检测的组织切片的相对红度Δa与步骤(3)中检测的组织切片的总类胡萝卜素含量TCC建立线性回归方程。
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