CN110057898B - 一种高浓度变性牛血清白蛋白的电化学检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于传感器技术领域，公开了一种高浓度变性牛血清白蛋白的电化学检测方法。本发明用尿素诱导BSA变性，且同时加入一定比例MB，反应一段时间后转移至具有恒定面积的铟锡氧化物(ITO)电极的容器中，进行线性扫描伏安法测试。MB的氧化峰电流密度与变性BSA的量呈现良好的线性关系。该方法不仅具有操作简单、成本低廉、生物相容性好的特点，而且通过加入的MB可视化观察BSA变性，实现高浓度变性BSA的检测，在生物传感的电化学检测领域有广阔的应用前景。

Description

一种高浓度变性牛血清白蛋白的电化学检测方法
技术领域
本发明属于传感器技术领域，具体涉及一种高浓度变性牛血清白蛋白的电化学检测方法。
背景技术
血清白蛋白是血液中的重要组成成分，有两个主要的功能，一种为结合功能，另一种为运载功能。在生物体的生命过程中血清白蛋白还起着维持渗透压作用、消除自由基作用和抗凝血作用等。BSA与人血清白蛋白(HSA)结构功能高度相似，故通常作为模型蛋白用于研究。只有蛋白质处于自然折叠的状态，才有生物活性，所以当蛋白质变性，即身体在不健康的状况下，例如肝病等，血清白蛋白的结合能力与转运能力会受到影响。因此，通过尿素诱导BSA变性，作为模型，可以知道无辅助因子蛋白的去折叠过程，从而了解生物体的相关生命特征。
目前，常见的用于蛋白质二级结构及变性蛋白质二级结构分析的方法有X射线衍射法、圆二色谱法、荧光光谱法、紫外可见光谱法及傅里叶变换红外光谱法等，但这些方法普遍测试费用较高、数据分析较复杂、样品处理较麻烦。相比之下，电化学仪器成本低、灵敏度高且操作简便。本发明利用强电化学活性的指示剂MB，希望发展一种操作快速简便、低廉环保、高效稳定的电化学方法，实现高浓度变性BSA的检测及应用。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种高浓度变性牛血清白蛋白的电化学检测方法；该方法是利用强电化学活性的指示剂亚甲基蓝(MB)，实现高浓度变性牛血清白蛋白(BSA)的检测。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种高浓度变性牛血清白蛋白的电化学检测方法，包括以下步骤：
(1)配制三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液，并以此配制BSA溶液；
(2)用尿素诱导BSA溶液中的BSA变性，同时加入MB，配制成含有不同浓度变性BSA的MB溶液；
(3)将ITO电极作为工作电极分别浸入不同浓度变性BSA的MB溶液中，以钛片为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，分别与电化学工作站的3个电极接头连接，进行线性扫描伏安法测试；循环操作，得到不同浓度变性BSA的MB溶液的峰电流，绘制峰电流密度随浓度线性变化曲线，即ipa＝23.17+0.41C变性BSA；
(4)对待测牛奶进行线性扫描伏安法测试，得到待测牛奶的峰电流密度，依据步骤(3)所得峰电流密度随浓度线性变化曲线，获得待测牛奶中变性牛血清白蛋白的浓度。
步骤(1)所述三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液的浓度为0.02mol/L，且pH值为5.0～9.0。
步骤(2)和步骤(3)所述线性扫描伏安法的电位区间为-200～1500mV、扫描速度为10～500mV/s。
步骤(3)中所述含有不同浓度变性BSA的MB溶液，其中变性BSA浓度为0.1～500μmol·L-1。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：本发明无需繁琐的样品处理以及复杂的电极修饰，可避免样品处理及修饰电极而导致的成本高、耗时长、操作繁琐。其不仅具有高灵敏度、高兼容性和低检出限等优点，而且通过加入的MB可视化观察BSA变性。本发明在识别变性BSA的过程中，能快速读取电化学信号的数据，有利于实际样品中高效检测变性BSA，具有一定的现实意义，在生物传感的电化学检测领域有广阔的应用前景。
附图说明
图1为含有MB的不同浓度变性BSA溶液的线性扫描伏安图，其中MB浓度为100μmol/L，而曲线1、2、3、4、5、6分别对应变性BSA的浓度分别为0、5、10、20、50和100μmol/L。
图2为含有MB的不同浓度变性BSA溶液与氧化峰电流密度的关系曲线图。
图3为含有MB的不同浓度BSA溶液的线性扫描伏安图，其中MB浓度为100μmol/L，而曲线1、2、3、4、5、6分别对应BSA的浓度分别为0、5、10、20、50和100μmol/L。
图4为采用本发明高浓度变性牛血清白蛋白的电化学检测方法在牛奶中检测的线性扫描伏安图。
具体实施方式
下面将结合具体的实施例进一步说明本发明，但本发明的实施方式不限于此。
根据本发明设计目的，同类物质的简单替代以及尺寸形状的变化，例如改变电极外观(如改为正方形或其它形状)，改变蛋白质的种类，改变MB和BSA的浓度比，改变溶质的用量或者溶液的pH值等均应属于本发明的范围；下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为本技术领域现有的常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：含有MB的不同浓度变性BSA溶液的配制
(1)使用酸度计配制pH 5.0～9.0的0.02mol·L-1三羟甲基氨基甲烷/0.1mol·L- 1NaCl缓冲溶液，并以此配制10mmol/L的MB溶液、10mol/L的尿素溶液以及1mmol/L的BSA溶液；
(2)用移液枪量取20μL MB溶液(10mmol/L)置于样品管中，往样品管中依次加入不同体积的BSA溶液(1mmol/L)，再往每个样品管中依次加入1600μL尿素溶液(10mol/L)；
(3)在室温下振荡混合，就可以得到2000μL混合液，其中含有100μmol/L MB和8mol/L尿素，而BSA的浓度分别为0、5、10、20、50和100μmol/L。将多个平行含有MB的不同浓度变性BSA溶液置于冰箱储存，隔夜反应15小时。
实施例2：含有MB的不同浓度变性BSA溶液的线性扫描伏安法测试
将事先裁切好的导电玻璃ITO电极作为工作电极浸入实施例1制备的溶液中，以钛片为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，分别与电化学工作站的3个电极接头连接，进行线性扫描伏安法测试，测量氧化峰电流密度随变性BSA溶液浓度线性变化曲线；
结果如图1所示，随着变性BSA浓度的增加，MB的氧化峰电流密度显著的增加。以氧化峰电流密度为纵坐标，变性BSA浓度为横坐标绘制标准曲线，即ipa＝23.17+0.41C变性BSA，MB的氧化峰电流密度与变性BSA浓度之间呈现良好的线性关系，结果如图2。更重要的是如图3所示，自然状态的BSA溶液随着浓度的变化，峰电流密度没有太明显变化，而尿素诱导变性的BSA溶液，在浓度0～100μmol/L的范围，氧化峰电流密度与变性BSA浓度呈现良好的线性关系，这表明可以通过MB的氧化峰电流密度，实现高浓度变性BSA的检测。
实施例3：基于高浓度变性BSA电化学检测方法的实际应用
对实施例2含有MB的不同浓度变性BSA溶液的线性扫描伏安法测试的方法建立后的实际应用，具体操作步骤如下：
将经过实施例1制备的含有100μmol/L变性BSA的MB溶液加入到400μL牛奶样品中，根据实施例2建立的MB的氧化峰电流密度随变性BSA浓度线性变化曲线，进行线性扫描伏安法测试，测量牛奶样品中变性BSA。
结果如图4所示，加入100μmol/L变性BSA溶液的牛奶与纯牛奶两者之间的峰电流密度差值为39.14μA/cm-2。而如图2所示的标准曲线，100μmol/L变性BSA溶液与不添加变性BSA溶液两者峰电流密度差值为42.43μA/cm-2。两者所测峰电流密度差值接近，本发明可有效检测高浓度变性BSA。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利申请的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (4)

1.一种高浓度变性牛血清白蛋白的电化学检测方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)配制三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液，并以此配制BSA溶液；
(2)用尿素诱导BSA溶液中的BSA变性，同时加入MB，配制成含有不同浓度变性BSA的MB溶液；
(3)将ITO电极作为工作电极分别浸入不同浓度变性BSA的MB溶液中，以钛片为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，分别与电化学工作站的3个电极接头连接，进行线性扫描伏安法测试；循环操作，得到不同浓度变性BSA的MB溶液的峰电流，绘制峰电流密度随浓度线性变化曲线，即ipa＝23.17+0.41C变性BSA；
(4)对待测牛奶进行线性扫描伏安法测试，得到待测牛奶的峰电流密度，依据步骤(3)所得峰电流密度随浓度线性变化曲线，获得待测牛奶中变性牛血清白蛋白的浓度；
步骤(3)和步骤(4)所述线性扫描伏安法的电位区间为-200～1500mV。
2.根据权利要求1所述的一种高浓度变性牛血清白蛋白的电化学检测方法，其特征在于：步骤(1)所述三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液的浓度为0.02mol/L，且pH值为5.0～9.0。
3.根据权利要求1所述的一种高浓度变性牛血清白蛋白的电化学检测方法，其特征在于：步骤(2)和步骤(3)所述线性扫描伏安法的扫描速度为10～500mV/s。
4.根据权利要求1所述的一种高浓度变性牛血清白蛋白的电化学检测方法，其特征在于：步骤(3)中所述含有不同浓度变性BSA的MB溶液，其中变性BSA浓度为0.1～500μmol·L-1。
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