CN115901376A - 植物组织的限制性固定包埋方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种植物组织的限制性固定包埋方法，该方法通过化学固定、树脂渗透和包埋块内定位技术实现，本方法适合不规则样品特殊位置限制性固定包埋的方法，能够在保持植物原有细胞形态结构的同时获得准确的细胞空间位置，适用于水稻颖果胚胎细胞的定位切片及类似不规则形态的植物样品特殊位置细胞形态结构的观测，从而为后续获得高质量切片奠定基础。

Description

植物组织的限制性固定包埋方法

技术领域

本发明涉及植物组织包埋技术领域，具体地说，涉及一种植物组织的限制性固定包埋方法。

背景技术

生命科学常规电镜技术的发展，使得观察组织、细胞的超微结构成为可能。在观察植物组织、细胞超微结构之前，均会将已经包埋好的组织块做一张半薄切片进行位置确定，一方面是初步检测样本状态，确定是否适合继续进行超薄切片的制备，更重要的一方面就是进行植物组织的空间定位。因为植物组织的生长具有明显的方向性，细胞之间的分布、排列具有很强的空间位置关系，所以一个准确的空间定位是进行超微结构观察之前非常重要的一步。

对于一些形状较为规则，细胞之间排列较为清晰且易于切割的植物组织，在取样时就会先根据植物组织生长的方向进行限制性切割，并在包埋时将所需的组织部位与切片方向保持一致，以确保在进行组织切片时，目的细胞可以准确的呈现。但是对于一些较小或者形状较为不规则，无法在取样时进行限制性切割的植物组织，比如本发明中的水稻颖果或类似组织，一种可以固定其在包埋块中的方向的方法就非常迫切。

目前对于在包埋时方向偏差的组织，一般采用先将包埋样本部分的树脂块切割下来，根据切片方向将这部分树脂块粘贴在空白树脂块上，再在切片机上进行切片；或者是直接在切片机上通过调整刀口角度和样品杆角度进行切片。但是上述两种操作存在一定的问题。第一种树脂块粘贴切片的方法，需要先根据样品的切片方向将原有的树脂块按方向切割，打磨切面，根据调整方向粘贴在空白树脂块上。由于切片方向相对于整个树脂块较微观，按方向切割树脂块存在不稳定因素；其次，两个树脂块粘贴不牢固会在修块时崩开，造成样品的损失。第二种直接在切片机上调整方向的方法，对于方向左右偏差较小的样品比较适合，而方向左右偏差较大或是发生翻转的样品，会超出切片机的调整范围，此时仍需要先通过第一种方法调整大致方向，再进行切片机调整，不稳定性和时长均会增加。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物组织的限制性固定包埋方法，具体地，提供一种可以保持植物样品在包埋时确定位置和方向的定位包埋方法，能够提供精准的方向定位，不需要经过切割、粘粘包埋块或者改变刀口、样品杆角度即可获得位置准确的半薄切片，并在半薄切片定位完成的基础上进行超薄切片，通过透射电子显微镜进行超微结构观察与分析。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种植物组织的限制性固定包埋方法，包括以下步骤：

(1)植物组织的化学固定；

(2)脱水处理；

(3)树脂渗透；

(4)样品包埋。

其中，步骤(4)包括以下子步骤：

A、制备模具

截取200μL枪头距离尖端5-10mm的长度作为模具，模具的长度与包埋板中的包埋孔的宽度一致；切掉模具一侧1/4的面积，从模具两端观察时为3/4圆；切除的1/4为模具的开口，开口一侧为正面，对应的为背面；将模具靠近枪头尖端的一端作为上端，远离枪头尖端的一端作为下端；开口的两条长边为左、右侧边；模具的开口从上端贯穿至下端，从上下端两侧观察模具为3/4圆；

B、将植物组织装载于模具内

装载前，先向模具中滴加少量树脂，去除模具中的空气；然后根据植物组织的形态，按照特定方向将树脂渗透过的植物组织从模具下端插入模具内；

C、包埋与聚合

将载有植物组织的模具放置在包埋孔内，模具正面朝向包埋孔的内侧，背面朝向包埋孔顶端，利用包埋板的弹性将模具固定住；然后向包埋孔中滴加树脂，使树脂充分包裹住模具，并通过模具开口与模具内部的树脂融合；将包埋板于60-65℃烘箱聚合4-5h，然后于70-72℃烘箱聚合40-48h(优选将包埋板于60℃烘箱聚合5h，然后于72℃烘箱聚合48h)；

D、聚合完成后，从包埋孔中取出模具，去除模具周围多余的树脂，用镊子从模具的下端向上端方向轻推模具，使模具与模具内部的树脂分离，暴露出植物组织。

所述植物组织为水稻颖果，优选水稻开花后3～5天的水稻颖果，更优选水稻开花后3天的颖果组织。

本发明的固定包埋技术还适用于与水稻颖果相似的不规则但观测位置特殊的植物组织器官。

本方法特别适用于发育初期形状外观不规则的水稻颖果样品及类似的植物组织。

进一步地，步骤B包括：取水稻颖果近胚端组织，从模具下端插入水稻颖果，柱头端向上，近胚端向下；待水稻颖果一半组织插入模具后，轻触近胚端的水稻颖果组织，调整水稻颖果方向，使水稻颖果的背部组织与模具开口右侧边平行。

进一步地，步骤(1)包括戊二醛固定及清洗：切掉水稻颖果靠近柱头端1/4的组织后，将其放入装有2.5％戊二醛的离心管中，在真空度0.080-0.085MPa的条件下固定4-5h(优选真空度0.085MPa的条件下固定4h)；然后取出离心管，4℃避光固定10-12h；吸弃离心管中的戊二醛，加入0.1M PB缓冲液清洗水稻颖果，优选清洗6次。

进一步地，步骤(2)包括：水稻颖果经化学固定后，依次用30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、90％乙醇进行脱水，每次脱水时间10min；然后用100％乙醇脱水两次，每次10min；最后用100％丙酮脱水两次，每次10min。

进一步地，步骤(3)包括：水稻颖果经脱水处理后，依次用20-30％树脂丙酮溶液、45-55％树脂丙酮溶液、70-80％树脂丙酮溶液进行梯度渗透，最后用100％树脂渗透三次；

优选地，依次用25％树脂丙酮溶液、50％树脂丙酮溶液、75％树脂丙酮溶液进行梯度渗透。

更进一步地，步骤(3)具体为：在真空度0.080-0.085MPa的条件下，以25％树脂丙酮溶液处理水稻颖果2.5-3.5h，以50％树脂丙酮溶液处理水稻颖果13.5-14.5h，以75％树脂丙酮溶液处理水稻颖果7.5-8.5h，以100％树脂处理水稻颖果13.5-14.5h，以100％树脂处理水稻颖果7.5-8.5h，最后以100％树脂处理水稻颖果13.5-14.5h；

优选地，在真空度0.080-0.085MPa的条件下，以25％树脂丙酮溶液处理水稻颖果3h，以50％树脂丙酮溶液处理水稻颖果14h，以75％树脂丙酮溶液处理水稻颖果8h，以100％树脂处理水稻颖果14h，以100％树脂处理水稻颖果8h，最后以100％树脂处理水稻颖果14h。

本发明使用的树脂可以是SPURR。由4221、736、NSA、DMAE(可市售获得)按照坚硬配方配制，其中4221 10g、736 4g、NSA 26g、DMAE 0.3g。

步骤(4)在制作模具之前，先将枪头和包埋板置于烘箱内进行干燥。具体地，将200μL枪头和包埋板放入72℃烘箱烘烤15h，去除吸附在表面的微滴水分。

第二方面，本发明提供所述方法在植物组织切片制作中的应用。

本发明还提供所述方法在颖果包埋切片制备和固定与水稻颖果相似的植物组织器官中的应用。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明提供一种适合不规则样品特殊位置限制性固定包埋的方法，能够在保持植物原有细胞形态结构的同时获得准确的细胞空间位置，适用于水稻颖果胚胎细胞的定位切片及类似不规则形态的植物样品特殊位置细胞形态结构的观测，从而为后续获得高质量切片奠定基础。

附图说明

图1为本发明模具的结构。其中，1-上端，2-下端，3-左侧边，4-右侧边，5-正面，6-背面。

图2为本发明较佳实施例中使用的水稻颖果。其中，A为垂直拍摄呈现的水稻颖果形貌。B为从侧面拍摄呈现的水稻颖果形貌，在两图中水稻颖果左上角区域组织为近胚端胚胎细胞所在区域。

图3为本发明较佳实施例中使用的模具。其中，A为200μL枪头截取位置对比图，最上方的枪头未经过切割的原始枪头，位于中间的枪头是去掉距离尖端5mm后的枪头，最下方的枪头为去掉距离尖端10mm的枪头；本发明模具截取的位置为距离枪头尖端5-10mm处，即中间位置枪头比最下方枪头长的区域。B和C为从模具上方观察模具时的形貌图，为3/4个圆。

图4为本发明较佳实施例中水稻颖果和模具组装及放入包埋孔图。其中，A为水稻颖果与模具组装图，靠近模具上端为颖果的柱头端，靠近模具下端的为颖果近胚端，调整颖果近胚端背部组织与模具右侧边平行。B为组装后的模具和颖果放在包埋孔图，图片右侧区域为包埋孔内侧，左侧区域为包埋孔顶端，模具开孔朝向包埋孔内侧放置；黄色液体为树脂。

图5为本发明较佳实施例中采用模具包埋后树脂聚合成块图。其中，A为树脂块正面图。B为树脂块侧面图，模具开口朝向内侧。C为未使用模具的颖果聚合图，颖果位置偏移，近胚端胚胎细胞组织区域方向改变。

图6为本发明较佳实施例中去掉模具周围包裹的树脂及摘除模具图。其中，A为去掉模具周围树脂图，B为A图的放大图。C为模具摘除后暴露颖果组织图。

图7为本发明较佳实施例中使用模具包埋后的颖果半薄切片图。其中，A、B为水稻开花后3天的颖果胚胎细胞结构图，图中呈近椭圆形组织为胚胎细胞。C、D为水稻开花后5天的颖果胚胎细胞结构图，图中呈梨形组织为胚胎细胞。

图8为本发明较佳实施例中水稻颖果透射电镜图片。其中，A为3天水稻颖果胚胎细胞透射电镜图，B为5天水稻颖果胚胎细胞透射电镜图。

图9为本发明对比例1中显微镜下观察到的水稻颖果胚胎细胞结构图。其中，A为3天水稻颖果胚胎细胞透射电镜图，B为5天水稻颖果胚胎细胞透射电镜图。

图10为本发明对比例2中显微镜下观察到的水稻颖果胚胎细胞结构图。其中，A为3天水稻颖果胚胎细胞图，B为5天水稻颖果胚胎图。

具体实施方式

本发明提供一种水稻颖果的包埋块内定位包埋的方法，通过化学固定、树脂渗透和包埋块内定位包埋技术实现，其中，树脂渗透及包埋块内定位按如下程序进行：

(1)2.5％戊二醛固定水稻颖果4h，0.1M PB清洗水稻颖果，梯度浓度乙醇脱水；

(2)丙酮脱水、树脂渗透，具体条件见表1：

表1

其中，丙酮在使用之前先加入10g的无水硫酸钠，用于吸收丙酮中残余的水分，保证脱水完全。各浓度的树脂以丙酮配置。

(3)制备模具，取200μL枪头距离尖端5-10mm处，于一侧切开宽度为1.5mm，长度与模具等长的开口；

(4)组装模具和水稻颖果，从模具下方插入水稻颖果，柱头端向上，近胚端向下；调整颖果方向，背部组织与模具开口右侧边平行；

(5)组装物横向置于包埋板中，利用包埋板的弹性将模具两端固定在包埋孔中，模具正面朝向包埋孔内侧，模具背部朝向包埋板顶端，于包埋孔中添加树脂0.7ml；

(6)树脂聚合，60℃烘箱聚合5h，72℃烘箱聚合48h；

(7)修块、切片，修掉包裹模具的多余树脂，摘除模具，暴露颖果；300um半薄切片定位观察细胞排列，90nm超薄切片超微结构观察。

水稻颖果胚胎细胞位于近胚端背部组织处，呈现球体结构，由多细胞密集排列组成。随着水稻颖果的发育，胚胎细胞的形状也发生变化。只有垂直于胚胎细胞切片产生的细胞切面能反应其最真实的发育特点和形态特征。通过实践测试发现，控制水稻颖果在包埋聚合时的方向位置，可以准确固定胚胎细胞方向与切片方向垂直，获得准确的定位。同时，由于胚胎细胞排列较为密集，本发明通过大量的条件摸索，不断调整从固定、脱水到树脂渗透等一系列条件，获得了高质量的包埋和切片结果。

本发明中，在树脂渗透包埋时进行水稻颖果渗透时，以树脂进行梯度渗透，渗透梯度依次为20-30％、45-55％、70-80％、100％、100％、100％。

优选地，树脂渗透包埋时进行水稻颖果渗透时，以树脂进行梯度渗透，渗透梯度依次为25％、50％、75％、100％、100％、100％。

本发明中，所述梯度渗透具体如下：以25％的树脂-丙酮混合液处理水稻颖果2.5-3.5h，以50％的树脂-丙酮混合液处理水稻颖果13.5-14.5h，以75％的树脂-丙酮混合液处理水稻颖果7.5-8.5h，以100％的树脂处理水稻颖果13.5-14.5h，以100％的树脂处理水稻颖果7.5-8.5h，再以100％的树脂处理水稻颖果13.5-14.5h。

优选地，以25％的树脂-丙酮混合液处理水稻颖果3h，以50％的树脂-丙酮混合液处理水稻颖果14h，以75％的树脂-丙酮混合液处理水稻颖果8h，以100％的树脂处理水稻颖果14h，以100％的树脂处理水稻颖果8h，再以100％的树脂处理水稻颖果14h。

本发明根据水稻颖果胚胎细胞的特性，通过大量摸索实验，将树脂渗透设置为上述特定梯度方式，以达到良好的包埋效果，使得后续超薄切片观察可以获得高质量且清晰完整的超微结构图片。

本发明中，在所述树脂包埋渗透前的化学固定和脱水环节，固定于0.085MPa真空条件下进行；0.1M PB清洗为6次，每次10min；梯度浓度乙醇依此为30％、50％、70％、90％、100％、100％，每个梯度脱水时间为10min。

本发明中，树脂渗透之后采用200μL枪头距离尖端5-10mm作为包埋时的固定模具，其长度与包埋板孔宽度一致；模具开口侧为正面，对应侧为背面；模具正面靠近右侧方向为下端，靠近左侧方向为上端；开口的两条长边为左、右侧边。

本发明中，模具使用前于72℃烘箱中烘烤15h；组装前于模具中滴加0.1ml树脂，组装时从模具下方插入水稻颖果，柱头端向上，近胚端向下；调整颖果方向，背部组织与模具开口右侧边平行。

烘箱烘烤可以有效去除枪头和包埋板表面残留的微滴水分，水分残留会导致聚合后的树脂在切片过程中碎末化；组装之前预先在模具中滴加0.1ml的树脂，可以清除模具空间中的空气，防止聚合时产生气泡空腔；包埋时以模具正面朝向包埋孔内侧，模具背面朝向包埋板顶端，可以通过开口融合模具内外树脂，便于在聚合时成为完整的树脂块。

模具置于包埋孔中以正面朝向包埋孔内侧，模具背部朝向包埋板顶端；模具中的树脂通过开口与模具外包埋孔中的树脂聚合。

模具选择的枪头规格及截取位置依据颖果的大小进行调整，长度与包埋孔宽度一致。

本发明中，修掉模具背部四周的多余树脂，采用双面刀片切掉包裹住模具的剩余树脂；使用镊子从模具下端向上端方向轻推模具，分离模具和颖果。

本发明中，树脂和模具的材质不同，模具周围及内部的树脂不会与模具聚合成质地均一的树脂块，在模具和树脂中间存在介质差异。鉴于上述原因，在去除多余树脂后，模具周围的限制因素消失，通过镊子从模具下端向上端方向产生的推力即可将模具分离。

颖果可以是新鲜的水稻开花后3-5天的颖果。优选地，水稻开花后3天的颖果组织。

本方法还可适用于与水稻颖果相似的不规则但观测位置特殊的植物组织器官。

本发明还提供上述方法在颖果包埋切片制备和固定与水稻颖果相似的植物组织器官中的应用。

本发明方法具体包括以下步骤：

(1)化学固定；

(2)常温脱水；

(3)树脂渗透；

(4)颖果包埋。

化学固定采用的试剂为2.5％戊二醛；常温脱水试剂为30％、50％、70％、90％、100％的乙醇以及100％丙酮；树脂为SPURR，由4221、736、NSA、DMAE按照坚硬配方配制，其中4221 10g、736 4g、NSA 26g、DMAE 0.3g。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

以下实施例中使用的模具的结构见图1。其中，1-上端，2-下端，3-左侧边，4-右侧边，5-正面，6-背面。

以下实施例中使用的水稻颖果的外观形态见图2。其中，A为垂直拍摄呈现的水稻颖果形貌。B为从侧面拍摄呈现的水稻颖果形貌，在两图中水稻颖果左上角区域组织为近胚端胚胎细胞所在区域。

以下实施例中使用的模具的取材位置见图3。其中，A为200μL枪头截取位置对比图，最上方的枪头未经过切割的原始枪头，位于中间的枪头是去掉距离尖端5mm后的枪头，最下方的枪头为去掉距离尖端10mm的枪头；本发明模具截取的位置为距离枪头尖端5-10mm处，即中间位置枪头比最下方枪头长的区域。B和C为从模具上方观察模具时的形貌图，为3/4个圆。

将水稻颖果和模具组装及放入包埋孔的示意图见图4。其中，A为水稻颖果与模具组装图，靠近模具上端为颖果的柱头端，靠近模具下端的为颖果近胚端，调整颖果近胚端背部组织与模具右侧边平行。B为组装后的模具和颖果放在包埋孔图，图片右侧区域为包埋孔内侧，左侧区域为包埋孔顶端，模具开孔朝向包埋孔内侧放置；黄色液体为树脂。

采用模具包埋后树脂聚合成块的示意图见图5。其中，A为树脂块正面图。B为树脂块侧面图，模具开口朝向内侧。C为未使用模具的颖果聚合图，颖果位置偏移，近胚端胚胎细胞组织区域方向改变。

去掉模具周围包裹的树脂及摘除模具的示意图见图6。其中，A为去掉模具周围树脂图，B为A图的放大图。C为模具摘除后暴露颖果组织图。

水稻颖果胚胎细胞结构图。其中，A为3天水稻颖果胚胎细胞透射电镜图，B为5天水稻颖果胚胎细胞透射电镜图。

实施例1水稻花后3天颖果的固定与包埋(模具)

本实施例提供一种水稻颖果包埋板内定位包埋的方法，具体如下：

1、戊二醛固定并清洗

(1)取水稻开花后3天的水稻颖果，切掉水稻颖果靠近柱头端1/4的组织，便于固定液渗入并放入装有2ml 2.5％戊二醛的离心管中；真空泵抽真空至0.085MPa，真空加速固定液渗透，固定4h；

(2)取出离心管，-4℃避光固定12h。

(3)吸弃离心管中的戊二醛，加入0.1M PB缓冲液2ml清洗水稻颖果，目的是将固定后残余的戊二醛清洗干净。清洗次数6次，每次5min。

2、乙醇梯度脱水

(1)依次加入30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、90％乙醇各两毫升进行脱水，每次脱水时间10min；

(2)依次加入2ml 100％乙醇脱水两次，每次10min。

3、丙酮脱水和树脂渗透

树脂与乙醇不相容，所以在进行树脂渗透之前需要使用100％丙酮进行两次脱水，目的是充分置换样品中的乙醇。具体流程见表1。

4、制备模具

最后一次树脂渗透之前，将200μL枪头和包埋板放入72℃烘箱烘烤15小时，去除吸附在表面的微滴水分。树脂渗透完成后，进行模具制备。根据包埋板中的包埋孔的宽度截取枪头尖端相应长度，本实施例中的包埋孔的宽度为5mm，因此截取200μL枪头距离尖端5-10mm的长度作为模具。用刀片切掉模具一侧1/4的面积，从模具两端观察时为3/4圆；切除的1/4为模具的开口，开口一侧为正面，对应的为背面；模具正面靠近右侧方向为下端，靠近左侧方向为上端；开口的两条长边为左、右侧边；模具的开口从上端贯穿至下端，从上下端两侧观察模具为3/4圆。

5、组装模具和水稻颖果

组装前于模具中滴加0.1ml树脂，去除模具中的空气；组装时用镊子轻轻夹取颖果近胚端组织，从模具下方插入水稻颖果，柱头端向上，近胚端向下；待颖果一半组织插入模具后，轻触近胚端的颖果组织，调整颖果方向，使背部组织与模具开口右侧边平行。

6、模具与样品包埋、聚合

将组装好的模具和样品横向放置在包埋孔内，模具正面朝向包埋孔的内侧、背面朝向包埋孔顶端，利用包埋板的弹性将模具固定住。向包埋孔中滴加0.7ml树脂，使树脂充分包裹住模具，并通过模具开口与其内部的树脂融合。烘箱高温聚合，60℃烘箱聚合5h，72℃烘箱聚合48h。

7、去除模具暴露颖果组织

利用修块机将模具背部周围的树脂修掉，再利用双面刀片将包裹模具两侧的树脂修掉；使用镊子从模具的下端向上端方向轻推模具，由于模具和树脂之间的介质差异，模具与树脂分离，颖果组织暴露出来。

8、修块、切片染色

将样品夹在切片机上，不用调整样品杆方向和刀口角度，直接用玻璃刀修正组织至颖果的胚胎细胞位置后切片300nm并捞片与载玻片上，60℃烤干后甲苯胺蓝染色，光学显微镜下观察细胞形态和位置结构，见图7(A-B)，可以看到颖果胚胎细胞组织形态完整，相对位置准确；确定细胞位置信息后，采用钻石刀切片90nm并捞片与铜网上染色，进行电镜观察，发现细胞结构清晰。

实施例2水稻花后5天颖果的固定与包埋(模具)

本实施例提供一种胚乳组织包埋的方法，具体如下(未详细说明部分与实施例1相同)：

1、戊二醛固定并清洗

(1)取水稻开花后5天的水稻颖果，切掉水稻颖果靠近柱头端1/4的组织，便于固定液渗入并放入装有2ml 2.5％戊二醛的离心管中；真空泵抽真空至0.085MPa，真空加速固定液渗透，固定4h；

(2)取出离心管，-4℃避光固定12h。

(3)吸弃离心管中的戊二醛，加入0.1M PB缓冲液2ml清洗水稻颖果，目的是将固定后残余的戊二醛清洗干净。清洗次数6次，每次5min。

2、乙醇梯度脱水

(1)依次加入30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、90％乙醇各两毫升进行脱水，每次脱水时间10min；

(2)依次加入2ml 100％乙醇脱水两次，每次10min。

3、丙酮脱水和树脂渗透

树脂与乙醇不相容，所以在进行树脂渗透之前需要使用100％丙酮进行两次脱水，目的是充分置换样品中的乙醇。具体流程见表1。

4、制备模具

最后一次树脂渗透之前，将200μL枪头和包埋板放入72℃烘箱烘烤15小时，去除吸附在表面的微滴水分。树脂渗透完成后，进行模具制备。根据包埋板中的包埋孔的宽度截取枪头尖端相应长度，本实施例中的包埋孔的宽度为5mm，因此截取200μL枪头距离尖端5-10mm的长度作为模具。用刀片切掉模具一侧1/4的面积，从模具两端观察时为3/4圆；切除的1/4为模具的开口，开口一侧为正面，对应的为背面；模具正面靠近右侧方向为下端，靠近左侧方向为上端；开口的两条长边为左、右侧边；模具的开口从上端贯穿至下端，从上下端两侧观察模具为3/4圆。

5、组装模具和水稻颖果

组装前于模具中滴加0.1ml树脂，去除模具中的空气；组装时用镊子轻轻夹取颖果近胚端组织，从模具下方插入水稻颖果，柱头端向上，近胚端向下；待颖果一半组织插入模具后，轻触近胚端的颖果组织，调整颖果方向，使背部组织与模具开口右侧边平行。

6、模具与样品包埋、聚合

将组装好的模具和样品横向放置在包埋孔内，模具正面朝向包埋孔的内侧、背面朝向包埋孔顶端，利用包埋板的弹性将模具固定住。向包埋孔中滴加0.7ml树脂，使树脂充分包裹住模具，并通过模具开口与其内部的树脂融合。烘箱高温聚合，60℃烘箱聚合5h，72℃烘箱聚合48h。

7、去除模具暴露颖果组织

利用修块机将模具背部周围的树脂修掉，再利用双面刀片将包裹模具两侧的树脂修掉；使用镊子从模具的下端向上端方向轻推模具，由于模具和树脂之间的介质差异，模具与树脂分离，颖果组织暴露出来。

8、修块、切片染色

将样品夹在切片机上，不用调整样品杆方向和刀口角度，直接用玻璃刀修正组织至颖果的胚胎细胞位置后切片300nm并捞片与载玻片上，60℃烤干后甲苯胺蓝染色，光学显微镜下观察细胞形态和位置结构，见图7(C-D)，可以看到颖果胚胎细胞组织形态完整，相对位置准确；确定细胞位置信息后，采用钻石刀切片90nm并捞片与铜网上染色，进行电镜观察，发现细胞结构清晰。

对比例1：

本对比例提供一种胚乳组织包埋的方法，其与实施例1的方法相同，区别仅在于，包埋的时候不使用模具。而是直接放进包埋孔中进行包埋，树脂聚合过程中，水稻颖果位置发生偏移，胚胎细胞组织方向改变，直接切片下产生的胚胎细胞空间位置和形态特征发生改变，如图8所示，胚胎细胞相对于颖果的空间位置放生较大位移，形态结构也随之发生改变，细胞之间的空间增加，水稻颖果近胚端细胞结构整体形变。显微镜下观察到的水稻颖果胚胎细胞结构见图9。其中，A为3天水稻颖果胚胎细胞透射电镜图，B为5天水稻颖果胚胎细胞透射电镜图。

综上，本发明提供的水稻颖果包埋的方法，通过化学固定、树脂渗透和包埋块内定位技术实现，通过对树脂渗透梯度、时间及包埋块内定位包埋等环节进行摸索，使得该方法能够获得保持植物原有细胞结构形态并精准定位的水稻颖果组织样品，适用于发育初期形状外观不规则的水稻颖果样品及类似的植物组织。采用本发明方法包埋的组织样品后续可以快速获得精准定位的半薄切片，同时获得高质量超薄切片，可以用于透射电镜超微结构观察。

对比例2：

本对比例提供一种水稻颖果组织包埋的方法，其与实施例1和2的方法相同，区别仅在于，树脂渗透程序如表2所示：

表2

获得的切片结果见图10。从图10中可以看出水稻颖果切片褶皱，细胞内部有大量的空洞，影响细胞结构的观察。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.植物组织的限制性固定包埋方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)植物组织的化学固定；

(2)脱水处理；

(3)树脂渗透；

(4)样品包埋；

其中，步骤(4)包括以下子步骤：

A、制作模具

截取200μL枪头距离尖端5-10mm的长度作为模具，模具的长度与包埋板中的包埋孔的宽度一致；切掉模具一侧1/4的面积，从模具两端观察时为3/4圆；切除的1/4为模具的开口，开口一侧为正面，对应的为背面；将模具靠近枪头尖端的一端作为上端，远离枪头尖端的一端作为下端；开口的两条长边为左、右侧边；模具的开口从上端贯穿至下端；

B、将植物组织装载于模具内

装载前，先向模具中滴加少量树脂，去除模具中的空气；然后根据植物组织的形态，按照特定方向将树脂渗透过的植物组织从模具下端插入模具内；

C、包埋与聚合

将载有植物组织的模具放置在包埋孔内，模具正面朝向包埋孔的内侧，背面朝向包埋孔顶端，利用包埋板的弹性将模具固定住；然后向包埋孔中滴加树脂，使树脂充分包裹住模具，并通过模具开口与模具内部的树脂融合；将包埋板于60-65℃烘箱聚合4-5h，然后于70-72℃烘箱聚合40-48h；

D、聚合完成后，从包埋孔中取出模具，去除模具周围多余的树脂，用镊子从模具的下端向上端方向轻推模具，使模具与模具内部的树脂分离，暴露出植物组织。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物组织为水稻颖果，优选水稻开花后3～5天的水稻颖果。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤B包括：取水稻颖果近胚端组织，从模具下端插入水稻颖果，柱头端向上，近胚端向下；待水稻颖果一半组织插入模具后，轻触近胚端的水稻颖果组织，调整水稻颖果方向，使水稻颖果的背部组织与模具开口右侧边平行。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括戊二醛固定及清洗：切掉水稻颖果靠近柱头端1/4的组织后，将其放入装有2.5％戊二醛的离心管中，在真空度0.080-0.085MPa的条件下固定4-5h；然后取出离心管，4℃避光固定10-12h；吸弃离心管中的戊二醛，加入0.1M PB缓冲液清洗水稻颖果，优选清洗6次。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)包括：水稻颖果经化学固定后，依次用30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、90％乙醇进行脱水，每次脱水时间10min；然后用100％乙醇脱水两次，每次10min；最后用100％丙酮脱水两次，每次10min。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)包括：水稻颖果经脱水处理后，依次用20-30％树脂丙酮溶液、45-55％树脂丙酮溶液、70-80％树脂丙酮溶液进行梯度渗透，最后用100％树脂渗透三次；

优选地，依次用25％树脂丙酮溶液、50％树脂丙酮溶液、75％树脂丙酮溶液进行梯度渗透。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)具体为：在真空度0.80-0.85MPa的条件下，以25％树脂丙酮溶液处理水稻颖果2.5-3.5h，以50％树脂丙酮溶液处理水稻颖果13.5-14.5h，以75％树脂丙酮溶液处理水稻颖果7.5-8.5h，以100％树脂处理水稻颖果13.5-14.5h，以100％树脂处理水稻颖果7.5-8.5h，最后以100％树脂处理水稻颖果13.5-14.5h；

优选地，在真空度0.080-0.085MPa的条件下，以25％树脂丙酮溶液处理水稻颖果3h，以50％树脂丙酮溶液处理水稻颖果14h，以75％树脂丙酮溶液处理水稻颖果8h，以100％树脂处理水稻颖果14h，以100％树脂处理水稻颖果8h，最后以100％树脂处理水稻颖果14h。

8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述树脂为SPURR。

9.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤(4)在制作模具之前，先将枪头和包埋板置于烘箱内进行干燥。

10.权利要求1-9任一项所述方法在植物组织切片制作中的应用。

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