CN117517029A - 小麦成熟期籽粒的树脂切片制作方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种小麦成熟期籽粒的树脂切片制作方法，包括如下步骤，取材、固定、漂洗、脱水、树脂渗透、包埋、聚合、修块、半薄切片、工作液处理；优点是：采取一种新的脱水和渗透梯度，脱水、渗透更彻底，整个流程所需时间得到有效缩短；建立了一种工作液处理树脂切片的方法，使制成切片褶皱数量明显减少，切片质量大大提高，可进一步应用于图片定量分析；本发明克服了常规方法制作成熟期切片流程长，所制切片卷曲严重、无法完全展片以及褶皱数量多的缺点，可获得组织、细胞结构完整、清晰，反差明显的小麦成熟期籽粒树脂切片，并能进一步应用于图像定量分析，从而为研究小麦成熟期籽粒的结构和功能提供了准确的技术支持。

Description

小麦成熟期籽粒的树脂切片制作方法
技术领域
本发明涉及显微组织切片的技术领域，具体为一种小麦成熟期籽粒的树脂切片制作方法。
背景技术
小麦是我国最重要的粮食作物之一。随着人民生活水平的日益提高，对小麦品质要求也逐渐升高。蛋白质是决定小麦品质最重要的化学组分，籽粒中蛋白质含量决定了小麦的营养价值。蛋白质在小麦籽粒中分布具有异质性，即不同部位的含量差异显著，利用这种差异可结合小麦制粉工艺生产专用面粉解决品质需求，因此研究小麦籽粒蛋白质分布异质性对于产质协同提升具有重要意义。
常用的制粉工艺以小麦成熟期籽粒为原料，目前对于小麦成熟期籽粒蛋白异质性的研究多采取分层磨粉、化学分析的方法，实际操作中存在操作步骤繁琐、耗时长、人为误差大的问题，而成熟期籽粒切片染色结合图像分析软件定量分析省时省力，为小麦籽粒蛋白质分布异质性的研究提供了新思路。
目前针对小麦成熟期籽粒切片的研究较少，根据韦存虚等人发明的一种谷物成熟种子的树脂切片制作方法，已经能得到完整的小麦成熟期籽粒切片，但由该方法所制切片存在大量褶皱，褶皱在染色过程中会与目标物质（蛋白或淀粉）染上相同的颜色从而引入大量误差，难以进一步应用于图像定量分析。
发明内容
针对背景技术提出一种小麦成熟期籽粒的树脂切片制作方法，该方法引入“工作液处理+水槽漂片”，在降低了制片难度的同时大大提高切片质量、缩短了制片时间，所制切片褶皱数量少，可进一步应用于图片定量分析，从而为小麦籽粒不同部位化学成分差异的研究提供技术支撑。
采用的技术方案如下：
本发明提出一种小麦成熟期籽粒的树脂切片制作方法，包括如下步骤：
S1、取材：选用成熟期小麦籽粒干种子，事先在水中浸泡使其软化；将软化的籽粒横切开，切取颖果中部2-3mm厚的组织块；
S2、固定：将S1中的组织块浸泡在10%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液中24h，使组织块内的组织和细胞充分固定；
S3、漂洗：用10×PBS缓冲液漂洗多次固定后的组织块，以充分洗去固定液；
S4、脱水：用25%-50%-75%-100%-100%乙醇水溶液对组织块逐级脱水，每级10min；
S5、树脂渗透：用20%-40%-60%-80%-100%-100%伦敦白胶树脂对组织块进行逐级渗透，每级2h；
S6、包埋：将渗透完的组织块放于包埋模具中，注入100%树脂；
S7、聚合：将包埋模具放在烘箱内，60℃聚合1-2天；
S8、修块：对包埋块进行手工修块，将组织块周围多余树脂削去；
S9、半薄切片：用超薄切片机切厚度为1-2μm切片；
S10、工作液处理：将工作液涂满载玻片表面，将切片转移至载玻片上反应1-2min；将装有切片的载玻片完全浸入水槽，使用新的载玻片捞取水面上的切片，将新的载玻片放到60℃加热板上干燥，使切片展平；
S11、染色：S10中的切片经考马斯亮蓝G250染色，在光学显微镜下观察，可获得分辨率高、反差适中的图像。
本发明的方法：采取一种新的脱水和渗透梯度，脱水、渗透更彻底，整个流程所需时间得到有效缩短；建立了一种工作液处理树脂切片的方法，使制成切片褶皱数量明显减少，切片质量大大提高，可进一步应用于图片定量分析；本发明克服了常规方法制作成熟期切片流程长，所制切片卷曲严重、无法完全展片以及褶皱数量多的缺点，可获得组织、细胞结构完整、清晰，反差明显的小麦成熟期籽粒树脂切片，并能进一步应用于图像定量分析，从而为研究小麦成熟期籽粒的结构和功能提供了准确的技术支持。
对本发明技术方案的进一步优选方案，S1中，提前用水润麦使其软化，切组织块时手拿麦粒勿用力挤压，以免组织发生形变。使用水润麦后切割组织块，软化适度，防止籽粒浸泡过久切割时组织发生形变。
对本发明技术方案的进一步优选方案，S2中，固定液的配方为100 ml 10%的多聚甲醛溶液，250 ml 0.2mol/l PH7.4 磷酸缓冲液和50 ml 25%的戊二醛水溶液；固定液固定温度为常温，用量为样品体积的10倍。采用10%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液固定技术，更好地保存成熟种子的细胞结构同时大大缩短了固定时间。
对本发明技术方案的进一步优选方案，S5中，20%-40%-60%-80%伦敦白胶树脂由100%树脂与100%乙醇分别按照1：4、2：3、3：2和4：1的体积比混合而成。S5，树脂渗透，选择了一种新的渗透梯度，在保证渗透充分的同时缩短了渗透时间，大幅度减少整个切片制备流程耗时。
对本发明技术方案的进一步优选方案，S9中，所述半薄切片的方法如下：
S91、超薄切片机上安装钨钢刀，放在刀夹中夹紧；
S92、调整切片厚度为1-2μm，调整刀片与包埋块的位置，使刀锋与包埋块对齐；
S93、右手缓慢转动旋转臂开始切片，左手使用毛刷轻轻按住切片正上方，在此过程中右手转动速度均匀，防止包埋块破碎，左手力量稳定，防止切片卷曲及破碎。制成的半薄切片图像清晰度、分辨率高，视野大，有利于在光学显微镜下获得高质量图像。
对本发明技术方案的进一步优选方案，S10中，配制工作液方法为：加过量氢氧化钠于无水乙醇中，使用保鲜膜封口防止进入水分，过夜至溶液变黄，吸取上清溶液，得到饱和氢氧化钠无水乙醇溶液，将饱和氢氧化钠无水乙醇溶液与甲苯溶液按照3：1的比例混合而成，得到工作液。
对本发明技术方案的进一步优选方案，S10中，使用移液枪吸取200ul工作液加在载玻片上，摇动载玻片使工作液均匀分布载玻片上，用镊子夹取多个切片置于载玻片上反应1-2min，后将载玻片完全浸于60℃水槽中，切片立刻漂至水面上。
对本发明技术方案的进一步优选方案，S10中，使用新的载玻片垂直90°插于水槽中，使用毛刷轻轻拨动切片使切片局部与载玻片接触，缓慢将载玻片抬离水面，将载玻片放到60℃加热板上。
对本发明技术方案的进一步优选方案，S11中，所述考马斯亮蓝G250染色的具体为：
S111、切片置于60℃加热板上；
S112、滴加考马斯亮蓝G250染色2 min；
S113、洗脱液分色10 min；
S114、水洗1 min；加热板上烘干后置于显微镜下观察。
对本发明技术方案的进一步优选方案，S11中，所述考马斯亮蓝G250染液配方为：1g考马斯亮蓝G250+400 ml乙醇+70 ml冰醋酸配1 L溶液；所述洗脱液配方为：250 ml乙醇+80 ml冰醋酸配1 L。
本发明与现有技术相比，其有益效果是：
1、本发明方法，使用水润麦后切割组织块，软化适度，防止籽粒浸泡过久切割时组织发生形变。
2、本发明方法，采用了 10%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液固定技术，更好地保存成熟种子的细胞结构同时大大缩短了固定时间。
3、本发明方法选择了一种新的脱水梯度，脱水时间缩短。
4、本发明方法，选择了一种新的渗透梯度，在保证渗透充分的同时缩短了渗透时间，大幅度减少整个切片制备流程耗时。
5、本发明方法，针对小麦籽粒选择1号透明胶囊包埋，加树脂后可对组织块的摆放进行调整，提高了包埋成功率，并且修块更加简单。
6、本发明方法，现有的切片方法目前只能做到切出籽粒的完整横截面，但是制成切片无法充分展片，烘干后存在大量褶皱，以小麦淀粉、蛋白染色为例，经过碘液、考马斯亮蓝染色后，褶皱会与淀粉、蛋白染成相同的颜色，从而仅能做到观察淀粉粒、蛋白体等胚乳组分的形态，难以进一步应用于图片定量分析。本方法通过工作液处理切片与其对应的展片方法、温度相结合，能够极大程度上减少褶皱的数量，避免由于褶皱染色引起的误差，使所制切片能够进一步应用于图片定量分析。
附图说明
图1是本实施例1的原方法所制切片染色图；
图2是本实施例1的优化后所制切片染色图；
图3是本实施例1的考马斯亮蓝G250染色小麦成熟期籽粒切片的显微照片，其中，A：淀粉粒；B：蛋白。
具体实施方式
下面对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。
为使本发明的内容更加明显易懂，以下结合附图1-图3和具体实施方式做进一步的描述。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本实施例系一种小麦成熟期籽粒的树脂切片制作方法，包括如下步骤：
S1、取材：挑取粒形正常的小麦籽粒2-4粒，事先在水中浸泡使其软化；使用剃须刀片切取籽粒中部2-3 mm厚的组织块，切取组织块时手拿麦粒勿用力挤压，以免组织受挤压发生形变；
S2、固定：
①配制10%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液：250mL 0.2 mol/L磷酸缓冲液(p H 7.4)+100 mL10%多聚甲醛水溶液+50 mL 25%戊二醛水溶液；
②镊子夹取组织块放于2 ml离心管中，使用移液枪加入1-1.5 ml固定液，常温条件下浸泡在固定液中48 h，使其得到充分固定；
S3、漂洗：使用移液枪吸去固定液，使用移液枪吸取1.5 ml 10×PBS缓冲液加入离心管以充分洗去固定液，该步骤每次20 min，重复6-8次；
S4、脱水：采取逐级脱水的方法，配制25%、50%、75%的乙醇水溶液，无水乙醇和水的比例按照1：3、1：1、3：1的比例配制，按25%、50%、75%、100%、100%的梯度对组织块进行逐级脱水，每级10 min；该步骤注意乙醇易挥发，将原梯度乙醇水溶液吸取干净后立即加入新梯度乙醇水溶液；
S5、树脂渗透：
①配制伦敦白胶树脂：提前将磁力搅拌器、烧杯、量筒玻璃棒洗净后放入烘箱烘干，按照40 ml树脂+0.8 g催化剂的比例配制伦敦白胶树脂，磁力搅拌使其充分溶解，置于4℃冰箱24 h后使用（配好的树脂冰箱中存放时间过长会变黄，属正常现象）；
②配制浓度为20%、40%、60%、80%的树脂乙醇溶液，树脂和无水乙醇的比例按照1：4、2：3、3：2、4：1的比例配制；
③按照20%、40%、60%、80%、100%、100%的梯度对组织块进行逐级渗透；每级2 h；
S6、包埋：将渗透后的组织块横截面朝下置于包埋模具中（这里针对小麦籽粒选择1号透明胶囊），使用移液枪缓慢注入树脂至浸没组织块，期间防止产生气泡，树脂注入后使用小镊子摆放组织块防止倾斜；
S7、聚合：将包埋模具放入60 ℃烘箱聚合1-2天，使树脂硬化（温度必须设置为60℃，聚合时间最长不能超过2天，否则不利于切片）；
S8、修块：用镊子将包埋模具撕掉，将样品表面包埋剂磨去，露出组织块横截面；
S9、半薄切片：
S91、超薄切片机上安装钨钢刀，放在刀夹中夹紧；
S92、调整切片厚度为1-2μm，调整刀片与包埋块的位置，使刀锋与包埋块对齐；
S93、右手缓慢转动旋转臂开始切片，左手使用毛刷轻轻按住切片正上方，在此过程中右手转动速度均匀，防止包埋快破碎，左手力量稳定，防止切片卷曲及破碎。
S10、工作液处理：
①配制饱和氢氧化钠无水乙醇溶液。加过量氢氧化钠于无水乙醇中，使用保鲜膜封口防止进入水分，过夜至溶液变黄，吸取上清溶液，与甲苯溶液按照3：1的比例混合；
②使用移液枪吸取200 ul工作液加在载玻片上，摇动载玻片使工作液均匀分布载玻片上，用镊子夹取多个切片置于载玻片上反应1-2 min，后将载玻片完全浸于60 ℃水槽中，切片立刻漂至水面上；
③使用新的载玻片垂直90°插于水槽中，使用毛刷轻轻拨动切片使切片局部与载玻片接触，缓慢将载玻片抬离水面，将载玻片放到60℃加热板上加热；
④将切片放于60 ℃烘箱中12 h，防止染色过程中脱片；
S11、染色：考马斯亮蓝G250染色：
S111、切片置于55 ℃加热板上；
S112、滴加考马斯亮蓝G250染色2 min；考马斯亮蓝G250染液配制（染蛋白呈深蓝色）：1 g考马斯亮蓝G250+400 ml乙醇+70 ml冰醋酸配1 L；
S113、洗脱液分色10 min；洗脱液配制：250 ml乙醇+80ml冰醋酸配1 L；
S114、水洗1 min；加热板上烘干后置于显微镜下观察。
切片经考马斯亮蓝G250染色后，在光学显微镜下观察，可获得褶皱少、分辨率高，反差适中的图像，拍照后可进一步应用于图像分析。
实施例1
小麦成熟期籽粒的树脂切片制作方法，如下：
S1、取材：挑取粒形正常的小麦籽粒2-4粒，事先在水中浸泡使其软化；使用剃须刀片切取籽粒中部2-3 mm厚的组织块，切取组织块时手拿麦粒勿用力挤压，以免组织受挤压发生形变；
S2、固定：
①配制0.2 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.4)：
a)母液A(0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液)：称取71.64g Na2HPO4 · 12H2O，用蒸馏水定容至1 L;
b)母液B(0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液)：称取31.21g Na H2P04 ·2H2O，用蒸馏水定容至1 L;
c)按照A液：B液=81：19的比例混合，调节pH至7.4。
②配制10%多聚甲醛水溶液：
a)称取20 g多聚甲醛于250 mL三角锥形瓶中，加入200 mL蒸馏水，放入25*9mm规格的磁力搅拌子；
b)配制0.1 mol/L氢氧化钠水溶液：称取40 mg氢氧化钠于10 mL离心管中，加入10mL蒸馏水，混合均匀；
c)向锥形瓶中逐滴滴加0.1 mol/L氢氧化钠水溶液至多聚甲醛水溶液恰好澄清；
d)冷却至室温，调节pH至7.4。
③配制10%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液：250mL 0.2mol/L磷酸缓冲液(pH 7.4)+100 mL10%多聚甲醛水溶液+50 mL 25%戊二醛水溶液充分混匀，调节pH至7.4。
④用镊子夹取组织块放于2ml离心管中，往离心管中中加入1.5 ml 4%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液，使颖果浸泡在固定液中，常温下固定48 h，使组织和细胞充分固定。
S3、漂洗：
①使用移液枪小心吸取离心管中的固定液，期间不要碰到组织块断面。
②使用移液枪吸取1.5 ml 10×PBS缓冲液加入离心管中漂洗固定后的组织块，漂洗6次，每次20 min，充分洗去固定液。
S4、脱水：
配制25%、50%、75%的乙醇水溶液，无水乙醇和水的比例按照1：3、1：1、3：1的比例配制，按25%、50%、75%、100%、100%的梯度对组织块进行逐级脱水，每级10 min；
S5、树脂渗透：
①配制伦敦白胶树脂：提前将磁力搅拌器、烧杯、量筒玻璃棒洗净后放入烘箱烘干，按照40 ml树脂+0.8 g催化剂的比例配制伦敦白胶树脂200 ml，磁力搅拌使其充分溶解后分装于4个50 ml离心管中，置于4℃冰箱24h后使用；
②配制浓度为20%、40%、60%、80%的树脂乙醇溶液，树脂和无水乙醇的比例按照1：4、2：3、3：2、4：1的比例配制；
③按照20%-40%-60%-80%-100%-100%的梯度对组织块进行逐级渗透；每级2 h；
S6、包埋：
使用小镊子将渗透后的组织块横截面朝下置于包埋模具中（这里针对小麦籽粒选择1号透明胶囊），使用移液枪缓慢注入树脂至浸没组织块，期间防止产生气泡，树脂注入后使用小镊子摆放组织块防止倾斜；
S7、聚合：
将包埋模具放入60 ℃烘箱聚合1-2天，使树脂硬化（温度必须设置为60 ℃，聚合时间最长不能超过2天，否则不利于切片）；
S8、修块：用镊子将包埋模具撕掉，将样品表面包埋剂磨去，露出组织块横截面；
S9、半薄切片：
①安装钨钢刀，放在刀夹中夹紧；
②调整切片厚度为1-2μm，调整刀片与包埋块的位置，使刀锋与包埋块对齐；
③右手缓慢转动旋转臂开始切片，左手使用毛刷轻轻按住切片正上方，在此过程中右手转动速度均匀，防止包埋快破碎，左手力量稳定，防止切片卷曲及破碎；
S10、工作液处理：
①配制饱和氢氧化钠无水乙醇溶液。加过量氢氧化钠于无水乙醇中，使用保鲜膜封口防止进入水分，过夜至溶液变黄，吸取上清溶液，与甲苯溶液按照3：1的比例混合；
②使用移液枪吸取200 ul工作液加在载玻片上，摇动载玻片使工作液均匀分布载玻片上，用镊子夹取多个切片置于载玻片上反应1-2 min，后将载玻片完全浸于60 ℃水槽中，切片立刻漂至水面上；
③使用新的载玻片垂直90°插于水槽中，使用毛刷轻轻拨动切片使切片局部与载玻片接触，缓慢将载玻片抬离水面，将载玻片放到50 ℃加热板上加热；
④将切片放于60 ℃烘箱中12 h，防止染色过程中脱片；
S11、染色：
①考马斯亮蓝G250染液配制（染蛋白呈深蓝色）：1 g考马斯亮蓝G250+400 ml乙醇+70 ml冰醋酸配1 L；
②洗脱液配制：250 ml乙醇+80 ml冰醋酸配1 L；
③考马斯亮蓝G250染色：
S111、切片置于60 ℃加热板上；
S112、滴加考马斯亮蓝G250染色2 min；
S113、洗脱液分色10 min；
S114、水洗1 min；加热板上烘干后置于显微镜下观察；
切片经考马斯亮蓝G250染色后，在光学显微镜下观察，可获得褶皱少、分辨率高，反差适中的图像，如图2、图3。图2、图3均为考马斯亮蓝G250染色后显示出小麦成熟期籽粒完整的胚乳横截面及蛋白、淀粉粒结构，避免了原方法如图1产生大量褶皱染色后影响观察分析，拍照后可进一步应用于图像分析。
本发明未涉及部分均与现有技术相同或可采用现有技术加以实现。
如上所述，尽管参照特定的优选实施例已经表示和表述了本发明，但其不得解释为对本发明自身的限制。在不脱离所附权利要求定义的本发明的精神和范围前提下，可对其在形式上和细节上作出各种变化。

Claims (10)

1.一种小麦成熟期籽粒的树脂切片制作方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、取材：选用成熟期小麦籽粒干种子，事先在水中浸泡使其软化；将软化的籽粒横切开，切取颖果中部2-3mm厚的组织块；
S2、固定：将S1中的组织块浸泡在10%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液中24h，使组织块内的组织和细胞充分固定；
S3、漂洗：用10×PBS缓冲液漂洗多次固定后的组织块，以充分洗去固定液；
S4、脱水：用25%-50%-75%-100%-100%乙醇水溶液对组织块逐级脱水，每级10min；
S5、树脂渗透：用20%-40%-60%-80%-100%-100%伦敦白胶树脂对组织块进行逐级渗透，每级2h；
S6、包埋：将渗透完的组织块放于包埋模具中，注入100%树脂；
S7、聚合：将包埋模具放在烘箱内，60℃聚合1-2天；
S8、修块：对包埋块进行手工修块，将组织块周围多余树脂削去；
S9、半薄切片：用超薄切片机切厚度为1-2μm切片；
S10、工作液处理：将工作液涂满载玻片表面，将切片转移至载玻片上反应1-2min；将装有切片的载玻片完全浸入水槽，使用新的载玻片捞取水面上的切片，将新的载玻片放到60℃加热板上干燥，使切片展平；
S11、染色：S10中的切片经考马斯亮蓝G250染色，在光学显微镜下观察，可获得分辨率高、反差适中的图像。
2.根据权利要求1所述的小麦成熟期籽粒的树脂切片制作方法，其特征在于，S1中，提前用水润麦使其软化，切组织块时手拿麦粒勿用力挤压，以免组织发生形变。
3.根据权利要求1所述的小麦成熟期籽粒的树脂切片制作方法，其特征在于，S2中，固定液的配方为100 ml 10%的多聚甲醛溶液，250 ml 0.2mol/l PH7.4 磷酸缓冲液和50 ml25%的戊二醛水溶液；固定液固定温度为常温，用量为样品体积的10倍。
4.根据权利要求1所述的小麦成熟期籽粒的树脂切片制作方法，其特征在于，S5中，20%-40%-60%-80%伦敦白胶树脂是100%伦敦白胶树脂与100%乙醇分别按照1：4、2：3、3：2和4：1的体积比混合而成。
5.根据权利要求1所述的小麦成熟期籽粒的树脂切片制作方法，其特征在于，S9中，所述半薄切片的方法如下：
S91、超薄切片机上安装钨钢刀，放在刀夹中夹紧；
S92、调整切片厚度为1或2μm，调整刀片与包埋块的位置，使刀锋与包埋块对齐；
S93、右手缓慢转动旋转臂开始切片，左手使用毛刷轻轻按住切片正上方，在此过程中右手转动速度均匀，防止包埋块破碎，左手力量稳定，防止切片卷曲及破碎。
6.根据权利要求1所述的小麦成熟期籽粒的树脂切片制作方法，其特征在于，S10中，配制工作液方法为：加过量氢氧化钠于无水乙醇中，使用保鲜膜封口防止进入水分，过夜至溶液变黄，吸取上清溶液，得到饱和氢氧化钠无水乙醇溶液，将饱和氢氧化钠无水乙醇溶液与甲苯溶液按照3：1的比例混合而成，得到工作液。
7.根据权利要求1所述的小麦成熟期籽粒的树脂切片制作方法，其特征在于，S10中，使用移液枪吸取200ul工作液加在载玻片上，摇动载玻片使工作液均匀分布载玻片上，用镊子夹取多个切片置于载玻片上反应1-2min，后将载玻片完全浸于60℃水槽中，切片立刻漂至水面上。
8.根据权利要求1所述的小麦成熟期籽粒的树脂切片制作方法，其特征在于，S10中，使用新的载玻片垂直90°插于水槽中，使用毛刷轻轻拨动切片使切片局部与载玻片接触，缓慢将载玻片抬离水面，将载玻片放到60℃加热板上。
9.根据权利要求1所述的小麦成熟期籽粒的树脂切片制作方法，其特征在于，S11中，所述考马斯亮蓝G250染色的具体为：
S111、切片置于60℃加热板上；
S112、滴加考马斯亮蓝G250染色2 min；
S113、洗脱液分色10 min；
S114、水洗1 min；加热板上烘干后置于显微镜下观察。
10.根据权利要求9所述的小麦成熟期籽粒的树脂切片制作方法，其特征在于，S11中，所述考马斯亮蓝G250染液配方为：1 g考马斯亮蓝G250+400 ml乙醇+70 ml冰醋酸配1 L溶液；所述洗脱液配方为：250 ml乙醇+80 ml冰醋酸配1 L。
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