CN112063606A - 一种快速提取贝类消化内源酶的方法 - Google Patents

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史亚萍
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Abstract

本发明公开了一种快速提取贝类消化内源酶的方法，主要涉及生物提取技术领域。包括以下步骤：取贝类的胃部或晶杆，加入在4℃预冷的pH5‑6缓冲液中，研磨浸提30min‑40min；取浸提液加入离心管，4℃条件10000g离心20‑30min；0.45μm微滤膜过滤，取上清液，以上述缓冲液为流动相，经1×8cm的交联葡聚糖色谱柱分离，收集一个柱体积之后的流出液，即得粗酶。本发明的有益效果在于：它简化了分离纯化步骤，大大缩短了贝类内源酶的提取分离时间。

Description

一种快速提取贝类消化内源酶的方法
技术领域
本发明涉及生物提取技术领域，具体是一种快速提取贝类消化内源酶的方法。
背景技术
贝类属于软体动物门瓣鳃纲，其体表具有两片贝壳，也被称为双壳纲。现存种类29000余种，其中大部分是海洋底栖动物，在水底泥沙中营穴居生活。消化酶主要是由消化腺和消化系统分泌的具有消化作用的酶类，根据其消化对象的不同大致可划分为蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶等。
关于海洋无脊椎动物消化酶的研究，国内很早就有报道，从种类上来看，以甲壳类和棘皮动物等的研究较多，而且大多数集中在消化酶的应用上，国内外关于贝类消化酶曾进行过很多方面的研究，在生产加工过程中，许多贝类的消化器官被丢弃掉，导致大量的酶浪费严重。
晶杆亦称晶柱、晶针，是软体动物消化管中之半透明明胶样棒状体，其中含大量消化酶，为软体动物消化酶的主要供体。
蛋白酶的提取方法主要是有机溶剂提取法如丙酮提取法，盐析沉淀法，如硫酸铵沉淀。这些方法具有提取纯度高的优点，但大都以丙酮粉为酶源，而丙酮粉的制备操作繁琐，消耗大量丙酮，成本高，效率低；而硫酸铵沉淀操作繁琐且不易控制硫酸铵的添加速度和终点的控制。
而盐析的方法时间较长，通过现有文献和实验经验可以知道，采用采用(NH4)2SO4等方法盐析提取，要透析24h后得蛋白酶提取液，时间太长。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速提取贝类消化内源酶的方法，它简化了分离纯化步骤，大大缩短了贝类内源酶的提取分离时间。
本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：
一种快速提取贝类消化内源酶的方法，包括以下步骤：
取贝类的胃部或晶杆，加入在4℃预冷的pH5-6缓冲液中，研磨浸提30min-40min；
取浸提液加入离心管，4℃条件10000g离心20-30min；
0.45μm微滤膜过滤，取上清液，以上述缓冲液为流动相，经1×8cm的交联葡聚糖色谱柱分离，收集流出液，即得粗酶。
进一步的，所述收集流出液，包括收集收集第一个柱体积流出液、一个柱体积之后的1mL流出液、第2个1mL的流出液和第3个1mL流出液，进行A280nm的测定和酶活检测,将有活性的各部分合并。
进一步的，所述缓冲液与贝类组织的比例为1-3:1。
进一步的，所用缓冲液包括pH5-6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、丁二酸缓冲液中的任一项。
进一步的，所述交联葡聚糖色谱柱的填料包括交联葡聚糖G10，交联葡聚糖G25，交联葡聚糖G75和交联葡聚糖G100中的任一种。
对比现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明实现了贝类内源性酶的快速高效的提取分离。本发明中的提取分离方法较传统的盐析和丙酮提取法相比具有易操作、提取率高级，提取时间短等优点，所提取的酶的量可以满足科学研究的需要。
附图说明
附图1是本发明的流程示意图。
附图2是本发明的应用本发明的提取方法对11种贝类的内源消化酶的活性测定结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所限定的范围。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
本发明所述的提取方法，其主要方法包括：
首先用金属剪刀撬壳，分别取其富含消化酶的胃部或晶杆。快速加入在4℃预冷的pH5-6缓冲液中，并在4℃的环境下研磨浸提30min-40min。取浸提液加入离心管，于冷冻离心机中4℃10000g离心20-30min。使用0.45μm微滤膜过滤上清液以除去大块色素和其他大分子杂质，直接加入到1×8cm的交联葡聚糖色谱柱里，以提取用缓冲液为流动相，收集流出液在280nm处测定吸光度，每次收集的流出液的量可以根据需要进行设定，收集1个柱体积收集液、1个柱体积之后的1mL收集液、和第2个1mL的收集液在280nm处进行比色，将有活性的各部分合并。
实施例1：
10只新鲜的菲律宾帘蛤(Ruditapesphilippinarum)，用金属剪刀撬壳，分别取其富含消化酶的胃部或晶杆。快速加入在3倍质量的4℃预冷的0.025M的丁二酸缓冲液(pH5.2)中，并在4℃的环境下研磨浸提30min。取浸提液加入离心管，于冷冻离心机中4℃10000g离心20min。使用0.45μm微滤膜过滤上清液以除去大块色素和其他大分子杂质，直接加入到1×8cm的交联葡聚糖色谱柱G25中，以提取用缓冲液为流动相，收集1个柱体积的流出液，之后的每1mL收集一次，分别测定酶活后，目标酶主要存在于1个柱体积和之后的1mL流出液中。
实施例2：
10只新鲜的贻贝(Mytilus edulis)，用金属剪刀撬壳，分别取其富含消化酶的胃部或晶杆。快速加入在3倍质量的4℃预冷的0.1M的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH5.0)中，并在4℃的环境下研磨浸提40min。取浸提液加入离心管，于冷冻离心机中4℃10000g离心30min。使用0.45μm微滤膜过滤上清液以除去大块色素和其他大分子杂质，直接加入到1×8cm的交联葡聚糖色谱柱G25中，以提取用缓冲液为流动相，收集1个柱体积的流出液，之后的每1mL收集一次，分别测定酶活后，目标酶主要存在于1个柱体积和之后两个的1mL流出液中。
实施例3：
10只新鲜的毛蚶(Scapharcasubcrenata)，用金属剪刀撬壳，分别取其富含消化酶的胃部或晶杆。快速加入在3倍质量的4℃预冷的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH5.2)中，并在4℃的环境下研磨浸提30min。取浸提液加入离心管，于冷冻离心机中4℃10000g离心20min。使用0.45μm微滤膜过滤上清液以除去大块色素和其他大分子杂质，直接加入到1×8cm的交联葡聚糖色谱柱G25中，以提取用缓冲液为流动相，收集1个柱体积的流出液，之后的每1mL收集一次，分别测定酶活后，目标酶主要存在于1个柱体积和之后的1mL流出液中。

Claims (5)

1.一种快速提取贝类消化内源酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
取贝类的胃部或晶杆，加入在4℃预冷的pH5-6缓冲液中，研磨浸提30min-40min；
取浸提液加入离心管，4℃条件10000g离心20-30min；
0.45μm微滤膜过滤，取上清液，以上述缓冲液为流动相，经1×8cm的交联葡聚糖色谱柱分离，收集流出液，即得粗酶。
2.根据权利要求1所述一种快速提取贝类消化内源酶的方法，其特征在于，所述收集流出液，包括收集收集第一个柱体积流出液、一个柱体积之后的1mL流出液、第2个1mL的流出液和第3个1mL流出液，进行A280nm的测定和酶活检测,将有活性的各部分合并。
收集的体积根据280nm处吸光度的检测结果来确定。
3.根据权利要求1所述一种快速提取贝类消化内源酶的方法，其特征在于，所述缓冲液与贝类组织的比例为1-3:1。
4.根据权利要求1所述一种快速提取贝类消化内源酶的方法，其特征在于，所用缓冲液包括pH5-6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、丁二酸缓冲液中的任一项。
5.根据权利要求1所述一种快速提取贝类消化内源酶的方法，其特征在于，所述交联葡聚糖色谱柱的填料包括交联葡聚糖G10，交联葡聚糖G25，交联葡聚糖G75和交联葡聚糖G100中的任一种。
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