CN105385674A - 一种从草鱼中提取纯化胰蛋白酶的方法 - Google Patents

一种从草鱼中提取纯化胰蛋白酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从草鱼中提取纯化胰蛋白酶的方法。本发明通过粗提液的制备、硫酸铵分级盐析、DEAE-Sephacel阴离子交换层析和Sephacryl-200凝胶过滤层析等提取纯化得到胰蛋白酶。该发明为胰蛋白酶的制备提供了一种新的材料来源，同时为草鱼内脏的合理回收及应用提供了理论依据。

Description

一种从草鱼中提取纯化胰蛋白酶的方法
技术领域
本发明涉及酶学、及其分离或纯化方法技术领域，具体地说涉及一种从胰脏中提取及纯化胰蛋白酶的方法。
背景技术
胰蛋白酶(trypsin，EC3.4.21.4)为丝氨酸蛋白酶类的一种。在脊椎动物体内作为消化酶而起作用。该酶在胰脏是作为酶的前体-胰蛋白酶原而被合成的。随胰液分泌到小肠中，受肠激酶，或胰蛋白酶的作用成为活化胰蛋白酶。胰蛋白酶是肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸（Lys）和精氨酸（Arg）残基中的羧基侧切断，酶切作用专一性强。它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起到活化作用。是特异性最强的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少的工具。
在多种鱼类肝胰脏和幽门垂中，胰蛋白酶以酶原形式分泌，进入消化道后在肠激酶和Ca2+的作用下，去除激活肽后成为有活性的胰蛋白酶。草鱼为中国主要淡水鱼类养殖对象，分布于中国各大水系，肉味美，营养丰富且易养殖，是一种很好的经济动物。有研究报道草鱼的胰脏蛋白酶活性较高，对其内脏蛋白酶的相关研究可以为草鱼内脏的合理利用提供理论基础，同时胰蛋白酶的制备提供了一种新的材料来源。
发明内容
本发明的目的是提供了一种从草鱼中提取纯化胰蛋白酶的方法。
本发明的技术方案是：将草鱼胰脏经粗提液的制备、硫酸铵分级盐析、DEAE-Sephacel阴离子交换层析和Sephacryl-200凝胶过滤层析得到胰蛋白酶纯品，包括如下步骤：
（1）粗提液的制备：取清洗干净的草鱼胰脏，加入pH7.0~9.0的含0.01~0.1mol/LNaCl、0.001~0.005mol/LCaCl2的0.02mol/LTris-HCl缓冲液，高速匀质机（10~20sec/次）捣碎20~30次；12000~15000rpm,4℃离心15~20分钟，收集上清作为胰蛋白酶粗提液。
（2）硫酸铵分级沉淀：
:向粗提液加固体硫酸铵至10%~30%饱和度，静置1~2h,12000~15000rpm,4℃离心15~20分钟；
:向上清液中继续添加硫酸铵至加硫酸铵至60%~70%饱和度；静置1~2h,12000~15000rpm,4℃离心15~20分钟；
:沉淀用上述同样的Tris-HCl缓冲液溶解后进行透析15~20h,期间更换3~5次透析液，每次透析液用量为样品体积的15~20倍；透析后12000~15000rpm,4℃离心15~20分钟；上清液用3~5层纱布过滤后得层析用酶液。
（3）DEAE-Sephacel阴离子交换层析：用pH7.0~9.0的含0.01~0.1mol/LNaCl、0.001~0.005mol/LCaCl2的0.02mol/LTris-HCl缓冲液平衡DEAE-Sephacel层析柱；将酶液上样于层析柱后，先用同样的Tris-HCl缓冲液冲洗掉未结合的蛋白，再换用pH7.0~9.0的含0.05~0.5mol/LNaCl0.02mol/LTris-HCl缓冲液洗脱，紫外检测，收集酶活性部分，超滤浓缩。
（4）Sephacryl-200凝胶过滤层析：用含pH7.0~9.0的含0.1~0.3mol/LNaCl的0.02mol/LTris-HCl缓冲液平衡SepharcylS-200凝胶柱，将上述浓缩液上样于该柱，用同样的含NaCl的Tris-HCl缓冲液洗脱，紫外检测仪检测并记录洗脱酶活性峰，洗脱液经4℃透析过夜，冷冻干燥得胰蛋白酶纯品。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例
所述的利用将草鱼胰脏经粗提液的制备、硫酸铵分级盐析、DEAE-Sephacel阴离子交换层析和Sephacryl-200凝胶过滤层析得到胰蛋白酶纯品，包括如下步骤：
（1）粗提液的制备：取清洗干净的草鱼胰脏，加入pH7.8的含0.05mol/LNaCl、0.002mol/LCaCl2的0.02mol/LTris-HCl缓冲液，高速匀质机20sec/次捣碎25次；13000,4℃离心15分钟，收集上清作为胰蛋白酶粗提液。
（2）硫酸铵分级沉淀：
:向粗提液加固体硫酸铵至20%饱和度，静置1.5h,13000rpm,4℃离心15分钟；
:向上清液中继续添加硫酸铵至加硫酸铵至70%饱和度；静置1.5h,13000rpm,4℃离心15分钟；
:沉淀用上述同样的Tris-HCl缓冲液溶解后进行透析16h,期间更换5次透析液，每次透析液用量为样品体积的20倍；透析后13000,4℃离心15分钟；上清液用4层纱布过滤后得层析用酶液。
（3）DEAE-Sephacel阴离子交换层析：加入pH7.8的含0.05mol/LNaCl、0.002mol/LCaCl2的0.02mol/LTris-HCl缓冲液平衡DEAE-Sephacel层析柱；将酶液上样于层析柱后，先用同样的Tris-HCl缓冲液冲洗掉未结合的蛋白，再换用pH7.8的含0.2mol/LNaCl0.02mol/LTris-HCl缓冲液洗脱，紫外检测，收集酶活性部分，超滤浓缩。
（4）Sephacryl-200凝胶过滤层析：用含pH7.8的含0.25mol/LNaCl的0.02mol/LTris-HCl缓冲液平衡SepharcylS-200凝胶柱，将上述浓缩液上样于该柱，用同样的含NaCl的Tris-HCl缓冲液洗脱，紫外检测仪检测并记录洗脱酶活性峰，洗脱液经4℃透析过夜，冷冻干燥得胰蛋白酶纯品。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (9)

1.一种从草鱼中提取纯化胰蛋白酶的方法，其特征在于：将草鱼胰脏经粗提液的制备、硫酸铵分级盐析、DEAE-Sephacel阴离子交换层析和Sephacryl-200凝胶过滤层析得到胰蛋白酶纯品。
2.根据权利要求1所述的提取纯化胰蛋白酶的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
（1）粗提液的制备：取清洗干净的草鱼胰脏，加入Tris-HCl缓冲液，高速匀质机捣碎，离心，收集上清作为胰蛋白酶粗提液；
（2）硫酸铵分级沉淀：
:向粗提液加固体硫酸铵至较低饱和度，静置，离心，取上清；
:向上清液中继续添加硫酸铵至较高饱和度，静置，离心收集沉淀；
:沉淀用上述同样的Tris-HCl缓冲液溶解后进行透析，透析后的样品离心，过滤得上清液；
（3）DEAE-Sephacel阴离子交换层析：用Tris-HCl缓冲液平衡DEAE-Sephacel层析柱；将酶液上样于层析柱后，先用同样的Tris-HCl缓冲液冲洗掉未结合的蛋白，再换用含一定浓度NaCl的Tris-HCl洗脱液洗脱，紫外检测，收集酶活性部分，超滤浓缩；
（4）Sephacryl-200凝胶过滤层析：用含NaCl的Tris-HCl缓冲液平衡SepharcylS-200凝胶柱，将上述浓缩液上样于该柱，用同样的含NaCl的Tris-HCl缓冲液洗脱，紫外检测仪检测并记录洗脱酶活性峰，超滤后冷冻干燥，即得成品。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的缓冲液是pH7.0~9.0的含0.01~0.1mol/LNaCl、0.001~0.005mol/LCaCl2的0.02mol/LTris-HCl缓冲液。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（1）中高速匀质机运行频率为10~20sec/次，捣碎20~30次；离心机转速12000~15000rpm,4℃离心15~20分钟。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤步骤（2）I中，加硫酸铵至10%~30%饱和度，静置1~2h,12000~15000rpm,4℃离心15~20分钟。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（2）II中，加硫酸铵至60%~70%饱和度；静置1~2h,12000~15000rpm,4℃离心15~20分钟。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（2）III中，透析时间为15~20h,期间更换3~5次透析液，每次透析液用量为样品体积的15~20倍；透析后12000~15000rpm,4℃离心15~20分钟；上清液用3~5层纱布过滤后得层析用酶液。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，平衡液是pH7.0~9.0的含0.01~0.1mol/LNaCl、0.001~0.005mol/LCaCl2的0.02mol/LTris-HCl缓冲液；洗脱液为pH7.0~9.0的含0.05~0.5mol/LNaCl0.02mol/LTris-HCl缓冲液；活性部分用YM-10超滤膜进行超滤浓缩。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（4）中，平衡液是pH7.0~9.0的含0.1~0.3mol/LNaCl的0.02mol/LTris-HCl缓冲液；洗脱液经4℃透析过夜，冷冻干燥得胰蛋白酶纯品。
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