JPS63201200A - ＴＧＦ−β制御糖タンパク質サブユニツト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、癌化成長因子β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｓｉｎ
ｇＧｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ−β　（ＴＧＦ−β）と
可逆的に結合してＴＧＦ−βの活性を阻害する、新規な
制御波タンパク質のサブユニットに関する。この新規物
質は、（＋）　ＴＧＦ−β過剰産生腫瘍に対する制癌剤
、（２）創傷並びに肝炎の治療剤、（３）血中及び組織
中のＴＧＦ−β濃度の高感度測定法に用いる試薬として
の用途を有する。

［従来の技術］ ＴＧＦ−βは外傷の修復や肝細胞の再生に関係する因子
であって、血小板中に蓄積されている。

ＴＧＦ−βは血小板をトロンビンて処理すると滞在型（
ｌａｔｅｎｔ　ｆｏｒｍ）の状態で血小板から分泌され
る。

（Ｎａｋａｍｕｒａ、　　Ｔ、、　　Ｔｅｒａｍｏｔｏ
　　Ｉｌ、、　　Ｔｏｍｉｔａ、　　Ｙ、　　＆ｌｃｌ
＋１ｈａｒａ、　　Ａ、、　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ、　　Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍｕｎ、　１３４．７５５−７６３　（１９８１
ｉ））　ＴＧＦ−βは多くの肝異機能を有する成熟ラッ
ト初代培養肝細胞の増殖を阻害する（Ｎａｋａｍｕｒａ
、　Ｔ、、　Ｔｏｍｉｔａ、　Ｙ、。

Ｈｉｒａｉ、　Ｒ，、Ｙａｍａｏｋａ、　Ｋ、、　Ｋａ
ｊｉ　Ｋ、　＆　１ｃｈｉｈａｒａ。

Ａ、　Ｂｉｏｃｈｅａ＋、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ
、　Ｃｏｍｍｕｎ、　山、　ｐｐ。

１０４２−１０５０　（１９８５）；　Ｈａｙａｓｈｉ
、　Ｉ、＆　Ｃａｒ！、　Ｂ、Ｉ。

Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　１２５．　ｐｐ
、８２−９１　（１９８５））。

ＴＧＦ−βはＴＧＦ−α又は表皮Ｊｌｉ！：長因子（Ｅ
にＦ）の存在下で、軟寒天中でＮＲＫ　４９Ｆ　繊維芽
細胞及びＡＫＲ−２８細胞の付着非依存性成長を促進し
くＲｏｂｅｒｔｓ、　八、Ｂ、。

Ｆｒｏｌｉｋ、　Ｃ，Ａ、、　Ａｎｚａｎｏ、　Ｍ、Ａ
、　＆　５ｐｏｒｎ、　Ｍ、Ｂ。

Ｆｅｄ、　Ｐｒｏｃ、　４２．　ｐｐ、２６２１−２６
２６　（＋９８３）；　Ａｓ５ｏｉａｎ。

Ｒｏに、、　Ｋｏｍｏｒｉｙａ、＾、、　Ｍｅｙｅｒｓ
、　Ｃ，Ａ、、　Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｄ。

Ｍ、＆　　５ｐｏｒｎ、Ｍ、Ｂ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ
ｅｗ、２５８．ｐｐ。

７１５５−７１６０　（１９８コ））、多くの細胞系の
単層培養における付刃依存性成長を阻害する（Ｔｕｃｋ
ｅｒ、　Ｒ，Ｆ、。

５ｈｉｐｌｅｙ、　Ｇ、Ｄ、、　Ｍｏ５ｅｓ、　Ｉｌ、
Ｌ、　＆　ｌ１ｏｌｌｅｙ、　Ｒ，Ｗ、。

５ｃｉｅｎｃｅ　２２６．　ｐｐ、７０５−７０７　（
＋９８４）；　Ｒｏｂｅｒｔｓ。

Ａ、Ｂ、、　Ａｎｚａｎｏ、　Ｍ、Ａ、、　Ｗａｋｅｆ
ｉｅｌｄ、　Ｌ、Ｍ、、　Ｒｏｃｈｅ。

Ｎ、Ｓ、、　５ｔｅｒｎ、　Ｄ、Ｆ、　＆　５ｐｏｒｎ
、　Ｍ、Ｂ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ−、８２，ｐｐ、１
１９−１２３　（１９８５））。

［発明の概要］ 本願発明者らは、４個以上の分子が会合してＴＧＦ−β
と可逆的に結合し、ＴＧＦ−βと結合している状態では
ＴＧＦ−βの活性を阻害してこれを潜在型とするＴＧＦ
−βの制御糖タンパク質サブユニットを見出し、これを
単離することに成功し本願発明を完成した。

すなわち、この発明は、血小板中に存在し、４個以上の
分子が会合したものがＴＧＦ−βと可逆的に結合してＴ
ＧＦ−βの活性を阻害し、熱及び酸に対して安定であり
、ジチオスレイトール又はトリプシンで処理するとその
ＴＧＦ−β阻害活性が失われる分子量約４６ｋｄ０′）
糖タンパク質サブユニットを提供する。

［発明の効果］ この発明により、　ＴＧＦ−βの活性を制御する新規な
糖タンパク質サブユニットか提供された。この発明のサ
ブユニットを会合させた糖タンパク質により、ＴＧＦ″
−βの高感度微量定量か可能となり、血中ＴＧＦ−βと
種々の疾病との相関か明らかにてきる。また、　ＴＧＦ
−βを産生じてオートクリン機構で自律的増殖を行なう
腫瘍の成長を阻害する制癌剤として利用できる。さらに
、肝炎などの種々の炎症に対する抗炎症剤として利用す
ることも可能である。

［発明の詳細な説明］ この発明の糖タンパク質サブユニットは以下のようにし
て単離、精製することかてきる。

まず、従来から知られている方法により、血小板から潜
在型のＴＧＦ−βを分泌させる。これは、全血から遠心
により血小板を分離し、これを例え−ば２Ｕ／■ｌのト
ロンビンを含むバッファーに２４゛し、例えば室温て１
０分間放置することによって行うことができる。遠心に
より血小板を除いた上清中に潜在型ＴＧＦ−βが含まれ
ており、以下の操作においてこれを出発物質とする。

次に、この潜在型子ＧＦ−β（ＴＧＦ−βに制御糖タン
パク質が結合したもの）から糖タンパク質サブユニット
の会合体を解離する。これは、上記上清を１００℃の水
中で５分間処理することによりて、又は上記上清を６Ｍ
尿素若しくはＩＮ酢酸で処理することによって行うこと
がてきる。６Ｍ尿素又はＩＮ酢酸による処理は、これら
を含むリン酸バッファーに対して一夜透析することによ
って行うことがてきる。なお、これらの処理を行う前に
、例えばＭｏｎｏ−Ｓカラム（ファルマシア社製）のよ
うな高性使陰イオン交換クロマトグラフィーによって肝
細胞増殖因子（ＩＩＧＦ）を除去し、さらに限外ろ過に
よって滅菌することか好ましい、ＷＩ在型ＴＧＦ−βを
含む分画は、上記Ｍｏｎｏ−Ｓカラムを素通りする。

上記操作により解離したＴＧＦ−βとその制御糖タンパ
ク質を次に、６Ｍ尿素とバッファーとて平衡化した例え
ばＭｏｎｏ−Ｑカラム（ファルマシア社製）のような高
性能陰イオン交換クロマトクラフィーに架ける。同一バ
ッファーて洗？４＋後、　ＮａＣｌ濃度勾配で溶出する
。後述する実施例て明らかになるように、制御Ｊ１糖タ
ンパク質は０．４Ｍ　ＮａＣ１により溶出されるので、
ＮａＣ１勾配は０．４Ｍを挟んで行う必要がある。精製
を確実に行うために、この陰イオン交換クロマトグラフ
ィーは少なくとも２回行うことが好ましい。

制御則タンパク質店性分画を次に６Ｍ尿素とバッファー
で平衡化した例えばセファクリルＳ−３００（ファルマ
シア社製）のようなゲルろ過クロマトグラフィーに架け
てさらに精製する。なお、ゲルろ過に架ける前に、上記
活性分画を限外ろ過にて濃縮しておくことが好ましい。

このゲルろ過クロマトグラフィーにおいて、この発明の
サブユニットの会合体である糖タンパク質か５００から
［１００ｋｄの分画に溶出する。

次に制御則タンパク質店性分画をＱ、０５ｚ）−ソフル
オロ酢酸（ＴＦＡ）に対して透析し、０．０５’Ｘ　丁
ＦＡて平衡化した例えばＢｉｏ　Ｒａｄ　Ｃ４カラムに
架けて逆相高速液体クロマトグラフィーを行う、溶出は
、例えば３０〜４５ｚのアセトニトリル勾配により行う
ことができる。この発明の制御糖タンパク質サブユニッ
トはアセトニトリル濃度３９％の位置に溶出する。

上記操作により、この発明の糖タンパク質サブユニット
は単離、精製される。還元条件下のＳＯ３−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（ＳＯ３−ＰＡＧＥ）により調べ
たところ、この発明の糖タンパク質サブユニットは、分
子量約４６ｋｄの位置に単一のバンドとして現れた。従
って、この発明の糖タンパク質サブユニットの分子量は
約４６ｋｄである。

ＴＧＦ−βの制御則タンパク質の分子量は中性条件下の
上記セファクリルＳ−３００ゲルろ過クロマトグラフィ
ーでは５００から５００ｋｄの大分子量を示し、還元条
件下の５Ｏ３−ＰＡＧＥでは４６ｋｄを示すことから、
制ｗ糖タンパク質は、この発明のサブユニットから成る
ホモオリゴマーであることがわがつた。ところが、非還
元条件下の５ＤＳ−ＰＡＧＥでは制御則タンパク質はい
ずれの位はにも町確なバントを示さない。そこで上記の
ようにして精製したａｌｔ糖タンパク質サブユニットを
２％　ＳＤＳて３７°Ｃ１１５時間処理後、５％ゲルを
用いた５ＤＳ−ＰＡＧＥを行い、２１會幅でゲルをスラ
イスして、各スライスから制御則タンパク質をリン酸バ
ッファーで一昼夜抽出して制御波タンパク質活性を測定
した。その結果、制御波タンパク質活性は分子量約１８
０ｋｄと約２２０ｋｄの位置に二本のピークとして検出
された。この結果、制御波タンパク質活性を示す最低分
子量が約１８０Ｍであることを示し、これは４６ｋｄの
サブユニット４個に相当する。また、制御波タンパク質
活性は後述するようにメルカプトエタノールやジチオス
レイトールで還元すると失活することより、サブユニッ
トの単量体ては活性がない、従って、この発明のサブユ
ニットは４個以上会合して活性なＴＧＦ−βの制御則タ
ンパク質として機能することがわかった。

この発明のサブユニットが４個以上会合して成る糖タン
パク質は、上述のように処理するとＴＧＦ−βから解離
するが、ＴＧＦ−βと共に中性条件て数分間インキュベ
ートすると、再びＴＧＦ−βと結合してＴＧＦ−βの活
性を阻害する。しかも、ＴＣＰ−β活性の阻害はこの発
明の糖タンパク質サブユニットの濃度に依存して変化す
る。

この発明のサブユニットから成る糖タンパク質は、１０
０℃、３分間の加熱によってそのＴＧＦ−β阻害活性が
全く減少せず、１Ｍ酢酸で２５°Ｃ１２時間処理しても
そのＴＧＦ−β阻害活性が２０％しか落ちないので、熱
及び酸に対して安定であるということが言える。一方、
５０ｍＭのジチオスレイトールで３７℃、２時間処理、
又は濃度１０ＪＬｇ／ｆｉｔのトリプシンて３７°Ｃ１
２時間処理することによってＴＧＦ−β阻害活性が実質
的に失われる。

この発明の新規物質は、コンカナバリンＡに対して高い
親和性を有し、α−メチルマンノシドによってコンカナ
バリンＡから解離するので、糖タンパク質であることが
わかった。

また、この発明のＴＧＦ−β制御糖タンパク質サブユニ
ットは、ヒトを含む哺乳動物に広く存在するものである
。

［実施例］ この実施例において、成熟ラット肝細胞の単離及び培養
のために用いた材料はＴａｎａｋａ、　Ｋ。

５ａｔｏ、　Ｍ、、　Ｔｏｓｉｔａ、　Ｙ　＆　Ｉｃｈ
ｉｈａｒａ、　Ａ、（１９７８）　Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　８４．９３７−９４６に記載された
ものと同しものを用いた。組換えヒトＥＧＦは赤穂市の
アース製薬社製、インシュリン、アプロチニン及び子ウ
シ海漿からの純粋トロンビンはシグマ化学社製、セファ
クリルＳ−３００、Ｍｏｎｏ−３及びＭｏｎｏ−Ｑカラ
ムはファルマシア社製、〔メチル−’ＩＩチミジン（Ｓ
２．４Ｃｉ／ＩＩａｏｌ）はニュー・イングランド・ヌ
クリア社製、ヒトＴＧＦ−βはバイオメディカル・テク
ノロジー社製のものを用いた。

ＴＧＦ−β及びＴＧＦ−β制御糖タンパク質の活性測定
法以下の実施例において、各分画のＴＧＦ−β活性は以
下に述べる２つの全く独立した方法の両方又は一方によ
り行なった。１つの方法ては、成熟ラット初代培養肝細
胞のＤＮＡ合成のＴＧＦ−βによる阻害を調べた。成熟
ラット肝細胞は、Ｎａｋａｍｕｒａ、　Ｔ、、　Ｔｏｓ
ｉｔａ、　Ｙ　＆　Ｉｃｈｉｈａｒａ、　Ａ、、　Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｓ、　９４．１０２９−１０３５　（１９
８３）に記載した方法により単離し単層培養した。イン
シュリン（１０−７Ｍ）　、　ＥＧＦ　（２０ｎｇ／ｍ
ｌ）　、　ＴＧＦ−βを培養２０時間後に加え、１５時
間後に【３旧チミジン（２，５゜Ｃｉ／ｍｌ、　０．３
ルＣｉ／層■ｏｌ）をアフィジコリン（１０ルｇ／ｌ）
と共に又はアフィジコリンを加えることなく加えた。２
４時間後、【３旧チミジンの取り込みをＮａｋａｍｕｒ
ａ、Ｔ、、　　Ｔｏ醜ｉｔａ、　　Ｙ　　＆　　Ｉｃｈ
ｉｈａｒａ、　　Ａ、（１９８３）Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、　９４．１０２９−１０３５に記載した方法により
測定した。ＴＧＦ−βはこのＤＮＡ合成を阻害するので
、その取り込み量が少ないほどＴＧＦ−βの活性が高い
ことになる。もう１つの方法では、軟寒天中でのＮＨＫ
　４９Ｆ細胞のコロニー形成を調べた。アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクションから得たＮＲＫ　４９
Ｆ細胞を、５％ウシ胎児血清を含むダルベツコの修飾培
地に維持した。軟寒天中でのコロニーの形成は、Ｎａｋ
ａｍｕｒａ、　Ｔ、、　Ｔｏｍｉｔａ、　Ｙ、。

Ｈｉｒａｉ、　Ｒ，、Ｙａ＋＊ａｏｋａ　、　Ｋ、、　
Ｋａｊｉ、に、　＆　Ｉｃｈｉｈａｒａ。

Ａ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　　Ｒｅｓ、
Ｃｏ５５ｕｎ、　　１３３．１０４２−１０５０　（１
９８５）に記載した方法に従い、２ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ
の存在下て行なった。

一方、　ＴＧＦ−β制御糖タンパク賀の活性は次のよう
にして測定した。２．５膿ｇ／＋ｓｌのウシ血清アルブ
ミンと２ｎｇ／ｍｌのラット又はヒトＴＧＦ−β（最大
有効量）を含むｓｏｇ＋のリン酸バッファー中て被検試
料を室温て５分間インキュベートした。得られた混合物
のＴＧＦ−β活性を上記と同様に肝細胞のＤＮＡ合成の
阻害又はＮＨＫ　４９Ｆ細胞のコロニー形成の促進を測
定することによって測定した。この発明の糖タンパク質
の活性の１ユニツトは、初代培養肝細胞のＤＮＡ合成を
完全に阻害する状態から５０％回復させる量を意味する
。比活性はタンパク質１ｍｇ当りのユニットて表わし、
タンパク質の測定はローリ−らの方法（Ｌｏ豐ｒｙ、　
Ｏ，Ｈ，。

Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇｈ、　Ｎ、Ｊ、、　Ｆａｒｒ、　Ａ
、Ｌ、　＆　ＲＡＮＤＡＬＬ、　Ｒ，Ｊ。

（１９５１）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｂｃ国、　１４す
、　２６５−２７５）に従って行なった。

成熟ラットの血液を、抗凝固剤として０．１倍体積の０
．ＩＳＭ　ＮａＣｌ−７７ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ７，４
）を含む注射筒に集めた。これを２００　ｘ　ｇで１５
分間遠心し、得られた上澄を２５００　ｘ　ｇで１５分
間遠心して血小板を沈殿させた。沈殿をリン酸バッファ
ーに懸濁して遠心する操作を２回行なって洗浄した。顕
微鏡て判定したところ９９％以上の純度の血小板沈殿が
得られた。２０／ｓｌのトロンビンを含むリン酸バッフ
ァー中に血小板を懸濁し、室温で１０分間放置し、次に
血小板の凝集物を２５００　ｘ　ｇで１５分間遠心して
沈殿させた。得られた上清を、この発明の糖タンパク質
精製の出発物質として用いた。

上記血小板抽出物を、０．１５Ｍ　ＮａＣ１，１０ｍＭ
Ｈｅｐｅｓ及び２ＩＩＭＣａＣ１２を含む５０＋＊Ｍの
トリス塩酸バッフｙ　−（ｐＨ８，５）で平衡化したＭ
ｏｎｏ−Ｓカラム（１ｘ　１０ｃｍ）にかけて肝細胞増
殖因子（ＩＩＧＦ）を除去した。素通り分画（４２０ｍ
ｌ）をプールし、ＰＭ　１０膜？アミコン社製）を用い
て限外ろ過し、５倍に濃縮した。このようにして濃縮し
た材料（４，３ｍｌ。

１．７７■ｇタンパク賀）を、６Ｍの尿素を含む２５Ｉ
ＩＭトリスバッファー（ｐＨ８，５）に対して一夜透析
し、この発明のサブユニットから成る糖タンパク質をＴ
ＧＦ−βとの複合体から解離させた。

透析後の試料（１４７ｔｇタンパク質）を上記トリスバ
ッファー（ｐＨ８，５）／６Ｍ尿素て十分平衡化したＭ
ｏｎｏ−Ｑカラム（ファルマシア社製）　（１ｘ　１０
ｃｍ）に架けた。同一ハツフア−てカラムを洗浄後、流
速１２０ｍ１／時間て３段階のＮａＣ１濃度勾配溶出を
行なった。先ず、０−０．２５　Ｍ　Ｎａ１ｌまでを１
０分間て上昇させ、さらに１０分間、０．２５Ｍ　Ｎａ
Ｃｌを流し続け、Ｍｏｎｏ−Ｑカラムに吸着した大部分
の夾雑タンパク質な洗い流した０次に、　０．２５−０
．５５Ｍまでを６０分。

間の勾配で流し、ＴＧＦ−βと制御語タンパク質を溶出
した。最後に、０．５５Ｍ−１，０Ｍまで１０分間て急
上昇させ、カラムを洗った。このクロマトグラ−フィー
の結果が第１図に示されている。第１図中、黒丸は制御
糖タンパク賀活性、白丸は成熟−ラット初代培養肝細胞
のＤＮＡ合成抑制能にて測定したＴＧＦ−β活性、実線
は２８０ｎ■ての吸光度又はＮａＣ１の潤度勾配を示す
、第１図から、ＴＧＦ−β活性は０．２５Ｍ　ＮａＣｌ
て、ＴＧＦ−β制御糖タンパク質は０．４ＭＮａ（：ｌ
てそれぞれ溶出され、両者は完全に分離したことかわか
る。

上記Ｍｏｎｏ−Ｑカラムによる陰イオン交換クロマトグ
ラフィーを再び行った。その結果を第２図に示す。この
再クロマトグラフィーにより制御則タンパク質は高度に
精製されることがわかる。

次に、上記Ｍｏｎｏ−Ｑカラムによる再クロマトグラフ
ィーの活性画分を集め、ＰＭＩＯの限外ろ過で１．１１
に濃縮後、リン酸バッファー７６Ｍ尿素で平衡化したセ
ファクリルＳ−３００（ファルマシア社製、１．６ｃｓ
　ｘ　７５ｃｍ）に架け、　１０ｍ１／時間の流速で溶
出した。このゲルろ過てＴＧＦ−β制御側タンパク質活
性はＶ。より少し遅れた位置に溶出され、分子量４００
ｋｄ以下の夾雑タンパク質と分離された。このゲルろ過
クロマトグラフィーの結果を第３図に示す。

上記ゲルろ過の活性画分（９１）を０．０５＄　ＴＦＡ
に対して透析し、ＴＦＡで平衡化後、Ｂｉｏ　Ｒａｄ　
（：４カラム（バイオラド社製、４．６ｍ＊　Ｘ　２５
０１票）に架け、３０−４５％の間てゆるやかなアセト
ニトリル濃度勾配により、制御則タンパク質を溶出した
。制御則タンパク質活性はアセトニトリル濃度３９％の
位置に溶出されるタンパク質のピークに一致して認めら
れた。この逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ
）の結果を第４図に示す。

以上の精製過程を第１表に要約した。１ｇ１表に示され
るように、逆相ＨＰＬＣて精製された制御則タンパク質
の比活性は、２７２７　ｘ　１０”単位／ｍｇタンパク
質で、Ｍｏｎｏ−３素通り画分から約１２８６倍に精製
され、その回収率は７％であった。

次に、逆相クロマトグラフィーにより得られた活性画分
をメルカプトエタノール存在下て処理し、　５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥを行い、銀染色によってタンパク質を染色した。

結果を第５図に示す、第５図に示されるように、この発
明の制御則タンパク質すツユニットは分子量約４６ｋｄ
の単一のハントとして得られ、実質的に均一標品である
ことがわかった。

ＴＧＦ−β制御糖タンパク質の諸性質 一方、メルカプトエタノール非存在下（非還元条件下）
ての５Ｏ３−ＰＡＧＥによっては、制御則タンパク質は
いずれの位置にも明確なハントを示さなかった。そこて
、上記逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃにより得られた活性画分を２％
ＳＤＳて３７℃、１５時間処理後、５％ゲルを用いた５
Ｏ３−ＰＡＧＥを行い、２Ｉ幅てゲルをスライスして各
スライスから制御則タンパク質をリン酸バッファーて一
昼抽出してその活性を測定した。

結果を第６図に示す。第６図に示すように、制御則タン
パク質活性は分子量約１８０ｋｄと約２２０ｋｄの位置
に２木のピークとして検出された。

この結果はＴＧＦ−β制御糖タンパク質活性を示す最低
分子量か１８０　ｋｄであることを示し、これは４６ｋ
ｄのこの発明のサツユニット４個に相当し、制ｍ糖タン
パク質は少なくともテトラマー以上の分子会合体である
ことがわかった。後述するように、制御則タンパク賀活
性はメルカプトエタノールやジチオスレイトールで還元
すると失活することから、４６ｋｄのサブユニット単量
体では活性がない。

次に、この発明のサブユニットから成る制御則タンパク
質か、ＴＧＦ−βと結合してその活性を量に依存して阻
害することを示す実験を行なった。

上記のように精製したこの発明のサブユニットから成る
糖タンパク質を、子ウシ血清アルブミン溶液（２ｊ＋ｇ
／ｍｌ）で希釈し、限外ろ過により滅菌した。　ＴＧＦ
−βの活性を、８ｉ々の糖タンパク質濃度において調べ
た。

結果を第７図に示す、第７図中、破線はＴＧＦ−βを加
えることなくインシュリンとＥＧＦのみを加えた場合の
肝細１抱のＤＮＡ合成を示す、第７図から明らかなよう
に、この発明のサブユニットから成る制ｕ１糖タンパク
質は、ＴＧＦ−βと再び結合してＴＧＦ−βによる肝細
胞ＤＮＡ合成の阻害を中和することがわかる。しかも、
その中和の程度が制御則タンパク質の量に依存して変化
することがわかる。

次に、上記のようにしてＭｇしたこの発明の制ｍｔＩタ
ンパク質０’）　５０　ｐ−１（０，２ｐＬｇ　９　ン
ハ’）質）をトップシン（１０ルｇ／ｍｌ、３７°Ｃ５
２時間）、ジチオスレイトール（５ｈＭ、２５℃、２時
間）、ＩＮ酢酸（２５℃、２時間）、又は加熱（沸騰水
、３分ＩＬ’ｌ　）処理した。トリプシンによる消化は
２時間インキュベート後、終濃度１ｍＭのフェニルメチ
ルスルフォニルフロリドを加えることによって反応停止
を行なった。これらの処理の後、試料にウシ血清アルブ
ミン（２，５＋ａｇ／ｍｌ）を加え、リン酸バッファー
に対して一夜透析し、その活性を上記方法に従って測定
した。

結果を第２表に示す、第２表より、この発明の糖タンパ
ク質は１００℃、３分間の加熱でその活性が全く減少せ
ず、上記酢酸処理によりても活性を８０％維持している
ことかわかる。従って、この発明の制御則タンパク質は
熱及び酸に対して安定であると言える。一方、上記ジチ
オスレイトールによる処理で活性が完全になくなるので
、活性を発揮するためにはジスルフィド結合が必要であ
ることかわかる。また、上記トリプシン処理によっても
活性が完全になくなるので、活性を発揮するためにはタ
ンパク質構造が必要であることがわかる。

この発明のサブユニットの木質が糖タンパク質であるこ
とは、コンカナバリンＡへの高い親和性とα−メチルマ
ンノシドによる解離によって示された。この実験は具体
的には以下のようにして行なった。すなわち、ゲルろ過
により部分精製した制御則タンパク質を０．ＳＭ　　Ｎ
ａ（：ｌを含む２５ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７
，５）で平衡化したコンカナバリンＡセファロースカラ
ム（０，５ｃ■ｘ　２ｃ■）にかけ、同−八ツファーで
カラムを十分洗浄後、α−メチルマンノシドを上記バッ
ファーに溶解させ、第８図に示す各濃度て段階約９溶出
した。

結果を第８図に示す、第８図から制御則タンパク質はコ
ンカナバリンＡセファロースに吸着し、０．０１〜０．
１Ｍα−メチルマンノシドにより特異的に溶出されるこ
とがわかる。

さらに、この発明の制御則タンパク質をノイラミニダー
ゼ、エンドグリコシダーゼＤ、エンドグリコシダーゼＨ
又はα−マンノシダーゼ（いずれも５■Ｕ）で処理して
その活性を調べた。

結果を第３表に示す、第３表より、この発明の制御則タ
ンパク質はノイラミニダーゼ、エンドグリコシダーゼＤ
、α−マンノシダーゼに対しては比較的安定であるが、
エンドグリコシダーゼＨに対しては不安定であり、この
ことから制御則タンパク質は高マンノース糖釦の基部の
Ｎ−アセチルグルコサミン結合を切断するとその活性を
失うことがわかる。すなわち、制ｕ４ａタンパク質の活
性には高マンノースａ鎖が必須であることがわかる。

ｔ５３表 なし　　　　　　　１．１２　　　　　　　−１　　＋
　ＥＧＦ　　　　　　　　　　　９．３７　　　　　　
　　　　　　　−＋　　ＴＧＦ−β　　　　　　　１．
７７　　　　　　　　　　　　−＋未処理　　　　９．
７３　　　　　　１００糖タンパク ダーゼ（５ｍＵ）

【図面の簡単な説明】

第１図は、この発明のＴＧＦ−β制御則タンパク質サブ
ユニットの精製工程における第１回目の陰イオン交換ク
ロマトグラフィーの結果を示す図。 第２図は同じく第２回目の陰イオン交換クロマトグラフ
ィーの結果を示す図、 第３図は同精製工程におけるゲルろ過クロマトグラフィ
ーの結果を示す図、 第４図は同精製工程における逆相高速液体クロマトグラ
フィーの結果を示す図。 第５図は精製されたこの発明のＴＧＦ−β制御則タンパ
ク質サブユニットの還元条件下ての５ＤＳ−ＰＡＧＥの
結果を示す図。 第６図は非還元条件下での丁ＧＦ−β制御糖タンパク質
の５ＤＳ−ＰＡＧＥの各ゲルスライス中の制御糖タンパ
ク質活性を示す図、 第７図は、この発明のサブユニットから成る糖タンパク
質によるＴＧＦ−βの活性阻害の濃度依存性を示す図。 ｔ５８図は、この発明のサブユニットから成る糖タンパ
ク質のコンカナバリンＡへの結合及び解離の状態を示す
図である。 特許出願人　　東亜燃料工業株式会社 特許出願人代理人　弁理士　谷用　芙次部第５図 Ｒｆ 第７図 制御塘タンパク質（ｎｇ／ｉｆ） 手　わタ　ネ市　正　書（方式） 昭和６２年９月１４日

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 　血小板中に存在し、４個以上の分子が会合したものが
   ＴＧＦ−βと可逆的に結合してＴＧＦ−βの活性を阻害
   し、熱及び酸に対して安定であり、ジチオスレイトール
   又はトリプシンで処理するとそのＴＧＦ−β阻害活性が
   失われる分子量約４６ｋｄの糖タンパク質サブユニット
   。