JPS63150300A - TGF−β制御糖タンパク質 - Google Patents
TGF−β制御糖タンパク質Info
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-
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
[産業上の利用分野]
この発明は、癌化成長因子β(Transformin
gGrowth Factor−β (TGF−β)と
可逆的に結合してTGF−βの活性を阻害する、新規な
制御軸タンパク質に関する。この新規物質は、(1)
TGF−β過剰産生腫瘍に対する制癌剤、(2)創傷並
びに肝炎の治療剤、(3)血中及び組織中のTGF−β
濃度の高感度測定法に用いる試薬としての用途を有する
。
gGrowth Factor−β (TGF−β)と
可逆的に結合してTGF−βの活性を阻害する、新規な
制御軸タンパク質に関する。この新規物質は、(1)
TGF−β過剰産生腫瘍に対する制癌剤、(2)創傷並
びに肝炎の治療剤、(3)血中及び組織中のTGF−β
濃度の高感度測定法に用いる試薬としての用途を有する
。
[従来の技術]
TGF−βは外傷の修復や肝細胞の再生に関係する因子
てあって、血小板中に蓄積されている。
てあって、血小板中に蓄積されている。
TGF−βは血小板をトロンビンて処理すると潜在型(
latent form)の状態で血小板から分泌され
る。
latent form)の状態で血小板から分泌され
る。
(Nakamura、 T、、 Teramoto H
,、Tomita、 Y、 &Ichihara、
A、、 Biochem、 Biophys、
Res。
,、Tomita、 Y、 &Ichihara、
A、、 Biochem、 Biophys、
Res。
Commun、 134.755−7[i3 (198
6)) TGF−βは多くの肝異機能を有する成熟ラッ
ト初代培養肝細胞の増殖を阻害する(Nakamura
、 T、、 Tomita、 Y、。
6)) TGF−βは多くの肝異機能を有する成熟ラッ
ト初代培養肝細胞の増殖を阻害する(Nakamura
、 T、、 Tomita、 Y、。
Hirai、 R,、Yamaoka、 K、、 Ka
ji K、 & Ichihara。
ji K、 & Ichihara。
八、 Biochem、 Biophys、 R
es、 Commun、 133. pp。
es、 Commun、 133. pp。
1042−1050 (1985); Hayashi
、 T、 & Carl、 B、I。
、 T、 & Carl、 B、I。
J、 Ce11. Physiol、 125. pp
、82−91 (1985))。
、82−91 (1985))。
TGF−βはTGF−α又は表皮成長因子(EGF)の
存在下て、軟寒天中でNRK 49F繊維芽細胞及びA
KR−2B細胞の付着非依存性成長を促進しくRobe
rts、 、A、B、。
存在下て、軟寒天中でNRK 49F繊維芽細胞及びA
KR−2B細胞の付着非依存性成長を促進しくRobe
rts、 、A、B、。
Frolik、C,A、、 Anzano、 M、A、
& 5porn、 M、B。
& 5porn、 M、B。
Fed、 Proc、 42.、 pp、2621−2
625 (1983); As5oian。
625 (1983); As5oian。
R,に、、 Komoriya、 A、、 Meyer
S、 C:、A、、 Miller、 D。
S、 C:、A、、 Miller、 D。
M、 & 5porn、 M、B、、 J、 Biol
、 Chem、 258. pp。
、 Chem、 258. pp。
7155−7160 (1983)) 、多くの細胞系
の単層培養における刺着依存性成長を阻害する(Tuc
ker、 R,F、。
の単層培養における刺着依存性成長を阻害する(Tuc
ker、 R,F、。
5hipley、 G、D、、 Mo5es、 H,L
、 & Ho1ley、 R,W、。
、 & Ho1ley、 R,W、。
5cience 226. pp、705−707 (
1984); Roberts。
1984); Roberts。
A、B、、 Anzano、 M、A、、 Wakef
ield、 L、M、、 Roche。
ield、 L、M、、 Roche。
N、S、、 5tern、 D、F、 & 5porn
、 M、B、、 Proc、 Natl。
、 M、B、、 Proc、 Natl。
Acad、 Sci、 U、S、A、 82. pp、
119−123 (1985))。
119−123 (1985))。
[発明の概要コ
本願発明者らは、TGF−βと可逆的に結合し、TGF
−βと結合している状態てはTGF−βの活性を阻害し
てこれを潜在型とするTGF−βの制御軸タンパク質を
見出し、これを単離することに成功し本願発明を完成し
た。
−βと結合している状態てはTGF−βの活性を阻害し
てこれを潜在型とするTGF−βの制御軸タンパク質を
見出し、これを単離することに成功し本願発明を完成し
た。
すなわち、この発明は、血小板中に存在し、TGF−β
と可逆的に結合してTGF−βの活性を阻害し、熱及び
酸に対して安定であり、ジチオスレイトール又はトリプ
シンて処理するとそのTGF−β阻害活性か失われる分
子量約440Mの糖タンパク質を提供する。
と可逆的に結合してTGF−βの活性を阻害し、熱及び
酸に対して安定であり、ジチオスレイトール又はトリプ
シンて処理するとそのTGF−β阻害活性か失われる分
子量約440Mの糖タンパク質を提供する。
[発明の効果]
この発明により、TGF−βの活性を制御する新規な糖
タンパク質か提供された。この発明の糖タンパク質によ
り、TGF−βの高感度微量定量か可能となり、血中T
GF−βと種々の疾病との相関が明らかにてきる。また
、TGF−βを産生じてオートクリン機構で自律的増殖
を行なう腫瘍の成長を阻害する制癌剤として利用てきる
。さらに、肝炎などの種々の炎症に対する抗炎症剤とし
て利用することも可能である。
タンパク質か提供された。この発明の糖タンパク質によ
り、TGF−βの高感度微量定量か可能となり、血中T
GF−βと種々の疾病との相関が明らかにてきる。また
、TGF−βを産生じてオートクリン機構で自律的増殖
を行なう腫瘍の成長を阻害する制癌剤として利用てきる
。さらに、肝炎などの種々の炎症に対する抗炎症剤とし
て利用することも可能である。
[発明の詳細な説明]
この発明の糖タンパク質は、後述の実施例において示す
ように、血小板にトロンビンを作用させて潜在型のTG
F−βを分泌させ、これを100℃の水中て5分間処理
するか又はIN酢酸若しくは6M尿素て処理することに
よって潜在型TGF−βから解離される。これをゲルろ
過クロマトクラフィー又は陰イオン交換クロマトグラフ
ィーにかけることによってこの発明の糖タンパク質を単
離することができる。
ように、血小板にトロンビンを作用させて潜在型のTG
F−βを分泌させ、これを100℃の水中て5分間処理
するか又はIN酢酸若しくは6M尿素て処理することに
よって潜在型TGF−βから解離される。これをゲルろ
過クロマトクラフィー又は陰イオン交換クロマトグラフ
ィーにかけることによってこの発明の糖タンパク質を単
離することができる。
この発明の糖タンパク質の分子量は、ゲルろ過クロマト
グラフィーにより約440kdであることがわかった。
グラフィーにより約440kdであることがわかった。
この発明の糖タンパク質は、上述のように処理するとT
GF−βから解離するが、TGF−βと共に中性条件て
数分間インキュベートすると、再びTGF−βと結合し
てTGF−βの活性を阻害する。しかも、TGF−β活
性の阻害はこの発明の糖タンパク゛質の濃度に依存して
変化する。TGF−βの阻害活性は0.3uLg/ml
て認められ、約1.2 Jl、g/mlて最大となる。
GF−βから解離するが、TGF−βと共に中性条件て
数分間インキュベートすると、再びTGF−βと結合し
てTGF−βの活性を阻害する。しかも、TGF−β活
性の阻害はこの発明の糖タンパク゛質の濃度に依存して
変化する。TGF−βの阻害活性は0.3uLg/ml
て認められ、約1.2 Jl、g/mlて最大となる。
この発明の糖タンパク質は、100°C13分間の加熱
によってそのTGF−β阻害活性が全く減少せず、1M
酢酸て25℃、2時間処理してもそのTGF−β阻害活
性が20%しか落ちないので、熱及び酸に対して安定で
あるということが言える。T方、50mMのジチオスレ
イトールて37℃、2時間処理、又は濃度10 JLg
/mlのトリプシンて37℃、2時間処理することによ
ってTGF−β阻害活性が実質的に失われる。
によってそのTGF−β阻害活性が全く減少せず、1M
酢酸て25℃、2時間処理してもそのTGF−β阻害活
性が20%しか落ちないので、熱及び酸に対して安定で
あるということが言える。T方、50mMのジチオスレ
イトールて37℃、2時間処理、又は濃度10 JLg
/mlのトリプシンて37℃、2時間処理することによ
ってTGF−β阻害活性が実質的に失われる。
この発明の新規物質は、コンカナバリンAに対して高い
親和性を有し、α−メチルマンノシドによってコンカナ
バリンAから解離するので、糖タンパク質であることが
わかった。
親和性を有し、α−メチルマンノシドによってコンカナ
バリンAから解離するので、糖タンパク質であることが
わかった。
[実施例]
この実施例において、成熟ラット肝細胞の単離及び培養
のために用いた材料はTanaka、 K。
のために用いた材料はTanaka、 K。
5ato、 M、、 Tomita、 Y & Ich
ihara、 A、(1978) J。
ihara、 A、(1978) J。
Biochem、 84.937−946に記載された
ものと同じものを用いた。組換えヒトEGFは赤穂布の
アース製薬社製、インシュリン、アプロチニン及び子ウ
シ血漿からの純粋トロンビンはシグマ化学社製、セファ
クリルS−300、Mono−3及びMono−’Qカ
ラムはファルマシア社製、[メチル−3旧チミジン(5
2,4Ci/mmol)はニュー・イングランド・ヌク
リア社製、ヒトTGF−βはバイオメディカル・テクノ
ロジー社製のものを用いた。
ものと同じものを用いた。組換えヒトEGFは赤穂布の
アース製薬社製、インシュリン、アプロチニン及び子ウ
シ血漿からの純粋トロンビンはシグマ化学社製、セファ
クリルS−300、Mono−3及びMono−’Qカ
ラムはファルマシア社製、[メチル−3旧チミジン(5
2,4Ci/mmol)はニュー・イングランド・ヌク
リア社製、ヒトTGF−βはバイオメディカル・テクノ
ロジー社製のものを用いた。
成熟ラットの血液を、抗凝固剤として0.1倍体積の0
.15M Mail−77mM EDTA(pH7,4
)を含む注射筒に集めた。これを200 x gて15
分間遠心し、得られた上澄を2500 x gで15分
間遠心して血小板を沈殿させた。沈殿をリン酸バッファ
ーに懸濁して遠心する操作を2回行なって洗浄した。顕
微鏡て判定したところ99%以上の純度の血小板沈殿か
得られた。20膜mlのトロンビンを含むリン酸バッフ
ァー中に血小板を懸濁し、室温で10分間放置し、次に
血小板の凝集物を2500 x gて15分間遠心して
沈殿させた。得られた上清を、この発明の糖タンパク質
精製の出発物質として用いた。
.15M Mail−77mM EDTA(pH7,4
)を含む注射筒に集めた。これを200 x gて15
分間遠心し、得られた上澄を2500 x gで15分
間遠心して血小板を沈殿させた。沈殿をリン酸バッファ
ーに懸濁して遠心する操作を2回行なって洗浄した。顕
微鏡て判定したところ99%以上の純度の血小板沈殿か
得られた。20膜mlのトロンビンを含むリン酸バッフ
ァー中に血小板を懸濁し、室温で10分間放置し、次に
血小板の凝集物を2500 x gて15分間遠心して
沈殿させた。得られた上清を、この発明の糖タンパク質
精製の出発物質として用いた。
上記血小板抽出物を、0.15M NaCl、10mM
Hepes及び2mM Ca(:12を含む50mMの
トリス塩酸バッフ y −(pH8−5)て平衡化した
Mono−Sカラム(1x 10cm)にかけて肝細胞
増殖因子(HGF)を除去した。通り抜けた分画をプー
ルし、PM 10膜(アミコン社製)を用いて限外ろ過
した。このようにして濃縮した材料(4,3ml、 1
.77mgタンパク質)を、6Mの尿素を含むリン酸バ
ッファーに対して一夜透析し、この発明の糖タンパク賀
をTGF−βとの複合体から解離させた。6M尿素を含
むリン酸バッファーで平衡化したセファクリルS−30
0カラム(2,6x 85C[O)に透析物をかけ、同
溶液て26+++I/hの流速て溶離した。TGF−β
及びこの発明の糖タンパク質の活性を調べるために、全
ての画分からそれぞれ500P+を採り、ウシ血清アル
ブミン(2,5mg/+1)を加え、リン酸バッファー
に対して一夜透析し、0.227Lm (1) 7 イ
ルター(ミレックス−GV、ミリポア社製)を通してろ
過することによって滅菌した。
Hepes及び2mM Ca(:12を含む50mMの
トリス塩酸バッフ y −(pH8−5)て平衡化した
Mono−Sカラム(1x 10cm)にかけて肝細胞
増殖因子(HGF)を除去した。通り抜けた分画をプー
ルし、PM 10膜(アミコン社製)を用いて限外ろ過
した。このようにして濃縮した材料(4,3ml、 1
.77mgタンパク質)を、6Mの尿素を含むリン酸バ
ッファーに対して一夜透析し、この発明の糖タンパク賀
をTGF−βとの複合体から解離させた。6M尿素を含
むリン酸バッファーで平衡化したセファクリルS−30
0カラム(2,6x 85C[O)に透析物をかけ、同
溶液て26+++I/hの流速て溶離した。TGF−β
及びこの発明の糖タンパク質の活性を調べるために、全
ての画分からそれぞれ500P+を採り、ウシ血清アル
ブミン(2,5mg/+1)を加え、リン酸バッファー
に対して一夜透析し、0.227Lm (1) 7 イ
ルター(ミレックス−GV、ミリポア社製)を通してろ
過することによって滅菌した。
各分画のTGF−β活性は2つの全く独立した方法によ
り行なった。1つの方法では、成熟ラット初代培養肝細
胞のDNA合成のTGF−βによる阻害を調べた。成熟
ラット肝細胞は、Nakamura、 T、。
り行なった。1つの方法では、成熟ラット初代培養肝細
胞のDNA合成のTGF−βによる阻害を調べた。成熟
ラット肝細胞は、Nakamura、 T、。
Tomita、 Y & Ichihara、 A、、
J、 Biochem、 94゜1029−1035
(1983)に記載した方法により単離し単層培養し
た。インシュリン(10−’M) 、 EGF(20膜
g/ml) 、 TGF−βを培養20時間後に加え、
15時間後に[3旧チミジン(2,5p Ci/ml、
0.3ILC4/mmol)をアフィジコリン(10
JLg/ml)と共に又はアフィジコリンを加えること
なく加えた。24時間後、[3旧チミジンの取り込みを
Nakamura、T、 。
J、 Biochem、 94゜1029−1035
(1983)に記載した方法により単離し単層培養し
た。インシュリン(10−’M) 、 EGF(20膜
g/ml) 、 TGF−βを培養20時間後に加え、
15時間後に[3旧チミジン(2,5p Ci/ml、
0.3ILC4/mmol)をアフィジコリン(10
JLg/ml)と共に又はアフィジコリンを加えること
なく加えた。24時間後、[3旧チミジンの取り込みを
Nakamura、T、 。
Tomita、 Y & Ichihara、 A、(
1983) J、 Biochem。
1983) J、 Biochem。
94、1029−1035に記載した方法により測定し
た。
た。
TGF−βはこのDNA合成を阻害するのて、その取り
込み量か少ないほどTGF−βの活性が高いことになる
。もう1つの方法では、軟寒天中でのNHK49F 細
胞のコロニー形成を調べた。アメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクションから得たNRK49F細胞を、5
%ウシ胎児血清を含むダルベツコの修飾培地に維持した
。軟寒天中でのコロニーの形成は、Nakamura、
T、、 Tomita、 Y、、 Hirai、 R
,。
込み量か少ないほどTGF−βの活性が高いことになる
。もう1つの方法では、軟寒天中でのNHK49F 細
胞のコロニー形成を調べた。アメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクションから得たNRK49F細胞を、5
%ウシ胎児血清を含むダルベツコの修飾培地に維持した
。軟寒天中でのコロニーの形成は、Nakamura、
T、、 Tomita、 Y、、 Hirai、 R
,。
Yamaoka 、 K、、 Kajj、 K、 &
Ichihara、 A、、 Biochem、 Bi
ophys、 Res、 Commun、 133.1
042−1050(1985)に記載した方法に従い、
2ng/mlのEGFの存在下で行なった。
Ichihara、 A、、 Biochem、 Bi
ophys、 Res、 Commun、 133.1
042−1050(1985)に記載した方法に従い、
2ng/mlのEGFの存在下で行なった。
一方、この発明の糖タンパク質の活性は次のようにして
測定した。2.5mg/mlのウシ血清アルブミンと2
ng/n+1のラット又はヒトT6F−β(最大有効量
)を含む50ルIのリン酸バッファー中で被検試料を室
温で5分間インキュベートした。得られた混合物のTG
F−β活性を上記と同様に肝細胞のDNA合成の阻害又
はNHK 49F細胞のコロニー形成の促進を測定する
ことによって測定した。この発明の糖タンパク質の活性
の1ユニツトは、−次培養肝細胞のD N A 64を
完全に阻害する状態から50%回復させる量を意味する
。非活性はタンパク質1mg当りのユニットて表わし、
タンパク質の測定はローリ−らの方法(Lowry、
O,H,。
測定した。2.5mg/mlのウシ血清アルブミンと2
ng/n+1のラット又はヒトT6F−β(最大有効量
)を含む50ルIのリン酸バッファー中で被検試料を室
温で5分間インキュベートした。得られた混合物のTG
F−β活性を上記と同様に肝細胞のDNA合成の阻害又
はNHK 49F細胞のコロニー形成の促進を測定する
ことによって測定した。この発明の糖タンパク質の活性
の1ユニツトは、−次培養肝細胞のD N A 64を
完全に阻害する状態から50%回復させる量を意味する
。非活性はタンパク質1mg当りのユニットて表わし、
タンパク質の測定はローリ−らの方法(Lowry、
O,H,。
Rosebrough、 N、J、、 Farr、 A
、L、 & RANDALL、 R,J。
、L、 & RANDALL、 R,J。
(1951) J、 Biol、 Chem、 193
.265−275)に従って行なった。
.265−275)に従って行なった。
結果を第1図に示す。図中、白丸はTGF−β活性、黒
丸は制御軸タンパク質活性を示す。第1図から明らかな
ように、TGF−βの制御糖タンパク質はフェリチン(
440kd)と同し位置に溶出した。このことから、こ
の発明の制御糖タンパク質の分子量は440kdである
ことかわかった。
丸は制御軸タンパク質活性を示す。第1図から明らかな
ように、TGF−βの制御糖タンパク質はフェリチン(
440kd)と同し位置に溶出した。このことから、こ
の発明の制御糖タンパク質の分子量は440kdである
ことかわかった。
一方、上記血小板抽出物を陰イオン交換クロマトグラフ
ィーによっても精製した。700匹のラットからの血小
板抽出物(1000ml)をPM 10膜を用いて限外
ろ過することによって約200 mlにCMした。0.
025M NaCl と6M尿素とを含む25mM)す
ス塩酸バッファー(pH8,5)に対して、上記濃縮試
料(147mgタンパク質)を−夜透析して平衡化し、
同バッファーて予め平衡化したMono−Qカラム(1
xlOcIll)に架けた。溶離は、同バッファー中の
連続する3種のNaC]濃度勾配((+−0,25M
10分、0.25−0.55M 60分、0.55−1
.0M 10分)を用い、120m1/時間の流速で行
なった。全ての両分から100.1づつを取り、ウシ血
清アルブミン(2,5mg/ml)溶液て5倍に希釈し
、リン酸バッファーに対して透析して尿素を除去した。
ィーによっても精製した。700匹のラットからの血小
板抽出物(1000ml)をPM 10膜を用いて限外
ろ過することによって約200 mlにCMした。0.
025M NaCl と6M尿素とを含む25mM)す
ス塩酸バッファー(pH8,5)に対して、上記濃縮試
料(147mgタンパク質)を−夜透析して平衡化し、
同バッファーて予め平衡化したMono−Qカラム(1
xlOcIll)に架けた。溶離は、同バッファー中の
連続する3種のNaC]濃度勾配((+−0,25M
10分、0.25−0.55M 60分、0.55−1
.0M 10分)を用い、120m1/時間の流速で行
なった。全ての両分から100.1づつを取り、ウシ血
清アルブミン(2,5mg/ml)溶液て5倍に希釈し
、リン酸バッファーに対して透析して尿素を除去した。
これらを上記Millex−GVフィルターに通して滅
菌し、そのTGF−β及び制御糖タンパク質の活性を調
べた。
菌し、そのTGF−β及び制御糖タンパク質の活性を調
べた。
結果を第2図に示す。図中、白丸がTGF−β活性、黒
丸が制御糖タンパク質活性、実線か280nmにおける
吸光度、破線がNaC]の濃度を示す。第2図から、M
ono−QてのFPLCによりこの発明の制御糖タンパ
ク質を精製することがてきることがわかる。
丸が制御糖タンパク質活性、実線か280nmにおける
吸光度、破線がNaC]の濃度を示す。第2図から、M
ono−QてのFPLCによりこの発明の制御糖タンパ
ク質を精製することがてきることがわかる。
次に、この発明の制御糖タンパク質が、TGF−βと結
合してその活性を量に依存して阻害することを示す実験
を行なった。上記陰イオン交換クロマトグラフィーによ
り精製したこの発明の糖タンパク質を、子ウシ血清アル
ブミン溶液(2,5mg/+nl)て希釈し、上記と同
様のろ過により滅菌した。制御糖タンパク質の活性を、
0.0.3.0.6.0.9゜1.27ig/mlのタ
ンパク質量の濃度で上記方法により調べた。
合してその活性を量に依存して阻害することを示す実験
を行なった。上記陰イオン交換クロマトグラフィーによ
り精製したこの発明の糖タンパク質を、子ウシ血清アル
ブミン溶液(2,5mg/+nl)て希釈し、上記と同
様のろ過により滅菌した。制御糖タンパク質の活性を、
0.0.3.0.6.0.9゜1.27ig/mlのタ
ンパク質量の濃度で上記方法により調べた。
結果を第3図に示す。第3図中、破線はTGF−βを加
えることなくインシュリンとEGFのみを加えた場合の
肝細胞のDNA合成を示す。第3図から明らかなように
、この発明の制yj糖タンパク質は、TGF−βと再び
結合してTGF−βによる肝細胞DNA合成の阻害を中
和することがわかる。しかも、その中和の程度か制御糖
タンパク質の量に依存して変化することかわかる。なお
、実験結果は2回の平均である。
えることなくインシュリンとEGFのみを加えた場合の
肝細胞のDNA合成を示す。第3図から明らかなように
、この発明の制yj糖タンパク質は、TGF−βと再び
結合してTGF−βによる肝細胞DNA合成の阻害を中
和することがわかる。しかも、その中和の程度か制御糖
タンパク質の量に依存して変化することかわかる。なお
、実験結果は2回の平均である。
次に、陰イオン交換クロマトクラフィーて精製したこの
発明の制御糖タンパク質の50g1(7,4川gタンパ
ク質)をトリプシン(10ルg/l、37°C,2時間
)、ジチオスレイトール(50mM、250C12時間
)、IN酢酸(25°C12時間)、又は加熱(洟騰水
、3分間)処理した。トリプシンによる消化は2時間イ
ンキュベート後、終濃度1mMのフェニルメチルスルフ
ォニルフロリドことによって反応停止を行なった。これ
らの処理の後、試料にウシ血清アルブミン(2.5mg
/ml)を加え、リン酸バッファーに対して一夜透析し
、その活性を上記方法に従って測定した。
発明の制御糖タンパク質の50g1(7,4川gタンパ
ク質)をトリプシン(10ルg/l、37°C,2時間
)、ジチオスレイトール(50mM、250C12時間
)、IN酢酸(25°C12時間)、又は加熱(洟騰水
、3分間)処理した。トリプシンによる消化は2時間イ
ンキュベート後、終濃度1mMのフェニルメチルスルフ
ォニルフロリドことによって反応停止を行なった。これ
らの処理の後、試料にウシ血清アルブミン(2.5mg
/ml)を加え、リン酸バッファーに対して一夜透析し
、その活性を上記方法に従って測定した。
結果を第1表に示す。第1表より、この発明の糖タンパ
ク質は1006C、3分間の加熱てその活性か全く減少
せず、上記酢酸処理によっても活性を80%維持してい
ることかわかる。従って、この発明の制御糖タンパク質
は熱及び酸に対して安定であると言える。一方、上記ジ
チオスレイトールによる処理て活性か完全になくなるの
で、活性を発揮するためにはジスルフィド結合が必要で
あることがわかる。また、上記トリプシン処理によって
も活性が完全になくなるのて、活性を発揮するためには
タンパク質構造が必要であることかわかる。
ク質は1006C、3分間の加熱てその活性か全く減少
せず、上記酢酸処理によっても活性を80%維持してい
ることかわかる。従って、この発明の制御糖タンパク質
は熱及び酸に対して安定であると言える。一方、上記ジ
チオスレイトールによる処理て活性か完全になくなるの
で、活性を発揮するためにはジスルフィド結合が必要で
あることがわかる。また、上記トリプシン処理によって
も活性が完全になくなるのて、活性を発揮するためには
タンパク質構造が必要であることかわかる。
この発明の制御物質の木質か糖タンパク質であることは
、コンカナバリンAへの高い親和性とα−メチルマンノ
シドによる解離によって示された。この実験は具体的に
は以下のようにして行なった。すなわち、ゲルろ過によ
り部分精製した制御軸タンパク質を0.5M NaC
]を含む25IIIMトリスfn m /<ッファ−(
pH7,5)て平衡化したコンカナバリンAセファロー
スカラム(0,5cm x 2cm)にかけ、同−八ツ
ファーてカラムを十分洗浄後、α−メチルマンノシドを
上記バッファーに溶解させ、第4図に示す各濃度で段階
的に溶出した。
、コンカナバリンAへの高い親和性とα−メチルマンノ
シドによる解離によって示された。この実験は具体的に
は以下のようにして行なった。すなわち、ゲルろ過によ
り部分精製した制御軸タンパク質を0.5M NaC
]を含む25IIIMトリスfn m /<ッファ−(
pH7,5)て平衡化したコンカナバリンAセファロー
スカラム(0,5cm x 2cm)にかけ、同−八ツ
ファーてカラムを十分洗浄後、α−メチルマンノシドを
上記バッファーに溶解させ、第4図に示す各濃度で段階
的に溶出した。
結果を第4図に示す。第4図から制御軸タンパク質はコ
ンカナバリンAセファロースに吸着し、0.01〜0.
1Mα−メチルマンノシドにより特異的に溶出されるこ
とがわかる。
ンカナバリンAセファロースに吸着し、0.01〜0.
1Mα−メチルマンノシドにより特異的に溶出されるこ
とがわかる。
さらに、この発明の制御軸タンパク質をノイラミニダー
ゼ、エンドグリコシダーゼD、エンドグリコシダーゼH
又はα−マンノシダーゼ(いずれも5mtl)で処理し
てその活性を調べた。
ゼ、エンドグリコシダーゼD、エンドグリコシダーゼH
又はα−マンノシダーゼ(いずれも5mtl)で処理し
てその活性を調べた。
結果を第2表に示す。第2表より、この発明の制御軸タ
ンパク質はノイラミニダーゼ、エンドグリコシダーゼD
、α−マンノシダーゼに対しては比較的安定であるが、
エンドグリコシダーゼHに対しては不安定であり、この
ことから制御軸タンパク質は高マンノース糖鎖の基部の
N−アセチルクルコサミン結合を切断するとその活性を
失うことがわかる。すなわち、制御糖タンパク賀の活性
には高マンノース糖鎖か必須であることがわかる。
ンパク質はノイラミニダーゼ、エンドグリコシダーゼD
、α−マンノシダーゼに対しては比較的安定であるが、
エンドグリコシダーゼHに対しては不安定であり、この
ことから制御軸タンパク質は高マンノース糖鎖の基部の
N−アセチルクルコサミン結合を切断するとその活性を
失うことがわかる。すなわち、制御糖タンパク賀の活性
には高マンノース糖鎖か必須であることがわかる。
第2表
なし 1.12 −1 、
EGF 9.37
−+ TGF−β 1.77
〜ダーゼ(5mU) 千ンドクリコシ 7.、83 76ター
ゼD(5mυ) ダーゼ(5mU)
EGF 9.37
−+ TGF−β 1.77
〜ダーゼ(5mU) 千ンドクリコシ 7.、83 76ター
ゼD(5mυ) ダーゼ(5mU)
第1図はこの発明の糖タンパク質な精製するために行な
ったゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示す図、 第2図はこの発明の糖タンパク質を精製するために行な
った陰イオン交換クロマトグラフィーの結果を示す図、 第3図は、この発明の糖タンパク質によるTGF−βの
活性阻害の濃度依存性を示す図、第4図は、この発明の
糖蛋白のコンカナバリンAへの結合及び解離の状態を示
す図である。
ったゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示す図、 第2図はこの発明の糖タンパク質を精製するために行な
った陰イオン交換クロマトグラフィーの結果を示す図、 第3図は、この発明の糖タンパク質によるTGF−βの
活性阻害の濃度依存性を示す図、第4図は、この発明の
糖蛋白のコンカナバリンAへの結合及び解離の状態を示
す図である。
Claims (1)
- 血小板中に存在し、TGF−βと可逆的に結合してTG
F−βの活性を阻害し、熱及び酸に対して安定であり、
ジチオスレイトール又はトリプシンで処理するとそのT
GF−β阻害活性が失われる分子量約440kdの糖タ
ンパク質。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61298432A JPH0725798B2 (ja) | 1986-12-15 | 1986-12-15 | TGF−β制御糖タンパク質 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61298432A JPH0725798B2 (ja) | 1986-12-15 | 1986-12-15 | TGF−β制御糖タンパク質 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS63150300A true JPS63150300A (ja) | 1988-06-22 |
JPH0725798B2 JPH0725798B2 (ja) | 1995-03-22 |
Family
ID=17859629
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61298432A Expired - Lifetime JPH0725798B2 (ja) | 1986-12-15 | 1986-12-15 | TGF−β制御糖タンパク質 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0725798B2 (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1992022319A1 (en) * | 1991-06-18 | 1992-12-23 | Ludwig Institute For Cancer Research | SUBSTANTIALLY PURE RECEPTOR LIKE TGF-β1 BINDING MOLECULES AND USES THEREOF |
WO1998032015A1 (fr) * | 1997-01-21 | 1998-07-23 | The Kitasato Institute | Procede d'examen de plaies et d'evaluation de leur evolution, necessaires a cet effet et technique permettant de decider d'une methode de traitement de ces surfaces lesees |
US6586394B1 (en) | 1985-04-19 | 2003-07-01 | Osi Pharmaceuticals, Inc. | Tissue-derived tumor growth inhibitor |
-
1986
- 1986-12-15 JP JP61298432A patent/JPH0725798B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6586394B1 (en) | 1985-04-19 | 2003-07-01 | Osi Pharmaceuticals, Inc. | Tissue-derived tumor growth inhibitor |
WO1992022319A1 (en) * | 1991-06-18 | 1992-12-23 | Ludwig Institute For Cancer Research | SUBSTANTIALLY PURE RECEPTOR LIKE TGF-β1 BINDING MOLECULES AND USES THEREOF |
US5578703A (en) * | 1991-06-18 | 1996-11-26 | Ludwig Institute For Cancer Research | Substantially pure receptor like TFG-β1 binding molecules |
US5731200A (en) * | 1991-06-18 | 1998-03-24 | Ludwig Institute For Cancer Research | Isolated nucleic acid encoding receptor-like TGF-β1 binding protein |
WO1998032015A1 (fr) * | 1997-01-21 | 1998-07-23 | The Kitasato Institute | Procede d'examen de plaies et d'evaluation de leur evolution, necessaires a cet effet et technique permettant de decider d'une methode de traitement de ces surfaces lesees |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0725798B2 (ja) | 1995-03-22 |
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