JPS63150300A - ＴＧＦ−β制御糖タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、癌化成長因子β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎ
ｇＧｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ−β　（ＴＧＦ−β）と
可逆的に結合してＴＧＦ−βの活性を阻害する、新規な
制御軸タンパク質に関する。この新規物質は、（１）　
ＴＧＦ−β過剰産生腫瘍に対する制癌剤、（２）創傷並
びに肝炎の治療剤、（３）血中及び組織中のＴＧＦ−β
濃度の高感度測定法に用いる試薬としての用途を有する
。

［従来の技術］ ＴＧＦ−βは外傷の修復や肝細胞の再生に関係する因子
てあって、血小板中に蓄積されている。

ＴＧＦ−βは血小板をトロンビンて処理すると潜在型（
ｌａｔｅｎｔ　ｆｏｒｍ）の状態で血小板から分泌され
る。

（Ｎａｋａｍｕｒａ、　Ｔ、、　Ｔｅｒａｍｏｔｏ　Ｈ
，、Ｔｏｍｉｔａ、　Ｙ、　＆Ｉｃｈｉｈａｒａ、　　
Ａ、、　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　　
Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍｕｎ、　１３４．７５５−７［ｉ３　（１９８
６））　ＴＧＦ−βは多くの肝異機能を有する成熟ラッ
ト初代培養肝細胞の増殖を阻害する（Ｎａｋａｍｕｒａ
、　Ｔ、、　Ｔｏｍｉｔａ、　Ｙ、。

Ｈｉｒａｉ、　Ｒ，、Ｙａｍａｏｋａ、　Ｋ、、　Ｋａ
ｊｉ　Ｋ、　＆　Ｉｃｈｉｈａｒａ。

八、　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　　Ｒ
ｅｓ、　　Ｃｏｍｍｕｎ、　　１３３．　　ｐｐ。

１０４２−１０５０　（１９８５）；　Ｈａｙａｓｈｉ
、　Ｔ、　＆　Ｃａｒｌ、　Ｂ、Ｉ。

Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　１２５．　ｐｐ
、８２−９１　（１９８５））。

ＴＧＦ−βはＴＧＦ−α又は表皮成長因子（ＥＧＦ）の
存在下て、軟寒天中でＮＲＫ　４９Ｆ繊維芽細胞及びＡ
ＫＲ−２Ｂ細胞の付着非依存性成長を促進しくＲｏｂｅ
ｒｔｓ、　、Ａ、Ｂ、。

Ｆｒｏｌｉｋ、Ｃ，Ａ、、　Ａｎｚａｎｏ、　Ｍ、Ａ、
　＆　５ｐｏｒｎ、　Ｍ、Ｂ。

Ｆｅｄ、　Ｐｒｏｃ、　４２．、　ｐｐ、２６２１−２
６２５　（１９８３）；　Ａｓ５ｏｉａｎ。

Ｒ，に、、　Ｋｏｍｏｒｉｙａ、　Ａ、、　Ｍｅｙｅｒ
Ｓ、　Ｃ：、Ａ、、　Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｄ。

Ｍ、　＆　５ｐｏｒｎ、　Ｍ、Ｂ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ
、　Ｃｈｅｍ、　２５８．　ｐｐ。

７１５５−７１６０　（１９８３））　、多くの細胞系
の単層培養における刺着依存性成長を阻害する（Ｔｕｃ
ｋｅｒ、　Ｒ，Ｆ、。

５ｈｉｐｌｅｙ、　Ｇ、Ｄ、、　Ｍｏ５ｅｓ、　Ｈ，Ｌ
、　＆　Ｈｏ１ｌｅｙ、　Ｒ，Ｗ、。

５ｃｉｅｎｃｅ　２２６．　ｐｐ、７０５−７０７　（
１９８４）；　Ｒｏｂｅｒｔｓ。

Ａ、Ｂ、、　Ａｎｚａｎｏ、　Ｍ、Ａ、、　Ｗａｋｅｆ
ｉｅｌｄ、　Ｌ、Ｍ、、　Ｒｏｃｈｅ。

Ｎ、Ｓ、、　５ｔｅｒｎ、　Ｄ、Ｆ、　＆　５ｐｏｒｎ
、　Ｍ、Ｂ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８２．　ｐｐ、
１１９−１２３　（１９８５））。

［発明の概要コ 本願発明者らは、ＴＧＦ−βと可逆的に結合し、ＴＧＦ
−βと結合している状態てはＴＧＦ−βの活性を阻害し
てこれを潜在型とするＴＧＦ−βの制御軸タンパク質を
見出し、これを単離することに成功し本願発明を完成し
た。

すなわち、この発明は、血小板中に存在し、ＴＧＦ−β
と可逆的に結合してＴＧＦ−βの活性を阻害し、熱及び
酸に対して安定であり、ジチオスレイトール又はトリプ
シンて処理するとそのＴＧＦ−β阻害活性か失われる分
子量約４４０Ｍの糖タンパク質を提供する。

［発明の効果］ この発明により、ＴＧＦ−βの活性を制御する新規な糖
タンパク質か提供された。この発明の糖タンパク質によ
り、ＴＧＦ−βの高感度微量定量か可能となり、血中Ｔ
ＧＦ−βと種々の疾病との相関が明らかにてきる。また
、ＴＧＦ−βを産生じてオートクリン機構で自律的増殖
を行なう腫瘍の成長を阻害する制癌剤として利用てきる
。さらに、肝炎などの種々の炎症に対する抗炎症剤とし
て利用することも可能である。

［発明の詳細な説明］ この発明の糖タンパク質は、後述の実施例において示す
ように、血小板にトロンビンを作用させて潜在型のＴＧ
Ｆ−βを分泌させ、これを１００℃の水中て５分間処理
するか又はＩＮ酢酸若しくは６Ｍ尿素て処理することに
よって潜在型ＴＧＦ−βから解離される。これをゲルろ
過クロマトクラフィー又は陰イオン交換クロマトグラフ
ィーにかけることによってこの発明の糖タンパク質を単
離することができる。

この発明の糖タンパク質の分子量は、ゲルろ過クロマト
グラフィーにより約４４０ｋｄであることがわかった。

この発明の糖タンパク質は、上述のように処理するとＴ
ＧＦ−βから解離するが、ＴＧＦ−βと共に中性条件て
数分間インキュベートすると、再びＴＧＦ−βと結合し
てＴＧＦ−βの活性を阻害する。しかも、ＴＧＦ−β活
性の阻害はこの発明の糖タンパク゛質の濃度に依存して
変化する。ＴＧＦ−βの阻害活性は０．３ｕＬｇ／ｍｌ
て認められ、約１．２　Ｊｌ、ｇ／ｍｌて最大となる。

この発明の糖タンパク質は、１００°Ｃ１３分間の加熱
によってそのＴＧＦ−β阻害活性が全く減少せず、１Ｍ
酢酸て２５℃、２時間処理してもそのＴＧＦ−β阻害活
性が２０％しか落ちないので、熱及び酸に対して安定で
あるということが言える。Ｔ方、５０ｍＭのジチオスレ
イトールて３７℃、２時間処理、又は濃度１０　ＪＬｇ
／ｍｌのトリプシンて３７℃、２時間処理することによ
ってＴＧＦ−β阻害活性が実質的に失われる。

この発明の新規物質は、コンカナバリンＡに対して高い
親和性を有し、α−メチルマンノシドによってコンカナ
バリンＡから解離するので、糖タンパク質であることが
わかった。

［実施例］ この実施例において、成熟ラット肝細胞の単離及び培養
のために用いた材料はＴａｎａｋａ、　Ｋ。

５ａｔｏ、　Ｍ、、　Ｔｏｍｉｔａ、　Ｙ　＆　Ｉｃｈ
ｉｈａｒａ、　Ａ、（１９７８）　Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　８４．９３７−９４６に記載された
ものと同じものを用いた。組換えヒトＥＧＦは赤穂布の
アース製薬社製、インシュリン、アプロチニン及び子ウ
シ血漿からの純粋トロンビンはシグマ化学社製、セファ
クリルＳ−３００、Ｍｏｎｏ−３及びＭｏｎｏ−’Ｑカ
ラムはファルマシア社製、［メチル−３旧チミジン（５
２，４Ｃｉ／ｍｍｏｌ）はニュー・イングランド・ヌク
リア社製、ヒトＴＧＦ−βはバイオメディカル・テクノ
ロジー社製のものを用いた。

成熟ラットの血液を、抗凝固剤として０．１倍体積の０
．１５Ｍ　Ｍａｉｌ−７７ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ７，４
）を含む注射筒に集めた。これを２００　ｘ　ｇて１５
分間遠心し、得られた上澄を２５００　ｘ　ｇで１５分
間遠心して血小板を沈殿させた。沈殿をリン酸バッファ
ーに懸濁して遠心する操作を２回行なって洗浄した。顕
微鏡て判定したところ９９％以上の純度の血小板沈殿か
得られた。２０膜ｍｌのトロンビンを含むリン酸バッフ
ァー中に血小板を懸濁し、室温で１０分間放置し、次に
血小板の凝集物を２５００　ｘ　ｇて１５分間遠心して
沈殿させた。得られた上清を、この発明の糖タンパク質
精製の出発物質として用いた。

上記血小板抽出物を、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ
Ｈｅｐｅｓ及び２ｍＭ　Ｃａ（：１２を含む５０ｍＭの
トリス塩酸バッフ　ｙ　−（ｐＨ８−５）て平衡化した
Ｍｏｎｏ−Ｓカラム（１ｘ　１０ｃｍ）にかけて肝細胞
増殖因子（ＨＧＦ）を除去した。通り抜けた分画をプー
ルし、ＰＭ　１０膜（アミコン社製）を用いて限外ろ過
した。このようにして濃縮した材料（４，３ｍｌ、　１
．７７ｍｇタンパク質）を、６Ｍの尿素を含むリン酸バ
ッファーに対して一夜透析し、この発明の糖タンパク賀
をＴＧＦ−βとの複合体から解離させた。６Ｍ尿素を含
むリン酸バッファーで平衡化したセファクリルＳ−３０
０カラム（２，６ｘ　８５Ｃ［Ｏ）に透析物をかけ、同
溶液て２６＋＋＋Ｉ／ｈの流速て溶離した。ＴＧＦ−β
及びこの発明の糖タンパク質の活性を調べるために、全
ての画分からそれぞれ５００Ｐ＋を採り、ウシ血清アル
ブミン（２，５ｍｇ／＋１）を加え、リン酸バッファー
に対して一夜透析し、０．２２７Ｌｍ　（１）　７　イ
ルター（ミレックス−ＧＶ、ミリポア社製）を通してろ
過することによって滅菌した。

各分画のＴＧＦ−β活性は２つの全く独立した方法によ
り行なった。１つの方法では、成熟ラット初代培養肝細
胞のＤＮＡ合成のＴＧＦ−βによる阻害を調べた。成熟
ラット肝細胞は、Ｎａｋａｍｕｒａ、　Ｔ、。

Ｔｏｍｉｔａ、　Ｙ　＆　Ｉｃｈｉｈａｒａ、　Ａ、、
　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　９４゜１０２９−１０３５
　（１９８３）に記載した方法により単離し単層培養し
た。インシュリン（１０−’Ｍ）　、　ＥＧＦ（２０膜
ｇ／ｍｌ）　、　ＴＧＦ−βを培養２０時間後に加え、
１５時間後に［３旧チミジン（２，５ｐ　Ｃｉ／ｍｌ、
　０．３ＩＬＣ４／ｍｍｏｌ）をアフィジコリン（１０
ＪＬｇ／ｍｌ）と共に又はアフィジコリンを加えること
なく加えた。２４時間後、［３旧チミジンの取り込みを
Ｎａｋａｍｕｒａ、Ｔ、　。

Ｔｏｍｉｔａ、　Ｙ　＆　Ｉｃｈｉｈａｒａ、　Ａ、（
１９８３）　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

９４、１０２９−１０３５に記載した方法により測定し
た。

ＴＧＦ−βはこのＤＮＡ合成を阻害するのて、その取り
込み量か少ないほどＴＧＦ−βの活性が高いことになる
。もう１つの方法では、軟寒天中でのＮＨＫ４９Ｆ　細
胞のコロニー形成を調べた。アメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクションから得たＮＲＫ４９Ｆ細胞を、５
％ウシ胎児血清を含むダルベツコの修飾培地に維持した
。軟寒天中でのコロニーの形成は、Ｎａｋａｍｕｒａ、
　Ｔ、、　Ｔｏｍｉｔａ、　Ｙ、、　Ｈｉｒａｉ、　Ｒ
，。

Ｙａｍａｏｋａ　、　Ｋ、、　Ｋａｊｊ、　Ｋ、　＆　
Ｉｃｈｉｈａｒａ、　Ａ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　１３３．１
０４２−１０５０（１９８５）に記載した方法に従い、
２ｎｇ／ｍｌのＥＧＦの存在下で行なった。

一方、この発明の糖タンパク質の活性は次のようにして
測定した。２．５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンと２
ｎｇ／ｎ＋１のラット又はヒトＴ６Ｆ−β（最大有効量
）を含む５０ルＩのリン酸バッファー中で被検試料を室
温で５分間インキュベートした。得られた混合物のＴＧ
Ｆ−β活性を上記と同様に肝細胞のＤＮＡ合成の阻害又
はＮＨＫ　４９Ｆ細胞のコロニー形成の促進を測定する
ことによって測定した。この発明の糖タンパク質の活性
の１ユニツトは、−次培養肝細胞のＤ　Ｎ　Ａ　６４を
完全に阻害する状態から５０％回復させる量を意味する
。非活性はタンパク質１ｍｇ当りのユニットて表わし、
タンパク質の測定はローリ−らの方法（Ｌｏｗｒｙ、　
Ｏ，Ｈ，。

Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇｈ、　Ｎ、Ｊ、、　Ｆａｒｒ、　Ａ
、Ｌ、　＆　ＲＡＮＤＡＬＬ、　Ｒ，Ｊ。

（１９５１）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　１９３
．２６５−２７５）に従って行なった。

結果を第１図に示す。図中、白丸はＴＧＦ−β活性、黒
丸は制御軸タンパク質活性を示す。第１図から明らかな
ように、ＴＧＦ−βの制御糖タンパク質はフェリチン（
４４０ｋｄ）と同し位置に溶出した。このことから、こ
の発明の制御糖タンパク質の分子量は４４０ｋｄである
ことかわかった。

一方、上記血小板抽出物を陰イオン交換クロマトグラフ
ィーによっても精製した。７００匹のラットからの血小
板抽出物（１０００ｍｌ）をＰＭ　１０膜を用いて限外
ろ過することによって約２００　ｍｌにＣＭした。０．
０２５Ｍ　ＮａＣｌ　と６Ｍ尿素とを含む２５ｍＭ）す
ス塩酸バッファー（ｐＨ８，５）に対して、上記濃縮試
料（１４７ｍｇタンパク質）を−夜透析して平衡化し、
同バッファーて予め平衡化したＭｏｎｏ−Ｑカラム（１
ｘｌＯｃＩｌｌ）に架けた。溶離は、同バッファー中の
連続する３種のＮａＣ］濃度勾配（（＋−０，２５Ｍ　
１０分、０．２５−０．５５Ｍ　６０分、０．５５−１
．０Ｍ　１０分）を用い、１２０ｍ１／時間の流速で行
なった。全ての両分から１００．１づつを取り、ウシ血
清アルブミン（２，５ｍｇ／ｍｌ）溶液て５倍に希釈し
、リン酸バッファーに対して透析して尿素を除去した。

これらを上記Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶフィルターに通して滅
菌し、そのＴＧＦ−β及び制御糖タンパク質の活性を調
べた。

結果を第２図に示す。図中、白丸がＴＧＦ−β活性、黒
丸が制御糖タンパク質活性、実線か２８０ｎｍにおける
吸光度、破線がＮａＣ］の濃度を示す。第２図から、Ｍ
ｏｎｏ−ＱてのＦＰＬＣによりこの発明の制御糖タンパ
ク質を精製することがてきることがわかる。

次に、この発明の制御糖タンパク質が、ＴＧＦ−βと結
合してその活性を量に依存して阻害することを示す実験
を行なった。上記陰イオン交換クロマトグラフィーによ
り精製したこの発明の糖タンパク質を、子ウシ血清アル
ブミン溶液（２，５ｍｇ／＋ｎｌ）て希釈し、上記と同
様のろ過により滅菌した。制御糖タンパク質の活性を、
０．０．３．０．６．０．９゜１．２７ｉｇ／ｍｌのタ
ンパク質量の濃度で上記方法により調べた。

結果を第３図に示す。第３図中、破線はＴＧＦ−βを加
えることなくインシュリンとＥＧＦのみを加えた場合の
肝細胞のＤＮＡ合成を示す。第３図から明らかなように
、この発明の制ｙｊ糖タンパク質は、ＴＧＦ−βと再び
結合してＴＧＦ−βによる肝細胞ＤＮＡ合成の阻害を中
和することがわかる。しかも、その中和の程度か制御糖
タンパク質の量に依存して変化することかわかる。なお
、実験結果は２回の平均である。

次に、陰イオン交換クロマトクラフィーて精製したこの
発明の制御糖タンパク質の５０ｇ１（７，４川ｇタンパ
ク質）をトリプシン（１０ルｇ／ｌ、３７°Ｃ，２時間
）、ジチオスレイトール（５０ｍＭ、２５０Ｃ１２時間
）、ＩＮ酢酸（２５°Ｃ１２時間）、又は加熱（洟騰水
、３分間）処理した。トリプシンによる消化は２時間イ
ンキュベート後、終濃度１ｍＭのフェニルメチルスルフ
ォニルフロリドことによって反応停止を行なった。これ
らの処理の後、試料にウシ血清アルブミン（２．５ｍｇ
／ｍｌ）を加え、リン酸バッファーに対して一夜透析し
、その活性を上記方法に従って測定した。

結果を第１表に示す。第１表より、この発明の糖タンパ
ク質は１００６Ｃ、３分間の加熱てその活性か全く減少
せず、上記酢酸処理によっても活性を８０％維持してい
ることかわかる。従って、この発明の制御糖タンパク質
は熱及び酸に対して安定であると言える。一方、上記ジ
チオスレイトールによる処理て活性か完全になくなるの
で、活性を発揮するためにはジスルフィド結合が必要で
あることがわかる。また、上記トリプシン処理によって
も活性が完全になくなるのて、活性を発揮するためには
タンパク質構造が必要であることかわかる。

この発明の制御物質の木質か糖タンパク質であることは
、コンカナバリンＡへの高い親和性とα−メチルマンノ
シドによる解離によって示された。この実験は具体的に
は以下のようにして行なった。すなわち、ゲルろ過によ
り部分精製した制御軸タンパク質を０．５Ｍ　　ＮａＣ
］を含む２５ＩＩＩＭトリスｆｎ　ｍ　／＜ッファ−（
ｐＨ７，５）て平衡化したコンカナバリンＡセファロー
スカラム（０，５ｃｍ　ｘ　２ｃｍ）にかけ、同−八ツ
ファーてカラムを十分洗浄後、α−メチルマンノシドを
上記バッファーに溶解させ、第４図に示す各濃度で段階
的に溶出した。

結果を第４図に示す。第４図から制御軸タンパク質はコ
ンカナバリンＡセファロースに吸着し、０．０１〜０．
１Ｍα−メチルマンノシドにより特異的に溶出されるこ
とがわかる。

さらに、この発明の制御軸タンパク質をノイラミニダー
ゼ、エンドグリコシダーゼＤ、エンドグリコシダーゼＨ
又はα−マンノシダーゼ（いずれも５ｍｔｌ）で処理し
てその活性を調べた。

結果を第２表に示す。第２表より、この発明の制御軸タ
ンパク質はノイラミニダーゼ、エンドグリコシダーゼＤ
、α−マンノシダーゼに対しては比較的安定であるが、
エンドグリコシダーゼＨに対しては不安定であり、この
ことから制御軸タンパク質は高マンノース糖鎖の基部の
Ｎ−アセチルクルコサミン結合を切断するとその活性を
失うことがわかる。すなわち、制御糖タンパク賀の活性
には高マンノース糖鎖か必須であることがわかる。

第２表 なし　　　　　　　１．１２　　　　　　　−１　　、
　ＥＧＦ　　　　　　　　９．３７　　　　　　　　　
−＋　ＴＧＦ−β　　　　　　１．７７　　　　　　　
　　〜ダーゼ（５ｍＵ） 千ンドクリコシ　　７．、８３　　　　　　　７６ター
ゼＤ（５ｍυ） ダーゼ（５ｍＵ）

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明の糖タンパク質な精製するために行な
ったゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示す図、 第２図はこの発明の糖タンパク質を精製するために行な
った陰イオン交換クロマトグラフィーの結果を示す図、 第３図は、この発明の糖タンパク質によるＴＧＦ−βの
活性阻害の濃度依存性を示す図、第４図は、この発明の
糖蛋白のコンカナバリンＡへの結合及び解離の状態を示
す図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 血小板中に存在し、ＴＧＦ−βと可逆的に結合してＴＧ
   Ｆ−βの活性を阻害し、熱及び酸に対して安定であり、
   ジチオスレイトール又はトリプシンで処理するとそのＴ
   ＧＦ−β阻害活性が失われる分子量約４４０ｋｄの糖タ
   ンパク質。