JPH0725798B2 - ＴＧＦ−β制御糖タンパク質 - Google Patents
ＴＧＦ−β制御糖タンパク質Info
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- JPH0725798B2 JPH0725798B2 JP61298432A JP29843286A JPH0725798B2 JP H0725798 B2 JPH0725798 B2 JP H0725798B2 JP 61298432 A JP61298432 A JP 61298432A JP 29843286 A JP29843286 A JP 29843286A JP H0725798 B2 JPH0725798 B2 JP H0725798B2
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、癌化成長因子β（Transforming Growth Fa
ctor-β（TGF-β）と可逆的に結合してTGF-βの活性を
阻害する、新規な制御糖タンパク質に関する。この新規
物質は、（１）TGF-β過剰産生腫瘍に対する制癌剤、
（２）創傷並びに肝炎の治療剤、（３）血中及び組織中
のTGF-β濃度の高感度測定法に用いる試薬としての用途
を有する。
ctor-β（TGF-β）と可逆的に結合してTGF-βの活性を
阻害する、新規な制御糖タンパク質に関する。この新規
物質は、（１）TGF-β過剰産生腫瘍に対する制癌剤、
（２）創傷並びに肝炎の治療剤、（３）血中及び組織中
のTGF-β濃度の高感度測定法に用いる試薬としての用途
を有する。
［従来の技術］ TGF-βは外傷の修復や肝細胞の再生に関係する因子であ
って、血小板中に蓄積されている。TGF-βは血小板をト
ロンビンで処理すると滞在型（latent form）の状態で
血小板から分泌される。（Nakamura,T.,Teramoto H.,To
mita,Y.＆Ichihara,A.,Biochem.Biophys.Res.Commun.13
4,755-763（1986））TGF−βは多くの肝異機能を有する
成熟ラット初代培養肝細胞の増殖を阻害する（Nakamur
a,T.,Tomita,Y.,Hirai,R.,Yamaoka,K.,KaJi K.＆ Ichih
ara,A.Biochem.Biophys.Res.Commun.133,pp.1042-1050
（1985）;Hayashi,I.＆ Carl,B.I.J.Cell.Physiol.125,
pp.82-91（1985））。TGF-βはTGF-α又は表皮成長因子
（EGF）の存在下で、軟寒天中でNRK 49F繊維芽細胞及び
AKR-2B細胞の付着非依存性成長を促進し（Roberts,A.
B.,Frolik,C.A.,Anzano,M.A.＆ Sporn,M.B.Fed.Proc.4
2,pp.2621-2626（1983）;Assoian,R.K.,Komoriya,A.,Me
yers,C.A.,Miller,D.M.＆ Sporn,M,B.,J.Biol.Chem.25
8,pp.7155-7160（1983））、多くの細胞系の単層培養に
おける付着依存性成長を阻害する（Tucker,R.F.,Shiple
y,G.D.,Moses,H.L.＆ Holley,R.W.,Science 226,pp.705
-707（1984）;Roberts,A.B.,Anzano,M.A.,Wakefield,L.
M.,Roche,N.S.,Stern,D.F.＆ Sporn.M.B.,Proc.Natl.Ac
ad.Sci.U.S.A.82,pp.119-123（1985））。
って、血小板中に蓄積されている。TGF-βは血小板をト
ロンビンで処理すると滞在型（latent form）の状態で
血小板から分泌される。（Nakamura,T.,Teramoto H.,To
mita,Y.＆Ichihara,A.,Biochem.Biophys.Res.Commun.13
4,755-763（1986））TGF−βは多くの肝異機能を有する
成熟ラット初代培養肝細胞の増殖を阻害する（Nakamur
a,T.,Tomita,Y.,Hirai,R.,Yamaoka,K.,KaJi K.＆ Ichih
ara,A.Biochem.Biophys.Res.Commun.133,pp.1042-1050
（1985）;Hayashi,I.＆ Carl,B.I.J.Cell.Physiol.125,
pp.82-91（1985））。TGF-βはTGF-α又は表皮成長因子
（EGF）の存在下で、軟寒天中でNRK 49F繊維芽細胞及び
AKR-2B細胞の付着非依存性成長を促進し（Roberts,A.
B.,Frolik,C.A.,Anzano,M.A.＆ Sporn,M.B.Fed.Proc.4
2,pp.2621-2626（1983）;Assoian,R.K.,Komoriya,A.,Me
yers,C.A.,Miller,D.M.＆ Sporn,M,B.,J.Biol.Chem.25
8,pp.7155-7160（1983））、多くの細胞系の単層培養に
おける付着依存性成長を阻害する（Tucker,R.F.,Shiple
y,G.D.,Moses,H.L.＆ Holley,R.W.,Science 226,pp.705
-707（1984）;Roberts,A.B.,Anzano,M.A.,Wakefield,L.
M.,Roche,N.S.,Stern,D.F.＆ Sporn.M.B.,Proc.Natl.Ac
ad.Sci.U.S.A.82,pp.119-123（1985））。
［発明の概要］ 本願発明者らは、TGF-βと可逆的に結合し、TGF-βと結
合している状態ではTGF-βの活性を阻害してこれを潜在
型とするTGF-βの制御糖タンパク質を見出し、これを単
離することに成功し本願発明を完成した。
合している状態ではTGF-βの活性を阻害してこれを潜在
型とするTGF-βの制御糖タンパク質を見出し、これを単
離することに成功し本願発明を完成した。
すなわち、この発明は、血小板中に存在し、TGF-βと可
逆的に結合してTGF-βの活性を阻害し、熱及び酸に対し
て安定であり、ジチオスレイトール又はトリプシンで処
理するとそのTGF-β阻害活性が失われる分子量約440kd
の糖タンパク質を提供する。
逆的に結合してTGF-βの活性を阻害し、熱及び酸に対し
て安定であり、ジチオスレイトール又はトリプシンで処
理するとそのTGF-β阻害活性が失われる分子量約440kd
の糖タンパク質を提供する。
［発明の効果］ この発明により、TGF-βの活性を制御する新規な糖タン
パク質が提供された。この発明の糖タンパク質により、
TGF-βの高感度微量定量が可能となり、血中TGF-βと種
々の疾病との相関が明らかにできる。また、TGF-βを産
生してオートクリン機構で自律的増殖を行なう腫瘍の成
長を阻害する制癌剤として利用できる。さらに、肝炎な
どの種々の炎症に対する抗炎症剤として利用することも
可能である。
パク質が提供された。この発明の糖タンパク質により、
TGF-βの高感度微量定量が可能となり、血中TGF-βと種
々の疾病との相関が明らかにできる。また、TGF-βを産
生してオートクリン機構で自律的増殖を行なう腫瘍の成
長を阻害する制癌剤として利用できる。さらに、肝炎な
どの種々の炎症に対する抗炎症剤として利用することも
可能である。
［発明の具体的説明］ この発明の糖タンパク質は、後述の実施例において示す
ように、血小板にトロンビンを作用させて潜在型のTGF-
βを分泌させ、これを100℃の水中で５分間処理するか
又は1N酢酸若しくは6M尿素で処理することによって潜在
型TGF-βから解離される。これをゲルろ過クロマトグラ
フィー又は陰イオン交換クロマトグラフィーにかけるこ
とによってこの発明の糖タンパク質を単離することがで
きる。
ように、血小板にトロンビンを作用させて潜在型のTGF-
βを分泌させ、これを100℃の水中で５分間処理するか
又は1N酢酸若しくは6M尿素で処理することによって潜在
型TGF-βから解離される。これをゲルろ過クロマトグラ
フィー又は陰イオン交換クロマトグラフィーにかけるこ
とによってこの発明の糖タンパク質を単離することがで
きる。
この発明の糖タンパク質の分子量は、ゲルろ過クロマト
グラフィーにより約440kdであることがわかった。
グラフィーにより約440kdであることがわかった。
この発明の糖タンパク質は、上述のように処理するとTG
F-βから解離するが、TGF-βと共に中性条件で数分間イ
ンキュベートトすると、再びTGF-βと結合してTGF-βの
活性を阻害する。しかも、TGF-β活性の阻害はこの発明
の糖タンパク質の濃度に依存して変化する。TGF-βの阻
害活性は0.3μg/mlで認められ、約1.2μg/mlで最大とな
る。
F-βから解離するが、TGF-βと共に中性条件で数分間イ
ンキュベートトすると、再びTGF-βと結合してTGF-βの
活性を阻害する。しかも、TGF-β活性の阻害はこの発明
の糖タンパク質の濃度に依存して変化する。TGF-βの阻
害活性は0.3μg/mlで認められ、約1.2μg/mlで最大とな
る。
この発明の糖タンパク質は、100℃、３分間の加熱によ
ってそのTGF-β阻害活性が全く減少せず、1M酢酸で25
℃、２時間処理してもそのTGF-β阻害活性が20％しか落
ちないので、熱及び酸に対して安定であるということが
言える。一方、50mMのジチオスレイトールで37℃、２時
間処理、又は濃度10μg/mlのトリプシンで37℃、２時間
処理することによってTGF-β阻害活性が実質的に失われ
る。
ってそのTGF-β阻害活性が全く減少せず、1M酢酸で25
℃、２時間処理してもそのTGF-β阻害活性が20％しか落
ちないので、熱及び酸に対して安定であるということが
言える。一方、50mMのジチオスレイトールで37℃、２時
間処理、又は濃度10μg/mlのトリプシンで37℃、２時間
処理することによってTGF-β阻害活性が実質的に失われ
る。
この発明の新規物質は、コンカナバリンＡに対して高い
親和性を有し、α−メチルマンノシドによってコンカナ
バリンＡから解離するので、糖タンパク質であることが
わかった。
親和性を有し、α−メチルマンノシドによってコンカナ
バリンＡから解離するので、糖タンパク質であることが
わかった。
［実施例］ この実施例において、成熟ラット肝細胞の単離及び培養
のために用いた材料はTanaka,K.Sato,M.,Tomita,Y ＆ I
chihara,A.（1978）J.Biochem.84,937-946に記載された
ものと同じものを用いた。組換えヒトEGFは赤穂市のア
ース製薬社製、インシュリン、アプロチニン及び子ウシ
血漿からの純粋トロンビンはシグマ化学社製、セファク
リルS-300、Mono-S及びMono-Qカラムはファルマシア社
製、［メチル−3H］チミジン（52.4Ci/mmol）はニュー
・イングランド・ヌクリア社製、ヒトTGF-βはバイオメ
ディカル・テクノロジー社製のものを用いた。
のために用いた材料はTanaka,K.Sato,M.,Tomita,Y ＆ I
chihara,A.（1978）J.Biochem.84,937-946に記載された
ものと同じものを用いた。組換えヒトEGFは赤穂市のア
ース製薬社製、インシュリン、アプロチニン及び子ウシ
血漿からの純粋トロンビンはシグマ化学社製、セファク
リルS-300、Mono-S及びMono-Qカラムはファルマシア社
製、［メチル−3H］チミジン（52.4Ci/mmol）はニュー
・イングランド・ヌクリア社製、ヒトTGF-βはバイオメ
ディカル・テクノロジー社製のものを用いた。
成熟ラットの血液を、抗凝固剤として0.1倍体積の0.15M
NaCl-77mM EDTA（pH7.4）を含む注射筒に集めた。これ
を200xgで15分間遠心し、得られた上澄を2500xgで15分
間遠心して血小板を沈殿させた。沈澱をリン酸バッファ
ーに懸濁して遠心する操作を２回行なって洗浄した。顕
微鏡で判定したところ99％以上の純度の血小板沈殿が得
られた。2U/mlのトロンビンを含むリン酸バッファー中
に血小板を懸濁し、室温で10分間放置し、次に血小板の
凝集物を2500xgで15分間遠心して沈殿させた。得られた
上清を、この発明の糖タンパク質精製の出発物質として
用いた。
NaCl-77mM EDTA（pH7.4）を含む注射筒に集めた。これ
を200xgで15分間遠心し、得られた上澄を2500xgで15分
間遠心して血小板を沈殿させた。沈澱をリン酸バッファ
ーに懸濁して遠心する操作を２回行なって洗浄した。顕
微鏡で判定したところ99％以上の純度の血小板沈殿が得
られた。2U/mlのトロンビンを含むリン酸バッファー中
に血小板を懸濁し、室温で10分間放置し、次に血小板の
凝集物を2500xgで15分間遠心して沈殿させた。得られた
上清を、この発明の糖タンパク質精製の出発物質として
用いた。
上記血小板抽出物を、0.15M NaCl、10mMHepes及び2mM C
aCl2を含む50mMのトリス塩酸バッファー（pH8.5）で平
衡化したMono-Sカラム（1x 10cm）にかけて肝細胞増殖
因子（HGF）を除去した。通り抜けた分画をプールし、P
M10膜（アミコン社製）を用いて限外ろ過した。このよ
うにして濃縮した材料（4.3ml,1.77mgタンパク質）を、
6Mの尿素を含むリン酸バッファーに対して一夜透析し、
この発明の糖タンパク質をTGF-βとの複合体から解離さ
せた。6M尿素を含むリン酸バッファーで平衡化したセフ
ァクリルＳ−300カラム（2.6x85cm）に透折物をかけ、
同溶液で26ml/hの流速で溶離した。TGF-β及びこの発明
の糖タンパク質の活性を調べるために、全ての画分から
それぞれ500μｌを採り、ウシ血浸アルブミン（2.5mg/m
l）を加え、リン酸バッファーに対して一夜透折し、0.2
2μｍのフィルター（ミレックス‐GV、ミリポア社製）
を通してろ過することによって減菌した。
aCl2を含む50mMのトリス塩酸バッファー（pH8.5）で平
衡化したMono-Sカラム（1x 10cm）にかけて肝細胞増殖
因子（HGF）を除去した。通り抜けた分画をプールし、P
M10膜（アミコン社製）を用いて限外ろ過した。このよ
うにして濃縮した材料（4.3ml,1.77mgタンパク質）を、
6Mの尿素を含むリン酸バッファーに対して一夜透析し、
この発明の糖タンパク質をTGF-βとの複合体から解離さ
せた。6M尿素を含むリン酸バッファーで平衡化したセフ
ァクリルＳ−300カラム（2.6x85cm）に透折物をかけ、
同溶液で26ml/hの流速で溶離した。TGF-β及びこの発明
の糖タンパク質の活性を調べるために、全ての画分から
それぞれ500μｌを採り、ウシ血浸アルブミン（2.5mg/m
l）を加え、リン酸バッファーに対して一夜透折し、0.2
2μｍのフィルター（ミレックス‐GV、ミリポア社製）
を通してろ過することによって減菌した。
各分画のTGF-β活性は２つの全く独立した方法により行
なった。１つの方法では、成熟ラット初代培養肝細胞の
DNA合成のTGF-βによる阻害を調べた。成熟ラット肝細
胞は、Nakamura,T.,Tomita,Y ＆ Ichinara,A.,J.Bioche
m.94,1029-1035（1983）に記載した方法により単離し単
層培養した。インシュリン（10-7M）、EGF（20ng/m
l）、TGF-βを培養20時間後に加え、15時間後に［3H］
チミジン（2.5μCi/ml,0.3μCi/mmol）をアフィジコリ
ン（10μg/ml）と共に又はアフィジンを加えることなく
加えた。24時間後、［3H］チミジンの取り込みをNakamu
ra,T.,Tomita,Y ＆ Ichihara,A.（1983）J.Biochem.94,
1029-1035に記載した方法により測定した。TGF-βはこ
のDNA合成を阻害するので、その取り込み量が少ないほ
どTGF-βの活性が高いことになる。もう１つの方法で
は、軟寒天中でのNRK49F細胞のコロニー形成を調べた。
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから得
たNRK49F細胞を、５％ウシ胎児血清を含むダルベッコの
修飾培地に維持した。軟寒天中でのコロニーの形成は、
Nakamura,T.,Tomita,Y.,Hirai,R.,Yamaoka,K.,Kaji,K.
＆ Ichihara,A.,Biochem.Biophys.Res.Commun.1331042-
1050（1985）に記載した方法に従い、2ng/mlのEGFの存
在下で行なった。
なった。１つの方法では、成熟ラット初代培養肝細胞の
DNA合成のTGF-βによる阻害を調べた。成熟ラット肝細
胞は、Nakamura,T.,Tomita,Y ＆ Ichinara,A.,J.Bioche
m.94,1029-1035（1983）に記載した方法により単離し単
層培養した。インシュリン（10-7M）、EGF（20ng/m
l）、TGF-βを培養20時間後に加え、15時間後に［3H］
チミジン（2.5μCi/ml,0.3μCi/mmol）をアフィジコリ
ン（10μg/ml）と共に又はアフィジンを加えることなく
加えた。24時間後、［3H］チミジンの取り込みをNakamu
ra,T.,Tomita,Y ＆ Ichihara,A.（1983）J.Biochem.94,
1029-1035に記載した方法により測定した。TGF-βはこ
のDNA合成を阻害するので、その取り込み量が少ないほ
どTGF-βの活性が高いことになる。もう１つの方法で
は、軟寒天中でのNRK49F細胞のコロニー形成を調べた。
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから得
たNRK49F細胞を、５％ウシ胎児血清を含むダルベッコの
修飾培地に維持した。軟寒天中でのコロニーの形成は、
Nakamura,T.,Tomita,Y.,Hirai,R.,Yamaoka,K.,Kaji,K.
＆ Ichihara,A.,Biochem.Biophys.Res.Commun.1331042-
1050（1985）に記載した方法に従い、2ng/mlのEGFの存
在下で行なった。
一方、この発明の糖タンパク質の活性は次のようにして
測定した。2.5mg/mlのウシ血清アルブミンと2ng/mlのラ
ット又はヒトTGF-β（最大有効量）を含む50μｌのリン
酸バッファー中で被検試料を室温で５分間インンキュベ
ートした。得られた混合物のTGF-β活性を上記と同様に
肝細胞のDNA合成の阻害又はNRK 49F細胞のコロニー形成
の促進を測定することによって測定した。この発明の糖
タンパク質の活性の１ユニットは、一次培養肝細胞のDN
A合成を完全に阻害する状態から50％回復させる量を意
味する。非活性はタンパク質1mg当りのユニットで表わ
し、タンパク質の測定はローリーらの方法（Lowry,0.
H.,Rosebrough,N.J.,Farr,A.L. ＆ RANDALL,R.J.（195
1）J.Biol.Chem.193,265-275）に従って行なった。
測定した。2.5mg/mlのウシ血清アルブミンと2ng/mlのラ
ット又はヒトTGF-β（最大有効量）を含む50μｌのリン
酸バッファー中で被検試料を室温で５分間インンキュベ
ートした。得られた混合物のTGF-β活性を上記と同様に
肝細胞のDNA合成の阻害又はNRK 49F細胞のコロニー形成
の促進を測定することによって測定した。この発明の糖
タンパク質の活性の１ユニットは、一次培養肝細胞のDN
A合成を完全に阻害する状態から50％回復させる量を意
味する。非活性はタンパク質1mg当りのユニットで表わ
し、タンパク質の測定はローリーらの方法（Lowry,0.
H.,Rosebrough,N.J.,Farr,A.L. ＆ RANDALL,R.J.（195
1）J.Biol.Chem.193,265-275）に従って行なった。
結果を第１図に示す。図中、白丸はTGF-β活性、黒丸は
制御糖タンパク質活性を示す。第１図から明らかなよう
に、TGF-βの制御糖タンパク質はフェリチン（440kd）
と同じ位置に溶出した。このことから、この発明の制御
糖タンパク質の分子量は440kdであることがわかった。
制御糖タンパク質活性を示す。第１図から明らかなよう
に、TGF-βの制御糖タンパク質はフェリチン（440kd）
と同じ位置に溶出した。このことから、この発明の制御
糖タンパク質の分子量は440kdであることがわかった。
一方、上記血小板抽出物を陰イオン交換クロマトグラフ
ィーによっても精製した。700匹のラットからの血小板
抽出物（1000ml）をPM10膜を用いて限外ろ過することに
よって約200mlに濃縮した。0.025M NaClと6M尿素とを含
む25mMトリス塩酸バッファー（pH8.5）に対して、上記
濃縮試料（147mgタンパク質）を一夜透析して平衡化
し、同バッファーで予め平衡化したMono-Qカラム（1x10
cm）に架けた。溶難は、同バッファー中の連続する３種
のNaCl濃度勾配（0-0.25M 10分、0.25-0.55M 60分、0.5
5-1.0M 10分）を用い、120ml/時間の流速で行なった。
全ての画分から100μｌづつを取り、ウシ血清アルブミ
ン（2.5mg/ml）溶液で５倍に希釈し、リン酸バッファー
に対して透析して尿素を除去した。これらを上記Millex
-GVフィルターに通して滅菌し、そのTGF-β及び制御糖
タンパク質の活性を調べた。
ィーによっても精製した。700匹のラットからの血小板
抽出物（1000ml）をPM10膜を用いて限外ろ過することに
よって約200mlに濃縮した。0.025M NaClと6M尿素とを含
む25mMトリス塩酸バッファー（pH8.5）に対して、上記
濃縮試料（147mgタンパク質）を一夜透析して平衡化
し、同バッファーで予め平衡化したMono-Qカラム（1x10
cm）に架けた。溶難は、同バッファー中の連続する３種
のNaCl濃度勾配（0-0.25M 10分、0.25-0.55M 60分、0.5
5-1.0M 10分）を用い、120ml/時間の流速で行なった。
全ての画分から100μｌづつを取り、ウシ血清アルブミ
ン（2.5mg/ml）溶液で５倍に希釈し、リン酸バッファー
に対して透析して尿素を除去した。これらを上記Millex
-GVフィルターに通して滅菌し、そのTGF-β及び制御糖
タンパク質の活性を調べた。
結果を第２図に示す。図中、白丸がTGF-β活性、黒丸が
制御糖タンパク質活性、実線が280nmにおける吸光度、
破線がNaClの濃度を示す。第２図から、Mono-QでのFPLC
によりこの発明の制御糖タンパク質を精製することがで
きることがわかる。
制御糖タンパク質活性、実線が280nmにおける吸光度、
破線がNaClの濃度を示す。第２図から、Mono-QでのFPLC
によりこの発明の制御糖タンパク質を精製することがで
きることがわかる。
次に、この発明の制御糖タンパク質が、TGF-βと結合し
てその活性を量に依存して阻害することを示す実験を行
なった。上記陰イオン交換クロマトグラフィにより精製
したこの発明の糖タンパク質を、子ウシ血清アルブミン
溶液（2.5mg/ml）で希釈し、上記と同様のろ過により滅
菌した。制御糖タンパク質の活性を、0,0.3,0.6,0.9,1.
2μg/mlのタンパク質量の濃度で上記方法により調べ
た。
てその活性を量に依存して阻害することを示す実験を行
なった。上記陰イオン交換クロマトグラフィにより精製
したこの発明の糖タンパク質を、子ウシ血清アルブミン
溶液（2.5mg/ml）で希釈し、上記と同様のろ過により滅
菌した。制御糖タンパク質の活性を、0,0.3,0.6,0.9,1.
2μg/mlのタンパク質量の濃度で上記方法により調べ
た。
結果を第３図に示す。第３図中、破線はTGF-βを加える
ことなくインシュリンとEGFのみを加えた場合の肝細胞
のDNA合成を示す。第３図から明らかなように、この発
明の制御糖タンパク質は、TGF-βと再び結合してTGF-β
による肝細胞DNA合成の阻害を中和することがわかる。
しかも、その中和の程度が制御糖タンパク質の量に依存
して変化することがわかる。なお、実験結果は２回の平
均である。
ことなくインシュリンとEGFのみを加えた場合の肝細胞
のDNA合成を示す。第３図から明らかなように、この発
明の制御糖タンパク質は、TGF-βと再び結合してTGF-β
による肝細胞DNA合成の阻害を中和することがわかる。
しかも、その中和の程度が制御糖タンパク質の量に依存
して変化することがわかる。なお、実験結果は２回の平
均である。
次に、陰イオン交換クロマトグラフィーで精製したこの
発明の制御糖タンパク質の50μｌ（7.4μｇタンパク
質）をトリプシン（10μg/ml、37℃、２時間）、ジチオ
スレイトール（50mM、25℃、２時間）、1N酢酸（25℃、
２時間）、又は加熱（沸騰水、３分間）処理した。トリ
プシンによる消火は２時間インキュベート後、終濃度1m
Mのフェニルメチルスルフォニルフロリドを加えること
によって反応停止を行なった。これらの処理の後、試料
にウシ血清アルブミン（2.5mg/ml）を加え、リン酸バッ
ファーに対して一夜透析し、その活性を上記方法に従っ
て測定した。
発明の制御糖タンパク質の50μｌ（7.4μｇタンパク
質）をトリプシン（10μg/ml、37℃、２時間）、ジチオ
スレイトール（50mM、25℃、２時間）、1N酢酸（25℃、
２時間）、又は加熱（沸騰水、３分間）処理した。トリ
プシンによる消火は２時間インキュベート後、終濃度1m
Mのフェニルメチルスルフォニルフロリドを加えること
によって反応停止を行なった。これらの処理の後、試料
にウシ血清アルブミン（2.5mg/ml）を加え、リン酸バッ
ファーに対して一夜透析し、その活性を上記方法に従っ
て測定した。
結果を第１表に示す。第１表より、この発明の糖タンパ
ク質は100℃、３分間の加熱でその活性が全く減少せ
ず、上記酢酸処理によっても活性を80％維持しているこ
とがわかる。従って、この発明の制御糖タンパク質は熱
及び酸に対して安定であると言える。一方、上記ジチオ
スレイトールによる処理で活性が完全になくなるので、
活性を発揮するためにはジスルフィド結合が必要である
ことがわかる。また、上記トリプシン処理によっても活
性が完全になくなるので、活性を発揮するためにはタン
パク質構造が必要であることがわかる。
ク質は100℃、３分間の加熱でその活性が全く減少せ
ず、上記酢酸処理によっても活性を80％維持しているこ
とがわかる。従って、この発明の制御糖タンパク質は熱
及び酸に対して安定であると言える。一方、上記ジチオ
スレイトールによる処理で活性が完全になくなるので、
活性を発揮するためにはジスルフィド結合が必要である
ことがわかる。また、上記トリプシン処理によっても活
性が完全になくなるので、活性を発揮するためにはタン
パク質構造が必要であることがわかる。
この発明の制御物質の本質が糖タンパク質であること
は、コンカナバリンＡへの高い親和性とα−メチルマン
ノシドによる解離によって示された。この実験は具体的
には以下のようにして行なった。すなわち、ゲルろ過に
より部分精製した制御糖タンパク質を0.5M NaClを含む2
5mMトリス酸バッファー（pH7.5）で平衡化したコンカナ
バリンＡセファロースカラム（0.5cm x 2cm）にかけ、
同一バッファーでカラムを十分洗浄後、α−メチルマン
ノシドを上記バッファーに溶解させ、第４図に示す各濃
度で段階的に溶出した。
は、コンカナバリンＡへの高い親和性とα−メチルマン
ノシドによる解離によって示された。この実験は具体的
には以下のようにして行なった。すなわち、ゲルろ過に
より部分精製した制御糖タンパク質を0.5M NaClを含む2
5mMトリス酸バッファー（pH7.5）で平衡化したコンカナ
バリンＡセファロースカラム（0.5cm x 2cm）にかけ、
同一バッファーでカラムを十分洗浄後、α−メチルマン
ノシドを上記バッファーに溶解させ、第４図に示す各濃
度で段階的に溶出した。
結果を第４図に示す。第４図から制御糖タンパク質はコ
ンカナバリンＡセファロースに吸着し、0.01〜0.1Mα−
メチルマンノシドにより特異的に溶出されることがわか
る。
ンカナバリンＡセファロースに吸着し、0.01〜0.1Mα−
メチルマンノシドにより特異的に溶出されることがわか
る。
さらに、この発明の制御糖タンパク質をノイラミニター
ゼ、エンドグリコシダーゼＤ、エンドグリコシダーゼＨ
又はα−マンノシダーゼ（いずれも5mU）で処理してそ
の活性を調べた。
ゼ、エンドグリコシダーゼＤ、エンドグリコシダーゼＨ
又はα−マンノシダーゼ（いずれも5mU）で処理してそ
の活性を調べた。
結果を第２表に示す。第２表より、この発明の制御糖タ
ンパク質はノイラミニダーゼ、エンドグリコシダーゼ
Ｄ、α−マンノシダーゼに対しては比較的安定である
が、エンドグリコシダーゼＨに対しては不安定であり、
このことから制御糖タンパク質は高マンノース糖鎖の基
部のＮ−アセチルグルコサミン結合を切断するとその活
性を失うことがわかる。すなわち、制御糖タンパク質の
活性には高マンノース糖鎖が必須であることがわかる。
ンパク質はノイラミニダーゼ、エンドグリコシダーゼ
Ｄ、α−マンノシダーゼに対しては比較的安定である
が、エンドグリコシダーゼＨに対しては不安定であり、
このことから制御糖タンパク質は高マンノース糖鎖の基
部のＮ−アセチルグルコサミン結合を切断するとその活
性を失うことがわかる。すなわち、制御糖タンパク質の
活性には高マンノース糖鎖が必須であることがわかる。
第１図はこの発明の糖タンパク質を精製するために行な
ったゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示す図、 第２図はこの発明の糖タンパク質を精製するために行な
った陰イオン交換クロマトグラフィーの結果を示す図、 第３図は、この発明の糖タンパク質によるTGF-βの活性
阻害の濃度依存性を示す図、 第４図は、この発明の糖蛋白のコンカナバリンＡへの結
合及び解離の状態を示す図である。
ったゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示す図、 第２図はこの発明の糖タンパク質を精製するために行な
った陰イオン交換クロマトグラフィーの結果を示す図、 第３図は、この発明の糖タンパク質によるTGF-βの活性
阻害の濃度依存性を示す図、 第４図は、この発明の糖蛋白のコンカナバリンＡへの結
合及び解離の状態を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/49
Claims (1)
- 【請求項１】血小板中に存在し、TGF-βと可逆的に結合
してTGF-βの活性を阻害し、熱及び酸に対して安定であ
り、ジチオスレイトール又はトリプシンで処理するとそ
のTGF-β阻害活性が失われる分子量約440kdの糖タンパ
ク質。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61298432A JPH0725798B2 (ja) | 1986-12-15 | 1986-12-15 | ＴＧＦ−β制御糖タンパク質 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61298432A JPH0725798B2 (ja) | 1986-12-15 | 1986-12-15 | ＴＧＦ−β制御糖タンパク質 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63150300A JPS63150300A (ja) | 1988-06-22 |
| JPH0725798B2 true JPH0725798B2 (ja) | 1995-03-22 |
Family
ID=17859629
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61298432A Expired - Lifetime JPH0725798B2 (ja) | 1986-12-15 | 1986-12-15 | ＴＧＦ−β制御糖タンパク質 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0725798B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6586394B1 (en) | 1985-04-19 | 2003-07-01 | Osi Pharmaceuticals, Inc. | Tissue-derived tumor growth inhibitor |
| US5229495A (en) * | 1991-06-18 | 1993-07-20 | Ludwig Institute For Cancer Research | Substantially pure receptor like TGF-β 1 binding molecules and uses thereof |
| JPH10206424A (ja) * | 1997-01-21 | 1998-08-07 | Kitasato Inst:The | 創傷進展度測定検査方法、測定用キット、及び創傷面治療法決定方法 |
-
1986
- 1986-12-15 JP JP61298432A patent/JPH0725798B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63150300A (ja) | 1988-06-22 |
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