JPS59155395A - エリスロポエチンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、貧血患者の尿〜のエリスロポエチン含有物か
らエリスロボエチンを高純度で効率よく製造する方法に
関する。

エリスロボエチ／（Ｅｐｏ）は、赤血球生成促進因子と
も呼ばれ、骨髄に存在する赤血球系細胞に働いて、赤血
球系細胞への分化を促進させる一私のホルモンであり、
主として腎で生成されると考えられている。ＥＰＯ生成
を調節するのは、酸累鋸蚤供給のノくランスであり、酸
素欠乏状態に陥ると生成が冗進し、逆に酸紫過処状態に
なると生成が減少する。例１えは、貧血患者では、ＥＰ
Ｏ生成が塩加し、ＥＰＯか尿に排泄されるようになる。

ＢＦ２は市販されており、分子量３〜４万の酸性瓢タン
ノくり弥、であるが、化学構造は完全には％！明されて
いない。ＥＰＯは、貧血患者、手術後患堝、腎摘出後の
人工透析患者に広く適用可能な医薬である。

尿中にＥＰＯが含まれていることは前記のとおりである
が°、その含ｌは極めて低く、全尿タンパク負中約００
１〜０．０２　Ｍ　ｆｉｒ、　Ｓ　ｂｊ度とみられる。

このため、尿からＥＰＯを有効に得ることは困難であり
、通常のりＰマド成鳥法では、Ｅ　ｐ　’ｏを高純度で
効率よく採取することはできない。

本発明者らは、免疫抗体を結合させた吸着カラム（抗体
吸着カラム）を使用して、貧血患者の尿等から免疫特異
的にＥＰＯを製造する方法について物豹を行ってきた。

カラムに使用する抗体を得るべく、ｈ　＆Ｅ　Ｐ　Ｏで
免疫したマウスの牌膨２細胞とマウスミエローマ細胞と
を融合させ、モノクローナル抗ＥＰＯ抗ｋ、を厚生する
ハイブリドーマ細胞を得た。どのハイブリドーマ細胞が
産生じた抗ＥＰＯ抗体を結合させて抗体吸滝カラムを作
ル又し、これに貧血患者の尿夕／ノξり質を通したとこ
ろ、目的のＥＰＯが％異的に吸着され、収率よく高純度
ＥＰＯを取得できた。そして、かかるモノクローナル抗
体がハイブリドーマ細胞かも安定的に得られることを知
見し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、下記要旨のものであるＣＫＰＯで
免疫した実駆動物の牌臓細胞とミエローマ細胞とを細胞
融合させたハイブリドーマｈ’　Ｈｅｚより有られたモ
ノクローナル抗ＥＰ○抗体を結合してなる吸着剤に、Ｅ
ＰＯ含有物を接触させてＥ’ＰＯを吸着させ、次いで溶
出し、吸着分としてＥＰＯを取得することを特徴とする
高純度ＥＰＯの製造方法。

本発明の方法は、ＥＰＯを特異的に吸着させ、これを吸
着分として取得するアフイニテイクロマト法である。本
発明によれば、使用吸着支持体に結合させた抗体がモノ
クローナル抗体であるから、抗体に同一の性質を持たせ
ることができ、またモノクローナル抗体が、選出樹立さ
れたハイブリドーマ細胞によシ産生されるため抗体を安
定的に入手することができ、さらにＥＰし０を免疫特異
的に吸着し、溶出するため貧血患者尿等から高純度のＥ
ＰＯを匁ｊ率よく製造することができる。

本発明では、モノクローナル抗体の結合した吸着剤が使
用される。そして、このモノクローナル抗体は、ハイプ
リドーマ細胞よシ産生される。

モノクローナル抗体を産生ずるハイプリドーマ細月四ば
、ＥＰＯ，例えは貧血患渚尿より鞠製したＥＰＯで免疫
した実駆動にの牌臓細胞と、ミエローマ（骨髄腫）ｋ・
胞とを約１胞融合して作られる。この場合の実跡、動物
・な、例えは、マウスやラット等であり、細胞融合は、
同和の！ｌｌ１ｌＩ物の細胞間で行わせるのか好ましい
。例えば、マウスの＋Ｉ卑臓絹、月トシとマウスのミエ
ローマ細胞との間で、細胞融合させる。ミエローマ短胞
は、悪性腫瘍り服の一種であって、増殖性に富む細胞で
ある。

マウスに対する免疫（抗原抗体反庄λは、ＥＰＯｌ例え
ば貧血患者の尿よシ精製したＥＰＯ橡品を抗原として使
用し、これをマウスに投与して行う。ここで抗原として
使用されるＥＰＯ橡萌ハ次のようにして得られたもので
あってもよい。すなわち、後記実が２例で示すように、
坏発明方法の１）１」手部分に準じてハイブリドーマ細
胞を作成しそれから得られた抗体を結合してなる吸温カ
ラムに貧抑７告者尿會通し７て連れ１クロマトに付し禾
吸水両呪・とじてＥＰＯを得る。

マウスへの抗ノ京投与は、逼ｎル腔内６Ｅ豹により行わ
れ、免疫を充分に声めるため、ｆ／ｌｌカ七２週間のｒ
Ｉ３−階をあけて、ｔ・回宿射をする。注射布、は、卸
、訃の第１．製ＥＰＯタンパク質を９１．えはＰＢＳと
呼はれる・恥酬壌り衝食址、水に治肪し、これにフロイ
ントのアジ−バンドを混合して、エマルジョンを形成さ
ゼて調製する。

このよってして免疫したマウスから、免疫処理終了後、
約３日後に、牌藤、を摘出し、この牌ｊし、却４’、ｉ
（主にＢ卸ｌ巴）と、方：に調製したマウスのミエロー
マ細胞との間で細胞層、台を行わせる。

マウスのミエローマ＋１−１１１胞として−は、Ｐ、−
Ｘ６３−Ａｇ８、Ｐ３−ＮＳ工／１−ＡＩｆ４−ｉ、Ｘ
６３−Ａｙ８　６５３などを培養して塊・殖させたもの
を使用する。

ｈｌ胞融合は、公知の扛法に促ってイコわれる。

途称、４二／リン（１００単位、　／’　ｍｉ　）及び
ストレフ０＋マイシン（１００μｇ／ｍｌ）さらに２ｍ
Ｍグルタミン、１　ｍ　Ｍビンレビン酬を添加したＲＰ
Ｍ１１６４０合成培養液（以下ＲＰＭ１１６４０散と記
す）と牛脂児血ｉ（：ｒｃｓ、）との混合液中でＰ！ｊ
記牌ｋ　ｋ＝ｋ　＋且織を糺障１し、卑屈）胞、化して
充分細胞を分散したのち、ＲＰ　Ｍ　Ｉ　１６４０　紗
に分散し、これンこ前記ミエローマｉｉ胞を混合し、遠
心後、上清？除去した混合細庵１に対し、細胞融合剤の
ポリエチレンクリコーノ２１５００の５０％溶液を添加
して、糺胞台召させる。

かくして作られた融合細胞の中から雑種の、いわゆるハ
イプリドーマ流用を公知のＨＡＴ選択によって選ひ出す
○ −ＨＡＴＬ択は、マイクロタイタープレートを使用して
行うことかできる。例Ｉえニー、同色及びｋ　＆ｊの融
合面胞６を９６穴マイクロタイタープレート上に１いて
、ＨＡＴ　（ヒポキサンチン−アミノグチリン−チミジ
ン）培養′液で培養を行い、糺２′？１間後、ハイプリ
ドーマが死滅しないで増殖している穴を確認し、ハイプ
リドーマを得る０次に、かくして選はれたハイプリドー
マについて、ＥＰＯと特異的に結合する抗体を産生ずる
か否かをソリ、ドフエーズ法にて検定したのち、さらに
本ノ・イブリドーマをマウス腹腔内に移植して膨水を発
生させ、肋木から公知の方法、例えは、硫安分画法によ
り、タンパク質を得るＯこのものは、主として免疫グロ
ブリン（工ｙ　Ｇ）である。この抗体を吸着剤に結合さ
せ、得られた抗体結合吸着剤をカラムに充填し、抗体吸
着カラム″を作成し、とのカラム（ｃ、Ｅｐｏ標品を通
し、ＥＰＯの吸着能を調べ、）・イブリドーマが抗ＥＰ
Ｏ抗体を産生ずるか否かを検定する。

この自信に使用される吸滝剤としては、秒ｌ、えはアフ
ィゲル（バイオラッド社製）、セファデックス（ファル
マンア社１）がある。このようにして鉛られた抗ＥＰＯ
抗体産生ノ・イブリドーマは、さらに公知の限界希釈法
によりモノクローン化を行う。抗ＥＰＯ抗体の産生能は
、前記のノリノドフェーズ法及び抗体成婚カラムへのＥ
ＰＯのｌ？、　Ｎ能で検定を省う。この中から、安定し
て、モノクローナル抗体を産生ずる細胞を選出する。細
胞は、凍結保存が可能であるので、必要に応じて融拓し
、マウスの腹腔内に移植ずれは、必をな抗体を未読的に
供給することができる。

以上のようにして選出した、モノクローナル抗ｇｐｏ抗
体産生ハイブリドーマ維胞により、前記と同様にしてマ
ウス？ｘ　！ｌ仝内で生産させたモノクローナル抗ＥＰ
Ｏ抗体を精製後吸着支持体に結合し、抗体結合吸着剤を
作、成する。これを原料のＥＰＯ含有物、好１しくけ貧
血患名の泳又はその処理物と接触させ、ＥＰＯを吸着さ
せ、次いで浴出し、吸着能・分としてｂＰｏを取得する
。

本発明の原料であるＥＰＯ含有物としては、正常人尿若
しくは貧Ｊｆｌｌ患者尿又はその各処理物、或は、ＥＰ
Ｏ産生細胞の培養上滑液又はＥＰＯ産生細胞移桓動物の
体液、組織抽出液若しくは尿々どが挙げられる。例えば
貧血患者尿を濾過、濃縮、脱塩して得た全尿タンパク質
又はその含有液が使用される。尿中のプロテアーゼ゛を
失活させるだめ予めフェノール処理又は加熱処理を行っ
てもよい。まだ、好ましくはＳＤＳ処理を行う。

本発明において、ＥＰＯはアフイニティクロマト法の通
常の技法によシ取得することができる。吸着カラムを使
用する場合には、前記の尿処理液をカラムに通し、Ｅｐ
ｏを吸着し、溶出液としてＥＰＯを取得する。

使用した成鳥カラムは再生させて１ｏ回程度ｈイに用す
ることができる。再生は、例えば酢酸と食塩水との混合
液を通すことに、より行われる０以上のごとき、抗体吸
着法では、モノクローナル抗ＪｌｅＰＯ抗体かＥＰＯを
特異的に吸着する紹果、カラムを１回通すたけで、溶出
液として］ｔ’Ｐ　Ｏを％異的に高純度で効率よく取有
することができる。

ＥＰＯの純度は、液中のタンパク質のＥＰＯ活ｔｌ：（
単位）を測定することにより決めることができる。Ｅｊ
Ｏの活性のｍｌ＋定法としては、マウス胎児肝細胞を用
い、赤血球系コロニーを形態学的に観察するコロニー法
　３Ｈ−チミジンのＤＮＡへの取り込み率を調べる３Ｈ
−チミジン法　５０　Ｆ　ｅのヘムへの取り込み率を調
べる５　Ｑ　Ｆ　ｅ法等が知られている。本発明の後記
実施例で示すＥＰＯ活性は、５Ｑ　Ｆ　ｅ法又は３Ｈ−
チミジン法で測定されたものである。

ＥＰＯ測定の標準物質としては、フェニルヒドラジン処
均した貧血ヒツジの薄情から訊裟さｉ＃ＥＰｏ（カナメ
、コンノート社製エリスロボエチン　ステップ３）を用
いることができる。

次に本発明を実＆　ｆｉ、によってＵｔ　８７１する。

実施例１ 〔抗原タンパク質（ＥＰＯ）の調製〕 貧血患者の尿６００ｔを限外濾過装置に通し、分子量１
０，０００までの低分子物質を除去することによシ濃ｉ
ｉを行い、さらに水を加えて同様に＆紬することにより
脱塩を行った。得られた尿纏縮液２０ｔを凍結乾燥して
全尿タンパク質粉末３１．０ｙ（ＫＰＯ活性１，８００
，０００単位／　３１．０．＠）を得た。（なお、タン
パク量に以下の操作と含め、バイオランド社製プロティ
ンアッセイキットによシ測定した。） （第１回クロマト） この粉末を５７１Ｍ１リス−ＨＣ！　ｔ　　（ｐ、、Ｉ
（６，’８）緩衝液に浴解し、予め５　ｍ　Ｍ　トリス
−ＨＣｌ（ｐＨ６，８）緩衝液で平衡化したＤ　Ｅ　Ａ
、Ｂ　−セルロース充填カラムに通して、族タンパク質
を吸処させた後、２００ｍＭＮａＣｔを含む５　ｍ　Ｍ
　トリ、ｘ、　−ＨＣｔ　（ｐ　Ｈ６，８）緩衝液で浴
出し、ＥＰＯ活性画分を得た。このものに含まれるタン
パク質は、１．６．０ｙであシ、ＥＰＯ比活性は、９９
単位／　ｍｙタンパク質で・ちった○ （第２回クロマト） 得られた前記Ｅｐｏ活性画分を水に対し透析し、透析物
を凍結乾燥して粉末を得た０この粉末を、１０　ｍ　Ｍ
燐酸ナトリウム（ｐＨ６，８）と４ＭＮａＣ１からなる
ｔｉ　ａ液に溶解し、予め１０’ｍＭ６ｆｌ：ナトリウ
Ａ（ｐＨ６，８）と４ＭＮａＣＡからなる緩衝液で平衡
化したフェニルセファロースＣ！Ｌ−４Ｂ充填カラムに
通してタンパク質を吸着させた後、１０ｍＭｇ４しナト
リウム（ｐＨ７，１とと０．５ＭｔＪａＣｔからなる緩
偽液で洗浄し、次いで１０ｍＭＮａＯＨ，２０％エチレ
ングリコール及び６Ｍ塩酸グアニジンからなる混合液で
溶出し、ＥＰＯ活恨画分を得た。この”ものに含まれる
タンパク質は２３２でありＥＰＯ比活セ・は４２１単位
／Ｑタンパク貿であった○ （第３１クロマト） 得られだが１ｈ「凡ＰＯ活性画分をかに対して透市］シ
、透析物を保結乾保させて、ｂ末を侍だ。このものを５
ｍυ」燐酸ナトリウム（ｐＨ６，９）し会液に溶％、シ
、巨」じ緩衝、杉、に１文づし逢、析した。

予め５　ｍ　Ｍ　ｋ＃ナトリウム（ｐＨ６，’＋）ｋ’
ｓ液で平衡化したヒドロキシルアノぞタイト充填カラム
に１１１記透析ｈ　′に！１．を辿し、非吸ル画分を鞘
だ。このものに含まれるタンパク質は６７２ｍｇであり
Ｅ　Ｐ’Ｏ比活性は１，２４０単位／　ｍｙタンパク負
でめった。

（第４回クロマト） 得られた前記Ｂｐｏ７ｉ！ｌｒ性画分（非吸％画分）を
水に対し透析し、か折物′ｆ：保糺乾燥して抄末を得た
。このものを１０ｍＭｋ？！！ナトリウム　（ｐＨ６，
９）　　と１５０７ｎＭＮａＣｔからなる緩衝亀、に溶
解した。予め負・・記と同じ緩衝液で千蜘化したセファ
デックスＧ１００充填カラム（（、前記浴准を通し、分
子量による往動を礼い、ＥＰＯ活恒活発画分た。このも
のに含まれるタンパク袈は８３ｆｆ１ｇでありＥＰＯ比
活性は３．０００単位／　ｍ９タンパク質てあった０（
第５回クロマト） 前記ＥＰＯ活性画分を水に対して透析後、透析≠を凍結
乾燥して粉末を得だ。このものｆ　５　ｍ’　Ｍ　、Ｃ
ａ　Ｃ！　Ｌ２（ｐ　Ｈ７，０）水溶液に浴シし・た後
Ｐ１じ水溶液に対し透析し、次いでＯ１／ ＫＦ、ＯＬでｐ　Ｆ、　・４．５に訓転した。予め５Ｔ
ｒＬＭ（、ａ　ＯＬ２（ｐ　Ｈ４，５）水浴液で平衡化
したＳＰ−セフ７デ７・クス充填カラムにく前記調整後
の液を通し、吸着後、５ｍＭ酢＄カルシウム（ｐＨ４，
５）＆衝液で洗浄し、次いで２０ｍ　Ｍ　ｈ醒カル／ウ
ム（ｐ　Ｉ（５，５）　＠２　’ａ１ｆｊｌ、で浴出し
、ＥＰｏ活性画分ヲ得た。このものに含捷れるタンパク
量は１６■であり、ＫＰＯ比活性は５．１００単位／’
　ｍ９タンパク質であった〇（第６回クロマト） 前記ｇｐｏ活性画分を、予めＰＢＳで平衡化したセファ
テックスＧ５．０充填カラムに通した後、前記の緩衝准
で溶出してＥＰＯ池性画性画分だ。

この液を後記の抗体結合吸着カラムに通して逆相クロマ
トに付し未吸着画分を初た。このものに含まれるクンバ
ク質は４　ｍｇであｐＥＰＯ比活性は２５，０００単位
、／　ｍ９タンパク質であった。

前記カラムは一次のようにして作った。すなわち、第５
回クロマト後のＥＰＯ標品で免疫したマウスを用いて本
発明方法の前半部分に準じてハイブリドーマ細胞を作成
し、これよ、ＤＡられる抗体のうちから、５ＤｓＨ気泳
動を行ったときＥＰＯ活性に近接して低分子倶ノに見出
される免疫力の高い主要タンパク質と結合するところの
抗体を選び出し、この抗体をアフィゲル−１０（バイオ
ランド社製）に結合させて抗体総合吸着カラムを作った
。

（ｓ：ｏｓ電気泳動によるＥＰＯの精製）得られたＥＰ
Ｏ活性画分（未成゛湊画分）を水に対′ｉ−透析し、透
析物を凍結乾燥して粉末を得たにのものを２％ＳＤＳを
含むトリス−塩酸緩衝液（ｐ　Ｉ（６，８）に溶解し、
ｎ法によシス３チポリアクリルアミドグルＳＤＳ電気激
動を行い、ＥＰＯ活性画分のゲルを切り出した。ケルに
対し、３倍量のＰＢＳを添加し、ゲルを磨細し、タンパ
ク質ヲ抽出した。

抽出液中のタンパク灘け］、　２　ｍｇであり、ＥＰＯ
比活性は５０．　ＯＯＯ単位／１ｎｇタンパク質であっ
た。抽出液を水に対し透析後凍結乾燥して粉末を得た。

〔マウスの免役〕

前記のＳＤＳ％気泳動粍製ｘｐｏ教品を抗原として使用
し、マウス（ＢＡＬ　　Ｂ／’ｃマｒ）ス）に対し、次
のとお９３回の免疫を行った。

負も１回−ＰＢＳ（ＩＪン酸塩緩衝負ら１水ン中に硝製
ＥＰＯタンパク質を２００　ＩＩ　ｇ／　ｍｔテ溶解し
、これに７０イ／ト完全アジユバ／ドを混合して得たエ
マルジョ／をマウスに対し０．５　ｍｉ　（Ｅ　Ｐ　Ｏ
タンパク％、　５０μｇ）を腹腔内注射て投与した。

第２回−ＰＢＳ中に梢製ＥＰＯタンパク負１００μｇ／
　ｍｅで浴解し、とれてフロイント完全アジュバントを
混合して得たエマル７ョンを２週間俵にマウスに対し、
Ｑ、　５　ｍｌ（ＥＰＯり／バクη２５μ？）を腹１投
内江射で投与した。

第３回−ＰＢＳ中にｈ製ＥＰＯタンパク外５０μｙ／ｍ
ｌで溶解した液を、さらに２週間俵−にマウスに対し、
０．５ｍｇ（ＥＰＯタンパクシー２５μ２）を服腔内注
射で投与した。

〔細胞融合〕

前記象疫処理終了から３日影に、免疫マウスの牌臓細胞
を焦振的に摘出し、合成培養液Ｒ・２Ｍ１１６４０液と
１５％牛脂児血渭（ＦｒＣ８）との混合液で洗浄後、該
混合液中で、牌臓組織衾ハサミで細断して単細胞化を行
い、該混合液で２回洗浄した後、単細胞化した細胞をＲ
ＰＭ１１６４０液に分散した。糺胞か・は、２０×１０
８個であった。

別にマウスのミエローマ細胞（ｐ３−ＮＳＩ／１−Ａ、
＠４−１）を前記ＲＰＭＩ及びＦｅ２の混合液中で培養
し、増殖した細胞とＲＰ　Ｍ工１６４０液で洗浄した。

細胞数は１．０Ｘ１０８個でおった。

次に前記で訴製した免疫マウス牌臓、！ｔ−胞とマウス
ミエローマ細胞とを、ＲＰＭ１１６４０液に分散し、混
合したのち、遠心し、上清を除去した。−１混名細胞を
、ポリエチレンクリコール１５００の５０飴浴液中で、
細胞融合させた後、融合糺胞群をＨＴ培養液（ヒポキサ
ンチンとチミジン及び１５％牛脂児血清を含むＲＰ　Ｍ
　１１６４０液、）に混合し、混合？＆を３枚の９６穴
マイクロタイターフ゛レートにまいて、２日目以％、Ｈ
ＡＴ培地（ヒビキサンチン、アミノプテリン、チミジン
及び１５％牛脂先血ｍを含むＲＰＭ１１６４０液）を添
加して各穴で２週間培養してＨＡＴ選択を行った。増殖
したハイブリドーマ細胞を２６４穴において確認した。

〔抗体産生細胞の選択〕

前記ゼ伯だ２６４種類のハイブリドーマより、特定の細
胞１、すなわち私製ＥＰＯ標品と特異的に結合しつる抗
体を産生ずるハイブリドーマを選ひ出すために、ビオチ
ン−アビジノンステムを用いるソリ、ドフーーズ法によ
り、スクリーニングを行った□その結果、目的に適合し
たものとして、１９種類の糺、胞が選出され、そのうち
７釉類が安定的に抗体産生を行うことを認めた。

１：　Ｅ　ｐ　ｏ吸着能による抗ＥＰＯ抗体産生細胞の
選択〕 前記７種類の各細胞を用いて抗体吸着カラムを作成し、
ＫＰＯ活性の吸着能を検定し、抗Ｅｐｏ抗体並生組・胞
の選択を行った。

すなわち、それぞれの細胞について、７匹のマウスに対
し、１つの種類の細胞をマウス１匹当り５　Ｘ　１０６
　　個し腔内に注射して抗体を産生させた仮、マウスか
ら腹水を採取し、これを４５％飽和硫安水溶液で硫安分
画に、伺し、それぞれの２Ｍ　ｈの＃４ｉ　１Ｍについ
て抗体として１００画分を４０〜６０７ｎ９得た。前記
で得られた工１Ｇ画分をアフィゲル１０　（バ米イオラ
、ド社製）と結合し、抗体吸着カラムを作成した。す彦
わち、アフィケル１０をガラスフィルター上で氷水冷却
下インプロパツールで洗浄し、さらに氷水で３回洗浄し
ゲルを回収した。このゲルと、４℃で５時間攪拌しなか
ら、結合反応を行わせた。反応後、ゲルを遠心回収した
。このものをｏ、　１　ｋ　Ｎ　ａ　ＨＣＯｓ　　と０
．１５　’Ｍ　Ｈａ　Ｃｔの混合液で２１１ｇＩ洗浄６
、ｏＩＭエタノールアミン−址彪烙（ｐ　Ｈ８）と震源
で６０分間よく混合して抗体結合ゲルを得た。このゲル
をカラムに充填して、抗体吸九カラムを作成した（７種
類のハイブリドーマにつき、各１本１名言１７本〕。

ここで得た７本の抗体吸着カラムに対して、前記和製Ｅ
ＰＯｈ品を井ｊいＥ　ｐ　ｏ　？ｑ、性吸光ｂヒり極短
した。

すなわち、ｈｐｏ、Ｔｈ品をＰＢＳに浴用′・し、この
液をヱめＰＥＳで平衡ｒｌシた前記成形カラムに１、し
た。溶出（ζ０２λζ酢酸と０．１５１ＡＮａＣ１との
龜合液で行い、未吸着画分及び浴出ω・分の五ＰＣ泡性
を御」定した。ここで竹だ７ねのカラムのうち３第１類
についてＥＰＯ活性のし、九を註、めた。

〔抗ＥＰＯ抗体産生細胞のクローニング〕前言ご３怨し
の抗ＥＰＯｖＬ負：λ生ハイフ゛リド−マについて、常
法に従い、限界希釈法により、クローニングを行った。

すなわちハイフリドーマ細、胞５０佃１と、４壱令Ｂ　
ｐ、　Ｌ　Ｄ　／　Ｃマウスの脱線よ、シ常法により訃
大した胸腺り胞１０８個ｆＲ？ＭＩ　１６４０液と１５
％ＦＣ！Ｓとの混合液Ｉ　Ｑ　ｍｌに分散し、９６穴マ
イクロタイタープレートの各穴に０．１　ｍｔすつ１き
、５白目及び１２日１にＲＰＭ工１６４０液と１５％Ｆ
Ｏ８の混合液（堀養゛液）を添加し席外したハイプリド
ーマ鞄胞について、前記と同様にしてソリッドフェーズ
法による抗ＥＰＯ抗体産生ｈ　Ｄｔｉの、スクリーニン
グを行い、さらに、ＥＰＯ吸着能による抗ＥＰＯ抗体産
生細胞の選択を杓いクローニング”を行った。このよう
にして、＠ｉ４　討３　ｆＨ％の抗ＥＰＯ抗体産生／・
イブリドーマよりそれぞれ細胞株Ｅ−１，Ｅ−２，Ｅ　
−３を樹立した。

〔モノクローナル抗Ｅ　Ｐ’　Ｏ抗体の産生〕前記のク
ローニン−グにより得た、抗ＥＰＯ抗体迄、／３−細胞
株（Ｅ−１，Ｅ−２，Ｅ−３）を用いて、抗体産生を行
った。すなわち、前記と同様に、マウスの腹腔内で抗体
産生をさせ、４５％価安分面により工２Ｇ画分をイもだ
。谷細胞株についてマウス２０匹を用い、５００π９の
モノクローナル抗体を竹た。

〔抗体吸九カラムの作成〕

前記と同様の操作で工ｙＧとアフィゲル１０との結合を
行わセ各モノクローナル抗体について５９ｍｇの抗体結
合ゲルを牝だ。

このゲルをカラムに充填し１、吸着カラムを作成した。

〔ＥＰＯの取得〕

原料液を訓シするため本実施例の抗原−タンパク質の調
製の冒頭で記載した限外濾過装置を用いて調製した全尿
タンパク粉末５０　ｍｇ　（２，９００単位）をＰＢＳ
ｌｏｍＪにｉ、　％し、外液４０１のＰＢＳに対し、１
夜透析を行い、遠心存、上清液を伜、原料液１０ｍ１を
有た。

前記で作成した抗体吸着カラム（Ｑ８ＣｎＬ　Ｘ　４ｍ
床容ｉ２ｍＪ、Ｅ−１）にＰ　Ｂ　８２０　ｍｌを２０
ｍ１／　ｈｒ　　で流し平復化し、次いでＯ，’　２　
Ｍ酢敢と０、１．５　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｏｔとの混合液５０
　ｍｌを同じ流速で流し、洗浄した彼、さらにＰ　Ｂ　
Ｓ　２０１１を同・様に流し平櫂化した。

このように庁、処理した奴漕カラムに、角１（記で調製
した原料液１０ｍ１を５罰／ｈ、ｒ　　のかｔ、速で辿
した。次にＰ　Ｂ　Ｓ　２０　ｍｉ、Ｏ’、　５　Ｖｉ
　Ｎ　ａ　Ｃｔ　ｆ含むｌＱ＋ｍＭリン酸緩衝＆　２０
ｒａｌ、　　０．１５　Ｍ　Ｎ　ａ　ｃｚ’、４Ｑｍｌ
の順に２０　ｍｌ　／　ｈｒ　でカラムを洗浄した後、
０．２　Ｍ酢酸と０．１５Ｍ’ＮａＣｔとの混合液’、
ｌ、Ｏｍｌを５．　ｍｌ　／　ｈ　ｒ　の流速で流し、
溶出液として高純度のＥＰＯを含む液を得た。

本液中のＥＰＯ活性は１．１６０単位であった○これを
原料液のそれの２．９００単位に対比すると回収率は４
０％であった。また本液中のＥｐＯ比活伽に４５，００
０単位／　ｍｙタンパク質であシ、ル科腋のそれの５８
単位／Ｔ１ｇタンパク質と対比するとＥ　Ｐ’　Ｏ純度
は、７８０％向上したことがわかる。

実施例２ 実施例１て作成した抗体結合ゲルを充填した梠１体吸九
カラム（０，８ＣＩｎｘ　４Ｃｍｌｌｊ容量２ｒｒｔｌ
。

Ｅ−２）を用いて次のとおり操作を行った。原料を和睦
けるため実施例１と同様に、限外濾過装置を用いて調製
した全尿タンパク脣粉末５０ｎｇ（２，９００番位）を
２％ＳＤＳを含むＦＢＳｌｏｍｔに溶解し、１００°Ｃ
３分間加熱処理後外液１０ｔのＰ　Ｂ　Ｓ　Ｋ対し、１
夜透析を行い、遠心後、上清欣１０ｒｒｔを得た。坏浴
液をＰＢＳで５伍外ル＼した後、実施例６１と同様にし
て削］処理を行った匍記抗体吸着カラムに対し、５　ｍ
ｌ　／　ｈｒの流速で通した。次にＰＢｓ２０ｍｇ、０
．５ＭＮａＣｔを含む１０７１１　Ｍす７ｋｋ３都２０
　ｍｔ、０、１５　ｈ、　Ｎ　ａ　ｃＬ　２　Ｕ　ｍｌ
のＪＬに２０１ｎｌ　／　ｈ　ｒてカラムを洗浄した後
、０．２Ｍ酢酸と０．１５　ＭＮａｃ４との混合液２０
ｍ１を５　ｍｌ　／　ｈ　ｒで流し溶出液として高純度
のＥＰＯを含む液を食た。

本液中のＢＰＯ活＋３：は２，６００年旬てあった○こ
れを原料液のそれの２．９００単勺−に対１比すると回
収率９０カであった。まだ本液中のＥＰＯ比活性は、６
０，０００単位／　ｍ９クンバク質で凍す、原料液のそ
ハの５８単位／ｍ９タンパク質と対比するとＥＰＯ糾度
は、約１．０００賠向上したことかわかる。

実於例３ 実が、９．３１で作成した抗体結合ゲルを充填した抗体
ｖ、にカラム（２ｃｍＸ　６．４　ｔｉ＋、比容７．２
　Ｑ　ｍｅ、Ｅ−３）を作成し、実が−・例］と同様に
して、前処理をもい、使用した。原料液は、実施例２と
同様に、全尿タンパクｉ粉５００　’ｎｇ（２９，００
０配位）’ｚ２９ｅｓＤｓを含むＰＢ８５０ｍｌに浴解
し、ＩＧＯ″Ｃ３分間加熱処理後、外液４０ｔに対１し
、１夜透胡を行し・、遠心謙１、上清液５０ｄを伯、ｐ
ｉｓで５倍希釈した。本原相液を前記前処理すみ抗体吸
着カラムに対し、２０ｍ１／ｈｒの流速で通した。次い
でＰＢＳ　２００ｒｒｒｌ、　０．５Ｒ４Ｎ　ａ　ＣＬ
　ｆ：含む１０　ｍ　Ｍ　リフ　ｋ組価液２００ｉｉ１
１＝、０．１５　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃｔ　２００　ｍｌのｊ
かに、１００ｍｂ　／　ｈ　ｒでカラムを洗浄した後、
０．２Ｍ酢酸と０．１５ＭＮ、ａＣｔとの混合液２　［
１）　Ｏａｔを２０ｍ１゜／ｂｒで流し、溶出液として
高純朋のＥＰＯを名む歇をそ・た。

本液中のｇＰＯ？ｉｂ（柚、２５，０００単位であった
○これを原を１液のそれの２９，０００単位に交り比す
ると回収率８６％であった。また本液中のＥＰＯ比活性
は、６　Ｑ、　（１００単位／　ｍｇタンパクＬであり
、原相敢のそれの５８単もｔ、／、ｔｎｑタンパク食と
対すする。ｑｚｐｏ純度は、約１，０００倍向上したこ
とがわかる。

特許出願人雪印乳業林式会社

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　エリスロピエチンで免疫した実もＬ物の牌臓
   細胞とミエローマ細胞とを細胞融合させたハイブリドー
   マに１胞よｐ得られた七ノ゛クローナル抗エリスロボエ
   チン抗体を結合してなる吸着剤に、エリスロボエチン含
   有物を接触させてエリスロボエチンを吸着させ、次いで
   浴出し、吸着分としてエリスロボエチンを取得すること
   を判像とする高純度エリスロボエチンの製造方法。
2. （２）　　エリスロポエチン含有物が貧血患者の尿又は
   その処理物である特許請求の範囲（１）の製造方法。
3. （３）　　吸着剤をカラムに充填して使用する特許請求
   の範囲（１）の製造方法。