PT86860B - Processo para a preparacao de citotoxinas e de composicoes farmaceuticas que as contem - Google Patents

Description

Memória descritiva

Esta invençSo refere-se a um pro cesso para a preparação de uma nova citotoxina, ao seu isç lamento do meio de cultura usado para a incubação de linhas de células limfoblastóides, à sua formulação e ao seu uso em medicina humana e veterinária.

As citotoxinas são um grupo de proteínas produzidas por células do sistema imunitário, se bem que citotoxinas diferentes possam ser produzidas por diferentes tipos de células. Entre outras actividades, estas proteínas sSo capazes de destruir células tumorais em cultura e foi demonstrado que as duas citotoxinas melhor caracterizadas, factores de necrose tumoral TNFof e TNFP (também denominada ©(-limfotoxina), possuem actividade antitumoral in vivo. Os cADNs que codificam tanto — 1 — ?P-

para o TNBY como para o TNFp têm sido clonados e expressos em E.coli (Pennica et al, Nature, 1984, 312, 724; Gray et__al, Nature, 1984, 312, 721). A caracterização de outras citotoxinas, tais como o factor citotóxico destruidor de células natural (“natural Killer celJ cytotoxic factor'* « NKCF) e a leucorregulina, não tem sido tão completa (ortaldo J.R. et al, J,Immunol., 1986, 137, 2857-2863).

Demonstrou-se agora que uma nova citotoxina, daqui em diante designada como limfotoxinc. básica e abreviada para bLT, possui actividade anti-neç plástica. Em particular, apresenta actividade citotóxica contra uma série de linhas de células de mamíferos incluindo especialmente a linha de células HT 29 (ATCC N.o HTB 38) do adenocarcinoma do cólon humano e a linhe de células de tumor quase-diplóide RPMI 2650 (ATCC K.s CCL 30) do septo nasal humano.

Em conformidade, a presente invenção proporciona um processo para a preparação de uma nova citotoxina que tem um peso molecular aparente por filtração em gel de 47 - 5 KDa, um ponto isoeléctrico aparente de pelo menos 7,7 e a análise de ácidos aminados seguinte :

Ácido	Número	Ácido	Número
aminado	de Resíduos	aminado	de Resíduos
Asx	36,0 -	Pro	24,5 I 2,9
Glx	46,7 t 5,6	Tir	12,3 Í 1,5
Ser	41,0 í 4,9	Vai	22,7 1 2,7
Gli	38,4 Í 4,6	Met	8,4 Í 1,0
His	13,6 — 1,6	Ile	19,6 t 2,4
Arg	19,6 t 2,4	Leu	43,1 Í 5,2
Thr	21,4 - 2,6	Fen	23,8 - 2,9
Ala	33,2 - 4,0	Lis	26,4 t 3,2

Na sua forma natural crê-se que a bLT tem uma estrutura quaternária composta de sub-unidades de peso molecular baixo, embora isto ainda não tenha sido confirmado.

De preferência, a bLT é apresentada numa forma substancialmente enriquecida e especialmente numa forma substancialmente livre das substâncias com as quais está normalmente associada no seu meio natural. Em particular, a pureza da bLT é maior que 90 % e dum modo especial maior que 95 % (p/p).

k bLT da presente invenção tem uma combinação de propriedades que é diferente das proprie dades de todas as citotoxinas anteriormente descritas. Além das propriedades físico-químicas atrás mencionadas, a bLT tem as seguintes propriedades biológicas que a distingue particularmente do TNF^f e/ou do ΤΝΕβ» (1) Conserva significativamente mais actividade citotóxica depois de incubação a 75°C que o TNFof recombinante ou o TNF£ recombinante;

(li) A sua actividade citotóxica não é afectada por trata mento com neuraminidase, enquanto que a actividade citotóxica do TNFf> natural é significativamente diminuída; e (iii) A sua actividade citotóxica em células L929 murinas (ATCC M.a CCL 1) não é inibida pelo interferão limfoblastóide em contraste com o TNF0 natural.

Os processos pelos quais as propri edades físico-químicas e biológicas acima mencionadas foram determinadas sSo descritos seguidamente, processo da presente invençSo pa ra a produção de bLT compreende a incubação de uma linha _ 3 -

de células limfoblastóides num meio de cultura, a indução da linha de células com um agente indutor e o isolamento de bLT do meio de cultura.

processo da presente invcr.ção inclui o uso de qualquer linha de células limfoblastóides mas particularmente de linhas de células limfoblastóides que são capazes de produzir interferão. (strander, et al , J. Clin. Microbiol ., 1975, 1, 116-124 e christofinis, G.J. et al , J, Gen, Virol ., 1981, 52, 169-171). Tais linhas de células são facilmente derivadas de células de doentes com o limfoma de Burkitt, um tumor causado pelo vírus de Epstein-Barr. Um exemplo particularmente útil desta linha de células foi derivado das células obtidas duma criança africana do sexo feminino chamada Namalwa (Klein, G. et al , Int, J, Câncer , 1973, 12, 396-408). Verificou-se que esta linha de células produzia grandes quantidades de interferão quando estimuladau de modo adequado (Strander, H. et al , J. clin. Micro,, 1975, 1, 116-117). obteve-se uma subcultura da linha de células fornecida pelo Dr. I. Gresser (Villejuif, Fran ça) em Janeiro de 1975. Nessa altura adaptou-se a linha para crescer no meio RMPI 1640 (Moore, G.E., J, Amer, Med, Assoe ., 1967, 199, 519-524) com 10 % de soro fetal de vitelo. Nestes laboratórios as células foram adaptadas para crescer no mesmo meio suplementado com 5 a 7 % de soro derivado de vitelos de 6 a 8 meses de ida de e fizeram-se subculturas duas a três vezes por semana durante um período de dezoito meses. Constituíu-se um depósito destas células denominadas Namalwa/WRL numa série de ampolas que foram armazenadas em azoto líquido. Verificou-se que estas células estavam isentas de infecção de micoplasmas e depositaram-se amostras na American Type Culture Collection (ATCC N,s CRL 1432). 0 processo pelo qual a linha de células limfoblastóides pode ser incubada e o meio de cultura utilizado são geralmente conhecidos na especialidade. Num aspecto prefe rido, o processo é substancialmente o mesmo que é usado

na produção de interferSo» Assim, as células são de preferência cultivadas em suspensão num meio que contém soro a ou a cerca de 37°c até se obter uma concentração a partir de 0,5 até lo x 10° células/ml. Nesta fase, é conveniente recolherem-se as células, por exemplo, por centrifugação ou por filtração, e ressuspen dê-las em meio de cultura fresco. Isto proporciona a vantagem potencial de aumentar a densidade das células usando menos meio (e assim aumentando o rendimento de bLT) e/ou de facilitar a purificação de bLT mediante o uso de um meio que contenha menos ou nenhum soro para a resuspensão das células. A uma escala da produção, contudo, estas fases adicionais podem não ter justificação

Um exemplo de um meio de cultura que contém soro é o meio RPMI 164c suple entado com de 1 a 10 % (v/v) de soro de vitelo ou de cavalo. Um exem pio de um meio de cultura Isento de soro é RFMI 164C de potência simples suplementado com o seguinte:

mH de glutamina

0,5	% (v/v)	de	triptona
3,5	mg/ml	de	glucose
1	mg/ml	de	insulina
0,14	mg/ml	de	putrescina
2	mg/ml	de	lecitina e
2,2	mg/ml	de	bicarbonato de sódio.

Exemplos de agentes indutores pre feridos incluem vírus, especialmente o vírus sendai, que podem ser usados em associação com um intensificador tal como um ácido carboxílico ou um seu sal. O vírus é adicionado de preferência à cultura de células para dar uma concentração final de desde 5 até 200 HAU/ral, de preferên cia 20 a 50 HAU/rnl. Depois de misturar completamente, incubou-se a cultura de células durante um período de 12 a 4£h a ou a cerca de 37°C para deixar a indução continuar até estar completa.

Se, como se prefere, se usar um intensificador, então é hacitual tratar as células com o intensificador assim que elas tenham atingido a concentração requerida de desde 0.5 a 10 x 10 células/ml. Pelo menos quando o processo é realizado em pequena escala é desejável que se remova o excesso do intensificador antes da indução. separando as células e resuspendendo-as como descrito acima. Se se usa um ácido carboxílico livre, então na adição ao meio de cultura.

que contem normalmente vérios sais Inorgânicos mente os sais do ácido, o ácido sob a forma dum ou orgânicos, formam-se normalSe se desejar, é possível usar o sal e adicionar este ao meio.

Exemplos de sais incluem sais de sódio, potássio e amónio.

á especialmente preferido que a indução da linha de células, particularmente em associação com um intensificador, se realize substancialmente da mesma maneira como se conhece para a produção de interferão, por exemplo como é descrito na patente US 4216203.

A seguir à incubação e incução da linha de células, a bLT está presente no meio de cultura em conjunto com interferão e outros produtos. A bLT é isolada de preferência do meio de cultura por um processo que inclui o uso de uma coluna de imunoafinidade de anti-corpo de interferão anti-linfoblastóide para remover o interferão linfoblastóide e de uma coluna de cromatografia para remover quaisquer citotoxinas que tenham um ponto isoeléctrico ácido que possam estar presentes. Deste modo, a bLT pode ser obtida numa forma substancialmente enriquecida que é substancialmente livre de interferão lin foblastóide e de citotoxinas acídicas.

A coluna de imunoafinidade para a remoção do interferão linfoblastóide compreende de preferência um gel de agarose de ligação cruzada, tal como a que é vendida sob a marca registada sepharose (pharmácia Ltd., Pharmácia House, fiidsummer Boulevard, Central

Milton Keynes# Bucks# Inglaterra# .”K9 3HF)# para o que s8o ligados anticorpos de interferSo nnti-linfoblístóide monoclonais ou policlonais. 0 meio de cultura ê normalmente primeiro centrifugado ou filtrado para retirar as células deixando uma fase líquida transparente que é então aplicada à coluna de imunoafinidade, 0 efluente da coluna# que contém bLT# é recolhido e pode ser conveniente mente concentrado nesta fase usando por exemplo ultrafiltraçSo.

A remoçSo das citotoxinas acídicas usando uma coluna cromatográfica pode ser completada por cromatofocagem ou por cromatografia de troca de i8es do efluente opcionalmente concentrado a partir da coluna de Imunoafinidade. Em ambos os casos a vantagem no facto de que a bLT da presente invençSo tem um ponto isoeléc trico aparente de pelo menos 7,7 enquanto que qualquer citotoxina acfdica que possa estar presente terá um ponto isoeléctrico mais baixo. Isto permite que a separaçSo se consiga aumentando a concentraçSo de sal ou diminuindo o pH do eluente de acordo com o tipo de permutador. No ca so de cromatofocagem# a coluna contém de preferência um gel de agarose de ligaçSo cruzada com grupos funcionais amina terciários e quaternários. Um exemplo específico de um tal gel é o que é vendido sob o nome registado de “PBL 94 (pharmácia Ltd.), No caso de cromatografia de troca de i8es, a coluna contém de preferência um gel de agarose de ligaçSo cruzada com grupos funcionais dietilaminoetilo (um aniSo permutador) ou com grupos funcionais carcoxime til (um catiSo permutador).

géis incluem os vendidos sob os nomes registados de ΓΈΛΕ

-Sepharose CL-6B e CM-Sepharose CL-6B respectivamente (Pharmácia Ltd.).

Pode ser vantajoso utilizar duas colunas permutadoras de i8es para conseguir uma separaçSo totalmente efectiva da bLT da presente invençSo das citoto xinas acídicas. Assim uma coluna# tal como aquela que ·* 7 *

I

contém um gel de agarose do ligaçSo cruzada com grupos fun cionais de dietllaminoetilo, pode ser usada pera reter as citotoxlnas acídicas e deixar a bLT passar através dela e a segunda coluna, tal como a que contém um gel de agarose de ligação cruzada com grupos funcionais carboxim tilo, po de ser usada para reter a bLT e deixar passar as citotoxinas acídicas.

A solução enri<uccida em bLT pode ser purificada adicionalmente para conseguir um nível de purificação maior do que 90 % (p/p) e espccialmente maior do que 95 % (p/p) por métodos conhecidos na especialidade, incluindo especialmente fases adicionais de cromatografia de coluna. Se por exemplo o meio de cultura em que as cé lulas limfoblastóides foram cultivadas continha soro, então seria desejável passar a solução de bLT enriquecida através de uma coluna de imunoafinicace anti-soro policlonal para remover quaisquer proteínas contaminantes do soro. Exemplo de outras colunas que podem ser empregues preferencialmente incluem as colunas que contêm um gel de agarose de ligação cruzada com procion Red (HE-3B) e um polímero hidrofílico monodisperso com grupos funcionais amina quaternária. Exemplos específicos dessas substâncias incluem as que são vendidas sob os nomes registados de Red Sepharose CL-óB e Mono C” respectivamente.

A bLT da presente invenção, ou um seu imunogénico determinante, podem ser usados como um lmunogene para produzir anticorpos por métodos bem conheci dos na especialidade. Podem obter-se anticorpos policlonais por imunização de um animal de laboratório com bLT, ou com um seu determinante imunogénico seguido da recolha do anti-soro. Podem obter-se anticorpos monoclonais por imunização de rato com bLT ou um seu determinante imunogénico, o isolamento de células de baço de rato sensibiliza das, e a fusão de tais células com células de mieloma para produzir células de hibridoma, que então clonadas e culti vadas como requerido.

— 8 —

Os anticorpos policlonais ou mono clonais produzidos contra bLT são usados na purificação de bLT por afinidade cromatográfica e na identificaçSo e caracterização de bLT.

Como previamente referido, a bLT tem actividade anti-neoplástica e por isso é usaôa no controle e tratamento de doenças neoplásticas. á de par ticular conveniência no que diz respeito a este assunto apresentar a bLT numa forma adequada. Em concordância, a presente invençSo proporciona uma formulação farmacêuti, ca que compreende bLT e um veiculo farmaceuticamente acei tável.

A formulação é de preferência uma solução parenteral aquosa adequadamente adaptada pera a administração por injecção ou perfusão. É opcionalmente tamponizada a ou a cerca do pH neutro e de preferência contêm solução salina ou dextrose a um nível suficiente para atingir uma tonicidade substâncial com o soro do san gue do paciente. Pode conter também um estabilizador, tal como albumina de soro humano ou um açúcar inerte. Con venientemente a bLT pode ser apresentada na forma liofi lizada adequada para a reconstituição em água imediu.tamen te antes de usar.

A formulação farmacêutica, quer húmida quer liofilizada é apre: entada de preferência em embalagens de vidro ou plástico estéreis e seladas.

A presente invenção proporciona também um método para o tratamento de doenças neoplásticas num animal que compreende a administração ao animal de uma quantidade terapêutica efectiva de bLT. Em alternativa proporciona-se também bLT para uso em medicina humana ou veterinária e em paricular para uso no tratamento de doen ças neoplásticas.

Opcionalmente, a bLT pode ser risada isoladamente ou em combinação com agentes químio-terapêutlcos ou outras linfoquinas incluindo interferSes, factores de necrose tumoral, interleuquinas e factores de estimulaçSo de colónia.

As vias de administração de bLT no animal são intravascular, intratumor, intraperitoneal e intrapleural.

Uma quantidade terapeuticamente efectiva de bLT para tratar um animal com uma doença neoplástica dependerá acima de tudo de um certo número de fac tores incluindo por exemplo, a idade e o peso do animal, o tratamento exigido para a precisa doença e a sua gravi dade, a via de administraçSo e dependerá em última análise da decisão do método assistente. á aceitável, contudo, que uma quantidade efectiva esteja geralmente na gama de desde 0,02 a 10 g/Kg, especialmente desde 0,1 a 4 g/Kg de peso corporal do paciente. Assim para um adulto humano tendo 70 Kg, uma quantidade efectiva estará geralmente de 1,4 até 700, especialmente de 7 a 280 g.

Os exemplos seguintes sSo dados como ilustraçSo da invençSo e não constituem de qualquer modo uma sua limitação. A quantidade de ligação de proteína às várias colunas foi medida pela absorção da luz a 2.80 nm (Α₂₈θ).

Exemplo 1

Preparação de uma solução enriquecida de bLT

Cultivaram-se células humanas lim foblastóides da linha Namalwa/WRL e introduziram-se como descrito previamente (Finter N.B. et al , cold Spring Harbour Symposia on Quantitative Biology, 1986, Vol, LI, 571-575). passou-se o sobrenadante de células resultantes através de uma coluna de imunoafinidade de Sepharose

(Pharmácia Ltd) e obteve-se anti-corpo policlonal de interferão anti-limfoblastÓide como anteriormente descrito (Flnter N.B., Fantes K.H. e Johnston H.D., Levelopments in Biological Standardisation, 1978, 38, 343-348; Fantes K.H., Burman C.J., Bali G.D., Johnston M.D, e Flnter N.B., Biochemical Characterisation of Lymphokines, 1980, 343-351, Edited by A.L, de V»eck,

F.Krlstensen and M. Lardy, New York and London, Academic Press) e correu também como anteriormente descrito (Secher D.S. and Burke D.C., 1980, Nature, 198C, 285, 446-450), Esta fase retirou praticamente todo o interferão linfoblastóide.

efluente da coluna que contém a bLT (500 ml) foi dialisado contra cloridrato de imldazolo 0,025 1. a pH 7,7 e foi aplicado a uma coluna de 1 cm x 3C cm de PBE 94 (pharmácia Ltd.) previamente equilibrada com o mesmo tampão, 0 fluxo de carga foi de 11 ml/h e recolheram-se 11 fracções enquan to se aplicava a amostra. Lavou-se então a coluna com 100 ml do tampão de cloridrato de imidazolo original an tes de ser eluída com um gradiente de pH formado por 500 ml de Polybuffer 74 (pharmácia Ltd) diluido oito vezes a pH 4,0, Durante a elição o volume da fracção alterou-se para 3 ml. pelo menos 80 % da substância (^A280^ ligou-se à coluna e poude assim ser separado da bLT por este processo. Normalmente o material carregado na coluna tinha uma concentração de proteína de aproximadamente 2 mg/ml e 56 U/ml de actividade cito tóxica, enquanto o efluente da coluna que contém a bLT tinha aproximadamente 0,33 mg/ml que continham 40 U/ml de actividade citotóxica.

Uma bém presente na substância luna e foi eluída dentro da um pico a 5,7.

actividade citotóxica, tamde partida, ligou-se à cogama depH 5,3 a 6,3, com

A análise para a actividade citotóxica utilizou células LM (ATCC N.s CCL 1,2) e corante vermelho neutro e realizou-se da seguinte maneira:

Inocularam-se células LM em alvé

4MB olos de microtitulação a 5 x 10^ células/ml (200 /11 por alvéolo) em meio RPMI 1640 contendo 1 % de soro fe tal de vitelo. Fizeram-se diluições da substância em ensaio em meio RPMI 1640 contendo 1 % de soro fetal de vitelo. Adicionaram-se amostras de 50 /11 de cada diluição para alvéolos em duplicado, imediatamente depois das células terem sido adicionadas aos alvéolos, Incubaram-se as placas de microtitulaçSo a 37°C em dióxido de carbono a 5 %. Depois de 64 a 72 horas de incubação, coraram-se as células durante 1,5 horas em vermelho neutro a 0,036 %, NaCl a 0,9 % e HC1 0,015 N (50 /11/ /alvéolo). a solução corada foi removida por aspiração e as células foram lavadas uma vez com solução de Nacl a 0,9 %. Lisaram-se as células com 200 /íl/depósito de solução de lise (50 % (v/v) de Nacl/etanol a o,9 %) durante 30 minutos â temperatura ambiente e determinou -se a absorvância a 540 nm.

Exemplo 2 Preparação alternativa de uma solução de bLT enriquecida

Concentraram-se aproximadamente 40 litros do efluente da coluna de imunoafinidade de anticorpo policlonal de interferão anti-linfoblastôide descrito no Exemplo 1 e simultaneamente cialisaram-se contra cloridrato de imidazolo 0,01 M a pli 7,7 usando um rim artificial Ashi (AM300; Kimal Scientific Products Ltd., Uxbridge, Middlesex, England). 0 volume final foi de aproximadamente 2,5 litros.

Aplicaram-se aproximadamente 2 litros deste produto concentrado a uma coluna de 2,5 cm — 12 — χ 18 cm de CM-Sepharose (pharmácia Ltd.) previamente equilibrada em cloridrato de imidazolo 0,01 M a pH 7,7. 0 fluxo através da coluna foi de 50 ml/h e colheram-se três fracções de volume de efluente. Lavou-se a coluna com 250 ml do mesmo tampSo de cloridrato de imidazolo e colheu-se o efluente em fracções de 10 x 25 ml. Eluíu-se então a coluna com um gradiente linear de força iónica crescente a partir de 1 litro do tampão de cloridra to de imidazolo inicial e um litro do mesmo tampão contendo cloreto de sódio 1 M. Durante a eluição colheram-se fracções de 10 ml.

A quantidade de proteína presente quer no efluente quer nas soluções de eluição foi tal que o perfil de eluição determinado por A_2g0 estava fora da escala e assim não pode ser feita qualquer estimati va da quantidade de material ligado à coluna.

Analisaram-se várias fracções através do perfil de eluição para a actividade citotóxica usando células LM e corante vermelho neutro como des crito no Exemplo 1. Detectou-se actividade nas duas áreas, a NaCl de 0,08 até 0,11 M e a NaCl de 0,28 até 0,33 M. Este resultado poderia estar relacionado com duas formas diferentes de bLT.

Exemplo 3

Preparação de uma solução purificada de bLT

Cultivaram-se tóides humanas da linha Namalwa/WL mentado com soro de bovino adulto a células linfoLlasem meio RFKl suple7 % (v/v), triptona a 0,5 % (p/v) e 3 mg/ml de glucose. Quando a densidade de células atingiu 2,5 a 3,0 x 10 células/ml, diluiu-se a cultura com soro de bovino adulto a 7 % até uma densidade de 1,0 a 1,5 x 10^ células/ml. Adicio nou-se butirato de sódio 1 M para dar uma concentração

final de 2mM. Manteve-se a cultura a 37°C com agitação durante 2 dias. Passado este tempo centrifugaram-se as células a 800 rpm numa centrífuga Mistral de 6 litros (M.S.E., Manor Royal, crawley, W. Sussex, England)· Lavaram-se as células sedimentadas e resuspendidas em RPMI 1640 livre de soro suplementado com glutamina 1 mM; triptona a 0,5 % (p/v); glucose a

3,5 mg/ml; insulina a 1 mg/litro; putrescina a 0,14 mg/ /litro; lecitina a 2 mg/litro; e bicarbonato de sódio a 2,2 mg/ml. Adicionou-se fluído Allantoic contendo vírus Sendaf a 1 % (v/v). Após incubação a 37°c ciuran te 24 horas, recolheu-se o sobrenadante por centrifugação a 1500 rpm durante 30 minutos numa centrífuga Mistral de 6 litros, filtrando-se em seguida através dum filtro de 0,22 jum.

Passou-se o sobrenadante através de uma coluna de imunoafinidade de anticorpo policlonal de interferão anti-linfoblastóide construído e usada como descrito no Exemplo 1. Concentraram-se 10 litros de efluente da coluna até 0,5 litros e simultaneamente diafiltrou-se contra uma solução de cloridrato de imidazolo a 25 mM a pH 7,7 usando um cartucho de ultrafiltra ção enrolado em espiral Amicon com uma membrana YM10 (Amicon Lda.). A solução concentrada foi depois dialisa da contra uma solução de cloridrato de imidazolo 25 mM a ph 7,4 a 4°c durante a noite.

Aplicou-se então a solução que continha o concentrado de bLT a duas colunas permutadoras de iões que corriam em séries uma coluna de 2,5 x 5 cm de DEAE-Sepharose CL-6B (pharmácia Ltd.) seguida por uma coluna de 2,5 x 2,5 cm de CM-Sepharose CL-6B (Phar mácia Ltd.). Ambas as colunas foram pré-equilibradas com uma solução de cloreidrato de imidazolo 25 mM a pH 7,λ a 4°c. 0 efluente da coluna de DEAE-Sepharose CL-6B fo:.

aplicado directamente à coluna de CM-Sepharose. Utilizari do aumentos graduais de concentração de Nacl (50 mH, 10C

mM e 250 mM), eluíu-se a coluna de CM-Sepharose CL-6B a um ritmo de 1 ml à linha de base.

por minuto até que

^Λ28Ο regressou pico maior que contém bLT foi eluído na presença de Nacl 100 mM num volume de 3o ml.

eluído que contém bLT foi aplicado directamente numa coluna de 2 cm x 1,6 cm de Red Sepharose CL-6B (Pharmácia Ltd.). 0 bLT ligou-se à coluna e eluíu-se com cloridrato de dietanolamina 50 mM

- arginina 0,1 M a pH 9,4 com um fluxo de 0,5 ml/minuto até que a ^re9^ressou & linha de base, este resultado foi necessário um volume de 15 ml.

para

Conseguiu-se com esta fase uma purificação equivalente a cinco vezes.

eluído que contém o eluído da coluna de Red Sepharose foi diluído (1:4) com cloridrato de dietanolamina a pH 9,4 e aplicado numa coluna de Mono Q (Pharmácia Ltd.) a um ritmo de 1 ml/minuto. To da a actividade citotóxica foi recolhida na fracção não ligada.

As actividades específicas das amostras obtidas durante o processo de purificação foram determinadas usando o ensaio baseado em células LM e corante vermelho neutro como descrito no Exemplo 1, cs re sultados são apresentados no quadro a seguir;

	Amostra	Concentração de proteína total (mg/ml)*	bLT	Actividade específica (yZasl
1.	Depois da coluna de imunoafinidade de interferão anti-llnfoblastói de C,12	150	1,25 x 103
2.	Depois da coluna de CM-Sepharose	0,085	800	9,4 x 104
3.	Depois da coluna de Red-Sepharose	0,012	8100	7,2 x 105
4.	Depois da coluna de Mono Q	0,008	9750	1,2 x 106

* Determinado usando um conjunto de análise de proteína Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Califórnia, U.S.A.).

Somente para a análise de aminoá eido, a bLT foi sujeita a uma purificação posterior envolvendo cromatografia de fase reversiva num sistema FPLC pharmácia com uma coluna de Pro RPC (Pharmácia Ltd.). Aplicou-se a amostra directamente a partir da coluna Monc C e eluiu-se com um gradiente de acetonitrilo 0-15-40 % em ácido trifluoroacético a 1 %. 0 fluxo foi de 0,7 ml por minuto. 0 primeiro aumento de 15 % na concentração de acetonitrilo teve lugar numa velocidade de 5 z por minuto. Foi deixado a 15 % durante cinco minutos e depois a variação de gradiente foi de 1 % por minuto. Detectou-se o bLT por ELISA num pico de traço da a₂₈₍₎, d< qual se apresenta uma cópia na Figura 1, o pico que foi eluído com acetonitrilo a 32 a 35 % — 16 —

Exemplo 4

Produçgo de anticorpos monoclonais contra bLT processo para a produção de hi bridomas foi globalmente como descrito por Kohler, G. et al. # Nature# 1975# 256, 495-497 excepto como indica do abaixo;

(i) Inocularam-se por via intraperitoneal e por via subcutânea dois ratos BALB/c em múltiplas localizações com uma quantidade estimada de 750 | ng/rato de bLT em adjuvante completo de Freund# tendo o bLT sido obtido pelo processo do Exemplo 2 e aplicado adicionalmente a uma coluna de imunoafinidade de soro an tibovino.

(ii) Depois de um mês cada rato foi injectado com 125 ng de bLT em adjuvante incompleto de Freund usando a via descrita acima# tendo o bLT sido obtido como em (i) e depois purificado por filtração de gel numa matriz de agarose de ligação cruzada vencida sob o nome registado de Sepharose 12” (Pharmácia Ltd.).

j (iii) Depois de passadas três semanas cada rato foi injectado por via subcutânea e por via intravenosa com 1,15 pg de bLT em Alhidrogel (2 % de hidróxido de aluminio em água)# tendo o bLT sido obtido da coluna de CM-Sepharose como descrito no Exemplo 3 e tendo sido depois purificada por filtração de gel.

(iv) Λ inoculação final# um mês mais tarde# utilizou 5,7 pg de bLT/rato e foi dada por via intravenosa# tendo o bLT sido obtido e purificado como era (iii). Depois de três dias os ratos foram mortos e as células do baço utilizadas para fusão com células de mieloma p3-NSI/I-Ag4-l ( J, Mol, Biol.# 1974, 90# 691).

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Os hibridomas resultantes foram clonados e cultivados de acordo com os processos conhecidos na especialidade. Os hibridomas clonados foram separados utilizando uma análise imunorradiométrica ou de mancha imunológica em conjunçSo com uma análise que dete cta reduçSo de actividade por imunoprecipitaçSo, Selec cionaram-se assim clones individuais pela sua capacidade de secretar os anticorpos desejados.

Exemplo 5

Propriedades Físico-Químicas de bLT

A. Peso molecular peso molecular aparente da bLT foi determinado por filtraçSo de gel. A bLT (200 juli foi obtida da coluna CM-Sepharose como descrito no Exem pio 3 e concentrada cinco vezes numa célula com agitaçSo de Amicon com uma membrana YM10 (Amicon Ltd.). A amostra concentrada foi aplicada numa coluna de filtraçSo de gel de Superose 12 HR 10/30 (Pharmácia Ltd.) e eluída com soluçSo salina tamponizada com fosfato a pH 7,2 com uma velocidade de 0,5 ml/minuto. 0 eluído da coluna foi analisado para a actividade citotóxica usando células LM e corante vermelho neutro como descrito no Exemplo 1.

Os resultados sSo apresentados na Figura 2 na qual a linha pontilhada corresponde à actividade citotóxica e em que as setas numeradas correspondem à posiçSo de eluiçSo das proteínas de peso molecular conhecido. A identidade das proteínas conhecidas é a seguinte:

1. Apoferritina

2. p-Amilase

3. Albumina de soro de bovino

4. Anidrase carbónica

5. Citocromo c — 18 — peso molecular aparente

B. Ponto isoeléctrico

No Exemplo 1 a bLT contida no efluente da coluna de imunoafinidade de interferão anti-linfoblastóide nSo se liga com a coluna de cromatofocagem de PBE 94 (Pharmácia Ltd.) sob as condições descritas. 0 seu comportamento cromatográfico deixa-nos assim concluir que o ponto isoeléctrico da bLT 4 maior que 7,7.

C. Análise de aminoácidos bLT obtida da coluna de ?ro como descrito no Exemplo 3 foi tida à análise de ácidos hidrolisada com HC1 6 N e submeaminados usando um sistema bater

Pico-Tag de acordo com métodos conhecidos na especialidade. A composiçSo de ácidos aminados calculada foi baseada num peso molecular de 47 KDa.

Exemplo 6

Propriedades biológicas de bLT

A. Actividade citotóxica de bLT, TNF«x e TNFfi

As linhas de células de mamífero visadas foram todas submetidas a processos idênticos para as avaliar para a sensibilidade para a actividade. Os processos foram como se seguej

As linhas de células foram cultivadas em meio RP11I 1640 contendo 5 a lo % de soro fetal de vitelo. No fim da fase de crescimento exponencial, substituíu-se o meio por RPMI 1640 contendo 1 % de soro fetal de vitelo. Tomaram-se volumes de 200 pl_t contendo cada um 10⁴ células e distribuiram-se por alvéolos de 0,3

ml de placas de microtitulação (Costar)·

Diluições múltiplas em série log_;[ de bLT_f obtidas da coluna Mono Q de acordo com o processo do Exemplo 3 e tendo a concentração de 3250 li como de terminado em células LM, foram feitas usando RPMI contendo 1 % de soro fetal de vitelo. Adicionaram-se imedia·· tamente as diluições (50 /il/alvéolo) às células visadas em duas filas de réplicas contendo diluições idênticas. Incubaram-se então as células visadas num incubador humidn ficado a 37°c em dióxido de carbono a 5 % durante 48 ho

M ras. No fim deste período adicionaram-se a cada alvéo lo 4 jici de ^fmetil- HJ timidina (Amersham internatio nal, England: 52 Ci/mM) em 40 jal do mesmo meio. As células visadas foram deixadas a marcar durante 18 horas a 37°c em dióxido de carbono a 5 %. Removeu-se então o meio dos tipos de células aderentes (LM, L929 e RPl-.I 2650) e substituiu-se por 200 de ácido etileno-diaminotetraacético e incubou-se durante 10 minutos à temperatu ra ambiente. Todas as células foram lavadas e recolhi das em filtros de disco de fibra de vidro (v;hatman GF/B) usando um recolhedor de células (M-48R, Brandel, U.S.a.) com solução salina com tampão fosfato a pH 7,2 como solução de lavagem. Cada disco de filtro foi colocado num frasco de vidro com 5 ml de cintilante vendido sob o nome registado Cocktail W (British Drug Houses, Poole, Dorset, England) e contado usando um contador de cintilações líquido. Determinaram-se as unidades de bLT necessárias para destruir 50 % de cada célula visada em comparação com células LM por análise de probabilidade ( ú_A Gen, Virol., 1972, 14, 49).

As várias linhas de células que se usaram e os resultados obtidos são apresentados no qua dro abaixoi

Células visadas

LM

RPMI 2650

L929

M0LT-4

K562

RAJI

DAUDI

HL60

Ndmero de unidades de LH de bLT que causam citotoxidade a 50 %

1	U/ml
20	U/ml
20	U/ml
25	U/ml
800	U/ml
> 1000	U/ml
>1000	U/ml
> 1000	U/ml

Linha de células	ATCC N.o
LM	CCL 1.2
RPMI 2650	CCL 30
L929	CCL 1
M0LT-4	CRL 1582
K562	CCL 243
RAJI	CCL 86
DAUDI	CCL 213
HL 60	CCL 240

Natureza

Fibroblasto tumorigénico de rato

Septo nasal humanoj tumor quase-diplóide

Fibroblasto tumorigénico de rato

Sangue humano periférico; leucemia linfoblástica aguda

Leucemia mielogenosa crónica humana

Linfoma de Burkkit humano

Limfoma de Burkkit humano

Leucemia promielocítica de sangue periférico humano

Usando a linha de células de ade nocarcinoma do cólon humano HT 29 (ATCC K.S HTB 38), as actividades citotóxicas de bLT, TNF°é e ΤΝΓβ naturais foram determinadas utilizando uma análise de libertação de trltio como descrito acima. Obteve-se o bLT da colu na de imunoafinidade de interferão anti-linfoblastóide como descrito no Exemplo 1. Usou-se TNF*=»< natural na for ma de um sobrenadante de células J774.1 estimuladas por lipopolisacarídeo (Nature, 1975, 257 , 393-394). Tam bém se usou ΤΝΡβ natural na forma de um sobrenadante pre parado de acordo com o processo seguinte:

Inocularam-se células RPHI 1788 (ATCC N.8 CCL 156) (6 x 10⁶ células/ml) em meio RP.aI 1640 livre de soro na presença de 2 ng/ml de acetato de miristato de forbol. Incubaram-se as células durante três horas a 37°c em dióxido de carbono a 5 %. Adicionou-se fito-hemaglutinina foi adicionada até uma concentração final de 5 )jg/ml e incubou-se a cultura durari te 48 horas. Removeram-se as células por centrifugação analisou-se o sobrenadante para a actividade de TNF(3 em células L929, e depois concentrou-se numa célula de filtração Amicon com uma membrana YM 10 (Amicon Ltd.).

ensaio de radiação de trítio realizou-se como a seguir:

As células visadas foram marcadas por cultura em modificação de Dulbeco do meio de Hagle suplementado com HEPES 25 mH, soro de vitelo fetal inactiva —3 — do pelo calor a 5 % e 5 juci/ml de metil-,/ H__/-timidina (2 Ci/mmol). Lavaram-se as monocamadas de células duas vezes em solução salina tamponizada com fosfato sem cálcio ou magnésio para remover o agente marcador em excesso, e em seguida retiraram-se das placas de plástico usando ácido etilenodiamina-tetraacético a C,C5 %. as células visadas marcadas foram dispersas em modificação de Dulbecco do meio de Tagle e distribuiram-se volumes de

200 jul (contendo cada volume IO⁴ células) em alvéolos de

0,3 ml de placas de microtitulação (Costar), e depois in cubaram-se num incubador humidificado a 37°c em dióxido de carbono a 5 % durante 18 horas. O meio foi aspirado e substituído por diluições de amostras (25o pl/alvéolo) em duas filas de réplicas que continham diluições em série loÇg idênticas. As placas foram então reincubadas durante 24 horas. Adicionou-se cicloheximida até urna cor centração final de 1 jug/ml e reincubaram-se as placas por mais 24 horas. Aspiraram-se volumes de 200 jul do sobre nadante dos alvéolos para o cintilador, cocktail W“, e ' contaram-se usando um contador cie cintilografia líquida.

Os resultados são apresentados graficamente na Figura 3,

B, Efeito da temperatura na actividade citotóxica de bLT, rTNF<* e rTNFfi

Incubaram-se amostras de (500 U/ /ml) de bLT purificada, obtida a partir da coluna Mono

Q de acordo com o processo do Exemplo 3, a várias temperaturas durante 30 minutos. Analisaram-se então usando a | linha de células LM e corante vermelho neutro como descrito no Exemplo 1.

Dum modo similar incubaram-se tam bém amostras de TNF<¥ recombinante (Genzyme Fine chemicals Ltd., Suffolk, England) e de TNFf> recombinante (NIBSC, South Mims, Potters Bar, Hertfordshire, England) num conjunto das mesmas temperaturas e analisaram-se do mesmo modo para dar uma base de comparação. Os resultados são apresentados no quadro abaixo:

Temperatura	% de Actividade Citotóxica Retida
	bLT	rTNF^	rTNF/3
20°C	100	100	100
42°C	100	ND	ND
56°C	100	ND	ND
65°C	100	ND	ND
75°c	81	9	63
8O°C	6,5	5	6

ND Νβο determinado

Os resultados para rTNFcx e rTNFfà foram obtidos a partir de uma experiência. Os resultados para bLT a 75°C e 80°C foram a média de três e duas experiências respectivamente. As outras temperaturas, os resultados para o bLT foram também obtidos a partir de uma experiência.

Os resultados a 75°c indicam uma diferença expressiva estatisticamente em estabilidade à temperatura entre bLT e rTNFcx e rTNFÇ>.

C. Efeito da Neuraminidase na Actividade Citotóxica de bLT c TNF0

Trataram-se a ostras de bLT, obtidas da coluna Mono-Q de acordo com o processo do .xemplc 3, com neuraminidase de vibrio cholerae (BDH Chemicals Ltd,, Poole, Dorset, ngland) como se segue:

Adicionaram-se 5 pl de neuramini·] dase (500 U/ml) a cada uma das amostras de 25 pl (2500

U/ml) juntamente com 5C yul de tampão de acetato de sódio 0,1 M a pH 5,1, e incubaram-se durante 60 minutos a 37°C.

Adicionaram-se 5 pl de ácido siálico (0,2 M) a cada amo^ tra para inactivar a enzima. Ajustou-se o volume a 0,3 ml com meio RPMI 1640 contendo soro fetal de vitelo a 1 % e depois analisou-se para a actividade usando a linha de células LM e corante vermelho neutro como descrito no

Exemplo 1. Como comparação para a especificidade da enzima, incubaram-se também amostras de neuraminidase, tam pão de acetato de sódio e ácido siálico 0,2 M antes da análise.

Os resultados indicam que a actividade citotóxica de bLT é completamente conservada a seguir ao tratamento com neuraminidase. Isto está em contraste com as observações publicadas com TNFP de células RPMI 1788 que indicam que a actividade citotóxica de TNFp se reduz 49 e 92 % por 0,2 e 0,4 unidades de neuraminidase (câncer Research, 1985, 45, 851-862).

D. Efeito da Quimotripsina na Actividade Citotóxica de bLT, rTNF<* e rTNFft

Incubaram-se amostras de bLT obtidas da coluna de Mono Q de acordo com o processo do Exemplo 3 e de TNFy recombinante e de TNF0 recombinante obtidas como indicado acima, com quimotripsina para ana lisar a susceptibilidade de cada proteína à digestão por essa enzima, o método usado foi o que se segue;

amostra las LM

Incubaram-se 300 F* de cada (500 U/ml) como analisado usando a linha de célu e corante vermelho neutro como descrito no Exemplo

1) com 6 unidades de quimotripsina (Tipo I-S; Sigma che micals Ltd., Poole, Dorset, England) durante 2 horas a 37°c. Depois deste tempo adicionou-se inibidor de tripsi na de Soja (sigma Chemicals Ltd.) a cada amostra para ini

- 25 bir a reacção. Analisaram-se então as amostras usando a linha de células LM e o corante vermelho neutro como des crito no Exemplo 1.

Os resultados mostram que a bLT e o rTNF^ não são minimamente afectados pela quimotripsina enquanto que a actividade citotóxica do rTNIW é reduzida abaixo dos níveis detectáveis. (0 limite de deteccção com o ensaio é 20 U/ml).

E. Efeito do Interferão de Linfoblastóide na Actividade Citotóxica de bLT e de TNFp.

Determinaram-se as actividades citotóxicas de bLT, obtida da coluna de imunoafinidade de in terferão anti-linfoblastóide de acordo com os processos de ambos os Exemplos 1 e 3, e de TNFp natural obtido de acordo com o processo descrito no Exemplo 6a, quer na ausência quer na presença de 0,1 a 10 000 U por alvéolo de interferão de limfoblastóide fwellferon)♦ Usou-se a linha de células L929 e a determinação foi por análise de radiação de trítio descrita no Exemplo 6A, Os resultados estão representados graficamente na Figura 4.

Não se observou qualquer inibição da actividade citotóxica de bLT enquanto que a actividade citotóxica de TNF(? foi inibida na presença de concentrações de interferão de limfoblastóide maiores que 10 U por alvéolo. 0 resultado com TNFP está de acordo com observações publicadas (billiams, Lymfoquine Research, 1984, 3, 113).

F. AeálAee de Gon^oúde......de-tefaT.......ne.....fííluonte de·· eelun-a.....page ae Aedividadoe de IntogleuqwAna-A.......e.......de.........

(i) Usando o efluente de imunoafinidade de interferão anti-linfoblastóide descrito no Exem pio 1, realizou-se uma análise para a actividade de inter-

leuquina-1 utilizando a análise de comitogénese de C^H/He ( Sur, J. Immunol. , 1986, 16, 37C-375). Não se detectou qualquer actividade.

(ii) Usando o efluente da coluna de ΡΒΞ 94 descrito no 'y^vnlo 1, realizou-se uma análise para a actividade de ^-interferão usando uma análise de imunorradiometria (sucrosep Kit, Boots-Celltech Diagnoíii tics Ltd,, England). Verificou-se que o nível de actividade era cerca de 1,5 unidades/ml.

Claims (4)

1. REIVINDICAÇÕES

   - 1« Processo para a preparação de uma citotoxina com um peso molecular aparente por filtração em gel de 47 - 5 KDa, um ponto isoeléctrico aparente de pelo menos 7,7 e a seguinte análise de ácidos aminados:

   Ác ido Número de Acido Número de Aminado Resíduos Aminado Resíduos ASX 36.0 - 4.3 Pro 24.5 «» 2.9 G1X 46.7 ± 5.6 Tyr 12.3 1.5 Ser 41.0 - 4.9 vai 22.7 + 2.7 Gly 38.4 Í 4.6 líet 8.4 «w l.C His 13.6 t 1.6 Ile 19.6 + 2.4 Arg 19.6 í 2.4 Leu 43.1 ± 5.2 Thr 21.4 1 2.6 Phe 23.8 X 2.9 Ala 33.2 ± 4.0 Lys 26.4 4· 3.2

   caracterizado por compreender as fases de incubação duma linha de células linfoblastóide num meio de cultura, indu ção da linha de células com um agente indutor e isolamento da citotoxina do meio de cultura.

   -
2. 2a Processo de acordo com a reivindi cação 1 caracterizado por a citotoxina ontida ter um grau de pureza superior a 90 % (p/p).

   ~
3. 3 ã Processo de acordo com a reivindi cação 2 caracterizado por a citotoxina obtida ter um grau de pureza superior a 95 % (p/p).
4. 4« Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3 caracterizado por o isolamento d«. citotoxina ser levado a efeito mediante a utilização duma coluna de imunoafinidade de um anticorpo de interferão anti-linfoblastóide para remoção do interferão linfoblastóide e duma coluna de cromatografia para eliminação das citç toxinas dotadas de um ponto isoeléctrico acídico.

   - 5fi Processo para a preparação de uma composição farmacêutica para uso em medicina humana ou veterinária com utilidade no tratamento de doenças neoplásticas, caracterizado por se incorporar como substância ac tiva uma citotoxina quando preparada de acordo com çtualque das reivindicações 1 a 4 em conjunto com uma substância veicular farmaceuticamente aceitável.

   — 6a processo de acordo com a reivindi cação 5 caracterizado por a composição farmacêutica ser adaptada para administração por injecção ou por infusão.

   - 7a Processo para a preparação de anticorpos monoclonais contra uma citotoxina preparada de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4 caracterizado por compreender as fases de imunização de um animal de la boratório com a referida citotoxina ou com um seu determinante imunogénico, de isolamento de células de baço do referido animal, fusão das referidas células com células de mieloma para produzir células de hibridoma e clonagem e cultura das células de hibridoma obtidas.

   29 A requerente declara que o primei ro pedido desta patente foi apresentado na Grã-Bretanha em 27 de Fevereiro de 1987, sob o N2. 8704646.