JPH0343077A

JPH0343077A - 酸性糖タンパク質

Info

Publication number: JPH0343077A
Application number: JP9036690A
Authority: JP
Inventors: Hideo Chiba; 千葉　英雄; Ryuzo Sasaki; 隆造佐々木; Masaji Ueda; 正次上田
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1990-02-17
Filing date: 1990-02-17
Publication date: 1991-02-25
Anticipated expiration: 2011-07-31
Also published as: JP2519561B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（発明の利用分野）本発明は、エリスロポエチンで免疫した動物の脾臓細胞
とミエローマ細胞とを細胞融合させたハイブリドーマ細
胞、及び、同細胞より得られたモノクローナル抗体、及
び、同抗体を結合させてなる吸着剤、及び、同抗体に結
合可能な特定の酸性糖タンパク質に関する。

エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、貧血患者、手術後患者
、腎摘出後の人工透析患者に広く適用可能な医薬である
。本発明にかかる前記ハイブリドーマ細胞等は、ＥＰＯ
を純粋に取得するのに好適に使用される。

（従来技術と問題点）工＋ｊスロポエチンは、赤血球生成促進因子とも呼ばれ
、骨髄に存在する赤血球系幹細胞に働いて、赤血球系細
胞への分化を促進させる一種のホルモンであり、主とし
て腎で生成されると考えられている。ＥＰＯ生成を調節
するのは、酸素需要供給のバランスであり、酸素欠乏状
態に陥ると生成が冗進し、逆に、酸素過剰状態になると
生成が減少する。例えば、貧血患者では、ＥＰＯ生戊が
増加し、ＥＰＯが尿に排泄されるようになる。ＥＰＯは
市販されており、分子量３〜４万の酸性糖タンパク質で
あるが、化学構造は完全には解明されていない。

尿中にＥＰＯが含まれていることは前記のとおりである
が、その含量は極めて低く、全尿タンパク質中約０．０
１〜０．０２重量％程度とみられる。

このため、尿からＥＰｐを有効に得ることは困難であり
、通常のクロマト吸着法では、ＥＰＯを高純度で効率よ
く採取することはできない。

（発明の知見と目的）本発明者らは、免疫抗体を結合させた吸着カラム（抗体
吸着カラム）を使用して、貧血患者の尿等から免疫特異
的にＥＰＯを製造する方法について検討を行ってきた。

カラムに使用する抗体を得るべく、精製ＥＰＯで免疫し
たマウスの牌ＳａＩ胞とマウスミエローマ細胞とを融合
させ、モノクローナル抗ＥＰＯ抗体を産生ずるハイブリ
ドーマ細胞を得た。このハイブリドーマ細胞が産生した
抗ＥＰＯ抗体を結合させて抗体吸着カラムを作威し、こ
れに貧血患者の尿タンパク質を通したところ、目的のＥ
ＰＯが特異的に吸着され、牧率よく高純度ＥＰＯを取得
できた。そして、かかるモノクローナル抗体がハイブリ
ドーマ細胞から安定的に得られることを知見した。

本発明は、この知見に基づき完成されたもので、本発明
の目的は、エリスロポエチンで免疫した動物の牌臓細胞
とミエローマ細胞とを細胞融合させたハイブリドーマ細
胞、及び、同細胞より得られたモノクローナル抗体、及
び、同抗体を結合させてなる吸着剤、及び、同抗体に結
合可能な特定の酸性糖タンパク質を提供しようとするも
のである。

（発明の構成と効果）本発明は下記のとおりである。

（１）エリスロポエチンで免疫した動物のｓｍ細胞とミ
エローマ細胞とを細胞融合させたハイブリドーマ細胞。

（２）特許請求の範囲（１）のハイブリドーマ細胞より
得られたモノクローナル抗体。

（３）特許請求の範囲（２）のモノクローナル抗体を結
合させてなる吸着剤。

（４）特許請求の範囲（２）のモノクローナル抗体に結
合可能であり、少なくとも約４５．０００単位／ｍｇタ
ンパク質以上のエリスロポエチン比活性を有する、分子
量約３０．ＱＯＯ〜４０．０００の酸性糖タンパク質。

特許請求の範囲（１）のハイブリドーマ細胞は、次の事
項により特定される。

■　親細胞マウスミエローマは細胞株Ｐ３−ＮＳＩ／１
−Ａｇ４−１である。

■　免疫原ＥＰＯはＳＤＳ電気泳動により調製をしたＥ
ＰＯである。

■　ＩｇＧ抗体を生産する。

また、特許請求の範囲（２）のモノクローナル抗体は、
次の事項により特定される。

■　抗体のクラスはＩｇＧである。

■　抗体の反応性は次のとおりである。

（イ）天然ＥＰＯとは、ゆるやかな結合性を示す。

（ロ）１）ＳＤＳ処理ＥＰＯに対して強い親和力を有す
る。

２）　Ｓ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅ法で３５．０００
〜２５，０００に分離し、Ｇ１００ゲルロ過で８０，０
００〜１２０．０００の分子量の位置に溶出し、ＥＰＯ
活性をほとんと示さないものとも結合する。

特許請求の範囲（３）記載の　　　　　　　　　吸着剤
としては、アフイーゲル１０（バイオランド社製）やシ
アノジエンブロマイド活性化セファロース４Ｂ、トシル
化活性化セファロース４Ｂ（いずれもファルマシア社製
）などの市販の担体と、本発明の抗体が結合することに
よりＥＰＯ吸着能を付与された吸着剤を挙げることがで
きる。

さらに、特許請求の範囲（４）記載の酸性糖タンパク質
は以下の特徴により特定することが可能である。

■　５ＤＳ−ＰＡＧＥ法で分子量３０．０００〜４０．
０００を示す。

■　クーマシーブリリアントプルーバインディングアッ
セイで卵アルブミンを標準タンパク質とした場合、ＥＣ
，＝　１３．１を示す。

■　セファデクスＧ１００　（ファルマシア社製）によ
るゲル口過で分子ｆｆ１４５，０００〜６５，０００を
示す。

本発明にかかる特許請求の範囲（１）〜（３）のものを
使用する方法によると、高純度のＥＰＯを効率よく製造
することができる。かかる方法として、例えば、下記の
製造方法を挙げることができる。

ＥＰＯで免疫した実験動物の脾臓細胞とミエローマ細胞
とを細胞融合させたハイブリドーマ細胞より得られたモ
ノクローナル抗ＥＰＯ抗体を結合してなる吸着剤に、Ｅ
ＰＯ含有物を接触させてＥＰＯを吸着させ、次いで、溶
出して吸着分としてＥＰＯを取得する高純度ＥＰＯの製
造方法。

この方法は、ＥＰＯを特異的に吸着させ、これを吸着分
として取得するアフィニティクロマト法である。これに
よれば、使用吸着支持体に結合させた抗体がモノクロー
ナル抗体であるから、抗体に同一の性質を持たせること
ができ、また、モノクローナル抗体が、選出樹立された
ハイブリドーマ細胞により産生されるため抗体を安定的
に人手することができ、さらに、ＥＰＯを免疫特異的に
吸着し、溶出するため貧血患者圧等から高純度のＥＰＯ
を効率よく製造することができる。

この方法では、モノクローナル抗体の結合した吸着剤が
使用される。そして、このモノクローナル抗体は、ハイ
ブリドーマ細胞より産生される。

モノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞は、
ＥＰＯｌ例えば、貧血患者圧より精製したＥＰＯで免疫
した実験動物の牌Ｉ！ｉａ細胞と、ミエローマ（骨髄腫
）細胞とを細胞融合して作られる。

この場合の実験動物は、例えば、マウスやラット等であ
り、細胞融合は、同種の動物の細胞間で行わせるのが好
ましい。例えば、マウスの脾臓細胞とマウスのミエロー
マ細胞との間で、細胞融合させる。°ミエローマ細胞は
、悪性腫瘍細胞の一種であって、増殖性に冨む細胞であ
る。

マウスに対する免疫（抗原抗体反応）は、ＥＰＯ、例え
ば、貧血患者の尿より精製したＥＰＯ標品を抗原として
使用し、これをマウスに投与して行う。ここで抗原とし
て使用されるＥＰＯ標品は次のようにして得られたもの
であってもよい。すなわち、後記実施例で示す士峯仝；
未発母方法の前半部分に準じてハイブリドーマ細胞を作
威し、それから得られた抗体を結合してなる吸着カラム
に貧血患者圧を通して逆相クロマトに付し未吸着両分と
してＥＰＯを得る。

マウスへの抗原投与は、通常腹腔的注射により行われ、
免疫を充分に進めるため、例えば２週間の間隔をあけて
、数回注射をする。注射液は、前記の精製ＥＰ○タンパ
ク貿を例えばＰＢＳと呼ばれる燐酸塩緩衝食塩水に溶解
し、これにフロイントのアジュバントを混合して、エマ
ルジョンを形成させて調製する。

このようにして免疫したマウスから、免疫処理終了後、
約３日後に、脾臓を摘出し、この牌１ｉＨＢＩ胞（主に
Ｂ細胞）と、別に調製したマウスのミエローマ細胞との
間で細胞融合を行わせる。マウスのミエローマ細胞とし
ては、Ｐ３　　Ｘ６３　　Ａｇ８、Ｐ。

ＮＳ　Ｉ／ｌ−＾ｇ４−１、Ｘ６３−４ｇ８６５３など
を培養して増殖させたものを使用する。

細胞融合は、公知の技法に従って行われる。通常、ペニ
シリン（１００単位／雌）及びストレプトマイシン（１
００μｇ／ｄ）、さらに、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピ
ルビン酸を添加したＲＰＭＩ　１６４０合戊培養液（以
下ＲＰＭＩ　　１６４０液と記す）と牛胎児血清（Ｆｅ
２）との混合液中で前記脾臓組織を細断し、単細胞化し
て充分細胞を分散した後、ＲＰＭｌ　　１６４０液に分
散し、これに前記ミエローマ細胞を混合し、遠心後、上
清を除去した混合細胞に対し、細胞融合剤のポリエチレ
ングリコール１５００の５０％溶液を添加して、細胞融
合させる。

かくして作られた融合細胞の中から雑種の、いわゆるハ
イブリドーマ細胞を公知のＨＡＴ選択によって選び出す
。

ＨＡＴ選択は、マイクロタイタープレートを使用して行
うことができる。例えば、同種及び雑種の融合細胞を９
６穴マイクロタイタープレート上にまいて、ＨＡＴ　（
ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）培養液で
培養を行い、約２週間後、ハイブリドーマが死滅しない
で増殖している穴を確認し、ハイブリドーマを得る。

次に、かくして選ばれたハイブリドーマについて、ＥＰ
Ｏと特異的に結合する抗体を産生ずるか否かをソリッド
フェーズ法にて検定したのち、さらに、本ハイブリドー
マをマウス腹腔内に移植して腹水を発生させ、腹水から
公知の方法、例えば、硫安分画法により、タンパク質を
得る。このものは、主として免疫グロブリン（ＩｇＧ）
である。

この抗体を吸着剤に結合させ、得られた抗体結合吸着剤
をカラムに充填し、抗体吸着カラムを作威し、このカラ
ムに、ＥＰＯ標品を通し、ＥＰＯの吸着能を調べ、ハイ
ブリドーマが抗ＥＰＯ抗体を産生ずるか否かを検定する
。この目的に使用される吸着剤としては、例えばアフィ
ゲル（バイオランド社製）、セファデックス（ファルマ
シア社製）がある。このようにして得られた抗ＥＰＯ抗
体産生ハイブリドーマは、さらに、公知の限界希釈法に
よりモノクローン化を行う。抗ＥＰＯ抗体の産生能は、
前記のソリッドフェーズ法及び抗体吸着カラムへのＥＰ
Ｏの吸着能で検定を行う。この中から、安定して、モノ
クローナル抗体を産生ずる細胞を選出する。細胞は、凍
結保存が可能であるので、必要に応じて融解し１．マウ
スの腹腔内に移植すれば、必要な抗体を永続的に供給す
ることができる。

以上のようにして選出した、モノクローナル抗ＥＰＯ抗
体産生ハイブリドーマ細胞により、前記と同様にしてマ
ウス腹腔内で生産させたモノクローナル抗ＥＰＯ抗体を
精製後、吸着支持体に結合し、抗体結合吸着剤を作成す
る。これを原料のＥＰＯ含有物、好ましくは貧血患者の
尿又はその処理物と接触させ、ＥＰＯを吸着させ、次い
で、溶出し、吸着画分としてＢＰＯを取得する。

この方法における原料であるＥＰＯ含有物としては、正
常人尿若しくは貧血患者尿又はその各処理物、或は、Ｅ
ＰＯ産生細胞の培養土清液又はＥＰＯ産生細胞移植動物
の体液、組織抽出液若しく口は尿などが挙げられる。例えば、貧血患者尿をＸ過、Ｉ
縮、脱塩して得た全尿タンパク質又はその含有液が使用
される。尿中のプロテアーゼを失活させるため予めフェ
ノール処理又は加熱処理を行ってもよい。また、好まし
くはＳＤＳ処理を行う。

この方法において、ＥＰＯはアフィニティクロマト法の
通常の技法により取得することができる。

吸着カラムを使用する場合には、前記の尿処理液をカラ
ムに通し、ＥＰＯを吸着し、溶出液としてＢＰＯを取得
する。

使用した吸着カラムは再生させて再使用することができ
る。再生は、例えば、酢酸と食塩水との混合液を通すこ
とにより行われる。

以上のごとき、抗体吸着法では、モノクローナル抗ＥＰ
Ｏ抗体がＥＰＯを特異的に吸着する結果、カラムを１回
通すだけで、溶出液としてＥＰＯを特異的に高純度で効
率よく取得することができる。

ＥＰＯの純度は、液中のタンパク質のＥＰＯ活性（単位
）を測定することにより決めることができる。ＥＰＯの
活性の測定法としては、マウス胎児肝細胞を用い、赤血
球系コロニーを形態学的に観察するコロニー法、３Ｈ−
チ【ジンのＤＮＡへの取り込み率を調べる３Ｈ−チミジ
ン法、５９ｐｅのヘムへの取り込み率を調べる５Ｗｐｅ
法等が知られている。

本発明の後記実施例で示すＥＰＯ活性は、Ｓ　Ｑ　Ｆｅ
法又は３Ｈ−チミジン法で測定されたものである。

ＥＰＯ測定の標準物質としては、フェニルヒドラジン処
理した貧血ヒツジの血清から調製されたＥＰＯ（カナダ
、コンノート社製エリスロポエチン　ステップ３）を用
いることができる。

抗ＥＰＯ抗体生産ハイブリドーマを培養することにより
得られる抗ＥＰＯモノクロナール抗体は、固定化担体に
結合させ、ＥＰＯ吸着剤を作製する。

固定化担体としては、−船釣な抗体の結合性を有するも
のであればどのようなものでも使用できる。

抗体を結合させるための担体としては、アフィゲルｌＯ
、アフィゲル１５（バイオラッド社製）、シアノジエン
ブロマイド化活性セファロース４Ｂ、トシル化活性セフ
ァロース４Ｂ（いずれもファルマシア社製）などを挙げ
ることができる。これらの抗体結合性担体と抗ＥＰＯ抗
体は、スペーサーを介して結合し、抗体吸着能を持つ吸
着剤として、ＥＰＯの精製や回収に使用が可能である。

このようにして得られた精製ＥＰＯは、５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ法で単一のバンドを示し、比活性は４５．０００１　
Ｕ以上を示す。このものは、極めて高純度のＥＰＯであ
り、分子量として約３４，０００であり、構成糖として
シアル酸を含有している酸性多糖である。

次に、本発明を実施例によって説明する。

実施例１〔抗原タンパク質（ＥＰＯ）の調製〕貧血患者の尿６００１を限外′淋過装置に通し、分子量
ｉｏ、ｏｏｏまでの低分子物質を除去することにより濃
縮を行い、さらに、水を加えて同様に濃縮することによ
り脱塩を行った。得られた尿濃縮液２０１、を凍結乾燥
して全尿タンパク質粉末３１．０ｇ　（ＥＰＯ活性１，
８００．０００単位／３１．０ｇ）を得た。（なお、タ
ンパク量は　　　　　　　　　バ」イオラッド社製プロティンアッセイキットにより測定し
た。）（第１回クロマト）この粉末を５ＩＩＩＭトリスーＨＣｌ　（ｐ１４６．８
　）緩衝液に？容解し、予め５ＩＩＭトリスーＨＣｌ　
（ｐＨ６，８）緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セルロー
ス充填カラムに通して、尿タンパク質を吸着させた後、
２００ｍＭのＮａＣｌを含む５ｍＭ）リス−１（Ｃｊ！
　（ｐＨ６，８）緩衝液で溶出し、ＥＰＯ活性画分を得
た。このものに含まれるタンパク質は、１６．０　ｇで
あり、ＥＰＯ比活性は、９９単位／ｍｇクンバク質であ
った。

（第２回クロマト）得られた前記ＥＰＯ活性画分を水に対し透析し、透析物
を凍結乾燥して粉末を得た。この粉末を、１０ｎ＋Ｍ燐
酸ナトリウム（ｐＨ６，８）と４ＭのＮａＣ１からなる
緩衝液に溶解し、予め１０ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ６
，８）と４ＭのＮａＣｌからなる緩衝液で平衡化したフ
ェニルセファロースＣＬ−４Ｂ充填カラムに通してタン
パク質を吸着させた後、１０ＩＩＩＭ燐酸ナトリウム（
ｐＨ７，１）と０．５　ＭのＮａＣ１２からなる緩衝液
で洗浄し、次いで、１０ｍＭのＮａＯＨ。

２０％エチレングリコール及び６Ｍ塩酸グアニジンから
なる混合液で溶出し、ＥＰＯ活性画分を得た。このもの
に含まれるタンパク質は２．３ｇであり、ＥＰＯ比活性
は４２１単位／ｍｇタンパク質であった。

（第３回クロマト）得られた前記ＥＰＯ活性画分を水に対して透析し、透析
物を凍結乾燥させて、粉末を得た。このものを５ｍＭ燐
酸ナトリウム（ｐＨ６，９）緩衝液に溶解し、同じ緩衝
液に対し透析した。予め５ｇＭ燐酸ナトリウム（ｐｌ（
６，９）緩衝液で平衡化したヒドロキシルアパタイト充
填カラムに前記透析溶液を通し、非吸着画分を得た。こ
のものに含まれるタンパク質は６７２■でありＥＰＯ比
活性は１．２４０単位／ｍｇタンパク質であった。

（第４回クロマト）得られた前記ＥＰＯ活性画分（非吸着画分）を水に対し
透析し、透析物を凍結乾燥して粉末を得た。このものを
、１０ｍＭｆｉ酸ナトリウム（ｐＨ６，９）と１５０ｍ
ＭのＮａＣｌからなる緩衝液に溶解した。

予め前記と同じ緩衝液で平衡化したセファデックスＧ１
００充填カラムに、前記溶液を通し、分子量による分画
を行い、ＥＰ○活性画分を得た。このものに含まれるタ
ンパク質は８３■であり、ＥＰＯ比活性は３．　ＯＯＯ
単位／ｍｇタンパク質であっ（第５回クロマト）前記ＥＰＯ活性画分を水に対して透析後、透析物を凍結
乾燥して粉末を得た。このものを、５ｇＭのＣａＣｆ　
ｔ　（ｐＨ７，０）水溶液に溶解した後、同じ水溶液に
対し透析し、次いで、０．　Ｉ　ＮのＨＣｌでｐＨ４，
５に調整した。予め５ｍＭのＣａＣｊｌ！　ｔ　（ｐ）
１４．５　）水溶液で平衡化したＳＰ−セファデックス
充填カラムに、前記調整後の液を通し、吸着後、５ｍＭ
酢酸カルシウム（ｐｌ＋４．５　）　Ｍ樹液で洗浄し、
次いで、２０−酢酸カルシウム（ｐｔ１５．５）緩衝液
で溶出し、ＥＰＯ活性画分を得た。このものに含まれる
タンパク量は１６ｍｇであり、ＥＰＯ比活性は５．１０
０単位／ｍｇタンパク質であった。

（第６回クロマト）前記ＥＰＯ活性画分を、予めＰＢＳで平衡化したセファ
デックスＧ５．０充填カラムに通した後、前記の緩衝液
で溶出してＥＰＯ活性画分を得た。

この液を後記の抗体結合吸着カラムに通して、逆相クロ
マトに付し未吸着画分を得た。このものに含まれるタン
パク質は４　ｍｇであり、ＥＰＯ比活性は２５，０００
単位／ｍｇタンパク質であった。

前記カラムは次のようにして作った。すなわち、ドーマ
細胞を作成し、これより得られる抗体のうちから、ＳＤ
Ｓ電気泳動を行ったときＥＰＯ活性に近接して低分子側
に見出される免疫力の高い主要タンパク質と結合すると
ころの抗体を選び出し、この抗体をアフィゲル−１０（
バイオランド社製）に結合させて抗体結合吸着カラムを
作った。

（ＳＤＳ電気泳動によるＥＰＯの精製）得られたＥＰＯ
活性画分（未吸着画分）を水に対し透析し、透析物を凍
結乾燥して粉末を得た。

このものを２％ＳＤ、Ｓを含むトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ６，８）に溶解し、常法により１３％ポリアクリルア
ミドゲルＳＤＳ電気泳動を行い、ＥＰＯ活性画分のゲル
を切り出した。ゲルに対し、３倍量のＰＢＳを添加し、
ゲルを磨細し、タンパク質を抽出した。抽出液中のタン
パク質は１．２　ｍｇであり、ＥＰＯ比活性は５０．０
００単位／ｍｇタンパク質であった。抽出液を水に対し
透析後凍結乾燥して粉末を得た。

〔マウスの免疫〕

前記のＳＤＳ電気泳動精製ＥＰＯ標品を抗原として使用
し、マウス（ＢＡＬＢ／Ｃマウス）に対し、次のとおり
３回の免疫を行った。

（第１回）ＰＢＳ　（リン酸塩緩衝食塩水）中に精製Ｅ
ＰＯタンパク質を２００ｕｇ／成で溶解し、これにフロイント完全アジク質５０μｇ）を腹腔内注射で投与した。

（第２回）ＰＢＳ中に精製ＥＰＯタンパク質１００μｇ
／ｄ、で熔解し、これにフロイント０．５ａｌｌ！（Ｅ
ＰＯタンパク質２５μｇ）を腹腔内注射で投与した。

間抜にマウスに対し、０．５ａｄ！（ＥＰＯタンパク賞
２５μｇ）を腹腔内注射で投与した。

〔細胞融合〕

前記免疫処理終了から３日後に、免疫マウスの牌臓細胞
を無菌的に摘出し、合成培養液ＲＰＭ１１６４０液と１
５％牛脂児血清（Ｆｅ２）との混合液で洗浄後、該混合
液中で、牌臓組織をハサξで細断して単細胞化を行い、
該混合液で２回洗浄した後、単細胞化した細胞をＲＰ　
Ｍ　Ｉ　　１６４０液に分散した。細胞数は、２．０Ｘ
１０”個であった。

別に、マウスのミエローマ細胞（Ｐ、−ＮＳ　ｌ／１−
Ａｇ４−１）を前記ＲＰＭＩ及びＦｅ２の混合液中で培
養し、増殖した細胞とＲＰ　Ｍ　Ｉ　　１６４０液で洗
浄した。細胞数は１．０Ｘ１０”個であった。

次に、前記で調製した免疫マウス牌臓細胞とマウスミエ
ローマ細胞とを、ＲＰＭＩ　　１６４０１に分散し、混
合した後、遠心し、上清を除去した。

混合細胞を、ポリエチレングリコール１５００の５０％
溶液中で、細胞融合させた後、融合細胞群をＨＴ培養液
（ヒポキサンチンとチミジン及び１５％牛脂児血清を含
むＲＰＭＩ　　１６４０液）に混合し、混合液を３枚の
９６穴マイクロタイタープレートにまいて、２日目以降
、ｔ（ＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チ
ごジン及び１５％牛脂児血清を含むＲＰＭＩ　　１６４
０液）を添加して、各穴で２週間培養してＨＡＴ選択を
行った。増殖したハイブリドーマ細胞を２６４穴におい
て確認した。

〔抗体産生細胞の選択〕

前記で得た２６４種類のハイブリドーマより、特定の細
胞、すなわち、精製ＥＰＯ標品と特異的に結合しうる抗
体を産生ずるハイブリドーマを選び出すために、ビオチ
ン−アビジンシステムを用いるソリッドフェーズ法によ
り、スクリーニングを行った。その結果、目的に適合し
たものとして、１９種類の細胞が選出され、そのうち７
種類が安定的に抗体産生を行うことを認めた。

（ＥＰＯ吸着能による抗ＥＰＯ抗体産生細胞の選択〕前記７種類の各細胞を用いて抗体吸着カラムを作成し、
ＥＰＯ活性の吸着能を検定し、抗ＥＰＯ抗体産生細胞の
選択を行った。

すなわち、それぞれの細胞について、７匹のマウスに対
し、１つの種類の細胞をマウス１匹当り５Ｘ１０６個腹
腔内に注射して抗体を産生させた後、マウスから腹水を
採取し、これを４５％飽和硫安水溶液で硫安分画に付し
、それぞれの種類の細胞について抗体として１８６画分
を４０〜６０■得た。前記で得られた１８６画分をアフ
ィゲル１０（バイオランド社製）と結合し、抗体吸着カ
ラムを作成した。すなわち、アフィゲル１０をガラスフ
ィルター上で氷水冷却下イソプロパツールで洗浄し、さ
らに、氷水で３回洗浄しゲルを回収した。このゲルと、
前記で得た抗体を含む液（０，２ＭのＮａＨＣＯｉ　　
ｐｌ＋　８．３　０．３　ＭのＮａＣｆ）とを等容量で
混合し、４°Ｃで５時間撹拌しながら、結合反応を行わ
せた。反応後、ゲルを遠心回収した。このものを、０．
１　ＭのＮａＨＣＯ，と０．１５　ＭのＮａＣｌとの混
合液で２回洗浄後、０．１Ｍエタノールアミン−塩酸塩
（ｐＨ８）と室温で６０分間よく混合して抗体結合ゲル
を得た。このゲルをカラムに充填して、抗体吸着カラム
を作成した（７種類のハイブリドーマにつき、各１本、
合計７本）。ここで得た７本の抗体吸着カラムに対して
、前記精製ＥＰ○標品を用いＥＰＯ活性吸着能を検定し
た。

すなわち、ＥＰＯ標品をＰＢＳに溶解し、この液を、予
めＰＢＳで平衡化した前記吸着カラムに通した。溶出は
、０．２Ｍ酢酸と０．１５　ＭのＮａＣ１との混合液で
行い、未吸着画分及び溶出画分のＥＰ○活性を測定した
。ここで得た７種のカラムのうち３種類についてＥＰＯ
活性の吸着を認めた。

〔抗ＥＰＯ抗体産生細胞のクローニング〕前記３種類の
抗ＥＰＯ抗体産生ハイブリドーマについて、常法に従い
、限界希釈法により、クロニングを行った。

すなわち、ハイブリドーマ細胞５０個と、４週令Ｂ　Ａ
　Ｌ　Ｂ／Ｃマウスの胸腺より常法により調製した胸腺
細胞１０８個をＲＰＭｉ　　１６４０液と１５％ＦＣ３
との混合液１０−に分散し、９６穴マイクロタイタープ
レートの各穴に０．　ｌ　ｄずつまき、５日目及び１２
２日目ＲＰＭＩ　　１６４０液と１５％ＦＣ３の混合液
（培養液）を添加し増殖したハイブリドーマ細胞につい
て、前記と同様にしてソリッドフェーズ法による抗ＥＰ
Ｏ抗体産生細胞のスクリーニングを行い、さらに、ＥＰ
Ｏ吸着能による抗ＥＰ○抗体産生細胞の選択を行いクロ
ーニングを行った。このようにして、前記３種類の抗Ｅ
ＰＯ抗体産生ハイブリドーマよりそれぞれ細胞株Ｅ−１
、Ｅ−２）Ｅ−３を樹立した。

〔モノクローナル抗ＥＰＯ抗体の産生］前記のクローニ
ングにより得た、抗ＥＰ○抗体産生細胞株（Ｅ−１、Ｅ
−２）Ｅ−３）を用いて、抗体産生を行った。すなわち
、前記と同様に、マウスの腹腔内で抗体産生をさせ、４
５％硫安分画により１８６画分を得た。各細胞株につい
てマウス２０匹を用い、５００■のモノクローナル抗体
を得た。

〔抗体吸着カラムの作成］前記と同様の操作でＩｇＧとアフィゲル１０との結合を
行わせ各モノクローナル抗体について５０ｄの抗体結合
ゲルを得た。

このゲルをカラムに充填し、吸着カラムを作成した。

（ＥＰ○の取得〕原料液を調製するため本実施例の抗原タンパク質の調製
の冒頭で記載した限外啓過装置を用いて調製した全尿タ
ンパク粉末５０■（２，９００単位）をＰ　Ｂ　Ｓ　Ｌ
　ＯｍＮに溶解し、外液４０ｆｆｉのＰＢＳに対し、１
夜透析を行い、遠心後、上清液を得、原料液１０−を得
た。

前記で作成した抗体吸着カラム（０，３ｃｍ　Ｘ　４　
（１床容Ｎ２成、Ｅ−１）にＰＢ３２０戚を２０−／ｈ
ｒで流し平衡化し、次いで０．２　Ｍ酢酸と０．１５　
ＭのＮａＣｌとの混合液５０ｍ１を同じ流速で流し、洗
浄した後、さらに、ＰＢ３２０ｄを同様に流し平衡化し
た。

このように前処理した吸着カラムに、前記で調製した原
料液１０ｍ１を５ｍＱ／ｈｒの流速で通した。

次にＰＢＳ２０ｍ１．．０．５ＭのＮａＣｌを含む１０
ｍＭリン酸緩衝液２０ｍ１！、０．１５　Ｍ（７）Ｎａ
（ｆ！　２０　ｍＯ）順に２０１１１１／ｈｒでカラム
を洗浄した後、０．２　Ｍ酢酸と０．１５　ＭのＮａＣ
ｊ！との混合液２０ＩＩ１．を５成／ｈｒの流速で流し
、溶出液として高純度のＥＰＯを含む液を得た。

本液中のＥＰＯ活性は１．１６０単位であった。

これを原料液のそれの２．９００単位に対比すると、回
収率は４０％であった。また、本液中のＥＰＯ比活性は
４５，０００単位／ｍｇタンパク質であり、原料液のそ
れの５８単位／ｍｇタンパク賞と対比すると、ＥＰＯ純
度は、７８０倍向上したことがわかる。

実施例２実施例１で作成した抗体、結合ゲルを充填した抗体吸着
カラム（０，８ａｍ　Ｘ　４　ｃｖａ床容ｌ２ＩＩＪ１
、Ｅ−２）を用いて次のとおり操作を行った。原料を調
製するため実施例１と同様に、限外濾過装置を用いて調
製した全尿タンパク質粉末５０■（２，９００単位）を
２％ＳＤＳを含むＰＢＳｌｏＩｄに溶解し、ｉｏ。

０３分間加熱処理後外液１０１のＰＢＳに対し、１夜透
析を行い、遠心後、上清液１０−を得た。

本溶液をＰＢＳで５倍希釈した後、実施例１と同様にし
て前処理を行った前記抗体吸着カラムに対し、５ｍｌ／
ｈｒの流速で通した。次に、ＰＢ３２０−１０．５Ｍの
ＮａＣ１を含む１０ｍＭリン酸緩衝液２０−１０．１５
　ＭのＮａＣ／！２０Ｉｌ！１！の順に２０ｓｊ！／ｈ
ｒでカラムを洗浄した後、０．２Ｍ酢酸と０．１５　Ｍ
のＮａＣ１２との混合液２０ｄを５ｍｌ／ｈｒで流し、
溶出液として高純度のＥＰＯを含む液を得た。本液中の
ＥＰＯ活性は２．６００単位であった。これを原料液の
それの２，９００単位に対比すると回収率９０％であっ
た。また本液中のＥＰＯ比活性は、６０．０００単位／
ｍｇタンパク質であり、原料液のそれの５８単位／ｍｇ
タンパク質と対比すると、ＥＰＯ純度は、約１　、００
０倍向上したことがわかる。

実施例３実施例１で作成した抗体結合ゲルを充填した抗体吸着カ
ラム（２ｃｍ　Ｘ　６．４　ｃｔｘ、床容量２Ｏ−１Ｅ
−３）を作成し、実施例１と同様にして、前処理を行い
、使用した。原料液は、実施例２と同様に、全尿タンパ
ク質粉５００■（２９，０００単位）を２％ＳＤＳを含
むＰＢＳ５０ｄに溶解し、１０００３分間加熱処理した
後、外液４０２に対し、１夜透析を行い、遠心後、上清
液５０１１１！を得、ＰＢＳで５倍希釈した０本原料液
を前記前処理ずみ抗体吸着カラムに対し、２０−／ｈｒ
の流速で通した。次いで、ＰＢ３２００ｍ、０．５　Ｍ
のＮａＣＩ！を含む１０ｍＭリン酸緩衝液２００ｍ、０
．１５　ＭのＮａＣｌ　２００−の順に、１００　ａｆ
／ｈｒでカラムを洗浄゛した後、０．２Ｍ酢酸と０．１
５　ＭのＮａＣｌとの混合液２００ｍｆｌを２０ｍ／ｈ
ｒで流し、溶出液として高純度のＥＰＯを含む液を得た
。

本液中のＥＰＯ活性は、２５．０００単位であった。

これを原料液のそれの２９．０００単位に対比すると、
回収率８６％であった。また本液中のＥＰＯ比活性は、
６０．０００単位／ｍｇタンパク質であり、原料液のそ
れの５８単位／ｍｇタンパク質と対比すると、ＥＰ○純
度は、約１　、０００倍向上したことがわかる。

（ＥＰＯのＨＰＬＣ）上述の工程で得られた精製ＥＰＯを２８０ｎｍの吸光度
で測定し２４■／Ｉｄｌの濃度の溶液を２４０μｌ、逆
相ＨＰＬＣに注入し、クロマトパターンを求めた。使用
したカラムは、Ｃ４カラム（０，４６Ｘ２５ＣＩＩ、バ
イダック社製）である。これを展開相としてアセトニト
リル及び水（０，１重量％ＴＦＡ含有）を使用し溶出し
た。２８０ｎｍの吸収をモニターした。得られたパター
ンを調べたところ、はぼタンパク質として純粋なＥＰＯ
が得られたことが確認できた。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）エリスロポエチンで免疫した動物の脾臓細胞とミ
エローマ細胞とを細胞融合させたハイブリドーマ細胞。
（２）特許請求の範囲（１）のハイブリドーマ細胞より
得られたモノクローナル抗体。
（３）特許請求の範囲（２）のモノクローナル抗体を結
合させてなる吸着剤。
（４）特許請求の範囲（２）のモノクローナル抗体に結
合可能であり、少なくとも約４５，０００単位／ｍｇタ
ンパク質以上のエリスロポエチン比活性を有する、分子
量約３０，０００〜４０，０００の酸性糖タンパク質。