FI81497B - Antikroppar mot biologiskt aktiva polypeptider och deras anvaendning vid diagnostiska foerfaranden. - Google Patents

Description

1 81497

Biologisesti aktiivisten polypeptidien vasta-aineita ja niiden käyttö diagnostisissa menetelmissä

Jakamalla erotettu hakemuksesta 841 649 5

Keksintö perustuu biologisesti aktiivisiin poly-peptideihin ja niiden tuottamiseen luonnossa esiintyvistä tai synteettisistä lähteistä ja näistä polypeptideistä johdettuihin oligopeptideihin. Erityisesti tämä keksintö 10 perustuu yleiseen polypeptidirakenteeseen, joka määrittelee proteiineja, joilla on solukasvua edistävä aktiivisuus, sekä uusiin muuntokasvutekijä-(TGF)-polypeptideihin, joilla on ominaisuus palautuvasti antaa muunnettu fenotyyppi normaalisoluille in vitro ja jotka siten näyttävät 15 olevan pahanlaatuisen fenotyypin välittömiä efektoreita, sekä erityisesti antigeenisiin oligopeptideihin, jotka on j ohdettu TGF-polypeptideistä.

Tämän keksinnön kohteena ovat vasta-aineet, joita muodostuu edellä mainituille antigeenisille oligopepti-20 deille sekä näihin liittyville TGF-polypeptideille ja jotka ovat hyödyllisiä pahanlaatuisuuksien havaitsemisessa. Muita tämän keksinnön erityisiä kohteita ovat menetelmät syövän ja muiden proliferatiivisten tautien havaitsemiseksi sekä luukatoon liittyvien sairauksien, kuten osteopo-25 roosin ja hyperkalsemian toteamiseksi.

Joukko polypeptidihormoni- ja hormoninkaltaisia kasvutekijöitä on löydetty kudosnesteistä ja niiden yhteys normaalin solukasvun tai mitoosin säätelyyn on vahvistettu. Nämä mitogeeniset polypeptidikasvutekijät käsittävät 30 insuliinin, insuliinin kaltaiset kasvutekijät, verihiuta- leperäisen kasvutekijän, hermokasvutekijän, fibroblasti-kasvutekijän ja orvaskesikasvutekijän (EGF). Ainakin joillakin näistä tunnetuista kasvutekijöistä on vaikutus muunnettujen solujen kasvuun, mutta in vitro -testien perus-35 teella näyttää siltä, että muunnetut solut tarvitsevat 2 81 497 vähemmän näitä tunnettuja kasvutekijöitä optimaalista kasvua ja monistumista varten kuin normaalit solut. Erityisesti on osoitettu kokeilla soluviljelyssä, että ulkosyntyisten kasvutekijöiden, kuten insuliinin ja EGF:n, lisää-5 minen voi saada normaalit solut jäljittelemään tiettyjä soluominaisuuksien muutoksia, jotka ovat analogisia muuntamisen kanssa. Ne eivät kuitenkaan pysty tuottamaan kaikkia muutoksia, jotka liittyvät muunnettuun fenotyyppiin, ks. esim. Sporn et ai., The New Eng. J. of Med. 15 (1981) 10 878 - 880.

Polypeptidikasvutekijöiden uusia tyyppejä, jotka on nimetty muuntokasvutekijöiksi eli TGFriksi, on äskettäin löydetty tietystä ihmis- ja eläinsyöpä- ja sarkoomasoluis-ta, joilla on enemmän ominaisuuksia, jotka ilmeisesti ovat 15 olennaisia fenotyyppimuunnoksille [Roberts et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77 (1980) 3494 - 3498 ja Todaro et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77 (1980) 5258 - 5262]. TGF-polypeptideille luokkana ovat ominaisia muutokset, joita ne aiheuttavat, kun niitä käytetään muuntamattomiin 20 normaaleihin indikaattorisoluihin, jotka kasvavat vilje lyssä. Nämä muutokset käsittävät a) solukasvun tiheydestä riippuvan kasvun estymisen puutteen yksisolukerrosvilje-lys-sä, b) solujen liikakasvun yksisolukerrosviljelyssä, c) muutoksen solun muodossa, mistä on tuloksena, että in-25 dikaattorisolut omaksuvat kasvainfenotyppin, ja d) kiinni tysriippumattomuuden saavuttamisen, mistä on tuloksena kyky kasvaa pehmytagarissa. Solujen kiinnittymisestä riippumattoman kasvun ominaisuus viljelyssä on erityisen voimakkaasti vastaavuussuhteessa neoplastisen kasvun kanssa 30 in vivo. Ainakin tietyt TGF-polypeptidit ovat jonkin verran samanlaisia kuin EGF siinä, että ne sekä ovat kuumuutta ja happoa kestäviä, pelkistimille ja proteaaseille herkkiä peptidejä, että näyttävät spesifisesti olevan vuorovaikutuksessa solumembraanin EGF-reseptorien kanssa ja 35 tuottavat biologisia vaikutuksia niiden kautta, jolloin 81 497 3 TGF kilpailee EGF:n kanssa sitoutumisesta solun EGF-resep-toriin. TGF on kuitenkin erotettavissa EGF:sta useissa tärkeissä suhteissa. Erityisesti EGF ei Indusoi kiinnittymisestä riippumatonta solujen kasvua viljelyssä, eivätkä 5 EGF:ää vastaan muodostetut vasta-aineet havaitse TGF:ää radioimmuunianalyysi- eikä immuunisaostuskokeissa. Lisäksi EGF:llä on ainoastaan vähäinen vaikutus viljeltyjen solujen fenotyyppiin, kun taas TGF tuottaa korostuneemman fe-notyypin muutoksen viljellyissä soluissa ja antaa niille 10 kyvyn käyttäytyä kuten muunnetut solut. Mikä mielenkiintoisinta, TGF:n aiheuttama muuntuminen ei ole pysyvä vaan palautuva TGF:n poissaollessa, eikä ole olemassa mitään todistusta siitä, että TGF toimii itse täydellisenä syöpää synnyttävänä aineena [Todaro et ai., J. of Supramolecular 15 Structure and Cell Biochem. 15 (1981) 287 - 301].

Siten TGF-polypeptidit muodostavat proteiinien ainutlaatuisen luokan, joka voidaan erottaa muista kasvutekijöistä, kuten EGF:stä, sekä biologisten ominaisuuksien että kemiallisen rakenteen kannalta. Näillä TGF:illä on 20 vuorostaan joukko erilaisia ominaisuuksia, jotka ovat arvokkaita tai mahdollisesti arvokkaita terveystieteiden alueella, kuten voimakkaat mutta palautuvat solukasvu- tai mitogeeniset ominaisuudet. Lisäksi TGF-polypeptidin tuotannolle tai tuotannon lisääntyneille tasoille on ominais-25 ta, ellei olennaista, tiettyjen solulinjojen morfologinen muuntaminen sekä ihmis- että hiirikudoksessa ja/tai -nesteissä; siten TGF-polypeptidit tai niiden antigeeniset fragmentit ovat arvokkaita normaalisolujen erottamisessa kasvainsoluista ja niitä vastaan syntyneillä vasta-aineil-30 la on käyttöä pahanlaatuisuuksien diagnoosissa. Lisäksi oivallus, että tietyt TGF-polypeptidit ovat spesifisesti vuorovaikutuksessa solumembraanin EGF-reseptoreiden kanssa ja tuottavat biologiset vaikutuksensa niiden kautta, antaa mahdollisuuden, kun TGF-polypeptidin perusrakenne on mää-35 ritetty, saattaa rakenne vastaavuussuhteeseen EGF:n raken- 4 81 497 teen kanssa oligopeptIdien kehittämiseksi, joilla on kemialliset ominaisuudet, jotka sallivat sitoutumisen EGF-re-septoreihin ilman solun samanaikaista fenotyypin muuntumista.

5 Tämän keksinnön mukaisten vasta-aineiden valmista miseksi on ensin kehitetty menetelmä TGF-polypeptidien valmistamiseksi riittäviä määriä ja riittävän puhtaina sallimaan täydellisen rakenteen määrittämisen, ja tuloksena tästä määrityksestä ja muista havainnoista, mukaan 10 lukien olennaisen homologien löytäminen ihmisen ja hiiren TGFrien välillä, on löydetty peruspeptidirakenne, jolla on laaja käyttö so-lumitoosin ja solun kasvuun liittyvällä alueella. Lisäksi saadaan homogeenisiä TGF-polypeptidejä, joilla on käyttöä sekä solukasvun alueella että syövän ja 15 muiden proliferatiivisten sairauksien toteamiseksi. TGF-polypeptidejä ja -oligopeptidejä vastaan muodostettuja vasta-aineita voidaan myös käyttää luukatoon liittyvien sairauksien, kuten osteoporoosin, hyperkalsemian ja luure-sorption, toteamiseen. Lisäksi vasta-aineita muodostetaan 20 antigeenisille oligopeptideille ja oligopeptideille, joil la on kyky sitoutua solukasvutekijäreseptoreihin, jotka oligopeptidit on johdettu peruspeptidirakenteesta ja määritetyistä TGF-polypeptidirakenteista. Niinpä tämä keksintö antaa käyttöön vasta-aineet, jotka on muodostettu TGF-25 polypeptideille ja niistä johdetuille antigeenisille oligopeptideille käytettäviksi TGF:stä ja EGF:stä riippuvien sairauksien toteamiseen.

Marquardt ja Todaro, J. of Bio. Chem. 257 (9) (1982) 5220 - 5225 (julkaistu 10.5.1982) kuvaavat pienimo-30 lekyylipainoisen ihmis-TGF:n eristämisen seerumittomasta väliaineesta, Jota oli käsitelty ihmisen metastaattisella melanoomakasvainlinjalla, käyttäen sarjaa menetelmävaihei-ta, jotka käsittävät uuttamisen 1 M etikkahappoon ja peräkkäisen puhdistuksen käänteisfaasikorkeapainenestekro-35 matografiällä eluoiden ensin asetonitriili-liuottimella ja li 5 81 497 sen jälkeen 1-propanolilla, jolloin saadaan puhdistettu TGF, jolla on luonteenomainen TGF:n biologinen aktiivisuus, esim. kiinnittymisestä riippumattoman solukasvun indusointi. Twardzik et ai. Science 216 (1982) 894 - 897 5 (julkaistu 21.5.1982) esittävät saman puhdistusmetodolo-gian käytön TGF:n puhdistamiseksi viruksella muunnetusta rottasolusta. Myös puhdistettujen aineiden biologinen aktiivisuus soluviljelyssä osoitetaan. Pike et ai. J. of Bio. Chem. 257 (24) (1982) 14 628 - 14 631 (julkaistu 10 25.12.1982) esittävät, että sekä osittain puhdistetulla rotan että ihmisen TGFrllä on kyky aktivoida proteiiniki-naasia ihmisen kasvainsolumembraaneissa ja siten stimuloida synteettisen, tyrosiinia sisältävän peptidin fosfory-lointia. Ainoat muut tähän asti selostetut molekyylit, 15 joilla on tämä aktiivisuus, ovat EGF, insuliini ja veri-hiutaleperäinen kasvutekijä, joista kaikilla uskotaan olevan tärkeitä fysiologisia funktioita ihmisessä ja eläimessä. Muita kiinnostavia kirjallisuusviitteitä on esitetty edellä mainituissa artikkeleissa.

20 Tämän keksinnön mukaisten vasta-aineiden valmista miseksi on kehitetty perusproteiinirakenne, joka määrittelee uuden luokan biologisesti aktiivisia molekyylejä. Tämän runkopolypeptidin, joka antaa biologisen aktiivisuuden erityisesti solukasvun edistämisen alueella, löytymi-25 nen perustuu havaintoon, että on olemassa selvä vastaavuussuhde tiettyjen, useita disulfidisidoksia sisältävien polypeptidien, TGF:t mukaan lukien, kolmiulotteisen rakenteen ja polypeptidistä aiheutuvan biologisen aktiivisuuden välillä. Siten tämän keksinnön kohteena ovat vasta-aineet, 30 jotka muodostuvat biologisesti aktiivisille polypeptideil le, joilla on kaava 5 10

Val-Val-Ser-His-Phe-Asn-R-Cys-Pro-Asp-Ser-His-Thr- 15 20 25 35 Gln-R'-Cys-Phe-His-Gly-Thr-Cys-Arg-R"-Leu-Val-Gln- 30 35

Glu-R^Lys-Pro-Ala-Cys-Val-Cys-His-Ser-Gly-R' ”- 6 81497 40 45 50

Val-Gly-R2-Arg-Cys-Glu-His-Ala-Asp-Leu-Leu-Ala jossa R on Asp tai Lys, R' on Phe tai Tyr, R" on Ser tai 5 Phe, R'" on Phe tai Tyr, R1 on Asp tai Glu ja R2 on Ala tai Vai, tai näiden polypeptidien aminohapposekvenssin 1-13, 34 - 43, 34 - 50 tai 39 - 50 käsittäville oligopeptidi-fragmenteille.

Keksinnön erään edullisen kohdan mukaisesti sen 10 kohteena ovat vasta-aineet, jotka on muodostettu edellä olevan kaavan mukaisille polypeptideille, joissa R on Asp, R' on Phe, R'" on Tyr, R1 on Asp ja R2 on Ala.

Keksintö koskee myös menetelmiä pahanlaatuisuuksien havaitsemiseksi, joissa menetelmissä käytetään edellä esi-15 tettyjä polypeptidi- ja oligopeptidirakenteita vastaan muodostettuja keksinnön mukaisia vasta-aineita. Vasta-aineet leimataan valinnaisesti merkkiaineella, joka pystyy antamaan havaittavan signaalin diagnostisissa menetelmissä käyttöä varten. Muut menetelmät, joissa käytetään hyväksi 20 edellä olevan kaavan mukaisille solukasvua edistäville polypeptideille muodostettuja vasta-aineita, muodostavat myös osan tästä keksinnöstä.

Keksintö koskee vasta-aineita, jotka on muodostettu kaavan I mukaisille homogeenisille muuntokasvutekijäpoly-25 peptideille, jotka on eristetty näitä polypeptidejä sisältävistä puhtaista vesipitoisista väliaineista tai kehon nesteistä, jotka on saatu muuntokasvutekijää tuottavista kasvainta kantavista nisäkkäistä. Edellä olevan kaavan I mukaiset polypeptidit voidaan eristää vesipitoisesta väli-30 aineesta, joka sisältää tätä muuntokasvutekijäpolypeptidiä epäpuhtaassa muodossa, menetelmällä, joka käsittää seuraa-vat vaiheet: (1) dialysoidaan vesipitoinen väliaine, joka sisältää muuntokasvutekijän epäpuhtaassa muodossa, vesipitoista 35 etikkahappoa vastaan antamaan liuotinfaasi, joka sisältää muuntokasvutekijäpolypeptidiä ja joka faasi väkevöidään ja . . valinnaisesti selkeytetään, 81 497 7 (2) muodostetaan vaiheen 1) väkevöity liuotinfaasi uudelleen vesipitoisella etikkahapolla ja saatetaan uudel-leenmuodostettu liuos geelisuodatuskromatografiaan viemällä uudelleenmuodostettua liuosta geelisuodatuskromatogra- 5 fia-pylvääseen, jota on tasapainotettu vesipitoisella etikkahapolla, ja eluoidaan vesipitoisella etikkahapolla eluaatin valittujen fraktioiden saamiseksi, jotka sisältävät muuntokasvutekijäpolypeptidiä puhtaampana, ja valitut fraktiot yhdistetään ja väkevöidään, jolloin saadaan ositit) tain puhdistettu, muuntokasvutekijäpolypeptidiä sisältävä tuote, (3) saatetaan vaiheen (2) osittain puhdistettu, muuntokasvutekijäpolypeptidiä sisältävä tuote peräkkäiseen käänteisfaasikorkeapainekromatografiaan viemällä tuote 15 uudelleenmuodostamisen jälkeen vesipitoiseen trifluori- etikkahappoon, yhden tai useamman hiilivetysidottujen pii-happomatriisipylväiden läpi, jotka on tasapainotettu vesipitoisella trifluorietikkahapolla, korkeapainenestekroma-tografian olosuhteissa, jolloin pylvään alkueluointi suo-20 ritetaan käyttäen lineaarista asetonitriili-gradienttia vesipitoisessa trifluorietikkahapossa ja sen jälkeen pyl-väseluointi, joka suoritetaan ensimmäisestä korkeapaine-nestekromatograflavaiheesta saaduille, yhdistetyille, muuntokasvutekijäpolypeptidiä sisältäville fraktioille, 25 toteutetaan käyttäen lineaarista 1-propanoli-gradienttia vesipitoisessa etikkahapossa, jolloin 1-propanolin gra-dienttia nostetaan riittävän pieninä 1-propanolin väke-vyyslisäyksinä antamaan muuntokasvutekijäpolypeptidi yhtenä ainoana selvänä huippuna homogeenisena polypeptidinä. 30 Peptidisekvenssi, joka luonnehtii esitetyn kaavan mukaista perusproteiinirakennetta, sisältää kuusi kysteii-nitähdettä sijoitettuina ratkaiseviin asemiin polypeptidi-rungossa. Arvellaan, että kysteiinitähteiden sijainti sallii polypeptidin laskostua erityisellä tavalla pariutunei-35 den kysteiinien välille muodostuneiden disulfidisiltojen johdosta ja siten tuottaa kolmiulotteisen rakenteen, joka 81 497 8 edistää osaltaan saadun proteiinin biologista aktiivisuutta. On olemassa jonkin verran todistusaineista, joka viittaa erityiseen dlsulfldi-siltajärjestykseen, jossa (numeroimalla edellä olevassa kaavassa Cys-tähteet l:stä 6reen 5 vasemnmalta oikealle) Cys-1 on sitoutunut Cys-3:een, Cys-2 on sitoutunut Cys-4:ään ja Cys-5 on sitoutunut Cys-6:een disulfidisidoksin perusproteiinirakenteen biologisesti aktiivisissa muodoissa.

Kuten seuraavassa yksityiskohtaisemmin esitetään, 10 edellä mainitun kaavan mukaisia TGF-polypeptidejä saadaan sopivasti erilaisista muunnetuista ihmis- ja hiirisolulin-joista, tietyistä sikiön solulinjoista ja kasvainta kantavien nisäkkäiden kehon nesteistä käyttäen myöhemmin kuvattua eristysmenetelmää tai tavanomaista synteettistä tai 15 rekombinanttimenetelmää polypeptidien syntetisoimiseksi.

Tyypillisesti mainitun kaavan mukaisten TGF-polypeptidien ja niiden oligomeerien molekyylipaino on alueella n.

5 000 - 35 000. Tässä suhteessa edullisia ovat TGF-poly-peptidit, joiden molekyylipaino on n. 5 000 - 8 000.

20 Kuten edellä mainittiin, tämän keksinnön mukaisilla TGF-polypeptidien vasta-aineilla on arvoa pahanlaatuisuuksien havaitsemisessa nisäkkäillä, koska TGF-polypeptidien tuotanto ja/tai nousseet tuotantotasot ovat luonteenomaisia tiettyjen ihmis- ja hiirisolulinjojen morfologiselle 25 muunnokselle. Tässä suhteessa vasta-aineilla TGF-polypep-tideille on käyttöä pahanlaatuisuuden diagnoosissa, koska niitä voidaan käyttää havaitsemaan kasvainsoluissa tai kehon nesteissä läsnäolevan TGF-polypeptidin äärimmäisen alhaiset tasot. Samalla kun koko TGF-polypeptidimolekyyliä 30 voidaan käyttää vasta-aineiden muodostamiseen (sekä polyk-lonaalisten että monoklonaallsten), on myös mahdollista ja edullista kustannusten ja teknisen ponnistelun kannalta määrittää TGF-polypeptidisekvenssin eri alueita, jotka todennäköisesti ovat determinanttikohtia, ja käyttää näitä 35 vähintään n. 8 aminohapon, tyypillisesti vähintään n. 10 eikä enemmän kuin n. 20 aminohapon oligopeptidejä määrit- 9 81 497 teleinään hapteenin, Jota voidaan käyttää vasta-aineen muodostumisen indusointiin. Kuten seuraavassa edelleen esitetään, oligopeptidi sidotaan sopivaan immunogeeniin ja viedään selkärankaiseen haluttujen vasta-aineiden toteamisek-5 si. Siten tämä keksintö antaa käyttöön myös sarjan vasta-aineita oligopeptideille, jotka vastaavat antigeenisiä alueita TGF polypeptideissä. Esimerkkejä antigeenisistä oligopeptideistä, jotka ovat käyttökelpoisia muodostettaessa tämän keksinnön mukaisia vasta-aineita, luetellaan 10 seuraavassa.

A) Val-Val-Ser-His-Phe-Asn-Lys-Cys-Pro-Asp-Ser-His-Thr B) Cys-His-Ser-Gly-Tyr-Val-Gly-Val-Arg-Cys C) Cys-His-Ser-Gly-Try-Val-Gly-Val-Arg-Cys-Glu-His- 15 Ala-Asp-Leu-Leu-Ala- tai D) Val-Gly-Val-Arg-Cys-Glu-His-Ala-Asp-Leu-Leu-Ala. Edellä esitetyn kaavan mukaisia polypeptidejä ja oligopeptidejä sekä edellä esitettyjä peptidisekvenssejä voidaan valmistaa käyttäen synteettisiä menetelmiä, mene-20 telmiä, joissa peptidi eristetään luonnossa esiintyvästä lähteestä, esim. solulinjoista ja kehon nesteistä, sekä menetelmiä, joissa käytetään hybridi-DNA-teknologiaa. Niinpä polypeptideille ja oligopeptideille käytetään sopivasti tavanomaista kiinteäfaasipeptldisynteeslä. Tässä 25 yleisessä synteesimenetelmässä peptidien valmistamiseksi, joka menetelmä on kuvattu esimerkiksi Ganfleld et ai'in. US-patentissa 4 341 761, käytetään tunnettuja sivuketju-suojaryhmiä ja tavanomaisia polystyreenihartsimatriiseja esim. kloorimetyloituja hartseja, hydroksimetyylihartseja 30 tai bentshydryyliamiinihartseja, aminohappokytkennän to teuttamiseksi. Polypeptideille voidaan sopivasti käyttää myös alempana kuvattua menetelmää homogeenisten TGF:ien eristämiseksi luonnon lähteistä halutun peptidin puhtaiden muotojen saamiseksi. Tässä suhteessa erityisen sopivia 35 TGF-polypeptidien lähteitä ovat seerumiton väliaine, jota on käsitelty retroviruksella muunnetuilla Fischer'in rotan 81 497 ίο sikiön fibroblasteilla, erityisesti fibroblasteilla, jotka on muunnettu Snyder-Theilen kissan sarkoomaviruksella, Moloneyn hiiren sarkoomaviruksel la muunnetuilla hiiri-3T3-soluilla ja ihmisen metastaattisilla melanoomia-soluiin-5 joilla A2058 ja A375. Lähteitä ja menetelmiä sopivia hii-risolulinjoja varten ovat kuvanneet DeLarco et ai., J. Biol. Chem. 255 (1980) 3685 - 3690 ja Ozanne et ai., J. Cell. Physiol. 105 (1980) 163 - 180. Lähteitä ja menetelmiä ihmisen solulinjoja varten ovat samalla tavalla kuvan-10 neet Todaro et ai., (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77, sivut 5258 - 5262 sekä Giard et ai., J. Natl. Cancer Inst., 51 (1973) 1417 -1423. Seuraavassa selostettua eristämismenetelmää voidaan myös käyttää TGF-polypeptidien saamiseksi erilaisista kehon nesteistä, kuten ihmisten tai 15 hiirten, joilla on pahanlaatuisuuksia, virtsasta, seerumista, plasmasta, kokoverestä tai aivoselkäydinnesteestä, tai muunnetuista soluista, jotka tuottavat TGF-polypepti-dejä. Tässä suhteessa sopiva TGF-polypeptidien lähde on virtsa tai muut kehon nesteet hiiristä, joihin on siirret-20 ty kasvainsoluja (ihmisen melanooma- tai muunnettuja rotan soluja), joiden tiedetään tuottavan TGF-polypeptidejä. Kaikissa tapauksissa TGF-polypeptidin identifiointia ja puhtautta voidaan tarkkailla radioreseptorimääritysmene-telmällä, joka perustuu ristiin reaktiivisuuteen EGF:n 25 kanssa reseptoriin sitoutumisesta (ks. koe-esimerkit seuraavassa). Menetelmissä, joissa käytetään yhdistelmä- tai hybridi-DNA-teknologiaa, voidaan oligopeptidejä tai poly-peptidien segmenttejä, jotka sisältävät korkeintaan esimerkiksi 20 aminohappoa, käyttää kodonisekvenssin johtami-30 seksi yksisäikeisiä nukleotidi (DNA) -koettimia varten. Nämä nukleotidikoettimet voidaan sitten syntetisoida käyttäen tunnettuja synteesimenetelmiä ja käyttää koettimena lähetti-RNA:n (mRNA) saamiseksi, joka koodaa kasvutekijä-tyyppisiä polypeptidejä sekä normaaleissa että muunnetuis-35 sa soluissa tai kehon nesteissä, jotka sisältävät näitä peptidejä. Kun lähetti-RNA on saatu, voidaan käyttää ta- 81 497 11 vanomaisia menetelmiä mRNA:n käänteiskopioimiseksi cDNArksi ja sen jälkeen kloonata cDNA sopivassa vektorissa halutun polypeptldln Ilmentymisen aikaansaamiseksi.

Menetelmää voidaan käyttää edullisesti homogeenis-5 ten TGF:ien eristämiseksi seerumittomista väliaineista, joita on käsitelty muunnetuilla, TGFrää tuottavilla solu-linjoilla. Tällöin käsitelty väliaine selkeytetään edullisesti, esim. sentrifugoimalla ja väkevöidään ennen dialyysiä ja TGFrää sisältävä dialyysistä saatu liuotinfaasi 10 selkeytetään sopivasti esimerkiksi sentrifugoimalla sekä väkevöidään myös ennen geelisuodatuskromatografiaa. Kaikissa tapauksissa dialyysi suoritetaan sopivasti käyttäen vesipitoista etikkahappoliuotinta, jonka etikkahappopitoi-suus on 0,01 -1 M, jolloin 0,1 M etikkahappo on edullinen. 15 Geelisuodatuskromatografia voidaan toteuttaa käyttäen joukkoa erilaisia geelejä, joita tavanomaisesti käytetään proteiinien tai polypeptidien erottamiseen molekyyli kokoon perustuen. Sopivia geelejä ovat dekstraanigeelit, agaroo-sigeelit ja polyakryyliamidigeelit. Tässä suhteessa edul-20 lisiä ovat polyakryyliamidigeelisuodatushartsit (Bio-Gel*)- hartsit, kuten Bio-Gel P-10, Bio-Gel P-30 ja Bio-Gel P-60, joista Bio-Gel P-10 on erityisen edullinen. Vesipitoisen etikkahapon, jota käytetään pylvään tasapainottamiseen ja TGF:ää sisältävien fraktioiden eluointiin, etikkahappopi-25 toisuus on sopivasti 0,2 -2,0 M, jolloin 1,0 M etikkahappo on edullinen. TGFrää sisältävät fraktiot, jotka eluoituvat pylväästä, voidaan tunnistaa määrittämällä niiden EGFrn kanssa kilpaileva aktiivisuus ja kasvua edistävä aktiivisuus pehmytagarissa (ks. koe-esimerkit seuraavassa). Gee-30 lisuodatuskromatografiasta saadut fraktiot, jotka sisältä vät TGF-polypeptidejä puhtaudeltaan parantuneina, yhdistetään ja väkevöidään, esimerkiksi kylmäkuivaamalla, valmistavana vaiheena lisäpuhdistusta varten käänteisfaasikor-keapainenestekromatografiällä (HPLC).

35 Puhdistusprosessin loppuvaihe käsittää peräkkäiset HPLCrt eluoiden asetonitriilillä ja 1-propanolilla vesi- 12 81 497 pi toisen trifluorietikkahapon läsnäollessa. Nämä peräkkäiset HPLC-ajot voidaan toteuttaa käyttäen yhtä tai useampia HPLC-pylväitä, mutta on edullista toteuttaa peräkkäiset HPLC-vaiheet käyttäen yhtä ainoata HPLC-pylvästä. Käytetty 5 pylvään täyte on sopivasti huokoista piihappomatriisia, johon on sidottu pitkäketjuinen hiilivety, esimerkiksi 16-22 hiiliatomia sisältävä hiilivety. Edullisia täytteitä ovat pBondapak-hiilivetypylväät, erityisesti pBondapak C1B-pylväs (partikkelikoko 10 pm, 0,39 x 30 cm, Waters Asso-10 dates). Menetelmä toteutetaan tyypillisesti paineen alaisena, edullisesti paineessa väliltä n. 3,45 x 105 - 3,45 x 107 Pa (50-5000 psi). Ennen pylvääseen viemistä väkevöidyt TGF:ää sisältävät fraktiot muodostetaan uudelleen 1 -10-%:iseen trifluorietikkahappoon ja säädetään pH-arvoon 15 2-5, edullisesti 3-5, lisäämällä trifluorietikkahap- poa. Pylväs tasapainotetaan sopivasti 0,01 - 0,l-%:isella vesipitoisella trifluorietikkahapolla, edullisesti 0,05-%:isella vesipitoisella trifluorietikkahapolla, ennen näytteen ruiskuttamista. Ensimmäinen eluointi suoritetaan 20 asetonitriilillä 0,01 - O,l-%:isessa, edullisesti 0,05- %:isessa trifluorietikkahapossa käyttäen lineaarista asetoni triiligradienttia (asetonitriili-väkevyys kasvaa lineaarisesti gradientilla n. 0,1 %/min - n. 1 %/min). Eluointi suoritetaan ajanjaksona 0,2:sta 3 tuntiin virtausnopeu-25 della n. 0,2 - 2 ml/min ja lämpötilassa n. 10 - 50 °C, edullisesti n. 40 °C:ssa. Yhdistetyt fraktiot, jotka sisältävät TGF-aktiivisuuden määritettynä EGF:n kanssa kilpailulla ja pehmytagar-analyysillä, väkevöidään, esimerkiksi kylmäkuivaamalla ennen toista HPLC-vaihetta käyttäen 30 1-propanoliliuotinta. Peräkkäisen HPLC:n toista vaihetta varten yhdistetyt ja väkevöidyt fraktiot ensimmäisestä HPLC-eluoinnista muodostetaan uudelleen 0,01 - 0,l-%:iseen trifluorietikkahappoon ja kromatografoidaan uudelleen samassa pylväässä tai toisessa pylväässä, joka on tasapaino-35 tettu trifluorietikkahapolla samalla tavalla, jota käytettiin ensimmäistä pylvästä varten. Tämä toinen eluointi 81 497 13 suoritetaan 1-propanolilla, 0,01 - 0,l-%:isessa, edullisesti 0,035-%:isessa trifluorietikkahapossa käyttäen lineaarista 1-propanoligradienttia. Optimituloksia varten on tärkeätä käyttää tässä vaiheessa matalaa lineaarista 1-5 propanoligradienttia. Erityisesti 1-propanolipitoisuutta tulisi lisätä lineaarisesti gradientilla, joka ei ylitä 0,1 %/min ja edullisesti lineaarinen 1-propanoligradientti tulisi pitää välillä 0,01 %/min ja 0,05 %/min eluoinnin aikana. Tämä toinen eluointi suoritetaan sopivasti aikana 10 yhdestä viiteen tuntiin virtausnopeudella n. 0,5 - 5 ml/min ja lämpötilassa alueella 10 -60 °C, edullisesti n. 40 eC:ssa. Säätämällä lineaarista 1-propanolipitoisuusgra-dienttia edellä annetuilla matalilla tasoilla on mahdollista eluoida TGF-polypeptidit hyvin määriteltyinä TGF-15 aktiivisuuden huippuina homogeenisina polypeptideinä.

Tällä eristysmenetelmällä on mahdollista ottaa talteen n. jopa 70 %:a alku-TGF-aktiivisuudesta epäpuhtaassa lähtöaineesta, jolloin saavutetaan yli 200 000 -kertaisia puhdistumiasteita. Eristämismenetelmällä saatujen homogee-20 nisten TGF-polypeptidien molekyylipainot ovat tyypillises ti alueella n. 5 000 - 35 000 ja ne ovat riittävän puhtaita sallimaan peptidisekvenointi. Edullisia homogeenisiä TGF-polypeptidejä, joita saadaan tällä menetelmällä, ovat TGF:t, joiden näennäiset molekyylipainot ovat 7 400, 25 20 000 ja 30 000 - 35 000. Näillä homogeenisilla TGF-poly- peptideillä on luonteenomaisia TGF-polypeptidien biologisia ominaisuuksia, kun niitä käytetään viljelmässä kasvaviin muuntamattorniin, normaaleihin indikaattorisoluihin, mukaan lukien kiinnittymisriippumattomuuden saavuttaminen, 30 mistä on tuloksena kyky kasvaa pehmytagarissa. Näitä homogeenisia TGF-polypeptidejä voidaan käyttää nostattamaan vasta-aineita (katso seuraavaa), joilla on arvoa syövän ja muiden proliferatiivisten tautien havaitsemisessa. Tässä suhteessa ei ole olennaista, että jokainen TGF:n muodoista 35 puhdistetaan homogeenisyyteen vasta-aineiden tuottamiseksi eri TGF-peptideille. Kaikkien eri TGF-polypeptideille muo- i4 81 497 dostettujen vasta-aineiden katsotaan kuuluvan keksinnön piiriin.

Keksinnön mukaisia vasta-aineita ovat sekä monoklonaaliset että polyklonaaliset vasta-aineet, joita syntyy 5 edellä esitetyn kaavan mukaisille TGF-polypeptideille, TGF-polypeptideistä peräisin oleville antigeenisille oli-gopeptideille sekä homogeenisille TGF-polypeptideille, jotka on saatu käyttäen edellä kuvattua eristämismenetelmää nisäkkäiden, joilla on pahanlaatuisuuksia, erilaisista 10 muunnetuista solulinjoista ja kehon nesteistä tai muunnetuista soluista. Keksinnön mukaisia vasta-aineita voidaan valmistaa joukolla erilaisia alalla tunnettuja tapoja riippuen siitä, halutaanko monoklonaalisia tai polyklonaa-lisia vasta-aineita. Polyklonaalisia vasta-aineita varten 15 hyperimmunisoidaan selkä-rankainen, tyypillisesti koti eläin, antigeenillä ja veri kerätään kohta toistuvien immunisointien jälkeen ja gammaglobuliini eristetään. Sopivia menetelmiä polyklonaalisten vastaaineiden valmistamiseksi on esitetty käsikirjassa Handbook of Experimental 20 Immunology, 3. painos, Weir, toimittaja, Blackwell Scientific Publications, Oxford ja Lontoo, 1978. Monoklonaalisia vasta-aineita varten hyperimmunisoidaan pieni eläin, tyypillisesti hiiri tai rotta, antigeenillä, perna poistetaan ja lymfosyytit yhdistetään myeloomasolujen kanssa 25 sopivan fuusiopromoottorin läsnäollessa. Syntyvät hybridi-solut eli hybridomat seulotaan yksittäisten kloonien eristämiseksi, joista jokainen erittää yhtä ainoata vasta-ai-nelajia antigeenille. Jokainen tällä tavalla saatu yksilöllinen vastaainelaji on yhden ainoan immuunin eläimen B-30 solun tuote, joka on kehittynyt vasteena spesifiselle antigeeniselle kohdalle, joka tunnistetaan immunogeenisessä aineessa. Yleisen menetelmän monoklonaalisten vasta-aineiden, keksinnön mukaiset mukaan luettuina, saamiseksi ovat kuvanneet Kohler ja Milstein Nature 256 (1975) 495 - 497. 35 Vasta-aineiden tuottamiseen käytettyjä polypeptidejä ja antigeenisiä oligopeptidejä voidaan suoraan käyttää immu- 15 81 497 nisoimisprosessissa tai ne voidaan sitoa sopivaan kantajaproteiiniin käyttäen alalla tunnettuja menetelmiä; katso esimerkiksi Ganfield et ai.'in US-patentti 4 341 761. Kantajaproteiinin käyttö on erityisen edullista, kun immuni-5 sointi suoritetaan käyttäen edellä kuvattuja antigeenisiä oligopeptidejä.

Keksinnön mukaisia vasta-aineita voidaan käyttää monilla tavoilla. Edullisessa sovellutuksessa niitä voidaan käyttää pahanlaatuisuuden ja muiden proliferatiivis-10 ten sairauksien diagnoosissa. Tapauksissa, joissa antigeeniä esiintyy fysiologisessa nesteessä tai erilaisena väkevyytenä ainoastaan silloin, kun pahanlaatuisuus tai muu proliferatiivinen sairaus on olemassa, analysoidaan fysiologinen neste, kuten seerumi, plasma, täysveri tai aivo-15 selkäydinneste. Analyyseissä käytetyt vasta-aineet voivat olla leimattuja tai leimaamattomia. Leimaamattomia vasta-aineita voidaan käyttää agglutinaatiossa; leimattuja vasta-aineita voidaan käyttää suuressa joukossa erilaisia menetelmiä, käyttäen suurta valikoimaa merkkiaineita, ku-20 ten radionuklideja, entsyymejä, fluoresoivia aineita, ent-syymisubstraatteja tai -kofaktoreita tai vastaavia. Näitä menetelmiä on runsaasti kuvattu kirjallisuudessa ja valaisevia esimerkkimenetelmiä löytyy US-patenteista 3 817 834; 3 935 074; 4 233 402 ja 4 318 980.

25 Joissakin menetelmissä on hyödyllistä leimata anti geeni tai sen fragmentti mieluummin kuin vasta-aine ja saada aikaan kilpailu vasta-aineesta leimatun antigeenin ja näytteessä olevan antigeenin välillä. Tässä tilanteessa on tavallista valmistaa testipakkauksia, jotka sisältävät 30 leimatun antigeenin tai leimatun fragmentin ja vasta-aineen yhdistelmän sellaisen määrän, että saadaan optimi-herkkyys ja tarkkuus. Toisissa tapauksissa on toivottavaa että on kiinteä kantaja, johon joko antigeeni tai vasta-aine on sidottu. Moniepitooppinen antigeeni voi toimia 35 siltana kantajaan sidotun vasta-aineen ja leimatun vasta-aineen välillä analyysivällaineessa. Vaihtoehtoisesti voi 16 81 497 olla kilpailu leimatun antigeenin ja jonkin näytteessä olevan antigeenin välillä rajoitetusta määrästä vastaa!-netta.

Kun antigeeniä ei voida löytää fysiologisesta nes-5 teestä tai jos se löydetään, se ei ole diagnostinen pahanlaatuisuudelle tai proliferatiiviselle kohdesairaudelle, on solut eristettävä ja analysoitava antigeenin läsnäolon suhteen. Antigeenin havaitsemista varten kudosnäyte voidaan hajottaa tavanomaisin menetelmin, esim. emäksellä, 10 detergenteillä jne., solujäte erottaa suodattamalla tai sentrifugoimalla ja eristää suodos tai supernatantti ja analysoida.

Vasta-aineisiin voidaan sitoa myös merkkiaineita, kuten radionuklideja, fluoresoivia aineita, entsyymejä 15 jne. Kun vasta-aineet viedään elimistöön, ne ohjaavat merkkiaineen pahanlaatuiseen soluun, jolloin pahanlaatuisuuden läsnäolo voidaan diagnostisoida.

Vasta-aineiden valmistemuoto vaihtelee laajasti riippuen merkkiaineen luonteesta ja paikasta, johon vasta-20 aineet on suunnattava jne. Tavallisesti vasta-aineet formuloidaan fysiologisesti hyväksyttävään kantajan, esim. fysiologiseen suolaliuokseen tai fosfaatilla puskuroituun fysiologiseen suolaliuokseen ja injektoidaan isäntään haluttuun kohtaan, kun tämä on mahdollista, ja kun tämä ei 25 ole mahdollista, kiertävään järjestelmään, kuten vereen.

Tämän keksinnön mukaisia vasta-aineita voidaan käyttää myös solujen eristämiseksi, jotka ekspressoivat TGF-polypeptidejä, ja solujen poistamiseksi in vitro heterogeenisestä solupopulaatiosta, joka sisältää TGF-polypep-30 tidiä ekspressoivia soluja. Erottaminen voidaan suorittaa fluoresenssillä aktivoidulla solulajittelljalla (FACS). Tätä samaa menetelmää voidaan käyttää TGF-polypeptidiä ekspressolvien solujentunnistamiseen ja eristämiseen. TGF-polypeptidiä ekspressoivien solujen poistamiseksi solu-35 seoksesta kohdevasta-aineet voidaan yhdistää komplementtiin, tai toksiinia hajoittavaan fragmenttiin (A-fragment- 81 497 17 tiin) (ks. EPO-patenttihahkemusjulkaisu 17 507 ja US-pa-tenttihakemusjulkasiu 2 034 324) tai solu voidaan aggluti-nolda ja erottaa fysikaalisin menetelmin.

Keksinnön mukaiset TGF-oligopeptidejä ja -polypep-5 tidejä vastaan muodostetut vasta-aineet ovat tehokkaita luukatoon liittyvien sairauksien toteamiseen. TGF-aktii-visuutta esiintyy esimerkiksi materiaalissa, joka vastaa hyperkalsemiaan liittyvien kasvainten luun resorptioak-tiivisuudesta [Ibbatson et ai., Science 221 (1983) 1292]. 10 Kohonnut luun resorptio voi olla kasvainsolujen erittämien TGF-molekyylien endokriinista vaikutusta.

Kohonneet TGF-tasot edistävät lisäksi luun resorp-tiota liuottamalla kalsiumia, mikä liittyy sairauksiin, kuten osteoporoosiin. Osteoporoosi on sairaus, joka yleen-15 sä esiintyy vanhemmilla ihmisillä ja joka aiheuttaa luukatoa. TGF-vasta-aineita voidaan käyttää osteoporoosin toteamiseksi ja siten ne ovat hyödyllisiä tämän tärkeän sairauden määrittämisessä. Keksinnön kohteena on menetelmä luukadon toteamiseksi ihmisessä, jossa menetelmässä soluja 20 tai kehon nesteitä saatetaan kosketukseen TGF-vasta-aineen kanssa ja määritetään mainitun vasta-aineen sitoutumistaso soluihin tai solutuotteisiin kehossa luukatoa sairastavan isännän diagnosoimiseksi.

Esimerkki I

25 Ihmisen pienimolekyylipainoisen muuntokasvutekijän (hTgF;t) tuottaminen, puhdistaminen ja luonnehtiminen A, Kokeellisia menetelmiä hTGF;ien lähde hTGF:t puhdistettiin seerumittomasta väliaineesta, 30 jota oli käsitelty ihmisen metastaattisella melanooma-linjalla Ά2058 [Todaro et ai. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77 (1980) 5258 - 5262], joka oli peräisin aivometastaasista 43 vuoden ikäiseltä mieheltä. Soluja kasvatettiin 90 %:n yhteenkasvuun kiertopulloissa, jotka sisälsivät Dulbecco'n 35 modifioitua Eagle'n väliainetta (Grand Island Biological Co., 430-2100), jota oli täydennetty 10 %:lla vasikan see- χβ 81 49? rumia (Colorado Serum Co.) 37 °C:ssa. Soluja pestiin 1 tunti 50 ml:11a seerumitonta Weymouth’in väliainetta (Grand Island Biological Co., MD 705/1). Tämä ja toinen 24 tuntia myöhemmin kerätty supernatantti hylättiin. Myöhem-5 mät supernatantit otettiin talteen joka toinen päivä tai joka kolmas päivä kahden viikon ajan.

Väliaine kerättiin talteen dekantoimalla, varastoitiin korkeintaan 24 h 4 *C:ssa proteaasi-inhibiittori-fe-nyylimetaanisulfonyylifluoridin (1 pg/ml), läsnäollessa ja 10 selkeytettiin jatkuvavirtaussentrifugoinnilla kierrosno- peudella 32 000 rpm 4 °C:ssa. Käytettiin virtausnopeuksia 5 1/h CF-32-jatkuvavirtausroottorissa (Beckman) L5-50 -mallisessa ultrasentrifugissa (Beckman). Suurnopeuksisen sentrifugoinnin jälkeen saatua supernatanttia nimitetään 15 A2058-käsitellyksi väliaineeksi.

A2058-käsitelty väliaine väkevöitiin välittömästi onttokuitu-dialysoimis/väkevöimislaitteessa (Model DC10, H1095-20-tyyppinen patruuna Amicon Corp.) 10 °C:ssa. Kon-sentraatti valutettiin, kun tilavuus oli pienentynyt 150-20 kertaisesti. Patruuna pestiin 1000 ml:11a Waymouth'in vä liainetta. Ultrasuodos hylättiin. hTGF:ien puhdistaminen Dialyysi ja sentrifugoiminen

Yhdistettyä retentaattia nestettä ja patruunan pe-25 sunestettä A2058-käsitellyn väliaineen ultrasuodatuksen jälkeen dialysoitiin 60 h 0,1 M etikkahappoa vastaan Spectrapor 3 -dialyysiletkussa (Spectrum Medical Industries). Retentaattia sentrifugoitiin 1 000 000 x g:ssa 1 h 4 °C:ssa. Pelletti hylättiin. Sypernatantti väkevöitiin 30 kylmäkuivaamalla ja liuotettiin 0,15 ml:aan 1 M etikkahappoa litraa alkuperäistä A2058-käsiteltyä väliainetta kohti.

Kromatografia Blo-Gel P-10-geelillä Väkevöinnin, dialyysin ja sentrifugoinnin jälkeen 35 supernatantti, joka sisältää hTGF-aktiivisuuden, puhdis tettiin edelleen geelisuodatuskromatografiällä Bio-Gel li 19 81497 P-10 -pylväässä 2,5 x 8,5 cm, patsaan tilavuus 420 ml, 200-400 mesh, Bio-Rad Laboratories). Pylväs tasapainotettiin 1 M etikkahapolla 22 eC:ssa. Pylvääseen vietiin pro-teiininäytteet (65 - 115 ml) IM etikkahapossa (5 ml).

5 Muuttumattoman virtausnopeuden varmistamiseksi nesteen ulosvirtaus pylväästä asetettiin 12 ml/h:ksi peristaltti-sella pumpulla. Koottiin 4,8 ml:n fraktioita. Pienet määrät fraktioita kylmäkuivattiin myöhempiä EGF:n kanssa kilpailevan aktiivisuuden ja kasvua edistävän aktiivisuuden 10 määrityksiä varten pehmytagarissa. Fraktiot, jotka edustivat tietyn huipun pääosia, yhdistettiin ja väkevöitiin kylmäkuivaamalla.

Käänteisfaasikorkeapainenestekromatografia hTGF:n lopullinen puhdistaminen tapahtui käänteis-15 faasi-HPLC:lla käyttäen yleistä menetelmää, jonka ovat selostaneet Marquardt et ai. J. of Biol. Chem., 256 (1981) 6859 - 6865. Kaikki erottamiset suoritettiin pBondapak C18 -kolonnilla (partikkelikoko 10 pm, 0,39 x 30 cm, Waters Associates) virtausnopeudella 1 ml/min 40 °C:ssa. Kylmä-20 kuivatut näytteet muodostettiin uudelleen 0,05-%:iseen (v/v) trifluorietikkahappoon vedessä, säädettiin pH 2:een 10-%:isella (v/v) trifluorietikkahapolla ja vietiin näyte-injektorin avulla pylvääseen, joka oli tasapainotettu 0,05-%:isella trifluorietikkahapolla. Pylväs eluoitiin 25 sitten lineaarisella asetonitriili-gradientilla 0,045 %:isessa trifluorietikkahapossa. Pylväästä ulosvirtaava neste kerättiin 1,5 ml:n fraktioina. Pienet määrät fraktioita kylmäkuivattiin EGF:n kanssa kilpailu- ja kasvun stimulointi-määrityksiä varten. Yhdistetyt fraktiot, jotka 30 sisälsivät pääosan hTGF-aktiivisuudesta, väkevöitiin kyl mäkuivaamalla.

Yhdistetyt, hTGF:ää sisältävät erät liuotettiin 0,05-%:iseen trifluorietikkahappoon ja kromatografoitiin uudelleen samassa pylväässä, joka oli sitä ennen tasapai-35 notettu 0,05-%:isella trifluorietikkahapolla vedessä. Pyl väs eluoitiin sitten lineaarisella 1-propanoligradientilla 81 497 20 0,035-%:isessa trifluorietikkahapossa. Pylväästä ulosvir-taava neste kerättiin 1,5 ml:n fraktioina. Pienet määrät fraktioita kylmäkuivattiin EGF:n kanssa kilpailu- ja kasvun stimulointi -määrityksiä varten.

5 SDS-polyakryyllamidigeelielektroforeesi SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi suoritettiin, kuten Laemmll on selostanut, Nature (Lond) 227 (1980) 680 - 685. Valmistettiin 15 - 30-%:inen akryyliami-digradienttilevy (140 x 120 x 0,75 mm) 4 %:n kanssa kon-10 sentrointigeeliä. Geelejä ajettiin ajojännitteellä 30 V käyttäen elektrodipuskuria, joka sisälsi Trls:ä (0,05 M), glysiiniä (0,38 M) ja SDS:ää (0,1 % w/v), kunnes merkkivä-rlaine (bromifenolisininen) oli kulkenut pois geelin päästä. Elektroforeesin jälkeen geelejä kiinnitettiin 50-15 %:isessa metanolissa, joka sisälsi 10 % etikkahappoa 2 tuntia, pestiin 5-%:isessa metanolissa, joka sisälsi 7 % etikkahappoa yli yön ja värjättiin hopealla [Oakley et ai., Anals. Biochem. (1980) 361 - 363].

Proteiinimääritys 20 Kokonaisproteiini määritettiin käyttäen naudan see- rumialbumiinia standardina. Ennen proteiinimääritystä lähtöaine dialysoitiin fosfaattipuskuroitua fysiologista suolaliuosta vastaan värireaktioita häiritsevien viljelyväli-aineen aineosien poistamiseksi tai kylmäkuivattiin, jos 25 näytteet oli liuotettu haihtuviin happoihin. Proteiini määritettiin myös aminohappoanalyysillä. Kylmäkuivatut näytteet hydrolysoitiin 110 °C:ssa 24 h tyhjennetyissä Pyrex-putkissa käyttäen 0,1 ml 6 M HC1, joka sisälsi 0,1 % nestemäistä fenjolia, ja analysoitiin Durrum D-500 -analy-30 saattorilla, joka oli varustettu PDP 8/A -tietokoneinteg-raattorilla käyttäen o-ftaalialdehydiä primaaristen amiinien fluorogeenista havaitsemista varten (Bensen et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 72 (1975) 619 - 622). Radioreseptorimääritys 35 Puhdistettu EGF leimattiin Na125I:lla kloramiini-T- menetelmän muunnoksella, kuten ovat selostaneet DeLarco et 81 497 21 ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75 (1978) 4001 - 4005. 125I-EGF-sitoutumisanalyysi suoritettiin käyttäen formaliinilla kiinnitettyjen A431-ihmissyöpäsolujen lähes yhteneviä yk-sisolukerroksia kuten aikaisemmin on selostettu (DeLarco 5 et ai., J. of Biol. Chem. 255 (1980) 3685 - 3690). Kiinnitetyt solut pestiin kahdesti 0,5 ml:11a sidepuskuria (Dulbecco'n modifioitu Eagle*n väliaine, joka sisälsi 1 mg/ml naudan seerumin albumiinia ja 50 mM 2-[bis(2-hydrok-sietyyli)amino]etaanisulfonihappoa, pH 6,8). Kilpailut 10 aloitettiin lisäämällä 0,2 ml sidepuskuria, joka sisälsi 0,4 ng 125I-EGF:ää mahdollisen inhibiittorin kanssa tai ilman sitä. 1 tunnin inkuboinnin jälkeen 22 °C:ssa spesifisesti sitoutunut 125I-EGF määritettiin. TGF-sisältö ilmaistiin sen 125I-EGF:n sitoutumista EGF-reseptoriin inhiboin-15 tiasteen avulla. Yksi EGF:n kanssa kilpaileva aktiivisuus-yksikkö määritellään määräksi proteiinia, joka estää 125I-EGF-sitoutumisen reseptoriinsa 50-%risesti.

Kasvumääritys pehmytagarilla

Pesäkekasvumääritys pehmytagarissa käyttäen normaa-20 Iin rotan munuaisfibroblasteja, kloonia 49F, suoritettiin kuten Todaro et ai. ovat esittäneet Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77 (1980) 5258 - 5262. Testattavat kylmäkuivatut näytteet muodostettiin uudelleen 0,5 ml:aan Dulbecco’n modifioitua Eagle’n väliainetta, jota oli täydennetty 10 %:lla 25 vasikan seerumia. Lisättiin 1,5 ml 0,5-%:sta (w/v) agaria (Difco) täydennetyssä väliaineessa ja 0,5 ml täydennettyä väliainetta, joka sisälsi 2,3 x 104 solua. 2,3 ml syntynyttä seosta pipetoitiin 2 ml:n pohjakerrokselle (0,5 % agaria täydennetyssä väliaineessa) 60 mm:n petrimaljoissa 30 (Falcon). Soluja inkuboitiin 37 °C:ssa kosteutetussa 5 % C02 ja 95 % ilmaa sisältävässä atmosfäärissä. Määritys luettiin kiinnittämättömänä ja värjäätymättömänä 5. päivänä ja 10 - 14. päivinä.

B. Tulokset 35 hTGFrlen lähde, väkevöinti ja alkufraktiointi hTGFrt eristettiin ihmisen erittäin muunnetun meta-staattisen melanoomasolulinjan, A2058, seerumittomasta 8145? 22 käsitellystä väliaineesta. hTGF:ien kvantitatiivinen määritys perustui kahteen sen ominaisuuteen: kykyyn indusoida normaalin rotan munuaisfibroblastien kiinnittymisestä riippumaton kasvu pehmytagarissa ja kyvystä kilpailla 125I-5 EGF:n kanssa EGF-reseptorikohdista ihmisen syöpäsoluissa A431. Yhteenveto vaiheista, jotka johtavat hTGF:ien eristämiseen ja sen talteenottoon, on esitetty taulukossa I.

23 81 497 :(0 :(0

_ -P

Λ — Μ I Μ ο ο *· λ m ο ο) ι ο ο ο νο νο 2 _ C Ηι—ΙΟΟ*·*· C"2 2

<0 tl) Ό M

<D O in 03 03 o ro r~ IU O

-PO dP O (Λ » » - — JS β H 4-> H in O1 U) -rl (0-P *a· -n1 ro — (0 Φ J· HO 00 > ±> 2 (fl β 00 -P ·Η

4-i δ Λ ^ σί . >1 C

tn β ,—ι r—ι j (O^.-h

0) I <u -H - - in lO -H c tP H

(Drn-P ro --- c tn 8 ^ G *H CO -P i—| H 30 <\) -H *H \ ·£"

•H Ό «0 μ h o (N ίο -H (0 :(0 P

G JS tn <W ro ro 8 PC :0 £ •H 33 PC oo ίο 3 M A! « H CP 4-> I *«. Λ (0 Ä ,

:<P ·—I ro f—I C -H

> oj «o G tn “ tn 03 ΓΜ -H -H PC -5 :(0 β 3 g £ « >i ^ +> Q> 3 ^ 3 .¾ tn l C tn :(0 μ · vo ·2 >1H •H-HtO'n* rH 00030 tl) G O :2 rH tl) Ph > PC *· - r^^uoo o -h >-h 8 μ O β -h -h pc «a· tn ι—ι o o tn -h _

(U-Ptutn-H-H * - tn x G

p d d ai +i ω oo c >i :2 •H 3 -H CP PC PC 00 (0 >1 in in tn h tn ίο >ι o Ό >-h - ή :<0 3 (fl r-H 1-1 ^4 (Ö G I p

G _ G G rH

oo .μ (0 0 -H

m p tn to ^ (0O<GM

O 0) tn (fl 3 :r0 G CP (fl :n3

n P G > 3 :o tn 03 f'-rooovo -H (fl > ;G

< Ο (0 Q) tn x CM 03 r^rocNi'- Ό JS tl) E · G M h h pc in (N ooio^r μ o ή -h

C Q) ·Η ^ -H ** ^ v k. ^ t. fOCO*^4-J

0) tl) G (fl -H M (N <N 1-H rH Ό-Η Mtn •ro 4-> ·· CP-H pc β g β PC qj 3 H (n H P >, (0 (0 -H -H tn H (0 O -ι-l PC 4J -Η tn ..

0 H W PC (fl tn -H -p 4C <*o

tn (0 3 -P >3 I

(0 -H G 4-> -H tn o

Big ω tn ro 2 1/1

OG-h in afl 3 > G

O Q) 3 -H M H -ppfötnnj

Gtu-Pd) o r~ r~ in o o +j <D JS ·μ tn

(0 -p -P -P 01 CS ro »»(MO >i CP > G

H H dl o 8 O 00 03 >. V Hfl β Ή -H

0) (0 -P μ *· OM rH O O x tn dl P H

ε h o cp rH >, ό -μ μ — g -μ g ·* o

G -H -H -H 3 Ό -P

Φ ι—ι —» -h μ tn cp tn -H -H 4J :(0 -H (0 Q) H -H H -P :(0 > > tn ε <u μο ω g -h <u o •β ei -μ e p ·η p p

•h ·Η :(fl -rH nj -H G -P -H

(OrH coca μ ω pc 2 β

G -H rH 1100 :(0 G <0 öi <D

Q) H :(0 O O 4-1 μ Λ H P 10

e :(0:(0 H H dl a 8 > G -j -H

•h > (¾ l ι tn I -h O pc ε 8 a a o h ·Η tn 3 (0 3G — — ή p h Λ p

-μ 4-> Q) >1>1 G (fl p td O

tn -H G o-P-Pcooo ·μ -P ·Η t® O

•rl <u 0-r4<l)rH4J-PrHrH H -H M G 4->

Ό JS -HO-PIOtUCJU O .p <D 2 -H

•G -H pc PC tn cp -P -P G CP 4C m 3 to ίο 3 0 tn tn pc PC o it in

H Cp > > -H GrH -H -H (Öio β> β G

tn l r-π ο Ό Ό CP CP CPpCG···· Οβ G ooO(flOJSJS«Ö(fl lii r OI h 14 PC <u 4J m a> ι >( >( O O -Hminoo PC-μ tn o CP Q) O GG « .j P W «

3 ·μ nj (OH H O O G .. -P I

rHPn Ό e SO n CC 03 Ofc-P-HH

3 U -G pc U 3 tn in

rOE-i 3 ·· · ·· OH 3 PC tN

H JS CP rH (N ro in 14 ΐ H Ch h to λ 81 497 24

Seerumlprotellnien poistamiseksi A2058-soluja pestiin perusteellisesti Waymouth'in väliaineella ennen niiden viljelemistä seerumittomassa väliaineessa. Superna-tanttinesteet otettiin talteen joka toinen päivä kahden 5 viikon ajan. Viljelyolosuhteet olivat sellaiset, että vil-jelyjakson lopussa yli 90 % soluista oli vielä elinvoimaisia ja kiinnittyivät yksisoluisina kerroksina. Ensimmäinen selkeytetty 136 l:n määrä A-2058 -käsiteltyä väliainetta, joka sisälsi 1,02 g kokona!sprotelinla ja 4525 10 yksikköä EGF:n kanssa kilpailevaa aktiivisuutta, väkevöit-lin n. 900 ml:ksl käyttäen onttokuituväkevölmislaitetta, jonka patruunoiden molekyylipainoraja oli 5000. Koko EGF:n kanssa kilpaileva aktiivisuus pidättyi ja saanto oli yli 95 %.

15 Väkevöidyn A2058-käsitellyn väliaineen dialyysi etikkahappoa vastaan ja senjälkeinen sentrifugointi tuottivat 95 %:n saannon alkuperäisestä EGF:n kanssa kilpailevasta kokonaisaktlivisuudesta. 18 % proteiinista oli happoon liukenematonta ja hylättiin. Happoliukoinen, osittain 20 puhdistettu hTGF saatettiin geelisuodatuskromatografiaan käyttäen Bio-Gel P-10 -geeliä. Pylväs eluoitiin 1 M etikka-hapolla. Kontaminoivan proteiinin päämassa eluoitiin yhdellä pylvään tilavuudella ja erottui hyvin EGF:n kanssa kilpailevasta aktiivisuudesta ja kasvua stimuloivasta ak-25 tiivisuudesta. Kahden aktiivisuushulpun havaittiin olevan hyvin erillään toisistaan. Fraktioiden, joilla oli sekä EGF:n kanssa kilpaileva että kasvua stimuloiva aktiivisuus (P-10-A ja P-10-B), näennäiset molekyylipainot olivat 10 500 ja 6 800, vastaavasti. Fraktioita, joilla oli vain 30 toinen näistä kahdesta aktiivisuudesta, ei havaittu.

hTGF:ää sisältävät fraktiot yhdistettiin, kuten on esitetty, kylmäkuivattiin ja puhdistettiin edelleen. Suurempimo-lekyylipainoinen TGF eluoitui pylväästä leveänä piikkinä (P-10-A) ja näytti liittyvän erikokoisiin polypeptideihin. 35 P-10-A sisälsi 46 % alkuperäisestä EGF:n kanssa kilpaile vasta aktiivisuudesta. Pienimolekyylipainoinen TGF eluoi- , 81497 25

tui pylväästä terävänä pilkkinä (P-10-B) ja edusti 45 % alkuperäisestä EGF:n kanssa kilpailevasta kokonaisak-tiivisuudesta. Pylvääseen viedyn EGF:n kanssa kilpailevan aktiivisuuden yhteinen saanto vaiheesta 1 geelisuodatus-5 kromatografia-vaiheen läpi oli 91 % (taulukko I). hTGF

eluoitui kahtena erillisenä pääpiikkinä, jotka vaihtelivat kvantitatiivisesti valmistuksesta toiseen. A2058-käsitel-lyn väliaineen joissakin valmisteissa oleellisesti kaikki kasvua edistävä aktiivisuus oli hTGF:ien alueella.

10 hTGF:ien puhdistaminen hTGF:t puhdistettiin edelleen käänteisfaasi-HPLC:llä. Väkevöidyn A2058-käsitellyn väliaineen happoliu-koisen, EGF:n kanssa kilpailevan aktiivisuuden geelisuoda-tuskromatografian jälkeen Bio-Gel P-10 -geeliä käyttäen 15 yhdistetty P-10-B-erä muodostettiin uudelleen 0,05-%:iseen trifluorietikkahappoon vedessä ja kromatograf oltiin sitten pBondapak C18 -kolonnilla. Yksittäisten fraktioiden EGF:n kanssa kilpaileva ja kasvua stimuloiva aktiivisuus pehmyt-agarissa määritettiin. hTGF:t erotettiin hyvin kontaminoi-20 van proteiinin päämassasta, joka eluoitui orgaanisen liuottimen suuremmilla väkevyyksillä. hTGF:t sisältävät fraktiot yhdistettiin, kylmäkuivattiin ja otettiin uudelleen kromatografoitaviksi. Saatiin hTGF:ien 57-kertainen puhdistuminen geelisuodatuskromatografian jälkeen. 80 % 25 alkuperäisestä EGF:n kanssa kilpailevasta aktiivisuudesta P-10-B-erässä otettiin talteen (taulukko I).

hTGF:t sisältävien fraktioiden uudelleenkromatogra-fointi pBondapak C18 -kantajalle valittiin lopulliseksi puhdistusvaiheeksi, koska näillä pylväillä havaittiin ai-30 noastaan suhteellisen pieniä EGF:n kanssa kilpailevan aktiivisuuden häviöitä. hTGF:ien selvän erottumisen epäpuhtauksista saavuttamiseksi oli tarpeen käyttää loivaa lineaarista 1-propanoli-gradienttia 0,035-%:isessa trifluori-etikkahapossa. Kontaminoivan peptidiaineksen päämassa 35 erottui hyvin määritellystä aktiivisuuspiikistä. EGF:n kanssa kilpaileva ja kasvua stimuloiva aktiivisuus puhdis- 26 81 497 tulvat rinnakkain ja niillä oli selvästi erottuvat absor-boivuuspiikit 13-%:isessa 1-propanolIssa. Fraktiot, jotka sisälsivät hTGF:t, yhdistettiin ja analysoitiin edelleen. hTGF:ien puhdistuminen oli n. 7000-kertainen geelisuoda-5 tuskromatografian jälkeen saannon ollessa 33 % alkuperäisestä EGF:n kanssa kilpailevasta kokonaisaktiivisuudesta. hTGF:ien kokonaissaanto vaiheesta 3 loppuilisen käänteis-faasi-HPLC-vaiheen läpi oli 73 % ja saanto vaihetta kohti oli 80 - 100 % (taulukko I).

10 hTGF:ien karakterisointi

Lopullisen hTGF-valmisteen puhtaus määritettiin analyyttisellä SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesil-la. Geeli värjättiin hopealla. Havaittiin yksi pääpolypep-tidinauha, jonka näennäinen Mr oli 7400. Sama kuviomalli 15 saatiin, kun näytteistä ajettiin elektroforeesi pelkistä-mättömissä olosuhteissa, mikä osoittaa, että TGF on yksi-ketjuinen molekyyli.

hTGF:ien reseptorireaktiivisuutta verrattiin EGF:ään radioreseptorimäärityksellä. hTGF:ien kvantitatii-20 vinen määritys perustui rinnakkaisnäytteen aminohappoana-lyysiin. Sekä hTGF:t että EGF kilpailivat 125I-EGF:n kanssa ihmisen A431-syöpäsolujen EGF-reseptoripaikoista. hTGF:ien spesifisen EGF:n kanssa kilpailevan aktiivisuuden havaittiin olevan 1 - 1,5 x 106 yksikköä/mg; hTGF:iä tai EGF:ää 25 tarvittiin 1,1 ng estämään EGF:ien sitoutuminen 50-%:ises-ti.

hTGF:t mahdollistivat normaalien kiinnittymisestä riippuvaisten rotan munuaissolujen, kloonin 49F, kasvamisen pehmytagarissa. hTRF:ien puolimaksimaalinen vaste peh-30 mytagarissa saavutettiin 1 EGF:n kanssa kilpailevalla yksiköllä tai 1,1 ng:lla hTGF:iä, kun taas EGF ei stimuloi näiden solujen kasvua pehmytagarissa edes testattuna jopa 10 pg:lla.

35 li 81 497 27

Esimerkki II

Ihmisen (hTGF), rotan (rTGF) ja hiiren (mTGF) muun-tokasvutekijöiden tuotanto suuressa mittakaavassa, puhdistaminen ja aminohapposekvenolntl 5 A. Kokeelliset menetelmät TGF:n lähde rTGF, mTGF ja hTGF puhdistettiin seerumittomasta väliaineesta, joka oli käsitelty Fisher'in rotan sikiöfib-roblasteilla, FRE CLIO, FRE 3A:n alakloonilla [Sacks et 10 ai.. Virology 97 (1979) 231 - 240], joka oli muunnettu ei-tuottavaksi Snyder-Theilen'in kissan sarkoomaviruksella [Snyder et ai. Nature (Lond) 221 (1969) 1074 - 1075], Moloney'n hiirien sarkoomaviruksella muunnetulla 3T3-solu-linjalla 3B11-IC [Bassin et ai. Int. J. Cancer 6 (1970) 15 95 - 107], ja kahdella Ihmisen metastaattisella melanooma- solulinjalla, A2058 (ks. esimerkki I) ja A375 [Girad et ai., J. Natl. Cancer Inst. 51 (1973) 1417 - 1423], vastaavasti. Soluja kasvatettiin 2 l:n muovisissa kiertopullois-sa, jotka sisälsivät Dulbecco'n modifioitua Eagle'n väli-20 ainetta täydennettynä 10 %:lla vasikan seerumia, ja ylläpidettiin sen jälkeen seerumittomassa Waymouth'in väliaineessa, kuten DeLarco et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75 (1978) 4001 -4005, ovat selostaneet. Seerumiton käsitelty väliaine koottiin talteen joka 24. tunti 3 päivän 25 ajan, selkeytettiin jatkuvavirtaussentrifugoinnilla ja supernatantti väkevöitiin [Marquardt et ai., J. of Biol. Chem. 255 (1980) 9177 - 9181]. Käsitellyn väliaineen kon-sentraatti oli lähtöaine TGF:ien puhdistusta varten.

TGF:ien puhdistaminen 30 TGF:t valmistettiin oleellisesti edellä esimerkissä I melanoomaperäisen hTGF:n puhdistamiselle selostetuin menetelmin. Käsitellyn väliaineen ultrasuodatuksen jälkeinen retentaatti dialysoitiin 0,1 M etikkahappoa vastaan ja sentrifugoinnin jälkeen saatu supernatantti väkevöitiin 35 kylmäkuivaarnalla ja liuotettiin uudelleen 1 M etikkahap- poon myöhempää geelisuodatuskromatografiaa varten Bio-Gel 81 497 28 P-10 -pylväällä (2,5 x 85 cm, 200-400 mesh, Rio-Rad Laboratories). Pylväs tasapainotettiin 1 M etikkahapolla. Fraktiot, jotka sisälsivät pääosan EGF:n kanssa kilpailevasta aktiivisuudesta ja joiden näennäinen molekyylipaino 5 oli 7 000, yhdistettiin ja kylmäkuivattiin.

rTGF:n, mTGF:n ja hTGF:n lopullinen puhdistaminen tapahtui käänteisfaasi-HPLC:llä käyttäen esimerkissä 1 kuvattua kromatografiasysteemiä. Erotukset suoritettiin pBondapak C18 -kolonnilla (partikkelikoko 10 pm, 0,39 x 30 10 cm, Waters Associates). Liikkuva faasi oli 0,05 % trifluo-rietikkahappo ja liikkuvan faasin modifioija oli asetonit-riili, joka sisälsi 0,045 % trifluorietikkahappoa. Asetoni triilin väkevyyttä nostettiin lineaarisesti (0,083 %/min) 2 tunnin aikana virtausnopeudella 1 ml/min 15 40 °C:ssa peptidien eluoimiseksi. Yhdistetyt TGFrää sisäl tävät erät kylmäkuivattiin ja liuotesttiin uudelleen 0,05-%:iseen trifluorietikkahappoon ja kromatografoltiin uudelleen samassa pylväässä käyttäen liikkuvan faasin modifioi-jana 1-propanolia, joka sisälsi 0,035 % trifluorietikka-20 happoa. 1-propanolin väkevyyttä nostettiin lineaarisesti (0,05 %/min) 2 tunnin aikana virtausnopeudella 1 ml/min 40 °C:ssa. Fraktioiden yhdistetyt erät, jotka sisälsivät pääosan EGF:n kanssa kilpailevasta aktiivisuudesta, kylmä-kuivattiin.

25 TGF:n määritysmenetelmä TGF määritettiin kvantitatiivisesti radioreseptori-määrityksellä, joka perustuu reseptorin ristireaktiivisuu-teen hiiren leuanalussylkirauhasen orvaskeden kasvutekijän (mEGF) kanssa. Puhdistettu mEGF leimattiin Na125I:lla klor-30 amiini-T -menetelmän muunnoksella, kuten esimerkissä I selostettiin. 125I-EGF:n sitomisanalyysi suoritettiin formaliinilla kiinnitetyillä ihmisen A431 -syöpäsoluilla, 8 x 103, Micro Test II -levyillä (Falcon). TGF:n väkevyys ilmaistiin mEGF ng-ekvivalentteina/ml ja perustui TGF:n mää-35 rään, joka tarvitaan aikaansaamaan yhtä suuri 125I-EGF:n 81 497 29 sitoutumisen A431-soluihin estyminen kuin tunnetulla määrällä leimaamatonta mE6F:ä.

TGF:n aminohapposekvenssin määritys Aminohapposekvenssianalyysiä varten rTGF (3 pg) 5 pelkistettiin ditiotreitolilla (20 mM) 100 pl:ssa Tris-HCl-puskuria (0,4 M), joka sisälsi guanidiini-HCl (6 M) ja Na2-EDTA (0,1 %), pH 8,5, 2 h 50 °C:ssa, ja S-karboksiami-dometyloitiin sen jälkeen jodiasetamidilla (45 mM) 30 min 22 °C:ssa. S-karboksiamidometyloidusta rTGF:sta poistet-10 tiin suolat pBondapak C18 -kolonnilla. Peptidi eluoitiin vesipitoisen asetonitriilin, joka sisälsi 0,045 % trifluo-rietikkahappoa, gradientilla. Asetonitriilin väkevyyttä nostettiin lineaarisesti (1 %/min) 1 h ajan virtausnopeudella 1 ml/min 40 °C:ssa.

15 S-karboksiamidometyloidun rTGF:n ja modifioimat- tomanmTGF:n ja hTGF:n automatisoidut sekvenssianalyysit [Edman et ai., Eur. J. Biochem. 1 (1967) 80 - 91] suoritettiin kaasu-neste-kiinteäfaasimikrosekvenaattorilla [Hewick et ai., J. of Biol. Chem. 256 (1981) 7990 - 7997]. 20 Sekvenaattorifraktiot analysoitiin käänteisfaasi-HPLC:llä [Hunkapiller et ai., Science 219 (1983) 650 - 659].

B. Tulokset TGF:n puhdistus

Pienimolekyylipainoisen rTGF:n, mTGF:n ja hTGF:n 25 puhdistettuja valmisteita saatiin retroviruksella muunnet tujen rotan ja hiiren fibroblastien ja ihmisen kahden me-lanoomasolulinjan käsitellystä väliaineesta, vastaavasti. Puhdistaminen tapahtui happoliukoisen EGF:n kanssa kilpailevan aktiivisuuden geelisuodatuskromatografialla Bio-30 Gel P-10 -geelillä 1 M etikkahapossa, mitä seurasi kään-teisfaasi-HPLC pBondapak C18 -kantajalla käyttäen peräkkäin vesipitoisen asetonitriilin lineaarista gradienttia ja sen jälkeen 1-propanolin, joka sisälsi 0,035 % trifluorietik-kahappoa, suoraviivaista gradienttia. rTGF:n, mTGF:n ja 35 hTGF:n lopullisen puhdistusvaiheen elutiomallit osoitta- 30 81 497 vat, että EGF:n kanssa kilpaileva aktiivisuus puhdistui rinnan selvästi erottuvan absorbanssipiikin kanssa ja erottui tehokkaasti kontaminoivasta, UV-absorboivasta aineksesta. Proteiinin pääpiikki rTGF-, mTGF- ja hTGF-vai-5 misteissa eluoitui pBondapak C18 -pylväästä standardiolo-suhteissa ajassa 48 - 55 minuuttia.

Geelisuodatuskromatografia Bio-Gel P-10 -geelillä aikaansai pienimolekyylipainoisten TGF:ien erottumisen suurempimolekyylipainoisista TGF:istä ja vähensi pBondapak 10 C18 -pylvääseen lisättyä proteiinimäärää seuraavassa puh- distusvaiheessa. Pienimolekyylipainoiset TGF:t edustivat 45 -80 % alkuperäisestä EGF:n kanssa kilpailevasta koko-naisaktiivisuudesta. TGF:ien käänteisfaasi-HPLC pBondapak C18 -kantajalla seuraavassa kahdessa puhdistusvaiheessa oli 15 hyvin tehokas kummankin antaessa tyypillisellä valmisteella saannon 80 - 100 % vaihetta kohti. Pienimolekyylipainoisten TGFiien lopullinen saanto oli n. 70 % laskettuna maksimaalisesta puhdistuksen kuluessa havaitusta EGF:n kanssa kilpailevasta kokonaisaktiivisuudesta- Puhdistetun 20 rTGF:n keskisaanto oli 90 ng/1, mTGF:n 50 ng/1 ja hTGF:n 10 ng/1 käsiteltyä väliainetta. Tämä laskelma perustuu spesifiseen aktiivisuuteen, joka on määritetty eristetyille TGF:ille olettaen, että EGF:n kanssa kilpaileva aktiivisuus mitattuna radioreseptorimääritysmenetelmällä hei-25 jastaa pelkästään pieni- ja suurimolekyylipainoisten TGF:ien kokonaispitoisuuksia. Immunoreaktiivista mEGF ei havaittu käsitellyssä väliaineessa.

TGF:n puhtaus rTGF:n, mTGF:n ja hTGF:n puhtaus saatuna kromato-30 grafisillä elutioprofiileilla määritettiin EGF-radioresep- torimääritysmenetelmällä ja aminohapposekvenssianalyysil-lä. rTGF, mTGF ja hTGF kilpailivat 125I-EGF:n kanssa EGF-reseptoripaikoista ihmisen A431-syöpäsoluilla ja olivat kvalitatiivisesti ja kvantitatiivisesti lähes erottumatto-35 mia mEGFrstä. Siten lopullisten TGF-valmisteiden uskottiin

II

31 81497 olevan erittäin puhtaita ja pääasiallisesti homogeenisia. Yksi ainoa aminotermlnaalinen sekvenssi määritettiin rTGF:lle, mTGF:lie ja hTGF:lle automatisoidulla Edman-ha-joituksella. Mikä tahansa suojaamaton vähäinen peptidisek-5 venssi, jota on läsnä yli 5 %, olisi voitu havaita käytetyillä menetelmillä. hTGF:n homogeenisyys vahvistettiin lisäksi analyyttisellä natriumdodekyylisulfaattipolyakryy-liamidigeelielektroforeesilla. Puhdistettu valmiste antoi yhden suuren polypeptidinauhan.

10 TGF;n aminohapposekvenointi rTGF:n, mTGF:n ja hTGF:n täydellinen sekvenointi suoritettiin ja näiden kolmen polypeptidin aminohapposekvenssit on annettu seuraavassa. Esitetyistä sekvensseistä havaitaan, että rTGF ja mTGF ovat kemialliselta rakenteel-15 taan identtisiä ja lisäksi, että oleellinen homologia on olemassa hiirien TGF:ien ja hTGF:ien välillä ja erilaisia aminohappotähteitä esiintyy ainoastaan harvoissa asemissa (7, 15, 23 ja 38) sekvensseissä.

(1) rTGF 5 10 20 Val-vai-ser-His-Phe-Asn-Lys-Cys-Pro-Asp-Ser-His- 15 20

Thr-Gln-Tyr-Cys-Phe-His-Gly-Thr-Cys-Arg-Phe-Leu- ; 25 30 35

Val-Gln-Glu-Glu-Lys-Pro—Ala-Cys-Val-Cys-His-Ser-40 45

Gly-Tyr-Val-Gly-Val-Arg-Cys-Glu-His-Ala-Asp-Leu-25 50

Leu-Ala :X; (2) mTGF 5 10

Val-Val-Ser-His-Phe-Asn-Lys-Cys-Pro-Asp-Ser-His-15 20

Thr-Gln-Tyr-Cys-Phe-His-Gly-Thr-Cys-Arg-Phe-Leu- 30 25 30 35

Val-Gln-Glu-Glu-Lys-Pro-Ala-Cys-Val-Cys-His-Ser- 40 45

Gly-Tyr-Val-Gly-Val-Arg-Cys-Glu-His-Ala-Asp-Leu- : - : 50

Leu-Ala (3) hTGF 5 10 '···' 35 Val-Val-Ser-His-Phe-Asn-Asp-Cys-Pro-Asp-Ser-His- 15 20 ' ' Thr-Gln-Phe-Cys-Phe-His-Gly-Thr-Cys-Arg-Phe-Leu- 25 30 35 ' ' Val-Gln-Glu-Asp-Lys-Pro-Ala-Cys-Val-Cys-His-Ser- 40 45

Gly-Tyr-Val-Gly-Ala-Arg-Cys-Glu-His-Ala-Asp-Leu-

Leu-Ala 32 81497

Esimerkki III

TGF:n tuottaminen in vivo ja sen eristäminen

Kasvainsolulinjoja (1 x 106), joiden tiedetään tuottavan (ihmisen melanooma- ja muunnettuja rotan) TGF:iä, 5 siirrettiin kateenkorvattomiin "karvattomiin" hiiriin ja kasvainten annettiin kehittyä. Kasvainta kantavien hiirten virtsa koottiin ja analysoitiin TGF:n läsnäolon suhteen käyttäen edellä esimerkissä 1 annettua eristämismenetelmää ja analyyttisiä menetelmiä. Kasvainta kantavien hiirien 10 virtsasta havaittiin TGF, jolla on sama koko ja eluoitu-misominaisuudet HPLC:ssä kuin soluviljelystä saadulla TGFsllä, jota on edellä selostettu esimerkeissä I ja II. Edelleen käyttäen edellä esimerkissä I selostettuja menetelmiä havaittiin hiirien virtsassa läsnäolevalla TGF:llä 15 olevan luonteenomaiset TGF:n biologiset ominaisuudet siinä, että se stimuloi solujen kiinnittymisestä riippumatonta kasvua ja sitoutuu EGF-reseptoriin. Sen jälkeen kasvaimet poistettiin kasvainta kantavista hiiristä ja hiirien virtsa testattiin kasvaimen poiston jälkeen TGF:n läsnä-20 olon suhteen käyttäen edellä mainittuja menetelmiä. Tässä tapauksessa ei havaittu TGF:ää, jolla olisi luonteenomaiset eluoitumisominaisuudet HPLC:ssä tai TGF:n kaltainen biologinen aktiivisuus. Nämä tulokset osoittavat, että kasvainsolut tuottavat TGF:ää kokonaisissa eläimissä yhtä 25 hyvin kuin soluviljelmissä ja että TGF voidaan havaita kehon nesteissä ja eristää niistä käyttäen edellä kuvattuja menetelmiä. Samanlaisia kokeita suoritettiin myös rotilla, joilla oli kemiallisesti karsinogeenilla indusoituja kasvaimia ja niillä havaittiin olevan TGF:ää virtsas-30 saan, edellä lueteltujen biologisten ja biokemiallisten ominaisuuksien perusteella, kun taas käsittelemättömillä rotilla ei ollut.

II

35 81 497 33

Esimerkki IV

Retroviruksella muunnettujen solujen kasvun estäminen in vitro vasta-aineilla antigeeniselle TGF-oligopep-tidille 5 Oligopeptidi, jolla oli seuraava aminohapposekvens si (joka vastaa rotan TGF:n aminohapposekvenssejä 34 -50):

Cys-His-Ser-Gly-Tyr-Val-Gly-Val-Arg-Cys-His-Ala-

Asp-Leu-Leu-Ala 10 syntetisoitiin käyttäen Ohgak et ai.'in, Journal of Immunol. Meth. 57 (1983) 171 - 184, kiinteäfaasimenetelmää. Tämä oligopeptidi kytkettiin sitten tulivuorikotilon hemo-syaniiniin Baron et ai.'in, Cell 28 (1982) 395 - 404, menetelmän mukaisesti ja käytettiin kaniinien immunisointiin 15 [Baron et ai., Cell 28 (1982) 395 - 404] ja lampaiden [Lerner, Nature 299 (1982) 592 - 596] immunisointiin. An-tiseerumeita analysoitiin peptidiä vastaan peroksidaasi-kytketyllä immunoanalyysillä (Kirkegaard ja Perry Laboratories Gaithersberg, MD) ja homogeenistä rotan TGF:ää vas-20 taan (puhdistettu edellä esimerkin II mukaisesti) immu-nosaostamalla [Bister et ai., J. Virol. 36 (1980) 617 -621] ja Western-blotting -menetelmin [Burnetti, Analyt. Biochem. 112 (1981) 195 - 203]. 125I-leimatun rotan TGF:n ja hiiren EGF:n (Bethesda Research Labs, Bethesda MD) sitou-25 tuminen A431-soluihin, jotka oli kasvatettu 96-kuoppaisil-la mikrotiitterilevyillä, oli kuten Pruss et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977) 3918 - 3921, ovat selostaneet .

Antiseerumit, jotka oli valmistettu yhdessä kanii-30 nissa ja kahdessa lampaassa, saatettiin reagoimaan vastaavan peptidin kanssa peroksidaasi-kytketyissä immunoana-lyyseissä tiittereinä vähintään 104. Kaniinin antiseerumin reaktiot rotan TGF:n kanssa varmistettiin immunosaostuk-sella ja varmistettiin Western-blotting -menetelmällä. An-35 tipeptidiantiseerumit eivät immunosaostaneet jodattua hii- 81 497 34 ren EGF:tä tässä tutkimuksessa. Ihmisen A431-orvaskesisyö-päsoluissa on 106 ylimääräistä EGF-reseptoria solua kohti [Fabricant et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977) 565 -569]. TGF kilpailee EGF:n kanssa sitoutumisesta näi-5 hin reseptoreihin. l2SI-leimatun rotan TGF:n sitoutuminen näihin soluihin estettiin ylimäärällä leimaamatonta EGF:ää ja antiseerumilla peptidiä vastaan. Antiseerumin estovaikutus TGF:n sitoutumiseen havaittiin myös, vaikka vasta-aine-TGF-kompleksia ei poistettu A431-soluja ympäröivästä 10 väliaineesta S. aureuksen proteiini A:11a helpotetulla immunosaostuksella. Estyminen vasta-aineella johtui vuorovaikutuksesta TGF-molekyylin kanssa eikä reseptorin kanssa, koska antiseerumit eivät reagoineet immunosaostusana-lyyseissä puhdistetun jodatun EGF-reseptorin kanssa. Kuten 15 immunosaostustuloksien perusteella voitiin odottaa peptidejä vastaan muodostettu antiseerumi ei häirinnyt hiirien EGF:n sitoutumista A431-soluihin.

Kun oli käytettävissä antiseerumeja, jotka estivät TGF:n mutta eivät EGF:n sellulaarisen sitoutumisen, oli 20 mahdollista testata, toimiiko TGF autokriinisellä mekanismilla stimuloiden pahanlaatuisten solujen kasvua ja voiko vasta-aine täten estää tällaisen kasvun in vitro. Niinpä muuntamattomia, normaaleja rotan munuaissoluja (NRK) ja joukko erilaisia retrovirussolulinjoja levitettiin levylle 25 pienissä tiheyksissä (500 - 2000 solua/malja) seerumia sisältävässä väliaineessa ja vaihdettiin lyhyen tarttumis-ajan jälkeen seerumittomaan väliaineeseen. Väliaineeseen lisättiin lampaan tai kaniinin vasta-aineita TGF-peptidil-le tai erilaisille asiaankuulumattomille, ristiin reagoi-30 mattomille peptideille ja tarkkailtiin vaikutusta solukas-vuun, mikroskooppiseen ja makroskooppiseen pesäkemuodos-tukseen sekä pesäkemorfologiaan. Kaikki vasta-aineet olivat yhtäläisesti puhdistettuja peptidipylväissä, perusteellisesti dialysoituja, väkevöityjä ja uudelleenliuotet-35 tuja antipeptiditiitteriin 103 - 104. Tulokset annetaan seuraavassa taulukossa II.

„ 81497 35

Taulukko II

Antipeptidi-vasta-aineiden vaikutus solujen kasvuun in vitro

Pesäkkeen muodos- ® Vasta-aine Lähde Tilavuus Muu lisä- tumisen estymis-% (μg/1) aine NRK- CL10- so- so- Ki- src- luil- luil- NRK: 3T3: _la la 11a 11a

Anti-TGF

10 oligopeptidi Kaniini 5 - 085NT53 5 TGF peptidi NT 36 NT 6

Anti-TGF

oligopeptidi Lammas 2 0 50 49 NT

5 0 68 85 77 15 10 0 79 73 100 5 TGF peptidi NT 9 20 43

5 asiaankuulu- NT 85 NT NT

maton peptidi

Anti-hetero- Lammas & 20 peptidit (4) kaniini 0 <15 <5 0

Kuten edellä esitetystä taulukosta II nähdään, ei 25 kaniinin eikä lampaan anti-TGF-oligopeptidi estänyt pesäkkeen muodostumista NRK-soluilla, mutta esti 48 tunnissa Kirsten-muunnettujen NRK-solujen, kissan sarkoomaviruksel-la muunnettujen rotan sikiöfibroblastien (CLIO) solujen ja Rousin sarkoomaviruksella muunnettujen 3T3-solujen kasvun.

30 CLIO-solujen tiedettiin olevan tuotteliaita TGF:n tuottajia [Marquardt et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80 (1983) 4684 - 4688]. Muutamat eloonjääneet pesäkkeet anti-TGF-vasta-aineella käsitellyissä soluissa pyrkivät olemaan pienempiä ja niistä puuttui normaalien pesäkkeiden roteva 35 ulkonäkö. Tarttumattomia, hajoittamattomia soluja kellui vapaana väliaineessa. Tämä estyminen kumoitui osittain, 36 81 497 kun TGF-peptidiä, mutta ei ristiin reagoimatonta asiaankuulumatonta peptidiä, lisättiin samanaikaisesti TGF:n vastaan muodostetun vasta-aineen kanssa. Kaniinin ja hiiren vasta-aineilla neljälle erilaiselle ristiin reagoimat-5 tomalle peptidille ei ollut vaikutusta NRK:n pesäkkeiden tai retroviruksella muunnettujen solulinjojen kasvuun. Vasta-ainetta sisältävän väliaineen korvaamisella tuoreella, vasta-ainetta sisältämättömällä vapaalla väliaineella 72 tunnin kuluttua ei onnistuttu kumoamaan pesäkkeen muo-10 dostuksen estämistä, mutta eloonjääneet pesäkkeet kasvoi-vat rajusti.

Esimerkki V

Rotan TGF:n synteesi ja karakterisointi

Rotan TGF:n (rTGF), jolla oli esimerkissä II annet-15 tu kemiallinen kaava, kemiallinen synteesi suoritettiin käsin vaiheittaisella kiinteäfaasimenetelmällä Merri-field'in, J. Amer. Chem. Soc. 85 (1963) 2149 - 2156, selostamien yleisten periaatteiden mukaisesti. Differentiaalinen happolabiili suojaryhmä -strategiaa sovellettiin tä-20 hän synteesiin yhdessä N-aminopään tert.-butyylioksikarbo-nyylin ja sivuketjujen bentsyylialkoholijohdannaisten tavanomaisen yhdistämisen kanssa. Paremmin happoa kestävää bentsyyliesterisidontaa, Joka kiinnitti suojatut aminohapot polymeerikantajaan, käytettiin peptidihäviöiden mini-25 moimiseksi toistuvien happokäsittelyjen aikana [Mitchell et ai., J. Amer. Chem. Soc. 92 (1976) 7357 - 7362]. Täydellinen suojauksen purkaminen ja peptidin poistaminen hartsista tapahtuivat Tam et ai.'in, Tetrahedron Lett. 23 (1982) 4435 - 4438, Low-High HF -menetelmän mukaisesti, 30 joka poikkesi tavanomaisesta HF -suojauksenpurkumenetel-mästä Ja poisti bentsyyli-suojaryhmät S„2-mekanismilla laimeassa HF-liuoksessa vakavien sivureaktioiden minimoimiseksi, jotka aiheutuvat hiilikationeista, joita kehittyy tavanomaisessa SNl-suojauksenpurkumenetelmässä. Lisäksi se 35 on myös suunniteltu vähentämään monia kysteinyyli-sivu-

II

81 497 37 reaktioita, jotka usein estävät monia disulfidisidoksia sisältävien proteiinien synteesin.

HF-käsittelyn jälkeen ja ennen mitään puhdistamista raaka ja pelkistetty synteettinen rTGF hapetettiin ja re-5 generoitiin seka-disulfidi-menetelmällä pelkistetyn ja hapetetun glutationin yhdistelmän läsnäollessa [Ahmed et ai., J. Biol. Chem. 250 (1975) 8477 - 8482]. Tällä vältettiin polymeeristen ainesten muodostuminen puhdistamisen aikana. Regeneroitu, puhdistamaton rTGF-Ι sisälsi 40-50 % 10 EGF-radioreseptoria ja tyrosiinispesifisiä proteiinikinaa-siaktiivisuuksia verrattuna luonnon-rTGF-Ι reen. Raaka synteettinen rTGF puhdistettiin homogeenisyyteen kolmessa vaiheessa: (1) geelisuodatuksella Bio-Gel P-10 -pylväällä; (2) ioninvaihtokromatografiällä CM-Sephadex-pylväällä; ja 15 (3) preparatiivisella korkeapainenestekromatografiällä (HPLC) C-18-käänteisfaasikolonnilla. Kokonaissaanto laskettuna Ala:n lähtömäärästä hartsiin oli 31 %.

Pelkistävissä tai pelkistämättömissä olosuhteissa puhdistetun synteettisen rTGF:n havaittiin antavan yhden 20 ainoan nauhan, jonka näennäinen molekyylipaino oli 7000 SDS-PAGE-elektroforeesilla. Aminohappoanalyysi 6 mol/1 HClrlla ja entsymaattisella hydrolyysillä antoivat ehdotetun sekvenssin odotetun teoreettisen moolisuhteen. Vapaata tiolia ei havaittu Ellman'in sulfhydryylin määrity-25 smenetelmällä synteettisestä rTGF:stä, mutta tiolyyttises- ti pelkistettäessä saatiin kuuden kysteiinin odotettu teoreettinen arvo. Nämä havainnot tukevat sitä johtopäätöstä, että synteettinen rTGF on yksiketjuinen polypeptidi, joka sisältää kuusi kysteiiniä disulfidisidoksissa, mikä on 30 sopusoinnussa luonnon rTGF:n odotettujen kemiallisten ominaisuuksien kanssa. Lisäksi synteettinen rTGF eluoitui yhdessä luonnon rTGF:n kanssa yhtenä ainoana symmetrisenä huippuna C-18-käänteisfaasi-HPLC:ssä.

35 81 497 38

Esimerkki VI

TGF-aktiivisuuden toteaminen syöpäpotilaiden virtsasta

Erilaisia virtsanäytteitä pidettiin 90 °C:ssa 1 5 min, kun niihin oli lisätty 1/9 tilavuudesta liuosta, joka sisälsi 20 % SDS:ää, 0,4 mol/1 DTT:tä, 0,4 mol/1 Hepesiä, 0,08 mol/1 natriumkloridia ja 1 mmol/1 EDTA:ta (pH 7,4). Näyte (20 μΐ) lisättiin inkubointiseokseen (kokonaistilavuus 50 μΐ), johon oli lisätty 1 % NP-40:tä. Näytettä, 10 esimerkin IV mukaista rotan TFG:n 17 aminohapon sekvenssille muodostettua vasta-ainetta ja 125I-leimattua synteettistä 17 aminohapon sekvenssiä inkuboitiin 96-kuoppaisilla levyillä 60 min ja sen jälkeen 30 min Pansorbinin kanssa. Vasta-aineeseen sitoutunut peptidi pelletoitiin dibutyyli-15 ftalaattialustalle, ja pelleteille tehtiin laskenta gamma-laskurissa käyttäen 3 mm:n paksuisia lyijysuojuksia pelle-toimattoman isotoopin suojaamiseen.

TGF-standardeina käytettiin synteettistä sekvenssiä ja konsentroidusta seerumittomasta modifioidusta kasvu-20 alustasta saatua ihmisen melanooma (solulinja A375) -TGF:ää. Kussakin kokeessa analysoitiin yksi tai useampia normaaleja näytteitä, ja keskimääräisen normaaliarvon katsottiin vastaavan yhtä suhteellista TGF-ekvivalenttia.

A. Näytteen valmistus 25 Tuoreita, selkeyttämättömiä virtsanäytteitä säily tettiin 25 ml:n annoksina lämpötilassa -70 eC korkeintaan 6 kk. Useimmissa tapauksissa näytteet sulatettiin nopeasti, ja niitä käsiteltiin välittömästi proteaasi-inhibiit-toreilla (0,5 m/mol fenyylimetyylisulfonyylifluoridi, 0,05 30 m/mol pepstatiini A, Sigma Chemical Co.) 30 min lämpötilassa 4 °C. Kymmenen millilitran näytteet dialysoitiin sitten lämpötilassa 4 °C joko 0,1 M etikkahappoa tai 0,1 M ammoniumbikarbonaattia vastaan. Käytettiin kolmea eri huokoskokoa olevia dialyysiletkuja: 3 500, 6 000 - 8 000; tai 35 12 000 - 14 000. (Joissakin tapauksissa virtsa kylmäkui- 39 81 497 vattiin ja uutettiin ensin, mutta neutralointi- ja etano-li/eetterisaostusvaiheet jätettiin pois.) 2-4 vrk kestäneen dialysoinnin jälkeen virtsat selkeytettiin (kiihtyvyys 10 000 g, 10 min), kylmäkuivat-5 tiin, liuotettiin 50-kertaiseksi pitoisuudeksi alkuperäiseen nähden 5 m/mol muurahaishappoon, joka sisälsi 50 mmol/1 natriumkloridia, ja selkeytettiin sitten nopeasti (12 000 g, 1 min) ennen esikäsittelyä.

B. Kreatlnlinlanalyyslt 10 Kustakin näytteestä testattiin kahtena rinnakkais- määrityksenä kreatiniini käyttäen manuaalista kolorimet-ristä määritystä.

C. Tulokset Näytteet normalisoitiin kreatiniinitason suhteen. 15 Kussakin kuudessa kokeessa tilastollinen analyysi (T-tes-ti) osoitti merkitsevää eroa syöpäpotilaiden ja normaali-näytteiden välillä (P < 0,001, 0,001, 0,001, 0,001, 0,01, 0,05). Näissä kuudessa kokeessa normaaliyksilöiden TGF-pi-toisuus virtsassa oli keskimäärin 0,18 ng TGF:ää/mg krea-20 tiinia, kun taas kalkkien syöpäpotilaiden virtsassa tämä arvo oli keskimäärin 0,64 ng TGF:ää. Kohonneita TGF-pitoi-suuksia havaittiin usemmilla syöpäpotilailla. Kunkin kokeen tulokset normalisoitiin myös kyseessä olevassa kokeessa saadun keskimääräisen normaaliarvon suhteen. Tulok-25 set esitetään numeerisesti taulukossa III. Käytettäessä valinnanvaraisena katkaisukohtana kaksinkertaista TGF-pi-toisuutta keskimääräiseen normaaliarvoon nähden, havaittiin normaalin ylittävä TGF-pitoisuus 81 %:ssa tutkituista erilaisista syöpätapauksista.

30 81497 40

Taulukko lii: Alfa-TGF-antigeenin detektointi virtsasta

Potilasryhmä Positiivisia Näytteen käsittely-pH

kaikkiaan_ja RIA-pitoisuuskerroin pH 2_pH 8_ ___9x_18x 9x 18x Näennäisesti terveet vertailuhenkilöt 1/18 (6%) 0/6 1/12 1/15 0/15

Hyvänlaatuista ti- laa potevat potilaat 1/3 0/3 1/3 0/1 0/1 paksusuoli (nukka- adenooma) 0/1 0/1 0/1 rinta (sidekudoksen rakkulakasvain) 0/1 0/1 0/1 0/1 0/1 raskaus (normaali, 38 viikkoa) 1/1 0/1 1/1

Syöpäpotilaat 26/32 17/28 22/31 9/16 12/16 (81%) (61%) (71%) (56%) (75%)

Keuhko 11/13 11/13 12/13 3/4 4/4 (85%) (85%) (92%) (75%) (100%) 2o Ruuansulatuskanava 4/7 4/7 4/7 3/7 3/7 (57%) (57%) (57%) (43%) (43%)

Virtsa- ja sukuelimet 3/3 1/3 1/3 2/3 3/3 (100%) (33%) (33%) (67%) (100%)

Rinta 5/5 1/1 5/5 25 (100%) (100%) (100%)

Imukudos 3/4 0/4 1/4 2/2 2/2 (75%) (0%) (25%) (100%)(100%)

2Q * Katkaisukohta > 2 x keskimääräinen normaaliarvo Esimerkki VII

TGF-aktiivisuuden toteaminen syöpäpotilaiden virtsasta 35 50 henkilön (25 normaalia ja 25 pitkälle edennyttä syöpää sairastavaa) virtsalle tehtiin immunologinen määri- « 81497 tys käyttämällä TGF:lle muodostettua vasta-ainetta ja edellä esimerkissä VI kuvattua menettelyä. Tässä tutkimuksessa kerättiin koehenkilöiltä 100 ml virtsaa, dialysoi-tiin se 1,0 m/mol etikkahappoa vastaan ja konsentroitiin 5 noin 100-kertaisesti. Tälle konsentroidulle virtsalle tehtiin sitten immunologinen määritys käyttämällä edellä esimerkissä IV kuvatulla tavalla 17 aminohapon oligopeptidiä vastaan muo-dostettua kaniinin polyklonaalista vasta-ainetta, ja tulokset annetaan alla olevassa taulukossa.

10 Taulukko IV

TGF-aktiivisuuden detektointi syöpäpotilaiden virtsasta Diagnoosi Positiivisten LKM/Testattujen LKM

15 Keuhkosyöpä 4/5

Rintasyöpä 4/5

Paksusuolisyöpä 3/5

Melanooma 5/5

Leukemia 0/5 20 Normaali tila 1/25 Tässä kokeessa suurimmalla osalla syöpäpotilaista virtsan TGF-pitoisuus oli vähintään 5 kertaa korkeampi kuin tutkituilla normaaliyksilöillä.

25 Esimerkki VIII

TGF:n toteaminen monospepsifisellä, synteettistä peptidiä vastaan muodostetulla antiseerumilla Peptidisynteesi

Peptidit, jotka vastaavat aminohappoja osista rTGF-30 aminohapposekvenssiä, jotka kuvattiin edellä esimerkissä II, syntetisoitiin kaupallisesti (Peninsula Labs) tavanomaisella kiinteäfaasimenetelmällä [Ohgak et ai., Journal of Immunol. Meth., 57 (1983) 171-184]. Peptidit puhdistettiin tarpeen vaatiessa käänteisfaasikorkeapainenestekroma-35 tograflalla (RP-HPLC:llä) ennen käyttöä.

42 81497 Käytetyt sekvenssit olivat:

Peptidi I - Val-Val-Ser-His-Phe-Asn-Lys-Cys-Pro-Asp-Ser-His-Thr

Peptidi II - Cys-His-Ser-Gly-Tyr-Val-Gly-Val-5 Arg-Cys

Peptidi III - Cys-His-Ser-Gly-Tyr-Val-Gly-Val-

Arg-Cys-Glu-His-Ala-Asp-Leu-Leu-Ala

Peptidi IV - Val-Gly-Val-Arg-Cys-Glu-His-Ala-Asp-Leu-Leu-Ala 10

Peptidien konjugointi ,1a immunisointi

Peptidinäyte (10 mg) sekoitettiin tulivuorikotilon hemosyaniiniin (10 mg, Calbiochem) 3,5 ml:ssa 0,1 M nat-riumfosfaattia (pH 7,4). Lisättiin 4 ml 25 mM glutaralde-15 hydiä ja seosta inkuboitiin ravistellen 1 tunti lämpötilassa 23 °C. Sitten lisättiin glysiiniä loppupitoisuudeksi 0,1 mol/1 ja seosta ravisteltiin yön yli lämpötilassa 23 °C. Saatu konjugaatti sekoitettiin yhtä suureen tilavuuteen Freundin täydellistä apuainetta ennen injektoin-20 tia.

Kaniinit immunisoitiin injektoimalla ihon alle 1 mg konjugaattia neljään eri kohtaan. Ensimmäisen injektion jälkeen annettiin kaksi tehostetta kahden viikon väliajoin. Tässä kokeessa käytetty seerumi kerättiin 80 vrk:n 25 kuluttua ensimmäisestä injektiosta. Tästä seerumista pre paroitiin immunoglobuliinifraktio ammoniumsulfaattisaos-tuksella. Im-munisoivalle peptidille spesifistä vasta-ainetuotetta seurattiin kiinteäfaasi-ELISA:11a.

Peptidien leimaus radioaktiivisella jodilla 30 Peptidit leimattiin Na125I:lla käyttämällä kloramii- ni-T-menettelyä, joka oli oleellisilta osiltaan Dasin et ai.'in kuvaaman menettelyn mukainen [Proc. Natl. Acad. Sei., 74 (1977) 2790 - 2794]. Liuoksiin, jotka sisälsivät hiiren leuanalussylkirauhas-EGF:ää (mEGF) (170 pmol), syn-35 teettistä rTGF:ää (4 pmol) tai peptidiä III (400 pmol), 81497 43 sekoitettiin 1-2 mCi Na125I:a (Amersham 2 mCi/nmol) 2 M kaliumfosfaatissa (pH 7,5). Lisättiin 50 - 100 pg klor-amiini-T:tä, ja jatkettiin inkubointia lämpötilassa 4 °C 1 min (mEGF ja rTGF) tai 7 min (peptidi III). Reaktiot py-5 säytettiin lisäämällä 10 - 20 pg Na2S205:a, ja leimatut proteiinit erotettiin reagoimattomasta Na125I:sta kromatografi-sesti Sephadex G-10:llä (Pharmacia). Tällä tavalla leimattujen peptidien ominaisaktiivisuudet olivat: 1 x 1010 cpm/nmol (EGF); 6 x 108 cpm/nmol (rTGF); ja 1 - 109 cpm/ 10 nmol (peptidi III).

Radioreseptorimääritys 125I-EGF:n sitoutuminen reseptoriinsa formaliinilla kiinnitettyjen A431-solujen yksisolukerroksilla mitattiin edellä esimerkissä I kuvatulla tavalla. 125I-EGF:ää lisät-15 tiin loppupitoisuudeksi 0,33 nmol/1 kilpailevien aineiden läsnä tai poissa ollessa. Leimaamattoman EGF:n lisääminen pitoisuudeksi 0,3 - 0,5 nmol/1 johti puoleen 125I-EGF:n sitoutumisen maksimi-inhibitiosta. TGF-pitoisuudet ilmoitettiin määränä, joka vaaditaan saamaan aikaan tunnettua TGF-20 määrää vastaava 125I-EGF:n sitoutumisen esto.

RIA (radlolmmuunianalyysi)

Reagenssit sekoitettiin 50 mikrolitran lopputila-vuudessa liuosta, joka sisälsi 20 mmol/1 natriumfosfaattia (pH 7,4), 200 mmol/1 NaCl:a, 40 mmol/1 ditiotreitolia, 25 0,1 % (w/v) BSA:ta, 0,1 % (w/v) NaN3:a, 125I-peptidi III:a (104 cpm); lopullista laimennusastetta 1/15000 vastaavan määrän antiseerumia, ja muita aineita ilmoitettaessa. Reaktio käynnistettiin lisäämällä antiseerumi ja sen annettiin jatkua lämpötilassa 23 °C 90 min. Sitten lisättiin 30 yhtä suuri tilavuus 10-%:isella formaliinilla kiinnitettyä Staphylococcus A -valmistetta (Pansorbin, Calbiochem) ja jatkettiin inkubointia vielä 30 min lämpötilassa 23 °C. Immunoadsorbantti poistettiin sedimentoimalla 10-%:isen (w/v) sakkaroosiliuoksen läpi, ja sitoutuneen 125I-peptidi 35 III:n määrä määritettiin käyttämällä gammalaskuria. Näissä .. 81497 44 olosuhteissa vasta-aine sitoi noin 25 % 125I-peptidistä kilpailijan poissa ollessa. Sitoutuneen peptidi lll:n määrä korjattiin epäspesifisen sitoutumisen suhteen, joka mitattiin vasta-aineen poissa ollessa (alle 5 % kokonaissitou-5 tumisesta) ja ilmoitettiin prosentteina maksimisitoutumi-sesta. Kilpailijoiden pitoisuudet ilmoitettiin siinä määränä peptidi III:a, joka tarvittiin saamaan aikaan vastaava saostumisen esto.

Kromatografla 10 Geelisuodatuskromatografia tehtiin valmistajan oh jeiden mukaan Bio Gel P-10 -kolonneilla (BioRad), jotka tasapainotettiin 1 N etikkahapolla. HPLC tehtiin Novapak C18 -kolonnilla (0,39 x 10 cm, Waters Associates) käyttämällä virtausnopeutta 1 ml/min lämpötilassa 23 °C.

15 Käsitellyn alustan valmistus

Snyder Theilen -transformoitujen Fischer -rotan al-kiosolujen (ST-FrSV-RFE klooni 10) seerumiton modifioitu alusta kerättiin Twardzikin et ai. kuvaamalla tavalla [Virology, 124 (1983) 201 - 207]. Kasvualusta selkeytettiin 20 sentrifugoimalla pienellä nopeudella ja kylmäkuivattiin. Jäännös suspendoitiin sitten 1 N etikkahappoon ja dialy-soitiin perusteellisesti 0,1 N etikkahappoa vastaan. Liu-kene-maton proteiini poistettiin sentrifugoimalla, ja su-pernatantti kylmäkuivattiin. Lopuksi jäännös suspendoitiin 25 takaisin sadasosatilavuuteen alkuperäisestä 1 N etikkahappoa ja säilytettiin lämpötilassa 4 eC.

Immunoblotting-analyysl

Analysoitaville näytteille tehtiin ensin natrium-dodekyylisulfaattipolyakryyliamidigeelielektroforeesi 30 (SDS-PAGE) käyttäen akryyliamidigradienttia 15 -> 20 % ja elektroforeesi ajettiin pelkistävissä olosuhteissa Laemm-lin kuvaamalla tavalla [Nature 227 (1970) 680-682]. Erottamisen jälkeen proteiinit siirrettiin elektroforeettises-ti nitroselluloosalle (Schleicher and Schuell, BA85, 0,45 35 μ) Burnetten kuvaamalla tavalla [Anal. Biochem. 112 (1981) li 81 497 45 195 - 203]. Siirto tehtiin jännitteellä 5 V/cm 3-4 tuntia 23 °C:ssa. Tuloksena olevaa proteiiniblottia inkuboi-tiin yön yli maitopohjaisessa seoksessa BLOTTO [Johnson et ai., Gene Anal.Techn., Is. 3-8]. Antiseerumi laimennet-5 tiin BLOTTO:11a ja lisättiin hiottiin peptidi III -ylimäärän läsnä tai poissa ollessa. Inkubointia vasta-aineen kanssa jatkettiin usein sekoittaen 2-3 tuntia lämpötilassa 23 °C. Sitten blotti pestiin, sitä inkuboitiin 125I-proteiinin kanssa (4 x 10® cpm/ml, 4 x 107 cpm/pg) 1 tunti 10 lämpötilassa 23 eC ja pestiin BLOTTO:11a. Vasta-aineen sitoutumiskohdat visualisoitiin tekemällä autoradiografia Kodak XAR-5 -filmille lämpötilassa -70 eC käyttämällä ku-vanvahvistuslevyjä.

Edellä kuvatun radioimmuunianalyysin yhteydessä li-15 sätty 125I-peptidi III saostui lähes kvantitatiivisesti antiseerumin laimennusasteen ollessa pieni; antiseerumille saatiin tiitteri > 10 000. Vasta-aineaffiniteetti mitattiin inkuboimalla antiseerumia suhteessa 1/5000 laimennettuna vaihtelevien 125I-peptidi III -pitoisuuksien läsnä ol-20 lessa. Näiden tulosten analysointi Scatchardin menetelmällä antoi tulokseksi yhden ryhmän sitoutuvaa/sitoutuvia komponenttia/komponentteja, jonka affiniteettivakio (Ka) 125I-peptidi III:n suhteen oli 8,3 x 108 M'1.

RIA:n spesifisyys 25 RIA:n spesifisyyden määrittämiseksi tutkittiin eri laisista peptideistä niiden kyky estää 125I-peptidi III:n saostuminen. Leimaamaton peptidi III esti 125I-peptidi III:n saostumisen suurin piirtein lineaarisesti alueella 0,13-11 nmol/1; leimaamattoman peptidi III:n pitoisuus, joka sai 30 aikaan puolet saostumisen maksimi-inhibitiosta, oli 0,7 nmol/1. Peptidi IV oli vain hieman tehottomampi saostumisen estäjänä kuin peptidi III, kun taas peptidi II oli täysin tehoton pitoisuuksiin 1,1 pmol/l asti. Myös peptidi I, joka vastaa 11 aminoterminaalista ryhmää, oli tehoton 35 kilpailijana. Nämä tulokset osoittavat, että tavanomaisis- 81497 46 sa koeolosuhteissa detektoitu epitooppi oli paikallistuneena peptidi III:n 11 karboksiterminaaliseen aminohappoon. Taulukossa V esitetään yhteenveto eri peptidien suhteellisista inhiboivista pitoisuuksista.

5

Taulukko V

Lisäys Suhteellinen inhibointiaktiivisuus peptidi III 1 10 peptidi IV 3,5 peptidi I > 1500 peptidi II > 1500 rTGF 0 ditiotreitoli 1 rTGF - ditiotreitoli 20 15 mEGF > 1500

Ilmoitetuista lisätyistä aineista tutkittiin niiden kyky estää standardi-RlA edellä kuvatulla tavalla. Kullekin lisätylle aineelle määritettiin pitoisuus, joka tarvittiin 20 saamaan aikaan puolet saostumisen maksimi-inhibitiosta, ja se ilmoitetaan suhteessa peptidi III -pitoisuuteen, joka vaaditaan saamaan aikaan vastaava inhibitio. Merkintä ">" osoittaa suurimman tutkitun pitoisuuden. (Peptidien I-IV inhibitioaktiivisuuteen ei vaikuttanut ditiotreitolin läs-25 näolo määrityksessä.)

Myös rTGF:n kyky estää 125I-leimatun peptidi III:n saostuminen tutkittiin. Synteettinen rTGF, joka vastasi biologiselta aktiivisuudeltaan täysin luontaista molekyyliä, oli yhtä tehokas (molaarisen pitoisuuden perusteella 30 arvioituna) inhibiittorina kuin peptidi III. rTGF:n suhteellinen inhibitiokapasiteetti aleni merkittävästi, kun pelkistin jätettiin pois reaktioseoksesta (taulukko). mEGF oli täysin tehoton kilpailijana pitoisuuksiin yli 1 ymol/l asti. Tämä osoittaa, että tässä kuvattu RIA eroaa muista 35 käytettävissä olevista TGF-määrityksistä siinä suhteessa, että se on spesifinen TGFille muttei EGF:lle.

81 497 47

Jotta osoitettaisiin suoraan, että antiseerumi sitoo rTGF:ää, korvattiin 125I-peptidi III 125I-leimatulla rTGFrllä tavanomaisessa RIA:ssa. Havaittiin annoksesta riippuva 125I-TGF:n saostuminen, jota esti oleellisesti yli-5 määräisen peptidi III:n lisääminen. Tällä tavalla saatujen sitoutumistulosten Scatchard-analyysi osoitti, että anti-seerumin Ka 125I-TGF:n suhteen oli 2,3 x 108 M"1. Tämä arvo sopii kohtuullisen hyvin yhteen 125I-peptidille III määritetyn Ka:n kanssa (8,3 x 108 M'1), ja osoittaa, että antisee-10 rumi sitoutuu rTGF:ään.

rTGF:n toteaminen transformoitujen solujen modifioidusta kasvualustasta

Eräs TGF-lähde on RNA-kasvainviruksilla transformoitujen solujen kasvualusta. rTGF:n toteamiseksi viljel-15 tyjen transformoitujen solujen modifioidusta kasvualustas ta käytettiin seuraavaa menettelyä. Kissan sarkoomaviruk-sen Snyder-Theilen -kannalla (ST-FeSV FRE klooni 10) transformoidun Fischer-rotan alkiosolulinjan on aiemmin osoitettu tuottavan kohonneita määriä rTGF:ää [Gray et 20 ai., Nature 303 (1983) 722-725]. Kerättiin seerumiton modifioitu alusta, käsiteltiin se ja väkevöitiin edellä kuvatulla tavalla. Osalle alustasta tehtiin sitten geelisuo-datuskromatografia Bio-Gel P-10:llä happamissa olosuhteissa. Fraktiosta analysoitiin rTGF EGF-reseptorikilpailumää-25 rityksellä tai RIA:lla.

Näissä olosuhteissa havaittiin EGF:n kanssa kilpailevaa aktiivisuutta kahdessa molekyylikokoryhmässä, toinen noin Mr - 10 000 ja toinen Mr >= 20 000; kummatkin molekyy-lilajit eluoitulvat selvästi näytteen proteiinin pääosan 30 jälkeen. Kumpikin kokoluokka, jolla oli EGF:n kanssa kilpaileva aktiivisuus, oli myös immunologisesti aktiivinen. Immunologista aktiivisuutta havaittiin lisäksi kolonnin patsaan tilavuudessa, jossa ei havaittu EGF:n kanssa kilpailevaa aktiivisuutta. Nämä havainnot osoittavat, että 35 edellä kuvatut rTGF-kokoryhmät ovat aktiivisia RIAissa. EGF:n kanssa kilpaileva aktiivisuuden suhde immunologiseen 48 8 1 4 9 7 aktiivisuuteen pieneni voimakkaasti suurimolekyylisissä TGF-fraktioissa, mikä osoittaa, että näiden TGF-molekyyli-lajien biologinen aktiivisuus on pienempi kuin pienimolekyylisten fraktioiden.

5 Sen vahvistamiseksi, että immunologinen aktiivisuus esiintyi samassa molekyylilajissa kuin EGF:n kanssa kilpaileva aktiivisuus, tehtiin RP-HPLC yhdistetyille fraktioille, jotka saatiin toistamalla tämä koe preparatiivi-sessa mittakaavassa ja jotka sisälsivät rTGF-kokoryhmät 10 Mr - 10 000 ja Mr 20 000; käytetyt olosuhteet olivat samanlaiset kuin ne, joita käytettiin rTGF:n puhdistamiseen Marquardt et ai.'in mukaisesti [Proc. Natl. Acad. Sei., 80 (1983) 4684-4688]. Yhdistettyjen TGF-fraktioiden, joiden Mr oli 10 000, ollessa kyseessä sekä EGF:n kanssa kil-15 paileva että immunologinen aktiivisuus puhdistuivat rinnakkain suurin piirtein kvantitatiivisella saannolla. Kummankin aktiivisuuden puhdistuminen rinnan sekä geelisuoda-tuskromatografiässä että HPLC;ssä viittasi vahvasti siihen, että kumpikin aktiivisuus esiintyy samassa molekyyli-20 lajissa. Kun EGF:n kanssa kilpailevalle kokoryhmälle Mr -20 000 tehtiin HPLC, havaittiin samanlainen EGF:n kanssa kilpailevan ja immunologisen aktiivisuuden rinnakkaispuh-distuminen. Nämä kokeet osoittavat, että suuri osa immunologisesta aktiivisuudesta, joka havaittiin St-FeSV-FRE-25 kloonin 10 käsitellyssä kasvualustassa, oli rTGFjn aiheuttamaa .

Eri rTGF-kokoryhmien immunoblottlng-analyysi Retroviruksilla transformoitujen rotan solujen käsitellyssä alustassa esiintyvät suuremmat TGF-kokoryhmät 30 voisivat edustaa joko aggregoituneita tiloja tai TGF-mole-kyylin erillisiä molekyylimuotoja. Näiden kahden vaihtoehdon erottamiseksi toisistaan tehtiin synteettiselle rTGFrlle ja luonnon TGF;n kokoluokille Mr = 10 000 ja Mr * 20 000 immunoblotting-analyysi, kun polypeptidikomponentit 35 oli erotettu SDS-PAGE:lla pelkistävissä olosuhteissa. Im-muunireaktiivinen synteettinen rTGF ja pienimolekyylinen

I

49 8 1 4 9 7 luonnon rTGF liikkuivat rinnakkain kumpikin yhtenä poly-peptidiketjuna, jonka Mr oli 6000, ja antiseerumin inku-bointi peptidi III -ylimäärän kanssa salpasi näiden molekyylien immunologisen reaktiivisuuden. Suurimolekyylinen 5 kokoluokka sitä vastoin sisälsi kolmea immuunireaktiivista peptidiä, Mr = 24 000, Mr - 40 000 ja Mr = 42 000; peptidi III -ylimäärän lisääminen salpasi myös näiden peptidien immunologisen reaktiivisuuden. Kaikissa kaistoissa havaittiin radioaktiivinen vyöhyke, jonka liikkumisnopeus vas-10 tasi Mr:a 43 500. Peptidi III -ylimäärän lisääminen poisti epätäydellisesti tämän materiaalin, ja se havaittiin yhtäläisesti kaikissa kokeissa analysoitavasta näytteestä riippumatta; siksi se näyttää edustavan kokeessa muodostunutta keinotekoista tuotetta. On huomionarvoista, ettei 15 suurimolekyylisessä kokoluokassa havaittu TGF:ää, jonka

Mr - 6000. Nämä tulokset osoittavat, että suurempimolekyy-liset rTGF-kokoluokat edustavat erillisiä TGF:n muotoja.

Esimerkki IX

Synteettinen rTGF-fragmentti, joka sitoutuu resep-20 toreihin ja on antigeeninen

Peptidit

Hiiren leuanalussylkirauhasista eristettiin EGF uuttamalla 1 M HCltlla, joka sisälsi 1 % trifluorietikka-happoa (TFA), 5 % muurahaishappoa ja 1 % NaClra, konsent-25 roimalla Sep-Pak-kolonneilla (Waters) ja tekemällä RP-HPLC Bondapak C-18 -kolonneilla (Waters) Elson et ai1 in kuvaamalla tavalla [Biochemistry Int., 8 (1984) 427 - 435]. Luontaisen rotta-TGF:n kokonaissynteesiä on kuvattu edellä esimerkissä V.

30 Synteettiset peptidifragmentit valmistettiin 1 % divinyylibentseeniä sisältävällä kloorimetyyli-polystyree-nihartsilla (Bio-Rad) käyttämällä Na-t-butoksikarbonyyli-suojausta. Peptideistä poistettiin suojaus ja ne irrotettiin hartsista käyttämällä HF:a tai, C-päästä suojattujen 35 analogien ollessa kyseessä, peptidi irrotettiin ensin am-monolyysillä (NH3/MeOH). Raakapeptidit, joista oli poistet- 81 497 50 tu suojaus, laimennettiin ja syklisoitiin disulfidimuotoon hapettamalla 0,01 M K3Fe(CN)6:11a. Peptidiliuos laitettiin Blo-Rex 70 -kationinvaihtokolonnille, pestiin H20:lla (300 ml) ja eluoitiin AcOH-gradientilla (-> 50 %). Peptidi puh-5 distettiin preparatiivisella HPLCtllä kolonnissa (2,5 x 100 cm Altex), joka oli täytetty Vydac 218TP C-18:lla, käyttäen eluenttina 20-%:ista CH3CN-liuosta, joka sisälsi 0,03 mol/1 NH40Ac:a (pH 4,5) (10). Peptidit 1 ja 2 edustavat rTGF:n aminohapposekvenssejä 34 - 43, Joilla on suo-10 jaamattomat tai vastaavasti suojatut päät (N Ac, C - amidi). Peptidi 3 on vastaavan hTGF-silmukan metyyliesteri (Ac-Cys-His-Ser-Gly-Tyr-Val-Gly-Ala-Arg-CysOMe), joka on valmistettu siirtotesteröinnillä hartsista (emäs/MeOH).

Immunogeenin valmistus ja immunologinen määritys 15 TGF-peptidi 1 liitettiin tulivuorikotilon hemosya- niinin (KLH) tai naudan seerumialbumiiniin tioli/maleimi-disidoksella [King et ai., J. Immunol. Methods 28 (1979) 201 - 206]. Kantaja-peptidikompleksit puhdistettiin geeli-suodatuksella. Saatiin keskimäärin 60 mol peptidiä/1 mol 20 KLH:a ja 20 ml peptidiä/1 mol BSA:a. Kaniinit immunisoitiin KLH:n ja peptidin 1 konjugaatilla injektoimalla useaan kertaan 2 mg proteiinia täydellisessä Freundin apuaineessa ihonalaisesti (s.c.) tai lihaksensisäisesti (i.m.). Kaniineille annettiin tehosteet kahden viikon vä-25 liajoin injektoimalla s.c. immunogeenia epätäydellisessä Freundin apuaineessa. Viiden tehosteen jälkeen kerätyn antiseerumin IgG-fraktio käytettiin immunologisiin määrityksiin ja se leimattiin radionuklidilla käyttämällä Na125I:a (NEN) ja Enzymobeads-helmiä (Bio-Rad) siten, että 30 laskentatulos oli 4 x 105 cpm/yg proteiinia. 92-kuoppaiset polyvinyylikloridilevyt (Costar) päällystettiin liuoksella, joka sisälsi 200 pg/ml BSA:n ja peptidin 1 konjugaat-tia, ja vastapäällystettiin fosfaattipuskuroidulla fysiologisella suolaliuoksella, joka sisälsi 10 % normaalin 35 kaniinin seerumia. Levyjä inkuboitiin 4 tuntia lämpötilassa 37 eC [125I] anti (KLH - peptidi l)-IgG:n kanssa (50 000 81 497 51 cpm/syvennys) Inhibiittorien läsnä tai poissa ollessa, pestiin ja tehtiin yksittäisille kuopille laskenta.

Radloreseptorimäärltys

Ihmisen epidermoidikarsinoomasoluja A-431 tai ih-5 misen esinahkafibroblasteja (HFF), jotka oli kerätty pri-maariviljelmistä, kasvatettiin yhtenäiseksi pinnaksi 24-kuoppaislssa ryhmämaljoissa (Costar) Dulbeccon minimialus-tassa (Dulbecco's minimal essential medium, DMEM, Gibco), joka sisälsi 10 % naudan sikiöseerumia (FCS, Hyclone). EGF 10 leimattiin radiojodilla edellä kuvatulla tavalla pulssi-määrään 4 x 104 - 8 x 104 cpm/mg proteiinia. Soluja inku-boitiin lämpötilassa 4 *C 60 min DMEM:ssä (pH 7,4 20 mmol/1 Hepesiä), joka sisälsi 1 mmol/1 [125I]-EGF:ää ja 0,1 % BSA:ta, inhibiittoripeptidien läsnä ollessa. Solut 15 pestiin kolmesti kylmällä puskuriliuoksella, hajotettiin 0,1 N Na0H:lla, ja mitattiin soluihin kytkeytynyt radioaktiivisuus (gammalaskuri). Epäspesifinen sitoutuminen, joka määritettiin 100-kertaisen ylimäärän kylmää EGF:ää läsnä ollessa, oli alle 5 % ja alle 10 % spesifisestä sitoutumi-20 sesta A431-soluille ja vastaavasti HFF-soluille.

Solujen proliferaatlomääritys HFF-soluja kasvatettiin yhtenäiseksi kerrokseksi 48kuoppaisissa ryhmämaljoissa DMEM:ssä, joka sisälsi 10 % FCS:a, ja lisääntyminen pysäytettiin pitämällä soluja 2 25 vrk ravintovajauksessa DMEM:ssä, joka sisälsi 0,5 % FCS:a. Mitogeeneja ja peptidejä inkuboitiin solujen kanssa lämpötilassa 37 °C 18 tuntia ennen 4 tunnin käsittelyä 1 pCi:llä [3H]-metyylitymidiiniä (NEN) ja määritettiin tri-kloorietikkahapolla saostuva radioaktiivisuus.

30 KLH:n ja peptidin 1^ konjugaattia vastaan muodoste tut kaniinin vasta-aineet reagoivat BSA-TGF-peptidin kanssa kiinteäfaasi-RIA:n mukaan. Tätä reaktiota inhiboi konsentraatiosta riippuvalla tavalla peptidi 1 ja hieman vähemmän luonnon TGF. EGF ei sitä vastoin aiheuttanut mer-35 kittävää inhibitiota.

52 81 497

Rotan TGF syrjäyttää kompetitiivisesti EGF:n sitoutumisen reseptoreihinsa. TGF-peptidien kyky kilpailla [125I]-EGF:n kanssa sitoutumisesta joko A-431-soluihin tai HFF-soluihin arvioitiin. Peptidi 1 esti osittain [125I]-5 EGF:n sitoutumisen A-431-soluihin pitoisuuden ollessa > 10'6 mol/1. Peptidien 2 ja 3 kyky estää sitoutumista oli parempi; IC50-arvot olivat 4 x 10'6 mol/1 ja vastaavasti 4 x 10"7 mol/1 (ts. noin 0,02 ja 0,2 % EGF:n tai TGF-a:n sitoutumistehosta). Samanlaisia havaintoja tehtiin EGF:n 10 inhibitiosta HFF-soluilla (taulukko VI). Näiden vuorovaikutusten reseptorispesifisyyttä valaisee näiden peptidien kyvyttömyys estää endoteelisolukasvutekijän sitoutuminen tai mitogeeninen vaikutus HFF-soluihin (ei esitetä).

Millään TGF-peptideistä ei ollut luontaisia mito-15 geenisiä ominaisuuksia pitoisuuteen 10'5 mol/1 asti inku-boitaessa niitä lisääntymättömien HFF-solujen kanssa (tuloksia ei esitetä). TGF-peptidit estivät kuitenkin pitoisuudesta riippuvalla tavalla DNA-synteesin indusoinnin lisääntymättömissä HFF-soluissa EGF:n vaikutuksesta. Nämä 20 antagonistit olivat yhtä tehokkaita käytettäessä TGF:ää mitogeenina (taulukko VI). Samoin kuin sitoutumistehokin TGF-peptidien antagonistinen teho parani suljettaessa amino- ja karboksipäät.

Taulukko VI

25 Synteettisten TGF-fragmenttien biologinen aktiivisuus ------—b~‘-

Mitogeneesin esto

Sitoutuminen3 IC5Q (M) IC50 ^ 30 _A-431_HFF_EGF_TGF PC_

Peptidi 1 8 + 2 x ΙΟ-5 6 + 2 x 10~5 >10~5 >10~5

Peptidi 2 4 + 2 x 10-6 2 + 2 x 10-6 5 + 2 x 10-6 3 + 1 x io_6

Peptidi 3 4 + 1 x 10 ^ 3 + 1 x 10 ^ 6 + 2 x 10~^ 5 + 3 x 10~^ 35

II

81 497 53 *IC50-arvot laskettu inhibitiokäyrlstä, jotka kuvaavat [125I]-EGF:n (1 nM) sitoutumista soluihin. bIC50-arvot ovat pitoisuuksia, jotka alentavat puoleen vertailunäyt-teen kyvyn edistää [3H]-metyylitymidiin ottoa lisääntymät-5 tömiin HFF-soluihin, jotka on indusoitu EGF:llä tai TGFrlla (1 nM).

Claims (9)

81 497

1. Vasta-aineet, joita muodostuu biologisesti aktiivisille polypeptide!Ile, joilla on kaava 5 5 10 Val-Val-Ser-His-Phe-Asn-R-Cys-Pro-Asp-Ser-His-Thr- 15 20 25 Gln-R’-Cys-Phe-His-Gly-Thr-Cys-Arg-R"-Leu-Val-Gln- 10 30 35 Glu-R1-Lys-Pro-Ala-Cys-Val-Cys-His-Ser-Gly-R'"- 40 45 50 Val-Gly-R2-Arg-Cys-Glu-His-Ala-Asp-Leu-Leu-Ala 15 jossa R on Asp tai Lys, R' on Phe tai Tyr, R" on Ser tai Phe, R'" on Phe tai Tyr, R1 on Asp tai Glu ja R2 on Ala tai Vai, tai näiden polypeptidien aminohapposekvenssin 1-13, 34 - 43, 34 - 50 tai 39 - 50 käsittäville oligopeptidi-20 fragmenteille.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukaiset vasta-aineet, tunnetut siitä, että R on Asp, R* on Phe, R'" on Tyr, R1 on Asp ja R2 on Ala.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukaiset vasta-aineet, 25 joita muodostuu oligopeptidifragmentille, joka käsittää aminohapposekvenssin A) Val-Val-Ser-His-Phe-Asn-Lys-Cys-Pro-Asp-Ser-His-Thr B) Cys-His-Ser-Gly-Tyr-Val-Gly-Val-Arg-Cys C) Cys-His-Ser-Gly-Tyr-Val-Gly-Val-Arg-Cys-Glu-His-

30 Ala-Asp-Leu-Leu-Ala tai D) Val-Gly-Val-Arg-Cys-Glu-His-Ala-Asp-Leu-Leu-Ala.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukaiset vasta-aineet, joita muodostuu oligopeptidifragmentille, joka käsittää aminohapposekvenssin Cys-His-Ser-Gly-Tyr-Val-Gly-Ala-Arg-

35 Cys.

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukaiset vasta-aineet, tunnetut siitä, että ne on leimattu 81 497 merkkiaineella, joka pystyy antamaan havaittavan signaalin.

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukaisen vasta-aineen käyttö in vitro pahanlaatuisuuden havaitsemisek- 5 si ihmisisännässä.

7. Menetelmä pahanlaatuisuuden havaitsemiseksi ihmisisännässä, tunnettu siitä, että tämän ihmis-isännän soluja tai kehon nesteitä saatetaan in vitro kosketukseen jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukaisen vas- 10 ta-aineen kanssa ja määritetään vasta-aineen sitoutumis- taso näihin soluihin tai solutuotteisiin kehon nesteessä diagnoosin saamiseksi isännästä, jolla on pahanlaatuinen kasvain.

8. Menetelmä luukadon toteamiseksi ihmisisännässä, 15 tunnettu siitä, että isännän soluja tai kehon nesteitä saatetaan in vitro kosketukseen jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukaisen vasta-aineen kanssa ja määritetään vasta-aineen sitoutumistaso soluihin tai solutuotteisiin kehon nesteessä diagnoosin saamiseksi isännästä, 20 jolla on luukato.

9. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta-aine on leimattu merkkiaineella, joka pystyy tuottamaan havaittavan signaalin. 56 81 497