FI81365B - Foerfarande foer framstaellning av biologiskt aktiva polypeptider. - Google Patents
Foerfarande foer framstaellning av biologiskt aktiva polypeptider. Download PDFInfo
- Publication number
- FI81365B FI81365B FI841649A FI841649A FI81365B FI 81365 B FI81365 B FI 81365B FI 841649 A FI841649 A FI 841649A FI 841649 A FI841649 A FI 841649A FI 81365 B FI81365 B FI 81365B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- tgf
- val
- cys
- egf
- gly
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/495—Transforming growth factor [TGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
1 81365
Menetelmä biologisesti aktiivisten polypeptidien valmistamiseksi
Keksintö koskee menetelmää biologisesti aktiivisten 5 polypeptidien ja näistä polypeptideistä johdettujen antigeenisten oligopeptidien valmistamiseksi luonnossa esiintyvistä tai synteettisistä lähteistä. Näillä peptideillä on yleinen polypeptidirakenne, joka määrittelee proteiineja, joilla on solukasvua edistävä aktiivisuus, ja ne 10 ovat uusia muuntokasvutekijä (TGF) -polypeptidejä, joilla on ominaisuus palautuvasti antaa muunnettu fenotyyppi nor-maalisoluille in vitro ja jotka siten näyttävät olevan pahanlaatuisen fenotyypin välittömiä efektoreita, tai erityisesti TGF-polypeptideistä johdettuja antigeenisiä oli-15 gopeptidejä. Nämä polypeptidit voivat myös olla oligopep-tidejä, joilla on kyky sitoutua solun kasvutekijäresepto-reihin ja siten voimakkaasti häiritä tiettyjen solulinjo-jen muuttumista syöpätilaan.
Keksinnön eräänä toteutusmuotona on erityisesti me-20 netelmä TGF-polypeptidien valmistamiseksi eristämällä ne homogeenisessa muodossa sekä muunnetuista ihmisen että hiiren solulinjoista ja kehon nesteistä.
Keksinnön mukaisesti valmistettuja polypeptidejä voidaan käyttää syövän ja muiden proliferatiivisten tau-25 tien havaitsemiseen ja hoitoon, solukasvuun liittyvään hoitoon, esimerkiksi haavan parantamiseen ja haavauman hoitoon, sekä luukatoon liittyvien sairauksien, kuten osteoporoosin ja hyperkalsemian hoitoon ja toteamiseen.
Joukko polypeptidihormoni- ja hormoninkaltaisia 30 kasvutekijöitä on löydetty kudosnesteistä ja niiden yhteys normaalin solukasvun tai mitoosin säätelyyn on vahvistettu. Nämä mitogeeniset polypeptidikasvutekijät käsittävät insuliinin, insuliinin kaltaiset kasvutekijät, verihiuta-leperäisen kasvutekijän, hermokasvutekijän, fibroblasti-35 kasvutekijän ja orvaskesikasvutekijän (EGF). Ainakin joil- 2 81365 lakin näistä tunnetuista kasvutekijöistä on vaikutus muunnettujen solujen kasvuun, mutta in vitro -testien perusteella näyttää siltä, että muunnetut solut tarvitsevat vähemmän näitä tunnettuja kasvutekijöitä optimaalista kas-5 vua ja monistumista varten kuin normaalit solut. Erityisesti on osoitettu soluviljelykokeilla, että ulkosyntyisten kasvutekijöiden, kuten insuliinin ja EGF:n, lisääminen voi saada normaalit solut jäljittelemään tiettyjä soluomi-naisuuksien muutoksia, jotka ovat analogisia muuntamisen 10 kanssa. Ne eivät kuitenkaan pysty tuottamaan kaikkia muutoksia, jotka liittyvät muunnettuun fenotyyppiin, ks. esim. Sporn et ai.. The New Eng. J. of Med. 15 (1981) 878 - 880.
Polypeptidikasvutekijoiden uusia tyyppejä, jotka 15 on nimetty muuntokasvutekijoiksi eli TGFriksi, on äskettäin löydetty tietystä ihmis- ja eläinsyöpä- ja sarkooma-soluista, joilla on enemmän ominaisuuksia, jotka ilmeisesti ovat olennaisia fenotyyppimuunnoksille (Roberts et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77 (1980) 3494 - 3498 ja Todaro 20 et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77 (1980) 5258 - 5262). TGF-polypeptideille luokkana ovat ominaisia muutokset, joita ne aiheuttavat, kun niitä käytetään muuntamattomiin normaaleihin indikaattorisoluihin, jotka kasvavat viljelmässä. Nämä muutokset käsittävät a) solukasvun tiheydestä 25 riippuvan kasvun estymisen puutteen yksisolukerrosvilje-lyssä, b) solujen liikakasvun yksisolukerrosviljelyssä, e) muutoksen solun muodossa, mistä on tuloksena, että indi-kaattorisolut omaksuvat kasvainfenotyppin, ja d) kiinni-tysriippumattomuuden saavuttamisen, mistä on tuloksena 30 kyky kasvaa pehmytagarissa. Solujen kiinnittymisestä riippumattoman kasvun ominaisuus viljelyssä on erityisen voimakkaasti vastaavuussuhteessa neoplastisen kasvun kanssa in vivo. Ainakin tietyt TGF-polypeptidit ovat jonkin verran samanlaisia kuin EGF siinä, että ne sekä ovat kuunuut-35 ta ja happoa kestäviä, pelkistimille ja proteaaseillc»
II
3 81365 herkkiä peptidejä että ne näyttävät spesifisesti olevan vuorovaikutuksessa solumembraanin EGF-reseptorien kanssa ja tuottavan biologisia vaikutuksia niiden kautta, jolloin TGF kilpailee EGF:n kanssa sitoutumisesta solun EGF-resep-5 toriin. TGF on kuitenkin erotettavissa EGFrsta useissa tärkeissä suhteissa. Erityisesti EGF ei indusoi kiinnittymisestä riippumatonta solujen kasvua viljelyssä, eivätkä EGF:ää vastaan muodostetut vasta-aineet havaitse TGF:ää radioimmuunianalyysi- eikä immuunisaostuskokeissa. Lisäksi 10 EGFrllä on ainoastaan vähäinen vaikutus viljeltyjen solujen fenotyyppiin, kun taas TGF tuottaa korostuneemman fe-notyypin muutoksen viljellyissä soluissa ja antaa niille kyvyn käyttäytyä kuten muunnetut solut. Mikä mielenkiintoisinta, TGF:n aiheuttama muuntuminen ei ole pysyvä vaan 15 palautuva TGF:n poissaollessa, eikä ole olemassa mitään todistusta siitä, että TGF toimii itse täydellisenä syöpää synnyttävänä aineena (Todaro et ai., J. of Supramolecular Structure and Cell Biochem. 15 (1981) 287 - 301).
Siten TGF-polypeptidit muodostavat proteiinien ai-20 nutlaatuisen luokan, joka voidaan erottaa muista kasvutekijöistä, kuten EGF:stä, sekä biologisten ominaisuuksien että kemiallisen rakenteen kannalta. Näillä TGF:illä on vuorostaan joukko erilaisia ominaisuuksia, jotka ovat arvokkaita tai mahdollisesti arvokkaita terveystieteiden 25 alueella, kuten voimakkaat mutta palautuvat solukasvu- tai mitogeeniset ominaisuudet, joita voidaan käyttää solun korjaamisessa, kuten esimerkiksi haavan parantamisessa tai haavauman hoidossa. Lisäksi TGF-polypeptidin tuottaminen tai lisääntynyt tuottaminen on ominaista, ellei olennais-30 ta, tiettyjen solulinjojen morfologiselle muuntamiselle sekä ihmis- että hiirikudoksessa ja/tai -nesteissä; siten TGF-polypeptidit tai niiden antigeeniset fragmentit ovat arvokkaita normaalisolujen erottamisessa kasvainsoluista ja niitä vastaan syntyneillä vasta-aineilla on käyttöä 35 pahanlaatuisuuksien diagnoosissa. Lisäksi oivallus, että 4 81365 tietyt TGF-polypeptidit ovat spesifisesti vuorovaikutuksessa solumembraanin EGF-reseptoreiden kanssa ja tuottavat biologiset vaikutuksensa niiden kautta, antaa mahdollisuuden, kun TGF-polypeptidin perusrakenne on määritetty, 5 saattaa rakenne vastaavuussuhteeseen EGF:n rakenteen kanssa oligopeptidien kehittämiseksi, joilla on kemialliset ominaisuudet, jotka sallivat sitoutumisen EGF-reseptorei-hin ilman solun samanaikaista fenotyypin muuntumista. Oli-gopeptideillä, joilla on tämä ominainen EGF-reseptoriin 10 sitoutumiskyky, on käyttöä hoidettaessa pahanlaatuisuuksia, koska oligopeptidi häiritsee tai kilpailee TGF:n kanssa käytettävissä olevista reseptorikohdista ja siten keskeyttää solun muunnettujen ominaisuuksien ilmentämisen.
Tämän keksinnön mukaisesti on kehitetty menetelmä 15 TGF-polypeptidien valmistamiseksi riittäviä määriä ja riittävän puhtaina sallimaan täydellisen rakenteen määrittämisen, ja tuloksena tästä määrittämisestä ja muista havainnoista, mukaan lukien olennaisen homologian löytäminen ihmisen ja hiiren TGFiien välillä, on löydetty peruspepti-20 dirakenne, jolla on laaja käyttö solumitoosin ja solukas-vuun liittyvällä alueella. Lisäksi menetelmällä saadaan homogeenisiä TGF-polypeptidejä, joilla on käyttöä sekä solukasvun alueella että syövän ja muiden proliferatiivis-ten sairauksien toteamisessa. TGF-polypeptidejä ja -oligo-25 peptidejä ja niitä vastaan muodostettuja vasta-aineita voidaan käyttää luukatoon liittyvien sairauksien, kuten osteoporoosin, hyperkalsemian ja luuresorption, toteamiseen ja hoitoon. Edelleen peruspeptidirakenteesta ja määritetyistä TGF-polypeptidirakenteista saadaan antigeenisiä 30 oligopeptidejä ja oligopeptidejä, joilla on kyky sitoutua solukasvutekij äreseptoreihin.
Marquardt ja Todaro, J. of Bio. Chem. 257(9) (1982) 5220 - 5225 (julkaistu 10.5.1982), kuvaavat pienimolekyy-lipainoisen ihmis-TGF:n eristämisen seerumittomasta väli-35 aineesta, jota oli käsitelty ihmisen metastaattisella me-
II
5 81365 lanoomakasvainlinjalla, käyttäen sarjaa menetelmävaiheita, jotka käsittävät uuttamisen 1 M etikkahappoon ja peräkkäisen puhdistuksen käänteisfaasikorkeapainenestekromatogra-fiällä eluoiden ensin asetonitriililiuottimella ja sen 5 jälkeen 1-propanolilla, jolloin saadaan puhdistettu TGF, jolla on luonteenomainen TGF-biologinen aktiivisuus, esimerkiksi kiinnittymisestä riippumattoman solukasvun indu-sointi. Twardzik et ai., Science 216 (1982) 894 - 897 (julkaistu 21.5. 1982), esittävät saman puhdistusmetodolo-10 gian käytön TGF:n puhdistamiseksi viruksella muunnetusta rottasolusta. Myös puhdistettujen aineiden biologinen aktiivisuus soluviljelyssä osoitetaan. Pike et ai., J. of Bio. Chem. 257 (24) (1982) 14 628 - 14 631 (julkaistu 25.12.1982), esittävät, että sekä osittain puhdistetulla 15 rotan että ihmisen TGFrllä on kyky aktivoida proteiiniki-naasia ihmisen kasvainsolumembraaneissa ja siten stimuloida synteettisen tyrosiinia sisältävän peptidin fosfory-lointia. Ainoat muut tähän asti selostetut molekyylit, joilla on tämä aktiivisuus, ovat EGF, insuliini ja veri-20 hiutaleperäinen kasvutekijä, joista kaikilla uskotaan olevan tärkeitä fysiologisia funktioita ihmisessä ja eläimessä. Muita kiinnostavia kirjallisuusviitteitä on esitetty edellä mainituissa artikkeleissa.
Nyt on havaittu, että tietty perusproteiinirakenne 25 määrittelee uuden luokan biologisesti aktiivisia molekyylejä. Tämän runkopolypeptidin, joka antaa biologisen aktiivisuuden erityisesti solukasvun edistämisen alueella, löytyminen perustuu havaintoon, että on olemassa selvä vastaavuussuhde tiettyjen, useita disulfidisidoksia sisäl-30 tävien polypeptidien, TGF:t mukaan lukien, kolmiulotteisen rakenteen ja polypeptidistä aiheutuvan biologisen aktiivisuuden välillä.
Siten tämä keksintö koskee menetelmää biologisesti aktiivisten polypeptidien valmistamiseksi, joilla on kaava 35 6 81365 5 10
Val-Val-Ser-His-Phe-Asn-R-Cys-Pro-Asp-Ser-His-Thr- 15 20 25
Gln-R'-Cys-Phe-His-Gly-Thr-Cys-Arg-R"-Leu-Val-Gln- 5 30 35
Glu-R1-Lys-Pro-Ala-Cys-Val-Cys-His-Ser-Gly-R'"- 40 45 50
Val-Gly-R2-Arg-Cys-Glu-His-Ala-Asp-Leu-Leu-Ala 10 jossa R on Asp tai Lys, R’ on Phe tai Tyr, R" on Ser tai Phe, R'" on Phe tai Tyr, R1 on Asp tai Glu ja P/ on Ala tai Vai, tai näiden polypeptidien aminohapposekvenssin 1-13, 34 - 43, 34 - 50 tai 39 - 50 käsittävien oligopeptidifrag-menttien valmistamiseksi, jossa menetelmässä: 15 a) aminohapot liitetään peräkkäin polypeptidin tai oligopeptidin kaavan mukaisessa järjestyksessä tavanomaisella kiinteätaasimenetelmällä sopivalla kantajalla, tai b) muodostetaan synteettisesti kaksisäikeinen DNA-sekvenssi, joka koodaa polypeptidirakenteen aminohapposek-20 venssiä, kaksisäikeinen DNA liitetään kloonausvälineen tai -vektorin sopivaan kohtaan yhdistelmä-DNA-molekyylin muodostamiseksi ja transformoidaan sopiva isäntä mainitulla yhdistelmä-DNA-molekyylillä polypeptidin ilmentymisen aikaansaamiseksi, tai 25 c) eristetään homogeeninen muuntokasvutekijä- polypeptidi vesipitoisesta väliaineesta, joka sisältää tämän muuntokasvutekijäpolypeptidin epäpuhtaassa muodossa, menetelmällä, joka käsittää seuraavat vaiheet: (1) dialysoidaan vesipitoinen väliaine, joka sisäl- 30 tää muuntokasvutekijän epäpuhtaassa muodossa, vesipitoista etikkahappoa vastaan antamaan liuotinfaasi, joka sisältää muuntokasvutekijäpolypeptidiä ja joka faasi väkevöidään ja valinnaisesti selkeytetään, (2) muodostetaan vaiheen 1) väkevöity liuotinfaasi 35 uudelleen vesipitoisella etikkahapolla ja saatetaan uudel- leenmuodostettu liuos geelisuodatuskromatografiaan viemällä uudelleenmuodostettua liuosta geelisuodatuskromatogra- 7 81365 fiapylvääseen, jota on tasapainotettu vesipitoisella etik-kahapolla, ja eluoidaan vesipitoisella etikkahapolla eluaatin valittujen fraktioiden saamiseksi, jotka sisältävät muuntokasvutekijäpolypeptidiä puhtaampana, ja valitut 5 fraktiot yhdistetään ja väkevöidään, jolloin saadaan osit tain puhdistettu, muuntokasvutekijäpolypeptidiä sisältävä tuote, (3) saatetaan vaiheen (2) osittain puhdistettu, muuntokasvutekijäpolypeptidiä sisältävä tuote peräkkäiseen 10 käänteisfaasikorkeapainenestekromatografiaan viemällä tuo te, uudelleenmuodostamisen jälkeen vesipitoiseen tri-fluorietikkahappoon, yhden tai useamman hiilivetysidottu-jen piihappomatriisipylväiden läpi, jotka on tasapainotettu vesipitoisella trifluorietikkahapolla, korkeapainenes-15 tekromatografian olosuhteissa, jolloin pylvään alkueluoin- ti suoritetaan käyttäen lineaarista asetonitriiligradient-tia vesipitoisessa trifluorietikkahapossa ja sen jälkeen pylväseluointi, joka suoritetaan ensimmäisestä korkeapai-nenestekromatografiavaiheesta saaduille, yhdistetyille, 20 muuntokasvutekijäpolypeptidiä sisältäville fraktioille, toteutetaan käyttäen lineaarista 1-propanoligradienttia vesipitoisessa etikkahapossa, jolloin 1-propanolin gra-dienttia nostetaan riittävän pieninä 1-propanolin väke-vyyslisäyksinä antamaan muuntokasvuteki jäpolypeptidi yhte-25 nä ainoana selvänä huippuna homogeenisenä polypeptidinä.
Keksinnön edullisen toteutusmuodon mukaisesti valmistetaan edellä olevan kaavan mukaisia polypeptidejä, joissa R on Asp, R' on Phe, R'" on Tyr, R1 on Asp ja R2 on Ala.
30 Peptidisekvenssi, joka luonnehtii esitetyn kaavan mukaista perusproteiinirakennetta, sisältää kuusi kysteii-nitähdettä sijoittuneina ratkaiseviin asemiin polypeptidi-rungossa. Arvellaan, että kysteiinitähteiden sijainti sallii polypeptidin laskostua erityisellä tavalla pariutunei-35 den kysteiinien välille muodostuneiden disulfidisiltojen 8 81365 johdosta ja siten tuottaa kolmiulotteisen rakenteen, joka edistää osaltaan saadun proteiinin biologista aktiivisuutta. On olemassa jonkin verran todistusaineistoa, joka viittaa erityiseen disulfidi-siltajärjestykseen, jossa 5 (numeroimalla edellä olevassa kaavassa Cys-tähteet l:stä 6 reen vasemmalta oikealle) Cys-1 on sitoutunut Cys-3:een, Cys-2 on sitoutunut Cys-4:ään ja Cys-5 on sitoutunut Cys-6reen disulfidisidoksin perusproteiinirakenteen biologisesti aktiivisissa muodoissa.
10 Tämä uusi polypeptidiluokka on johdettu havainnos ta, että tietyt TGFrt, jotka on saatu erilaisista nisäkäslajeista (sekä hiiristä että ihmisistä), ovat olennaisesti homologisia peptidisekvenssin aminohapporakenteen suhteen (yli 90 %rn sekvensseistä ollessa samoja) ja niillä on 15 myös pääasiallisesti samat biologiset ominaisuudet. Erityisesti edellä olevan kaavan mukaiset polypeptidit aiheuttavat solukasvun tiheydestä riippuvan estymisen puutetta yksikerrosviljelyssä, liikakasvua yksikerrosvilje-lyssä, luonteenomaisen muutoksen solun morfologiassa ja 20 kiinnittymisestä riippumattoman kasvun saamisen, kun niitä käytetään muuntamattomiin, normaaleihin indikaattorisolui-hin, jotka on kasvatettu viljelmässä. Sen lisäksi että ne ovat äärimmäisen voimakkaita solukasvun edistäjiä ja solu-muunnoksen aiheuttajia, edellä esitetyn kaavan mukaiset 25 TGF-polypeptidit kilpailevat EGFrn kanssa sitoutumisesta solun EGF-reseptoriin ja niillä on kyky aktivoida entsyymi, proteiinikinaasi, ihmisen kasvainsolumembraaneissa.
Kuten seuraavassa yksityiskohtaisemmin esitetään, keksinnön mukaisesti edellä mainitun kaavan mukaisia TGF-30 polypeptidejä saadaan sopivasti erilaisista muunnetuista ihmis- ja hiirisolulinjoista, tietyistä sikiön solulin-joista ja kasvainta kantavien nisäkkäiden kehon nesteistä käyttäen myöhemmin kuvattavaa eristysmenetelmää tai tavanomaista synteettistä tai rekombinanttimenetelmää polypep-35 tidien syntetisoimiseksi. Tyypillisesti mainitun kaavan 9 81365 mukaisten TGF-polypeptidien ja niiden oligomeerien mole-kyylipaino on alueella n. 5000 - 35 000. Tässä suhteessa edullisia ovat TGF-polypeptidit, joiden molekyylipaino on n. 5000 - 8000.
5 Keksinnön mukaisesti valmistettuja TGF-polypeptide- jä voidaan käyttää pahanlaatuisuuksien havaitsemisessa nisäkkäillä, koska TGF-polypeptidien tuotanto ja/tai nousseet tuotantotasot ovat luonteenomaisia tiettyjen ihmis-ja hiirisolulinjojen morfologiselle muunnokselle. Tässä 10 suhteessa myös vasta-aineilla TGF-polypeptideille on käyttöä pahanlaatuisuuden diagnoosissa, koska niitä voidaan käyttää havaitsemaan kasvainsoluissa tai kehon nesteissä läsnäolevan TGF-polypeptidin äärimmäisen alhaiset tasot. Samalla kun koko TGF-polypeptidimolekyyliä voidaan käyttää 15 vasta-aineiden muodostamiseen (sekä polyklonaalisten että monoklonaalisten), on myös mahdollista ja edullista kustannusten ja teknisen ponnistelun kannalta määrittää TGF-polypeptidisekvenssin eri alueita, jotka todennäköisesti ovat determinanttikohtia, ja käyttää näitä vähintään noin 20 8 aminohapon, tyypillisesti vähintään noin 10 eikä enemmän kuin noin 20 aminohapon oligopeptidejä määrittelemään hap-teeni, jota voidaan käyttää vasta-aineen muodostumisen indusointiin. Oligopeptidi sidotaan sopivaan immunogeeniin ja viedään selkärankaiseen haluttujen vasta-aineiden to-25 teamiseksi. Esimerkkejä antigeenisistä oligopeptideistä, jotka ovat käyttökelpoisia muodostettaessa tällaisia vasta-aineita, luetellaan seuraavassa.
A)Val-Val-Ser-His-Phe-Asn-Lys-Cys-Pro-Asp-Ser-His-Thr 30 B) Cys-His-Ser-Gly-Tyr-Val-Gly-Val-Arg-Cys C) Cys-His-Ser-Gly-Tyr-Val-Gly-Val-Arg-Cys-Glu-His-
Ala-Asp-Leu-Leu-Ala ja D) Val-Gly-Val-Arg-Cys-Glu-His-Ala-Asp-Leu-Leu-Ala.
Keksinnön mukaisesti edellä esitetyn kaavan mukai- 35 siä polypeptidejä ja oligopeptidejä sekä edellä esitettyjä peptidisekvenssejä voidaan valmistaa käyttäen synteettisiä 10 81 365 menetelmiä, menetelmiä, joissa peptidi eristetään luonnossa esiintyvästä lähteestä, esim. solulinjoista ja kehon nesteistä, sekä menetelmiä, joissa käytetään hybridi-DNA-teknologiaa. Niinpä polypeptideille ja oligopeptideille 5 käytetään sopivasti tavanomaista kiinteäfaasipeptidisyn- teesiä. Tässä yleisessä synteesimenetelmässä peptidien valmistamiseksi, joka menetelmä on kuvattu esimerkiksi Ganfield et ai.'n US-patentissa 4 341 761, käytetään tunnettuja sivuketjusuojaryhmiä ja tavanomaisia polystyreeni-10 hartsimatriiseja, esimerkiksi kloorimetyloituja hartseja, hydroksimetyylihartseja tai bentshydryyliamiinihartseja, aminohappokytkennän toteuttamiseksi. Polypeptideille voidaan sopivasti käyttää myös alempana kuvattua menetelmää homogeenisten TGF:ien eristämiseksi luonnon lähteistä ha-15 lutun peptidin puhtaiden muotojen saamiseksi. Tässä suhteessa erityisen sopivia TGF-polypeptidien lähteitä ovat seerumiton väliaine, jota on käsitelty retroviruksella muunnetuilla Fischer'in rotan sikiön fibroblasteilla, erityisesti fibroblasteilla, jotka on muunnettu Snyder-Thei-20 Ien kissan sarkoomaviruksella, Moloneyn hiiren sarkoomavi-ruksella muunnetuilla hiiren 3T3-soluilla ja ihmisen me-tastaattisilla melanoomasolulinjoilla A2058 ja A375. Lähteitä ja menetelmiä sopivia hiirisolulinjoja varten ovat kuvanneet DeLarco et ai., J. Biol. Chem. 255 (1980) 3685 -25 3690, ja Ozanne et ai., J. Cell. Physiol. 105 (1980) 163 - 180. Lähteitä ja menetelmiä ihmisen solulinjoja varten ovat samalla tavalla kuvanneet Todaro et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77 (1980) 5258 - 5262 sekä Giard et ai., J. Natl. Cancer Inst. 51 (1973) 1417 - 1423. Seuraa-30 vassa selostettua eristämismenetelmää voidaan myös käyttää TGF-polypeptidien saamiseksi erilaisista kehon nesteistä, kuten ihmisten tai hiirten, joilla on pahanlaatuisuuksia, virtsasta, seerumista, plasmasta, kokoverestä tai aivoselkäydinnesteestä, tai muunnetuista soluista, jotka tuotta-35 vat TGF-polypeptidejä. Tässä suhteessa sopiva TGF-polypep-
II
11 81365 tidien lähde on virtsa tai muut kehon nesteet hiiristä, joihin on siirretty kasvainsoluja (ihmisen melanooma- tai muunnettuja rotan soluja), joiden tiedetään tuottavan TGF-polypeptidejä. Kaikissa tapauksissa TGF-polypeptidin iden-5 tifiointia ja puhtautta voidaan tarkkailla radioreseptori-määritysmenetelmällä, joka perustuu ristiin reaktiivisuuteen EGF:n kanssa reseptoriin sitoutumisesta (ks. koe-esi-merkit seuraavassa). Menetelmissä, joissa käytetään yhdistelmä- tai hybridi-DNA-teknologiaa, voidaan oligopeptidejä 10 tai polypeptidien segmenttejä, jotka sisältävät korkeintaan esimerkiksi 20 aminohappoa, käyttää kodonisekvenssin johtamiseksi yksisäikeisiä nukleotidi (DNA) -koettimia varten. Nämä nukleotidikoettimet voidaan sitten syntetisoida käyttäen tunnettuja synteesimenetelmiä ja käyttää 15 koettimena lähetti-RNA:n (mRNA) saamiseksi, joka koodaa kasvutekijätyyppisiä polypeptidejä sekä normaaleissa että muunnetuissa soluissa tai kehon nesteissä, jotka sisältävät näitä peptidejä. Kun lähetti-RNA on saatu, voidaan käyttää tavanomaisia menetelmiä mRNA:n käänteiskopioimi-20 seksi cDNA:ksi ja sen jälkeen kloonata cDNA sopivassa vektorissa halutun polypeptidin ilmentymisen aikaansaamiseksi .
Keksinnön mukainen menetelmä antaa käyttöön ainutlaatuisen tehokkaan keinon TGF-polypeptidien saamiseksi 25 homogeenisessa muodossa erilaista vesipitoisista nesteistä, jotka sisältävät TGF-polypeptidien vähemmän puhtaita muotoja, esimerkiksi seerumittomista väliaineista, jotka on käsitelty TGF-polypeptidejä tuottavilla muunnetuilla solulinjoilla, tai nisäkkäiden, joilla on pahanlaatuisuuk-30 siä, kehon nesteistä, esimerkiksi virtsasta, tai muunnetuista soluista, jotka tuottavat TGF-polypeptidejä. Tämän eristys- tai puhdistusmenetelmän tärkeitä puolia ovat al-ku-uutto eli dialyysivaihe, jossa käytetään vesipitoista etikkahappoa, sitä seuraava TGF:ää sisältävän happoon liu-35 kenevan aktiivisuuden geelisuodatuskromatografia ja lopuk- i2 81 365 si käänteisfaasikorkeapainenestekromatografia käyttäen peräkkäin asetonitriiliä ja 1-propanolia vesipitoisen tri-fluorietikkahapon läsnäollessa.
Eräässä edullisessa sovellutusmuodossa keksinnön 5 mukaista menetelmää voidaan käyttää edullisesti homogeenisten TGF:ien eristämiseksi seerumittomista väliaineista, joita on käsitelty muunnetuilla, TGF:ää tuottavilla solu-linjoilla. Tällöin käsitelty väliaine selkeytetään edullisesti esimerkiksi sentrifugoimalla ja väkevöidään ennen 10 dialyysiä ja TGFrää sisältävä dialyysistä saatu liuotin-faasi selkeytetään sopivasti esimerkiksi sentrifugoimalla sekä väkevöidään myös ennen geelisuodatuskromatografiaa. Kaikissa tapauksissa dialyysi suoritetaan sopivasti käyttäen vesipitoista etikkahappoliuotinta, jonka etikka-15 happopitoisuus on 0,01 - 1 M, jolloin 0,1 M etikkahappo on edullinen. Geelisuodatuskromatografia voidaan toteuttaa käyttäen joukkoa erilaisia geelejä, joita tavanomaisesti käytetään proteiinien tai polypeptidien erottamiseen mole-kyylikokoon perustuen. Sopivia geelejä ovat dekstraarigee-20 lit, agaroosigeelit ja polyakryyliamidigeelit. Tässä suhteessa edullisia ovat polyakryyliamidigeelisuodatushartsit (Bio-GelR-hartsit), kuten Bio-Gel P-10, Bio-Gel P-30 ja Bio-Gel P-60, joista Bio-Gel P-10 on erityisen edullinen. Vesipitoisen etikkahapon, jota käytetään pylvään tasapai-25 nottamiseen ja TGF:ää sisältävien fraktioiden eluointiin, etikkahappopitoisuus on sopivasti 0,2 -2,0 M, jolloin 1,0 M etikkahappo on edullinen. TGF:ää sisältävät fraktiot, jotka eluoituvat pylväästä, voidaan tunnistaa määrittämällä niiden EGF:n kanssa kilpaileva aktiivisuus ja kasvua 30 edistävä aktiivisuus pehmytagarissa (ks. koe-esimerkit seuraavassa). Geelisuodatuskromatografiästä saadut fraktiot, jotka sisältävät TGF-polypeptidejä puhtaudeltaan parantuneina, yhdistetään ja väkevöidään, esimerkiksi kyl-mäkuivaamalla, valmistavana vaiheena lisäpuhdistusta var-35 ten käänteisfaasikorkeapainenestekromatografiällä (FiPLC).
Il i3 81 5 6 5
Puhdistusprosessin loppuvaihe käsittää peräkkäiset HPLC:t eluoiden asetonitriilillä ja 1-propanolilla vesipitoisen trifluorietikkahapon läsnäollessa. Nämä peräkkäiset HPLC-ajot voidaan toteuttaa käyttäen yhtä tai useampia 5 HPLC-pylväitä, mutta on edullista toteuttaa peräkkäiset HPLC-vaiheet käyttäen yhtä ainoata HPLC-pylvästä. Käytetty pylvään täyte on sopivasti huokoista piihappomatriisia, johon on sidottu pitkäketjuinen hiilivety, esimerkiksi 16-22 hiiliatomia sisältävä hiilivety. Edullisia täytteitä 10 ovat pBondapak-hiilivetypylväät, erityisesti pBondapak C18-pylväs (partikkelikoko 10 pm, 0,39 x 30 cm, Waters Associates). Menetelmä toteutetaan tyypillisesti paineen alaisena, edullisesti paineessa väliltä n. 3,45 x 105 - 3,45 x 107 Pa (50-5000 psi). Ennen pylvääseen viemistä vä-15 kevöidyt, TGF:ää sisältävät fraktiot muodostetaan uudelleen 1 - 10-%:iseen trifluorietikkahappoon ja säädetään pH-arvoon 2-5, edullisesti 3-5, lisäämällä trifluori-etikkahappoa. Pylväs tasapainotetaan sopivasti 0,01 - 0,1-%:isella vesipitoisella trifluorietikkahapolla, edullises-20 ti 0,05-%:isella vesipitoisella trifluorietikkahapolla, ennen näytteen ruiskuttamista. Ensimmäinen eluointi suoritetaan asetonitriilillä 0,01 - 0,l-%:isessa, edullisesti 0,05-%:isessa trifluorietikkahapossa käyttäen lineaarista asetonitriiligradienttia (asetonitriiliväkevyys kasvaa 25 lineaarisesti gradientilla n. 0,1 %/min - n. 1 %/min). Eluointi suoritetaan ajanjaksona 0,2:sta 3 tuntiin virtausnopeudella n. 0,2-2 ml/min ja lämpötilassa n. 10 -50 °C, edullisesti n. 40 cC:ssa. Yhdistetyt fraktiot, jotka sisältävät TGF-aktiivisuuden määritettynä EGF:n kanssa 30 kilpailulla ja pehmytagaranalyysillä, väkevöidään esimerkiksi kylmäkuivaamalla ennen toista HPLC-vaihetta käyttäen 1-propanoliliuotinta. Peräkkäisen HPLC:n toista vaihetta varten yhdistetyt ja väkevöidyt fraktiot ensimmäisestä HPLC-eluoinnista muodostetaan uudelleen 0,01 - 0,l-%:iseen 35 trifluorietikkahappoon ja kromatografoidaan uudelleen sa- i4 81 365 massa pylväässä tai toisessa pylväässä, joka on tasapainotettu trifluorietikkahapolla samalla tavalla, jota käytettiin ensimmäistä pylvästä varten. Tämä toinen eluointi suoritetaan 1-propanolilla, 0,01 - 0,l-%:sessa, edullises-5 ti 0,035-%:sessa trifluorietikkahapossa, käyttäen lineaarista 1-propanoligradienttia. Optimituloksia varten on tärkeätä käyttää tässä vaiheessa matalaa lineaarista 1-propanoligradienttia. Erityisesti 1-propanolipitoisuutta tulisi lisätä lineaarisesti gradientilla, joka ei ylitä 10 0,1 %/min ja edullisesti lineaarinen 1-propanoligradientti tulisi pitää välillä 0,01 %/min ja 0,05 %/min eluoinnin aikana. Tämä toinen eluointi suoritetaan sopivasti aikana yhdestä viiteen tuntiin virtausnopeudella n. 0,5 - 5 ml/min ja lämpötilassa alueella 10 -60 °C, edullisesti n. 15 40 °C:ssa. Säätämällä lineaarista 1-propanolipitoisuusgra- dienttia edellä annetuilla matalilla tasoilla on mahdollista eluoida TGF-polypeptidit hyvin määriteltyinä TGF-aktiivisuuden huippuina homogeenisina polypeptideinä.
Tällä eristysmenetelmällä on mahdollista ottaa tal-20 teen n. jopa 70 % alku-TGF-aktiivisuudesta epäpuhtaassa lähtöaineesta, jolloin saavutetaan yli 200 000 -kertaisia puhdistumiasteita. Eristämismenetelmällä saatujen homogeenisten TGF-polypeptidien molekyylipainot ovat tyypillisesti alueella n. 5 000 - 35 000 ja ne ovat riittävän puhtai-25 ta sallimaan peptidisekvenointi. Edullisia homogeenisiä TGF-polypeptidejä, joita saadaan tällä menetelmällä, ovat TGF:t, joiden näennäiset molekyylipainot ovat 7 400, 20 000 ja 30 000 - 35 000. Näillä homogeenisillä TGF-poly-peptideillä on luonteenomaisia TGF-polypeptidien biologi-30 siä ominaisuuksia, kun niitä käytetään viljelmässä kasvaviin muuntamattomiin, normaaleihin indikaattorisoluihin, mukaan lukien kiinnittymisriippumattomuuden saavuttaminen, mistä on tuloksena kyky kasvaa pehmytagarissa. Näitä homogeenisiä TGF-polypeptidejä voidaan käyttää nostattamaan 35 vasta-aineita, joilla on arvoa syövän ja muiden prolifera-
II
is 8 Ί 3 6 5 tiivisten tautien havaitsemisessa. Tässä suhteessa ei ole olennaista, että jokainen TGF:n muodoista puhdistetaan homogeenisyyteen vasta-aineiden tuottamiseksi eri TGF-pep-tideille.
5 Keksinnön mukaisesti valmistettuja polypeptidejä ja oligopeptidejä voidaan käyttää syövän ja muiden prolifera-tiivisten sairauksien hoitoon sekä hoitoihin, joissa solu-kasvun edistäminen on eduksi, esim. haavan parantamiseen ja haavauman hoitoon. Niitä voidaan käyttää farmaseuttisi-10 na koostumuksina, jotka sisältävät tehokkaan määrän kyseistä poly- ja/tai oligopeptidiä sekoitettuna farmaseuttisesti hyväksyttäviin kantajiin. Erityisesti farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisältävät aktiivisena aineosana keksinnön mukaisesti valmistettuja poly- tai oligopeptide-15 jä, voidaan yleensä formuloida sopivan kiinteän tai nestemäisen kantajan kanssa kulloinkin käytettävää antotapaa vastaavasti. Esimerkiksi parenteraaliset formulaatiot ovat tavallisesti injektoitavia nesteitä, joissa käytetään kantajina farmaseuttisesti ja fysiologisesti hyväksyttäviä 20 nesteitä, kuten fysiologista suolaliuosta, tasapainotettuja liuoksia jne. Oraalisesti käytettävät formulaatiot puolestaan voivat olla kiinteitä, esim. tabletteja tai· kapseleita, tai nestemäisiä liuoksia tai suspensioita.
Keksinnön mukaisesti valmistettuja poly- ja/tai 25 oligopeptidejä voidaan antaa ihmisille eri tavoin, kuten suun kautta, laskimonsisäisesti, lihaksensisäisesti, vat-saontelonsisäisesti, nenänsisäisesti, ihonsisäisesti ja ihonalaisesti. Käytettävän antotavan ja annosalueen valitsee hoitava lääkäri ottaen huomioon potilaan yksityiskoh-30 dat, tarvittavan hoidon luonteen ja/tai kyseessä olevan sairauden tilan. Esimerkiksi haavoista vaurioitunutta kudosta hoidetaan tavallisesti päivittäisellä tai kahdesti päivässä annettavalla annoksella muutamasta päivästä muutamaan viikkoon; kun taas kasvain- tai syöpähoito käsittää 35 päivittäisen tai useita päivittäisiä annoksia kuukausien ie 81365 tai vuosien ajan. Hoito keksinnön mukaisesti valmistetuilla poly- ja/tai oligopeptideillä voidaan yhdistää muiden hoitojen kanssa ja siihen voi liittyä hoito muilla kemote-rapeuttisilla tai kemiallisesti estävillä aineilla hoidon 5 antamiseksi proliferatiivisia sairauksia tai kasvaimia vastaan tai muissa tiloissa, joihin ne ovat tehokkaita.
Esimerkki I
Ihmisen pienimolekyylipainoisten muuntokasvuteki-jöiden (hTGF:t) tuottaminen, puhdistaminen ja karakteri-10 sointi A. Kokeellisia menetelmiä hTGF:ien lähde hTGFit puhdistettiin seerumittomasta väliaineesta, jota oli käsitelty ihmisen metastaattisella melanooma lin-15 jalla A2058 (Todaro et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77 (1980) 5258 - 5262), joka oli peräisin aivometastaasista 43 vuoden ikäiseltä mieheltä. Soluja kasvatettiin 90 %:n yhteenkasvuun kiertopulloissa, jotka sisälsivät Dulbecco'n modifioitua Eagle'n väliainetta (Grand Island Biolocfical 20 Co., 430-2100), jota oli täydennetty 10 %:lla vasikan seerumia (Colorado Serum Co.) 37 °C:ssa. Soluja pestiin 1 tunti 50 ml:11a seerumitonta Waymouth'in väliainetta (Grand Island Biological Co., MD 705/1). Tämä ja toinen 24 tuntia myöhemmin kerätty supernatantti hylättiin. Myöhem-25 mät supernatantit otettiin talteen joka toinen päivä tai joka kolmas päivä kahden viikon ajan.
Väliaine kerättiin talteen dekantoimalla, varastoitiin korkeintaan 24 h 4 °C:ssa proteaasi-inhibiittori-fe-nyylimetaanisulfonyylifluoridin (1 pg/ml) läsnäollessa ja 30 selkeytettiin jatkuvavirtaussentrifugoinnilla kierrosno-peudella 32 000 rpm 4 °C:ssa. Käytettiin virtausnopeuksia 5 1/h CF-32-jatkuvavirtausroottorissa (Beckman) L5-50 -mallisessa ultrasentrifugissa (Beckman). Suurnopeuksisen 35
II
i7 8 1 365 sentrifugoinnin jälkeen saatua supernatanttia nimitetään A2058-käsitellyksi väliaineeksi.
A2058-käsitelty väliaine väkevöitiin välittömästi onttokuitu-dialysoimis/väkevöimislaitteessa (Model DC10, 5 H10P5-20-tyyppinen patruuna, Amicon Corp. ) 10 °C:ssa. Kon-sentraatti valutettiin, kun tilavuus oli pienentynyt 150-kertaisesti. Patruuna pestiin 1 000 ml:11a Waymouth'in väliainetta. Ultrasuodos hylättiin. hTGF:ien puhdistaminen 10 Dialyysi ja sentrifugoiminen
Yhdistettyä retentaattia ja patruunan pesunestettä A2058-käsitellyn väliaineen ultrasuodatuksen jälkeen dia-lysoitiin 60 tuntia 0,1 M etikkahappoa vastaan Spectrapor 3 -dialyysiletkussa (Spectrum Medical Industries). Reten-15 taattia sentrifugoitiin 100 000 x g:ssa 1 tunti 4 °C:ssa. Pelletti hylättiin. Supernatantti väkevöitiin kylmäkuivaa-malla ja liuotettiin 0,5 mlraan 1 M etikkahappoa litraa alkuperäistä A2058-käsiteltyä väliainetta kohti. Kromatografia Bio-Gel P-10 -geelillä 20 Väkevöinnin, dialyysin ja sentrifugoinnin jälkeen supernatantti, joka sisälsi hTGF-aktiivisuuden, puhdistettiin edelleen geelisuodatuskromatografiällä Bio-Gel P-10 -pylväässä (2,5 x 8,5 cm, patsaan tilavuus 420 ml, 200-400 mesh, Bio-Rad Laboratories). Pylväs tasapainotettiin 1 M 25 etikkahapolla 22 °C:ssa. Pylvääseen vietiin proteiininäyt-teet (65 - 115 mg) IM etikkahapossa (5 ml). Muuttumattoman virtausnopeuden varmistamiseksi nesteen ulosvirtaus pylväästä asetettiin 12 ml/h:ksi peristalttisella pumpulla. Kerättiin 4,8 ml:n fraktioita. Pienet määrät fraktioi-30 ta kylmäkuivattiin myöhempiä EGF:n kanssa kilpailevan aktiivisuuden ja kasvua edistävän aktiivisuuden määrityksiä varten pehmytagarissa. Fraktiot, jotka edustivat tietyn huipun pääosia, yhdistettiin ja väkevöitiin kylmäkuivaa-malla.
35 is 81365 Käänteisfaasikorkeapainenestekromatografla hTGF:n lopullinen puhdistaminen tapahtui kääriteis-faasi-HPLC:11a käyttäen yleistä menetelmää, jonka ovat selostaneet Marquardt et ai., J. of Biol. Chem. 256 (1981) 5 6859 - 6865. Kaikki erottamiset suoritettiin pBondapak C18- kolonnilla (partikkelikoko 10 pm, 0,39 x 30 cm, Vfaters Associates) virtausnopeudella 1 ml/min 40 °C:ssa. Kylmäkuivatut näytteet muodostettiin uudelleen 0,05-%:iseen (v/v) trifluorietikkahappoon vedessä, säädettiin pH-arvoon 10 2 10-%:isella (v/v) trifluorietikkahapolla ja vietiin näy- teinjektorin avulla pylvääseen, joka oli tasapainotettu 0,05-%:isella trifluorietikkahapolla. Pylväs eluoitiin sitten lineaarisella asetonitriili-gradientilla 0,045-%:isessa trifluorietikkahapossa. Pylväästä ulosvir-15 taava neste kerättiin 1,5 ml:n fraktioina. Pienet määrät fraktioita kylmäkuivattiin EGF:n kanssa kilpailu- ja kasvun stimulointi-määrityksiä varten. Yhdistetyt fraktiot, jotka sisälsivät pääosan hTGF-aktiivisuudesta, väkevöitiin kylmäkuivaamalla.
20 Yhdistetyt, hTGF:ää sisältävät erät liuotsittiin 0,05-%:iseen trifluorietikkahappoon ja kromatografoitiin uudelleen samassa pylväässä, joka oli sitä ennen tasapainotettu 0,05-%:isella trifluorietikkahapolla vedessä. Sitten pylväs eluoitiin lineaarisella 1-propanoli-gradissntil-25 la 0,035-%:isessa trifluorietikkahapossa. Pylväästä ulos-virtaava neste kerättiin 1,5 ml:n fraktioina. Pienet määrät fraktioita kylmäkuivattiin EGF:n kanssa kilpailu- ja kasvun stimulointi -määrityksiä varten.
SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi 30 Natriumdodekyylisulfaatti (SDS) -polyakryyliamidi- geelielektroforeesi suoritettiin, kuten Laemmli on sselos-tanut, Nature (Lond) 227 (1980) 680 - 685. Valmistsvttiin 15 - 30-%:inen akryyliamidigradienttilevy (140 x 120 x 0,75 mm), jossa oli 4 %:inen konsentrointigeeli. Gsselejä 35 ajettiin ajojännitteellä 30 V käyttäen elektrodipuskuria,
II
i9 81 365 joka sisälsi Tris:ä (0,05 M), glysiiniä (0,38 M) ja SDS (0,1 %, w/v), kunnes merkkiväriaine (bromifenolisininen) oli kulkenut pois geelin päästä. Elektroforeesin jälkeen geelejä kiinnitettiin kahden tunnin ajan 50-%:isessa meta-5 nolissa, joka sisälsi 10 % etikkahappoa, pestiin yli yön 5-%:isessa metanolissa, joka sisälsi 7 % etikkahappoa, ja värjättiin hopealla (Oakley et ai., Anal. Biochem. 105 (1980) 361 - 363).
Proteiinimääritys 10 Kokonaisproteiini määritettiin käyttäen naudan see- rumialbumiinia standardina. Ennen proteiinimääritystä lähtöaine dialysoitiin fosfaattipuskuroitua fysiologista suolaliuosta vastaan värireaktioita häiritsevien viljelyväli-aineen aineosien poistamiseksi tai kylmäkuivattiin, jos 15 näytteet oli liuotettu haihtuviin happoihin. Proteiini määritettiin myös aminohappoanalyysillä. Kylmäkuivattuja näytteitä hydrolysoitiin 110 °C:ssa 24 tuntia tyhjennetyissä Pyrex-putkissa käyttäen 0,1 ml 6 M HCl:a, joka sisälsi 0,1 % nestemäistä fenolia, ja analysoitiin Durrum D-20 500 -analysaattorilla, joka oli varustettu PDP 8/A -tieto- koneintegraattorilla käyttäen, o-ftaalihappoaldehydiä primaaristen amiinien fluorogeenista havaitsemista varten (Bensen et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 72 (1975) 619 -622).
25 Radioreseptorimääritys
Puhdistettu EGF leimattiin Na125I:lla kloramiini-T-menetelmän muunnoksella, kuten ovat selostaneet DeLarco et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75 (1978) 4001 - 4005. 125I-EGF-sitoutumisanalyysi suoritettiin käyttäen formaliinilla 30 kiinnitettyjen A431-ihmissyöpäsolujen lähes yhteneviä yk-sisolukerroksia, kuten aikaisemmin on selostettu (DeLarco et ai., J. of Biol. Chem. 255 (1980) 3685 - 3690). Kiinnitetyt solut pestiin kahdesti 0,5 ml:11a sidepuskuria (Dulbecco'n modifioitu Eagle'n väliaine, joka sisälsi 1 35 mg/ml naudan seerumin albumiinia ja 50 mM 2-[bis(2-hydrok- 20 81 365 sietyyli)amino]etaanisulfonihappoa, pH 6,8). Kilpailut aloitettiin lisäämällä 0,2 ml sidepuskuria, joka sisälsi 0,4 ng 125I-EGF:ää mahdollisen inhibiittorin kanssa tai ilman sitä. Yhden tunnin inkuboinnin jälkeen 22 °C:ssa spe-5 sifisesti sitoutunut 125I-EGF määritettiin. TGF-sisältö ilmaistiin sen 125I-EGF:n sitoutumista EGF-reseptoriin inhi-bointiasteen avulla. Yksi EGF:n kanssa kilpaileva aktiivi-suusyksikkö määritellään määräksi proteiinia, joka estää 125I-EGF-sitoutumisen reseptoriinsa 50-%:isesti.
10 Kasvumääritys pehmytagarissa
Pesäkekasvumääritys pehmytagarissa käyttäen normaalin rotan munuaisfibroblasteja, kloonia 49F, suoritettiin kuten Todaro et ai. ovat esittäneet, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77 (1980) 5258 - 5262. Testattavat kylmäkuivatut 15 näytteet muodostettiin uudelleen 0,5 ml:aan Dulbecco'n modifioitua Eagle'n väliainetta, jota oli täydennetty 10 %:lla vasikan seerumia. Lisättiin 1,5 ml 0,5-%:ista (w/v) agaria (Difco) täydennetyssä väliaineessa ja 0,5 ml täydennettyä väliainetta, joka sisälsi 2,3 x 104 solua. 2,3 ml 20 syntynyttä seosta pipetoitiin 2 ml:n pohjakerrokselle (0,5 % agaria täydennetyssä väliaineessa) 60 mm:n petri-maljoissa (Falcon). Soluja inkuboitiin 37 °C:ssa kosteutetussa, 5 % C02 ja 95 % ilmaa sisältävässä atmosfäärissä. Määritys luettiin kiinnittämättömänä ja värjäämättömänä 5. 25 päivänä ja 10 - 14. päivinä.
B. Tulokset hTGF:ien lähde, väkevöinti ja alkufraktiointi hTGF:t eristettiin ihmisen erittäin muunnetun ineta-staattisen melanoomasolulinjan, A2058, seerumittomasta 30 käsitellystä väliaineesta. hTGF:ien kvantitatiivinen määritys perustui kahteen sen ominaisuuteen: kykyyn indusoida normaalien rotan munuaisfibroblastien kiinnittymisestä riippumaton kasvu pehmytagarissa ja kyvystä kilpailla 125I-EGF: n kanssa EGF-reseptorikohdista ihmisen syöpäsoluissa 35 A431. Yhteenveto vaiheista, jotka johtavat hTGF:ien eris tämiseen ja sen talteenottoon, on esitetty taulukossa I.
Il 2i 81 ό 6 5 —κ m <—· —» rH 1
O O ** — CO
- OOO'sO^OJW .
0 i—I rH 00 * - Φ ,Q 2 e ' ’ ' ' ' ’ fN rs) .β to * 2 o in o o o m t— .p u JH dP o <ji - - - tOC 1-1 5 H to h< co > Φ ^ to h· h< m 0)" -p 00 · p [0
tn , C °° <0 P
Φ d 3 —· — σι ή >ί .5 Q) .Η ·ω β Ή .H I" - β :t0 * 1 c “ ·Η - ^ « -h e θ' 2 h 2 S to ^ -Htnfi^
(0 q 2 +> r-l r-l VOOJ E Ή O
H -T 2 D .—ICOCNVO β (0 tfO D
r-t^4^ Φ ro ro Λ i(0 [n A COVO r-i a! ^ > · - 3 i _r - « «o * .
5 2 rH ΓΟ C -H
-.to - Ϊ 3 c c tn 2 P ’ 5 “t Cn <N -H Ή Λ * » « ‘«n >j s g oi * * ^ <u β -H -H ;fö C · CO :(0
H p β φ p :° ^ H o o o o φ C O
(D o j ή ^ ‘ H in O <U Ή Ή B
^ m J m ΐ ^ ^ 1/1 rHOO UI -H _,
.H w -( ui to ,H - tn χ G
m , ! tn co h β >i :2 «o p oo m to tri -<0 v <u , >, o Ό .—I « 1-1 3 «e -h ^ - cd 3 td β 1 3 j oo .· 2 β βπ3ΓΗ^'ΐ1
lp, CX tn o -h +J
oU'd'd-Q U ft C ,¾ ” cm I W :rö β Dj (0 ·® tl) < C :θ m σι ro co vo -H to > *5 w Φ β to '3 A «n σ. r" ro oi r- T3 .β Φ b” - Φ P tn "n A m cm o o m h D o ή
β P P tn το ·η - - ^ G O 'S A
(D H (D C ™ tn 'f H· CNtNf-lrH TO-H 70^ •n <0 -P ra <ö A G E β ^ 2 H °A > >1 ^ « % m to 0 tn -h +j tn
tn ro β P 31 F
1 -H β P -h « -h ro i c cu tn to 3 d
E β -h m :to β > 3 D
OCUD-H (NrH +J D rO tn O
O cu 4-· cu o r- r> in o o U 0 Λ ^ C p p p Cnnjro - - 01 o >1 Dj h Pj (0 M φ O go 00 OH'-- :r0 β -r] £ P rO P P - (N P O O ΑΦφ-ΗΦ Φ H O Dj P >1 Ό £ £ g — C P 3 * β H -H -H D Ό C »H —- ·Η M W ζ5
φ Λ1 ·Η -H P :r0 -H [0 D
tn JJ -H h -P :r0 > > “ •H 5 , DO Φ E -H <U -h g -h i -p c -μ -h ^ s Λ 3 5 -H (0 Ή C P -H β •h il F cmcDj ρ φ a 3 -3 ."dm IIOO :t0 β f0 3
β 'v X O O P P :t0 Ή d O
φ >S4 p p φ Dj β ^ 3 I I tn 1 -Η φ A Ή •η r?“ ft Oj o h -h -h tn tn g ^β — β +J -H <0 to "d Φ >1 >1 -H to lp tn β +J tl) c O P pl 00 00 -H P -H tn ·· tn φ "F -h rH p P 1—) 1—1 cu-Hing^
•H Λ -h o ΙΦΦυυ -l-> pj a» S
Ό -H w^jpjpp OGDj-^W
p to ‘S3 tntnAA
Μβ > * ·Η , H -H H o t) Dj >
Dj ω I rld φ Ό Ό Dj Dj I A β " £ O 3 00 OfiOPP Ό rö tn tUpH^j
j<c p> m 0,+^ 1 >i >1 O o -HetnUrH
Αϋ tn o a S o β β to2‘HW.rj o S -h <n ta 3 -h 00 g p* _, :d
rHfcj Ό CK-^CQ PQ 03 0 ^ ^ m . I
β O Λ tOEn β ... .. ΟΗβ^^ E-ip PU PtNro H1 in «ΧΐΡ^ΐΦ <0 p 22 81 365
Seerumiproteiinien poistamiseksi A2058-soluja pestiin perusteellisesti Waymouth’in väliaineella ennen niiden viljelemistä seerumittomassa väliaineessa. Superna-tanttinesteet otettiin talteen joka toinen päivä kahden 5 viikon ajan. Viljelyolosuhteet olivat sellaiset, että vil-jelyjakson lopussa yli 90 % soluista oli vielä elinvoimaisia ja kiinnittyivät yksisoluisina kerroksina. Ensimmäinen selkeytetty 136 l:n määrä A-2058-käsiteltyä väliainetta, joka sisälsi 1,02 g kokonaisproteiinia ja 4525 yk-10 sikköä EGF:n kanssa kilpailevaa aktiivisuutta, väkevöitiin n. 900 mltksi käyttäen onttokuituväkevöimislaitetta, jonka patruunoiden molekyylipainoraja oli 5 000. Koko EGF:n kanssa kilpaileva aktiivisuus pidättyi ja saanto oli yli 95 %.
15 Väkevöidyn, A2058-käsitellyn väliaineen dialyysi etikkahappoa vastaan ja senjälkeinen sentrifugointi tuottivat 95 %:n saannon alkuperäisestä EGF:n kanssa kilpailevasta kokonaisaktiivisuudesta. 18 % proteiinista oli happoon liukenematonta ja hylättiin. Happoliukoinen, osittain 20 puhdistettu hTGF saatettiin geelisuodatuskromatografiaan käyttäen Bio-Gel P-10 -geeliä. Pylväs eluoitiin 1 M etik-kahapolla. Kontaminoivan proteiinin päämassa eluoitiin yhdellä pylvään tilavuudella ja erottui hyvin EGF:n kanssa kilpailevasta aktiivisuudesta ja kasvua stimuloivasta ak-25 tiivisuudesta. Kahden aktiivisuushuipun havaittiin olevan hyvin erillään toisistaan. Fraktioiden, joilla oli sekä EGF:n kanssa kilpaileva että kasvua stimuloiva aktiivisuus (P-10-A ja P-10-B), näennäiset molekyylipainot olivat 10 500 ja 6 800, vastaavasti. Fraktioita, joilla oli vain 30 toinen näistä kahdesta aktiivisuudesta, ei havaittu.
hTGF:ää sisältävät fraktiot yhdistettiin, kuten on esitetty, kylmäkuivattiin ja puhdistettiin edelleen. Suurempimo-lekyylipainoinen TGF eluoitui pylväästä leveänä piikkinä (P-10-A) ja näytti liittyvän erikokoisiin polypeptideihin. 35 P-10-A sisälsi 46 % alkuperäisestä EGF:n kanssa kilpaile vasta aktiivisuudesta. Pienimolekyylipainoinen TGF eluoi-
II
23 8 1 365 tui pylväästä terävänä piikkinä (P-10-B) ja edusti 45 % alkuperäisestä EGF:n kanssa kilpailevasta kokonaisak-tiivisuudesta. Pylvääseen viedyn EGF:n kanssa kilpailevan aktiivisuuden yhteinen saanto vaiheesta 1 geelisuodatus-5 kromatografiavaiheen läpi oli 91 % (taulukko I). hTGF e-luoitui kahtena erillisenä pääpiikkinä, jotka vaihtelivat kvantitatiivisesti valmistuksesta toiseen. A2058-käsitel-lyn väliaineen joissakin valmisteissa oleellisesti kaikki kasvua edistävä aktiivisuus oli hTGF:ien alueella.
10 hTGF:ien puhdistaminen hTGF:t puhdistettiin edelleen käänteisfaasi-HPLC:llä. Väkevöidyn, A2058-käsitellyn väliaineen happo-liukoisen, EGF:n kanssa kilpailevan aktiivisuuden geeli-suodatuskromatografian jälkeen Bio-Gel P-10 -geeliä käyt-15 täen yhdistetty P-10-B-erä muodostettiin uudelleen 0,05 -%:iseen trifluorietikkahappoon vedessä ja kromatografoi-tiin sitten pBondapak C18 -kolonnilla. Yksittäisten fraktioiden EGF:n kanssa kilpaileva ja kasvua stimuloiva aktiivisuus pehmytagarissa määritettiin. hTGF:t erotettiin 20 hyvin kontaminoivan proteiinin päämassasta, joka eluoitui orgaanisen liuottimen suuremmilla väkevyyksillä. hTGF:t sisältävät fraktiot yhdistettiin, kylmäkuivattiin ja otettiin uudelleen kromatografoitaviksi. Saatiin hTGF:ien 57-kertainen puhdistuminen geelisuodatuskromatografian jäl-25 keen. 80 % alkuperäisestä EGF:n kanssa kilpailevasta aktiivisuudesta P-10-B-erässä otettiin talteen (taulukko I).
hTGF:t sisältävien fraktioiden uudelleenkromatogra-fointi pBondapak C18 -kantajalle valittiin lopulliseksi puhdistusvaiheeksi, koska näillä pylväillä havaittiin ai-30 noastaan suhteellisen pieniä EGF:n kanssa kilpailevan aktiivisuuden häviöitä. hTGF:ien selvän erottumisen epäpuhtauksista saavuttamiseksi oli tarpeen käyttää loivaa lineaarista 1-propanoli-gradienttia 0,035-%:isessa trifluori-etikkahapossa. Kontaminoivan peptidiaineksen päämassa 35 erottui hyvin määritellystä aktiivisuuspiikistä. EGF:n kanssa kilpaileva ja kasvua stimuloiva aktiivisuus puhdis- 24 81 365 tuivat rinnakkain ja niillä oli selvästi erottuvat absor-boivuuspiikit 13-%:isessa 1-propanolissa. Fraktiot, jotka sisälsivät hTGF:t, yhdistettiin ja analysoitiin edelleen. hTGF:ien puhdistuminen oli n. 7 OOO-kertainen geelisuoda-5 tuskromatografian jälkeen saannon ollessa 33 % alkuperäisestä EGF:n kanssa kilpailevasta kokonaisaktiivisuudesta. hTGF:ien kokonaissaanto vaiheesta 3 lopullisen käänteis-faasi-HPLC-vaiheen läpi oli 73 % ja saanto vaihetta kohti oli 80 - 100 % (taulukko I).
10 hTGF:ien karakterisointi
Lopullisen hTGF-valmisteen puhtaus määritettiin analyyttisellä SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesil-la. Geeli värjättiin hopealla. Havaittiin yksi pääpolypep-tidinauha, jonka näennäinen Mp oli 7 400. Sama kuviomalli 15 saatiin, kun näytteistä ajettiin elektroforeesi pelkistä-mättömissä olosuhteissa, mikä osoittaa, että TGF on yksi-ketjuinen molekyyli.
hTGF:ien reseptorireaktiivisuutta verrattiin EGF:ään radioreseptorimäärityksellä. hTGF:ien kvantitatii-20 vinen määritys perustui rinnakkaisnäytteen aminohappoana-lyysiin. Sekä hTGF:t että EGF kilpailivat 125I-EGF:n kanssa ihmisen A431-syöpäsolujen EGF-reseptoripaikoista. hTGF:ien spesifisen EGF:n kanssa kilpailevan aktiivisuuden havaittiin olevan 1 - 1,5 x 106 yksikköä/mg; hTGF:iä tai EGF: ää 25 tarvittiin 1,1 ng estämään EGF:n sitoutuminen 50-%:isesti.
hTGF:t mahdollistivat normaalien kiinnittymisestä riippuvaisten rotan munuaissolujen, kloonin 49F, kasvamisen pehmytagarissa. hTRF:ien puolimaksimaalinen vaste peh-mytagarissa saavutettiin yhdellä EGF:n kanssa kilpaileval-30 la yksiköllä tai 1,1 ng:lla hTGF:iä, kun taas EGF ei stimuloi näiden solujen kasvua pehmytagarissa edes testattuna jopa 10 pg:lla.
35
II
25 81 365
Esimerkki II
Ihmisen (hTGF), rotan (rTGF) ja hiiren (mTGF) muun-tokasvutekijöiden tuotanto suuressa mittakaavassa, puhdistaminen ja aminohapposekvenolnti 5 A. Kokeelliset menetelmät TGF;n lähde rTGF, mTGF ja hTGF puhdistettiin seerumittomasta väliaineesta, joka oli käsitelty Fisher*in rotan sikiöfib-roblasteilla, FRE CLIO, FRE 3A:n alakloonilla (Sacks et 10 ai., Virology 97 (1979) 231 - 240), joka oli muunnettu ei-tuottavaksi Snyder-Theilen'in kissan sarkoomaviruksella (Snyder et ai., Nature (Lond) 221 (1969) 1074 - 1075), Moloney*n hiiren sarkoomaviruksella muunnetulla 3T3-solu-linjalla 3B11-IC (Bassin et ai., Int. J. Cancer 6 (1970) 15 95 - 107) ja kahdella ihmisen metastaattisella melanooma- solulinjalla, A2058 (ks. esimerkki I) ja A375 (Girad et ai., J. Natl. Cancer Inst. 51 (1973) 1417 - 1423), vastaavasti. Soluja kasvatettiin 2 l:n muovisissa kiertopul-loissa, jotka sisälsivät Dulbecco'n modifioitua Eagle'n 20 väliainetta täydennettynä 10 %:lla vasikan seerumia, ja ylläpidettiin sen jälkeen seerumittomassa Waymouth'in väliaineessa, kuten DeLarco et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75 (1978) 4001 -4005, ovat selostaneet. Seerumiton käsitelty väliaine koottiin talteen joka 24. tunti 3 päi-25 vän ajan, selkeytettiin jatkuvavirtaussentrifugoinnilla ja supernatantti väkevöitiin (Marquardt et ai., J. of Biol. Chem. 255 (1980) 9177 -9181). Käsitellyn väliaineen kon-sentraatti oli lähtöaine TGF:ien puhdistusta varten.
TGF:ien puhdistaminen 30 TGF:t valmistettiin oleellisesti edellä esimerkissä I melanoomaperäisen hTGF:n puhdistamiselle selostetuin menetelmin. Käsitellyn väliaineen ultrasuodatuksen jälkeinen retentaatti dialysoitiin 0,1 M etikkahappoa vastaan ja sentrifugoinnin jälkeen saatu supernatantti väkevöitiin 35 kylmäkuivaamalla ja liuotettiin uudelleen 1 M etikkahap-poon myöhempää geelisuodatuskromatografiaa varten Bio-Gel 26 8 1 365 P-10 -pylväällä (2,5 x 85 cm, 200-400 mesh, Bio-Rad Laboratories). Pylväs tasapainotettiin 1 M etikkahapolla. Fraktiot, jotka sisälsivät pääosan EGF:n kanssa kilpailevasta aktiivisuudesta ja joiden näennäinen molekyylipaino 5 oli 7 000, yhdistettiin ja kylmäkuivattiin.
rTGF:n, mTGF:n ja hTGF:n lopullinen puhdistaminen tapahtui käänteisfaasi-HPLC:llä käyttäen esimerkissä I kuvattua kromatografiasysteemiä. Erotukset suoritettiin pBondapak C18 -kolonnilla (partikkelikoko 10 pm, 0,39 x 30 10 cm, Waters Associates). Liikkuva faasi oli 0,05 % trifluo-rietikkahappo ja liikkuvan faasin modifioija oli asetonit-riili, joka sisälsi 0,045 % trifluorietikkahappoa. Aseto-nitriilin väkevyyttä nostettiin lineaarisesti (0,083 %/min) 2 tunnin aikana virtausnopeudella 1 ml/min 40 15 °C:ssa peptidien eluoimiseksi. Yhdistetyt TGF:ää sisältävät erät kylmäkuivattiin ja muodostettiin uudelleen 0,05-%:iseen trifluorietikkahappoon ja kromatografoitiin uudelleen samassa pylväässä käyttäen liikkuvan faasin modifioi-jana 1-propanolia, joka sisälsi 0,035 % trifluorietikka-20 happoa. 1-propanolin väkevyyttä nostettiin lineaarisesti (0,05 %/min) 2 tunnin aikana virtausnopeudella 1 ml/min 40 °C:ssa. Fraktioiden yhdistetyt erät, jotka sisälsivät pääosan EGF:n kanssa kilpailevasta aktiivisuudesta, kylmäkuivattiin.
25 TGF:n määritysmenetelmä
TGF määritettiin kvantitatiivisesti radioreseptori-määrityksellä, joka perustuu reseptorin ristireaktiivi-suuteen hiiren leuanalussylkirauhasen orvaskeden kasvutekijän (mEGF) kanssa. Puhdistettu mEGF leimattiin Na12’I:lla 30 kloramiini-T -menetelmän muunnoksella, kuten esimerkissä I
selostettiin. 125I-EGF:n sitomisanalyysi suoritettiin formaliinilla kiinnitetyillä ihmisen A431 -syöpäsoluilla, 8 x 103, Micro Test II -levyillä (Falcon). TGF:n väkevyys ilmaistiin mEGF ng-ekvivalentteina/ml ja perustui TGF:n mää-35 rään, joka tarvitaan aikaansaamaan yhtä suuri 125I--EGF:n 27 81365 sitoutumisen A431-soluihin estyminen kuin tunnetulla määrällä leimaamatonta mEGF:ä.
TGF:n aminohapposekvenssin määritys Aminohapposekvenssianalyysiä varten rTGF (3 pg) 5 pelkistettiin ditiotreitolilla (20 mM) 100 pl:ssa Tris-HCl-puskuria (0,4 M), joka sisälsi guanidiini-HCl:a (6 M) ja Na2-EDTA:ta (0,1 %), pH 8,5, kahden tunnin ajan 50 °C:ssa, ja S-karboksiamidometyloitiin sen jälkeen jodi-asetamidilla (45 mM) 30 minuutin ajan 22 °C:ssa. S-karbok-10 siamidometyloidusta rTGF:sta poistettiin suolat pBondapak C18 -kolonnilla. Peptidi eluoitiin 0,045 % trifluorietikka-happoa sisältävän, vesipitoisen asetonitriilin gradientil-la. Asetonitriilin väkevyyttä nostettiin lineaarisesti (1 %/min) 1 tunnin aikana virtausnopeudella 1 ml/min 40 15 °C:ssa.
S-karboksiamidometyloidun rTGF:n ja modifioimatto-mien mTGF:n ja hTGF:n automatisoidut sekvenssianalyysit (Edman et ai., Eur. J. Biochem. 1 (1967) 80 - 91) suoritettiin kaasu-neste-kiinteäfaasimikrosekvenaattorilla 20 (Hewick et ai., J. of Biol. Chem. 256 (1981) 7990 - 7997).
Sekvenaattorifraktiot analysoitiin käänteisfaasi-HPLC:llä (Hunkapiller et ai., Science 219 (1983) 650 - 659).
B. Tulokset TGF:n puhdistus 25 Pienimolekyylipainoisen rTGF:n, mTGF:n ja hTGF:n puhdistettuja valmisteita saatiin retroviruksella muunnettujen rotan ja hiiren fibroblastien ja kahden ihmisen me-lanoomasolulinjan käsitellystä väliaineesta, vastaavasti. Puhdistaminen tapahtui happoliukoisen EGF:n kanssa kil-30 pailevan aktiivisuuden geelisuodatuskromatografiällä Bio-Gel P-10 -geelillä 1 M etikkahapossa, mitä seurasi käänteisfaasi-HPLC pBondapak C18 -kantajalla käyttäen peräkkäin vesipitoisen asetonitriilin lineaarista gradienttia ja sen jälkeen 0,035 % trifluorietikkahappoa sisältävän 1-propa-35 nolin lineaarista gradienttia. rTGF:n, mTGF:n ja hTGFrn 28 81 365 lopullisen puhdistusvaiheen eluutiomallit osoittavat, että EGF:n kanssa kilpaileva aktiivisuus puhdistui rinnan selvästi erottuvan absorbanssipiikin kanssa ja erottui tehokkaasti kontaminoivasta, UV-absorboivasta aineksesta. Pro-5 teiinin pääpiikki rTGF-, mTGF- ja hTGF-valmisteissa €‘.luoi-tui pBondapak C18 -pylväästä standardiolosuhteissa ajassa 48 - 55 minuuttia.
Geelisuodatuskromatografia Bio-Gel P-10 -geelillä aikaansai pienimolekyylipainoisten TGFzien erottumisen 10 suurempimolekyylipainoisista TGFzistä ja vähensi pBondapak C18 -pylvääseen lisättyä proteiinimäärää seuraavassa puh-distusvaiheessa. Pienimolekyylipainoiset TGF:t edustivat 45 -80 % alkuperäisestä EGF:n kanssa kilpailevasta koko-naisaktiivisuudesta. TGFzien käänteisfaasi-HPLC pBondapak 15 C18 -kantajalla seuraavassa kahdessa puhdistusvaiheessa oli hyvin tehokas kummankin antaessa tyypillisellä valmisteella saannon 80 - 100 % vaihetta kohti. Pienimolekyylipainoisten TGFzien lopullinen saanto oli n. 70 % laskcjttuna maksimaalisesta, puhdistuksen kuluessa havaitusta EGFzn 20 kanssa kilpailevasta kokonaisaktiivisuudesta. Puhdistetun rTGFzn keskisaanto oli 90 ng/1, mTGFzn 50 ng/1 ja hTGFzn 10 ng/1 käsiteltyä väliainetta. Tämä laskelma perustuu spesifiseen aktiivisuuteen, joka on määritetty eristetyille TGFzille olettaen, että EGFzn kanssa kilpaileva aktii-25 visuus mitattuna radioreseptorimääritysmenetelmällä hei jastaa pelkästään pieni- ja suurimolekyylipainoisteri TGFzien kokonaispitoisuuksia. Immunoreaktiivista mEGF ei havaittu käsitellyssä väliaineessa.
TGFzn puhtaus 30 rTGFzn, mTGFzn ja hTGFzn puhtaus saatuna kromato grafisilla eluutioprofiileilla määritettiin EGF-radiore-septorimääritysmenetelmällä ja aminohapposekvenssianalyy-sillä. rTGF, mTGF ja hTGF kilpailivat 125I-EGFzn kanssa EGF-reseptoripaikoista ihmisen A431-syöpäsoluilla ja olivat 35 kvalitatiivisesti ja kvantitatiivisesti lähes erotturnatto- 29 8 1 365 mia mEGFrstä. Siten lopullisten TGF-valmisteiden uskottiin olevan erittäin puhtaita ja pääasiallisesti homogeenisiä. Yksi ainoa aminoterminaalinen sekvenssi määritettiin rTGF:lle, mTGF:lie ja hTGF:lle automatisoidulla Edman-ha-5 joituksella. Mikä tahansa suojaamaton vähäinen peptidisek-venssi, jota on läsnä yli 5 %, olisi voitu havaita käytetyillä menetelmillä. hTGF:n homogeenisyys vahvistettiin lisäksi analyyttisellä natriumdodekyylisulfaattipolyakryy-liamidigeelielektroforeesilla. Puhdistettu valmiste antoi 10 yhden suuren polypeptidinauhan.
TGF:n aminohapposekvenointl rTGF:n, mTGF:n ja hTGF:n täydellinen sekvenointi suoritettiin ja näiden kolmen polypeptidin aminohapposekvenssit on annettu seuraavassa. Esitetyistä sekvensseistä 15 havaitaan, että rTGF ja mTGF ovat kemialliselta rakenteeltaan identtisiä ja lisäksi että oleellinen homologia on olemassa hiiren TGF:ien ja hTGF:ien välillä ja erilaisia aminohappotähteitä esiintyy ainoastaan harvoissa asemissa (7, 15, 23 ja 38) sekvensseissä.
20 (1> ·?·;;·· 5 io
Val-Val-Ser-His-Phe-Asn-Lys-Cys-Pro-Asp-Ser-His-15 20
Thr-Gln-Tyr-Cys-Phe-His-Gly-Thr-Cys-Arg-Phe-Leu- 25 30 35 ^ Val-Gln-Glu-Glu-Lys-Pro—Ala-Cys-Val-Cys-His-Ser- 4 0 4 5
Gly-Tyr-Val-Gly-Val-Arg-Cys-Glu-His-Ala-Asp-Leu- 50
Leu-Ala (2) mTGF 5 10 30 Val-Val-Ser-His-Phe-Asn-Lys-Cys-Pro-Asp-Ser-His- 15 20
Thr-Gln-Tyr-Cys-Phe-His-Gly-Thr-Cys-Arg-Phe-Leu- 25 30 35
Val-Gln-Glu-Glu-Lys-Pro-Ala-Cys-Val-Cys-His-Ser- 40 45
Gly-Tyr-Val-Gly-Val-Arg-Cys-Glu-His-Ala-Asp-Leu- 50
Leu-Ala 30 81 365 (3) hTGF 5 10
Val-Val-Ser-His-Phe-Asn-Asp-Cys-Pro-Asp-Ser-His-15 20
Thr-Gln-Phe-Cys-Phe-His-Gly-Thr-Cys-Arg-Phe-Leu-25 30 35 5 Val-Gln-Glu-Asp-Lys-Pro-Ala-Cys-Val-Cys-His-Ser- 4 0 4 5
Gly-Tyr-Val-Gly-Ala-Arg-Cys-Glu-His-Ala-Asp-Leu- 50
Leu-Ala
10 Esimerkki III
TGF:n tuottaminen in vivo ja sen eristäminen
Kasvainsolulinjoja (lx 106), joiden tiedetään tuottavan (ihmisen melanooma- ja muunnettuja rotan) TGF:iä, siirrettiin kateenkorvattomiin "karvattomiin" hiiriin ja 15 kasvainten annettiin kehittyä. Kasvainta kantavien hiirten virtsa koottiin ja analysoitiin TGF:n läsnäolon suhteen käyttäen edellä esimerkissä I annettua eristämismenetelmää ja analyyttisiä menetelmiä. Kasvainta kantavien hiirien virtsasta havaittiin TGF, jolla on sama koko ja eluoitu-20 misominaisuudet HPLC:ssä kuin soluviljelystä saadulla TGFillä, jota on edellä selostettu esimerkeissä I ja II. Edelleen käyttäen edellä esimerkissä I selostettuja menetelmiä havaittiin hiirien virtsassa läsnäolevalla TGF:llä olevan luonteenomaiset TGF:n biologiset ominaisuudet sii-25 nä, että se stimuloi solujen kiinnittymisestä riippumatonta kasvua ja sitoutuu EGF-reseptoriin. Sen jälkeen kasvaimet poistettiin kasvainta kantavista hiiristä ja hiirien virtsa testattiin kasvaimen poiston jälkeen TGF:n läsnäolon suhteen käyttäen edellä mainittuja menetelmiä. Tässä 30 tapauksessa ei havaittu TGF:ää, jolla olisi luonteenomaiset eluoitumisominaisuudet HPLC:ssä tai TGF:n kaltainen biologinen aktiivisuus. Nämä tulokset osoittavat, että kasvainsolut tuottavat TGF:ää kokonaisissa eläimissä yhtä hyvin kuin soluviljelmissä ja että TGF voidaan havaita 35 kehon nesteissä ja eristää niistä käyttäen edellä kuvat- 11 31 81365 tuja menetelmiä. Samanlaisia kokeita suoritettiin myös rotilla, joilla oli kemiallisesti karsinogeenilla indusoituja kasvaimia, ja niillä havaittiin olevan TGF:ää virtsassaan edellä lueteltujen biologisten ja biokemiallisten 5 ominaisuuksien perusteella, kun taas käsittelemättömillä rotilla ei ollut.
Esimerkki IV
Rotan TGFtn synteesi ja karakterisointi
Rotan TGF:n (rTGF), jolla oli esimerkissä II annet-10 tu kemiallinen kaava, kemiallinen synteesi suoritettiin käsin vaiheittaisella kiinteäfaasimenetelmällä Merri-field'in, J. Amer. Chem. Soc. 85 (1963) 2149 - 2156, selostamien yleisten periaatteiden mukaisesti. Differentiaalinen happolabiili suojaryhmä -strategiaa sovellettiin 15 tähän synteesiin yhdessä N-aminopään tert.-butyylioksikar-bonyylin ja sivuketjujen bentsyylialkoholijohdannaisten tavanomaisen yhdistämisen kanssa. Paremmin happoa kestävää bentsyyliesterisidontaa, joka kiinnitti suojatut aminohapot polymeerikantajaan, käytettiin peptidihäviöiden mini-20 moimiseksi toistuvien happokäsittelyjen aikana (Mitchell et ai., J. Amer. Chem. Soc. 92 (1976) 7357 - 7362). Täydellinen suojauksen purkaminen ja peptidin poistaminen hartsista tapahtuivat Tam et ai.'in, Tetrahedron Lett. 23 (1982) 4435 - 4438, Low-High HF -menetelmän mukaisesti, 25 joka poikkesi tavanomaisesta HF -suojauksenpurkumenetel-mästä ja poisti bentsyyli-suojaryhmät SH2-mekanismilla laimeassa HF-liuoksessa vakavien sivureaktioiden minimoimiseksi, jotka aiheutuvat hiilikationeista, joita kehittyy tavanomaisessa SNl-suojauksenpurkumenetelmässä. Lisäksi se 30 on myös suunniteltu vähentämään monia kysteinyyli-sivu-reaktioita, jotka usein estävät monia disulfidisidoksia sisältävien proteiinien, synteesin.
HF-käsittelyn jälkeen ja ennen mitään puhdistamista raaka ja pelkistetty synteettinen rTGF hapetettiin ja re-35 generoitiin seka-disulfidi-menetelmällä pelkistetyn ja 32 81 365 hapetetun glutationin yhdistelmän läsnäollessa (Ahmed et ai., J. Biol. Chem. 250 (1975) 8477 - 8482). Tällä vältettiin polymeeristen ainesten muodostuminen puhdistamisen aikana.' Regeneroitu, puhdistamaton rTGF-I sisälsi 40-50 % 5 EGF-radioreseptoria ja tyrosiinispesifisiä proteiinikinaa-siaktiivisuuksia verrattuna luonnon-rTGF-I:een. Raaka synteettinen rTGF puhdistettiin homogeenisyyteen kolmessa vaiheessa: (1) geelisuodatuksella Bio-Gel P-10 -pylväällä; (2) ioninvaihtokromatografialla CM-Sephadex-pylväällä; ja 10 (3) preparatiivisella korkeapainenestekromatograf .Laila (HPLC) C-18-käänteisfaasikolonnilla. Kokonaissaanto laskettuna Ala:n lähtömäärästä hartsiin oli 31 %.
Pelkistävissä tai pelkistämättömissä olosuhteissa puhdistetun synteettisen rTGF:n havaittiin antavan yhden 15 ainoan nauhan, jonka näennäinen molekyylipaino oli 7 000 SDS-PAGE-elektroforeesilla. Aminohappoanalyysi 6 rnol/1 HCl:lla ja entsymaattisella hydrolyysillä antoivat ehdotetun sekvenssin odotetun teoreettisen moolisuhteen. Vapaata tiolia ei havaittu Ellman'in sulfhydryylin määritys-20 menetelmällä synteettisestä rTGF:stä, mutta tiolyyttisesti pelkistettäessä saatiin kuuden kysteiinin odotettu teoreettinen arvo. Nämä havainnot tukevat sitä johtopäätöstä, että synteettinen rTGF on yksiketjuinen polypeptidi, joka sisältää kuusi kysteiiniä disulfidisidoksissa, mikä on 25 sopusoinnussa luonnon rTGF:n odotettujen kemiallisten ominaisuuksien kanssa. Lisäksi synteettinen rTGF eluoitui yhdessä luonnon rTGF:n kanssa yhtenä ainoana symmetrisenä huippuna C-18-käänteisfaasi-HPLC:ssä.
Tämän esimerkin mukaista synteettistä rTGF:ää ver-30 rattiin luonnon rTHF:ään kolmessa analyysissä otaksutun muuntokasvutekijän biologisten ominaisuuksien suhteen. Mi-togeenianalyysissä normaalien rotan munuaissolujen, joista seerumi oli poistettu, kasvun stimuloitumista rTGF:llä mitattiin yhdistämällä 125I-jodideoksiuridiinia. Analyysis-35 sä pehmytagarilla naudan seerumin albumiinin ja toisen
II
33 81 365 TGF:n, TGF-beetan, läsnäollessa rTGF:n aiheuttamat morfologiset ja fenotyypin muutokset voitiin määrittää kvantitatiivisesti pesäkkeenmuodostuksella pehmytagariin. Jälkimmäisen muuntoanalyysin on osoitettu korreloivan hyvin 5 kasvaimien syntymisen kanssa (Stoker et ai., Int. J. Cancer 3 (1968) 683 - 693). Naudan sikiön seerumi tai TGF-beeta eivät yksinään indusoi NRK-solujen muuntumista viljelyssä. Samoin ei luonnollinen eikä synteettinen TGF saa aikaan tällaista vaikutusta TGF-beetan poissaollessa. Sekä 10 synteettinen että luonnon rTGF antoivat samanlaiset annos-vastekäyrät sekä puolimaksimaaliset aktiivisuudet näissä kahdessa analyysissä.
Koska rTGF kilpailee mEGFrn kanssa EGF-reseptorien sitomisesta solukalvoilla, synteettistä rTGFrää verrattiin 15 luonnon rTGF:ään sitoutumisen suhteen ihmisen A431-syöpä-soluihin. Jälleen luonnon ja synteettisen rTGF:n vasteen ja aktiivisuuksien havaittiin oleva toisistaan erottumattomia. Väkevyyden, joka tarvitaan 125I-EGF:n sitoutumisen estämiseen 50-%:isesti, havaittiin olevan 3,5 ja 4,1 nM 20 luonnon ja vastaavasti synteettiselle rTGF:lie. Eräs seuraus TGF:n tai EGF:n sitoutumisesta EGF-membraaniresepto-reihin on synteettisten peptidien tai endogeenisten substraattien tyrosiinitähteiden fosforyloitumisen stimuloitu-minen (Pike et ai., J. Biol. Chem. 257 (1982) 14 628 -25 14 631). Synteettisen rTGF:n havaittiin stimuloivan syn teettisen angiotensinyyli-peptidisubstraatin fosfory-lointia puolimaksimaalisella aktiivisuudella 0,3 nM, joka aktiivisuus oli verrannollinen luonnon rTGF:llä saatuun arvoon, jonka Reynold et ai., Nature 292 (1981) 259 - 261, 30 ovat esittäneet.
Esimerkki V
Haavojen parantaminen TGF:ien avulla
Ihmisen EGF:ää (hEGF), rotan TGF:ää (rTGF), ihmisen TGF:n analogia, luonnon vacciniaviruskasvutekijää (VGF) ja 35 yhdistelmä-VGF:ää käytettiin haavan parannuskokeessa, joka 34 81 365 tehtiin jäljempämä kuvattua menetelmää noudattaen, kunkin tekijän parantavien vaikutusten määrittämiseksi toisen asteen palovammaan. Rotan TGF syntetisoitiin edellä esimerkissä IV kuvatulla tavalla, ja sen kemiallinen kaava 5 oli esimerkissä II esitetyn kaavan mukainen. Ihmisen TGF-analogilla, joka valmistettiin tavanomaisia rekombinaatio-menetelmiä käyttäen, oli seuraava aminohapposekvenssi: 5
Val-Val-Ser-His-Phe-Asn-Asp-Cys-Pro-Asp-Ser-His-Thr·-15 20 25
Gln-Phe-Cys-Phe-His-Gly-Thr-Cy s-Arg-Ser-Leu-Val-Gln--30 35
Glu-Glu-Lys-Pro-Ala-Cys-Val-Cys-His-Ser-Gly-Phe-Val--40 45 50
Gly-Val-Arg-Cys-Glu-His-Ala-Asp-Leu-Leu-Ala
Luonnon VGF puhdistettiin jäljempänä esimerkissä 15 XII kuvattavalla tavalla. Myös yhdistelmä-VGF valmistettiin käyttämällä tavanomaista yhdistelmä-DNA-tekniikkaa. Luonnon VGF on 25 kilodaltönin (kD) proteiini, joka sisältää seuraavan aminohapposekvenssin.
5 10 20 Leu-Cys-Pro-Glu-Gly-Asp-Gly-Tyr-Cys-Leu-His-Gly-Asp-15 25
Cys-Ile-His-Ala-Arg-Asp-Ile-Asp-Gly-Met-Thr-Cys-Arg-30 35
Cys-Ser-His-Gly-Tyr-Thr-Gly-Ile-Arg-Cys-Gln-His-Val- 40
Val-Leu-Val 25 Jäljempänä esimerkissä XII kuvattavalla tavalla puhdistetun (ja yhdistelmä-DNA-tekniikalla tuotetun) VGF-molekyylin koko aminohapposekvenssi on seuraava: 30 35 O c; n Λ ~7 r Γ 35 o i joo 5 10
Asp-Ser-Gly-Asn-Ala-ILe-Glu-Thr-Thr-Ser-Pro-Glu-Ile-15 20 25
Thr-Asn-Ala-Thr-Thr-Asp-Ile-Pro-Ala-Ile-Arg-Leu-Cys-30 35
Gly-Pro-Glu-Gly-Asp-Gly-Tyr-Cys-Leu-His-Gly-Asp-Cys-5 40 45 50 lle-His-Ala-Arg-Asp-Ile-Asp-Gly-Met-Tyr-Cys-Arg-Cys-55 60 ' 65
Ser-His-Glv-Tyr-Thr-Gly-Ile-Arg-Cys-Gln-His-Val-Val- 70 75
Leu-Val-Asp-Tyr-Gln-Arg-Ser-Glu-Asn-Pro-Asn-Thr-Thr-80 85 90 , 0 Thr-Ser-Tyr-Ile-Pro-Ser-Pro-Gly-Ile-Ilet-Lcu-Val-Leu- 9 5 100
Val-Gly-Ile-Ile-Ile-Ile-Thr-Cys-Cys-Leu-Leu-Ser-Val-105 110
Tyr-Arg-Phe-Thr-Arg-Arg-Thr 15 Kolme naarasporsasta, jotka kukin painoivat noin 4,5 kg, nukutettiin Ketaminella ja Rompumilla, niiden peräpäästä ajeltiin karvat ja jäljelle jääneet karvat poistettiin kokonaan kaupallisella karvanpoistovoiteella. Mes-sinkikappale (3x3 cm, 147 g) temperoitiin 70 “Ctisessa 20 vesihauteessa ja painettiin sitten tiiviisti paljasta nahkaa vasten tarkalleen 10 sekuntia. Selkärangan kummallekin puolelle tehtiin viisi vammaa, joiden etäisyys toisistaan oli noin 2,5 cm. Kunkin muodostuneen rakkulan pinta poistettiin kokonaan ja vammoja hoidettiin kahdesti vuorokau-25 dessa pelkällä Silvadenella, Silvadenella, joka sisälsi yhtä kasvutekijöistä, tai jätettiin hoitamatta. Porsaiden annettiin syödä ja juoda vapaasti.
Porsaat nukutettiin 9 tai 10 vrk:n kuluttua ja rupi poistettiin kustakin palovammasta. Kaikki palovammat valo-30 kuvattiin ja kustakin palovammasta otettiin koepala.
Seuraavassa taulukossa esitetään, kuinka monta prosenttia kustakin vammasta arvioitiin epitelisoituneeksi visuaalisesti tarkasteltuna.
35 36 81 365
Taulukko II
Luonnon VGF jug/ml
Oikea puoli Silvadene Hoitamaton 0,1 0,1 5 15% 0% 70% 65%
Sika 1 9 vrk polton jälkeen _hEGF M?/ml
Vasen puoli Silvadene Hoitamaton 0,1 0,1 0,1 75% 55% 60% 70% 30% 10
Yhdistelmä-VGF /ug/ml
Oikea puoli Silvadene Hoitamaton 0,1 0,5 1,0 50% 0% 95% 95% 60%
Sika 2 10 vrk polton jälkeen 15
Vasen puoli Silvadene Hoitamaton 0,1 0_,5 1,0 50% 0% 60% 75% 40%
Rotan TGF /gq/ml
Oikea puoli Silvadene Hoitamaton 0,1 0,5 10 20 20% 15% 90% 65% 90%
Sika 3 9 vrk polton jälkeen Ihmis-TGF-analogi Aig/ml__
Vasen puoli Silvadene Hoitamaton 0,1 0,5 10 25% 5% 90% 85% 65% 25
Kuten taulukosta II ilmenee, TGF:t olivat hyvin tehokkaita haavan parantamisessa verrattuina hoitomatto-miin vertailunäytteisiin ja jopa pelkkään Silvadenee.n. Esimerkki VI
30 Haavojen parantaminen
Tehtiin toinen koe, jonka tarkoituksena oli mitata edellä kuvatun ihmis-TGF-analogin vaikutusta toisen asteen palovammojen paranemiseen. Koeolosuhteet olivat edellä kuvattujen kaltaiset. Menetelmiin tehtiin kuitenkin seuraa-35 vat muutokset. Yksi Yorkshire-porsas nukutettiin Ketami-
II
37 81 365 neliä ja kukin 12:sta palovammasta tehtiin käyttämällä messinkikappaletta 11 s/poltto. Kun kukin rakkula oli poistettu, haavoja hoidettiin kerran vuorokaudessa yhdellä seuraavista aineista: 5 a) 1 pg/ml TGF:ää Silvadenessa; b) 0,1 pg/ml TGF:ää Silvadenessa; c) ei mitään; d) pelkkä Silvadene; e) 1 yg/ml hEGF:ää Silvadenessa; ja 10 f) 0,1 pg/ml hEGF:ää Silvadenessa.
Rupi poistettiin 7 vrk:n kuluttua. Vamman prosentuaalinen paraneminen, joka laskettiin planimetriatulok-sista, esitetään alla olevassa taulukossa. TGF oli hyvin tehokas vamman parantajana.
15 Taulukko III
Hoito Parantuneen vamman prosenttiosuus
Palovamma A_Palovamma B
TGF 1 pg/ml 9 26 20 TGF 0,1 pg/ml 34 57
Hoitamaton 3 6
Silvadene 14 21 hEGF 1 pg/ml 14 17 hEGF 0,1 pg/ml 17 14 25
Esimerkki VII
Sarveiskalvovamman parantaminen rTGF:llä A. rTGF-polypeptidin valmistaminen TGF-polypeptidi syntetisoitiin käyttäen lähtökohta-30 na aminohapposekvenssiä, joka esitettiin edellä esimerkissä II TGF:lie, joka oli puhdistettu kissan sarkoomaviruk-sella transformoitujen Fisher-rotan alkiofibroblastien kasvualustasta. rTGF:n kemiallinen synteesi toteutettiin edellä esimerkissä IV kuvatulla tavalla.
35 38 81 365 B. Holtoformulan valmistus rTGF-a-polypeptidiä lisättiin isotoniseen (285 mosmol), steriiliin, fosfaattipuskuroituun fysiologiseen suolaliuokseen (pH 7,4) pitoisuudeksi 50 ng/ml.
5 C. Sarveiskalvoperuskudoksen puhkaisut
Kalvon kokonaan läpäisevät 5 mm:n pituiset aukot, jotka ulottuivat etukammioon asti koko pituudeltaan, tehtiin aikuisten naaraspuolisten Macaca fasicularis -apinoiden sarveiskalvon keskelle. Oikea silmä toimi vertailukoh-10 teenä ja sitä käsiteltiin kolmesti vuorokaudessa kahdella pisaralla isotonista (285 mosmol) steriiliä fosfaattipus-kuroitua suolaliuosta (pH 7,4), joka ei sisältänyt rTGF:ää. Vasenta silmää hoidettiin samaa ohjelmaa noudattaen edellä kuvatulla hoitoformulalla. Kolmen vuorokauden 15 hoidon jälkeen haavojen lujuus mitattiin kvantitatiivisesti sijoittamalla pienireikäinen neula (n:o 25) etukammioon sarveiskalvon reunuksen kautta. Neula kytkettiin aneroidi-manometriin ja painetta nostettiin hitaasti ja tasaisesti, kunnes haavat alkoivat vuotaa ja lopulta aukesivat. Tämän 20 menetelmän on kuvannut yksityiskohtaisesti Weene (Anal. Ophthalmol. 15 (183) 438).
D. Tulokset
Taulukossa IV esitetyt tulokset osoittavat, että TGF-käsiteltyjen sarveiskalvojen puhkaisulujuus oli mer-25 kittävästi suurempi kuin fysiologisella suolaliuoksella käsiteltyjen sarveiskalvojen.
Taulukko IV
paine (mm/Hg) 30 Oikea vertailusilmä TGF:llä hoidettu vasen silmä
Vuoto Aukeaminen Vuoto Aukeaminen Apina P-21 25 30* 210 225*
Apina P-20 35 90* 155 >300* 35 *t = 40,0, p >0,025, parillinen T-testi
II
39 8 1 3 6 5
Esimerkki VIII
TGF:n toteaminen monospesifisellä, synteettistä peptidiä vastaan muodostetulla antiseerumilla
Peptidisynteesi 5 Peptidit, jotka vastaavat aminohappoja osista rTGF- aminohapposekvenssiä, jotka kuvattiin edellä esimerkissä II, syntetisoitiin kaupallisesti (Peninsula Labs) tavanomaisella kiinteäfaasimenetelmällä (Ohgak et ai., Journal of Immunol. Meth. 57 (1983) 171 - 184). Peptidit puhdis-10 tettiin tarpeen vaatiessa käänteisfaasikorkeapaineneste-kromatografiällä (RP-HPLC:llä) ennen käyttöä.
Käytetyt sekvenssit olivat:
Peptidi I - Val-Val-Ser-His-Phe-Asn-Lys-Cys-Pro-Asp-Ser-His-Thr 15 Peptidi II - Cys-His-Ser-Gly-Tyr-Val-Gly-Val-
Arg-Cys
Peptidi III - Cys-His-Ser-Gly-Tyr-Val-Gly-Val-
Arg-Cys-Glu-His-Ala-Asp-Leu-Leu-Ala
Peptidi IV - Val-Gly-Val-Arg-Cys-Glu-His-Ala-20 Asp-Leu-Leu-Ala
Peptidien konjugointi ja immunisointi
Peptidinäyte (10 mg) sekoitettiin tulivuorikotilon hemosyaniiniin (10 mg, Calbiochem) 3,5 ml:ssa 0,1 M nat-25 riumfosfaattia (pH 7,4). Lisättiin 4 ml 25 mM glutaralde-hydiä ja seosta inkuboitiin ravistellen 1 tunti lämpötilassa 23 °C. Sitten lisättiin glysiiniä loppupitoisuudeksi 0,1 mol/1 ja seosta ravisteltiin yön yli lämpötilassa 23 eC. Saatu konjugaatti sekoitettiin yhtä suureen tilavuu-• 30 teen Freundin täydellistä apuainetta ennen injektointia.
Kaniinit immunisoitiin injektoimalla ihon alle 1 mg konjugaattia neljään eri kohtaan. Ensimmäisen injektion jälkeen annettiin kaksi tehostetta kahden viikon väliajoin. Tässä kokeessa käytetty seerumi kerättiin 80 vrk:n 35 40 81 365 kuluttua ensimmäisestä injektiosta. Tästä seerumista preparoitiin immunoglobuliinifraktio ammoniumsulfaattisaos-tuksella. Immunisoivalle peptidille spesifistä vasta-ainetuotetta seurattiin kiinteäfaasi-ELISA:11a.
5 Peptidien leimaus radioaktiivisella jodilla
Peptidit leimattiin Na125I:lla käyttämällä kloramii-ni-T-menettelyä, joka oli oleellisilta osiltaan Dasin et ai.'in kuvaaman menettelyn mukainen [Proc. Natl. Acad. Sei. 74 (1977) 2790-2794]. Liuoksiin, jotka sisälsivät 10 hiiren leuanalussylkirauhas-EGF:ää (mEGF) (170 pmol), synteettistä rTGF:ää (4 pmol) tai peptidiä III (400 pmol), sekoitettiin 1-2 mCi Na125I:a (Amersham 2 mCi/nmol) 2 M kaliumfosfaatissa (pH 7,5). Lisättiin 50 - 100 pg klor-amiini-T:tä ja jatkettiin inkubointia lämpötilassa 4 °C 1 15 min (mEGF ja rTGF) tai 7 min (peptidi III). Reaktiot py-säytet-tiin lisäämällä 10 - 20 pg Na2S205:a ja leimatut proteiinit erotettiin reagoimattomasta Na125I: sta kromatograf i-sesti Sephadex G-10:llä (Pharmacia). Tällä tavalla leimattujen peptidien ominaisaktiivisuudet olivat: 1 x 1010 20 cpm/nmol (EGF); 6 x 108 cpm/nmol (rTGF); ja 1 - 109 cpm/nmol (peptidi III).
Radioreseptorimääritys 125I-EGF:n sitoutuminen reseptoriinsa formaliinilla kiinnitettyjen A431-solujen yksisolukerroksilla mitattiin 25 edellä esimerkissä I kuvatulla tavalla. 125I-EGF:ää lisättiin loppupitoisuudeksi 0,33 nmol/1 kilpailevien aineiden läsnä tai poissa ollessa. Leimaamattoman EGF:n lisääminen pitoisuudeksi 0,3 - 0,5 nmol/1 johti puoleen 125I-EGF:n sitoutumisen maksimi-inhibitiosta. TGF-pitoisuudet ilmoitet-30 tiin määränä, joka vaaditaan saamaan aikaan tunnettua TGF-määrää vastaava 125I-EGF:n sitoutumisen esto.
RIA (radioimmuunianalyysi)
Reagenssit sekoitettiin 50 mikrolitran lopputila-vuudessa liuosta, joka sisälsi 20 mmol/1 natriumfosfaattia 35 (pH 7,4), 200 mmol/1 NaCl:a, 40 mmol/1 ditiotreitolia,
II
4i 81365 0,1 % (w/v) BSA:ta, 0,1 % (w/v) NaN3:a, 125I-peptidi IIl:a (104 cpm); lopullista laimennusastetta 1/15000 vastaavan määrän antiseerumia, ja muita aineita ilmoitettaessa. Reaktio käynnistettiin lisäämällä antiseerumi ja sen an-5 nettiin jatkua lämpötilassa 23 °C 90 min. Sitten lisättiin yhtä suuri tilavuus 10-%:isella formaliinilla kiinnitettyä Staphylococcus A -valmistetta (Pansorbin, Calbiochem) ja jatkettiin inkubointia vielä 30 min lämpötilassa 23 °C. Immunoadsorbantti poistettiin sedimen- 10 toimalla 10-%:isen (w/v) sakkaroosiliuoksen läpi, ja sitoutuneen 125I-peptidi III:n määrä määritettiin käyttämällä gammalaskuria. Näissä olosuhteissa vasta-aine sitoi noin 25 % 125I-peptidistä kilpailijan poissa ollessa. Sitoutuneen peptidi III:n määrä korjattiin epäspesifisen sitou-15 tumisen suhteen, joka mitattiin vasta-aineen poissa ollessa (alle 5 % kokonaissitoutumisesta) ja ilmoitettiin prosentteina maksimisitoutumisesta. Kilpailijoiden pitoisuudet ilmoitettiin siinä määränä peptidi III:a, joka tarvittiin saamaan aikaan vastaava saostumisen esto.
20 Kromatografia
Geelisuodatuskromatografia tehtiin valmistajan ohjeiden mukaan Bio Gel P-10 -kolonneilla (BioRad), jotka tasapainotettiin 1 N etikkahapolla. HPLC tehtiin Novapak C18 -kolonnilla (0,39 x 10 cm, Waters Associates) käyttä-25 mällä virtausnopeutta 1 ml/min lämpötilassa 23 “C.
Käsitellyn alustan valmistus
Snyder Theilen -transformoitujen Fischer -rotan al-kiosolujen (ST-FrSV-RFE klooni 10) seerumiton modifioitu alusta kerättiin Twardzikin et ai. kuvaamalla tavalla [Vi-30 rology, 124 (1983) 201 - 207]. Kasvualusta selkeytettiin sentrifugoimalla pienellä nopeudella ja kylmäkuivattiin. Jäännös suspendoitiin sitten 1 N etikkahappoon ja dialy-soitiin perusteellisesti 0,1 N etikkahappoa vastaan. Liukenematon proteiini poistettiin sentrifugoimalla, ja su-35 pernatantti kylmäkuivattiin. Lopuksi jäännös suspendoitiin 42 81 365 takaisin sadasosatilavuuteen alkuperäisestä 1 N etikkahap-poa ja säilytettiin lämpötilassa 4 “C.
Immunoblotting-analyysi
Analysoitaville näytteille tehtiin ensin natrium-5 dodekyylisulfaattipolyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) käyttäen akryyliamidigradienttia 15 -> 20 % ja elektroforeesi ajettiin pelkistävissä olosuhteissa Laemm-lin kuvaamalla tavalla [Nature 227 (1970) 680-682]. Erottamisen jälkeen proteiinit siirrettiin elektroforeettises-10 ti nitroselluloosalle (Schleicher and Schuell, BA85, 0,45 μ) Burnetten kuvaamalla tavalla [Anal. Biochem. 112 (1981) 195 - 203], Siirto tehtiin jännitteellä 5 V/cin 3 -4 tuntia 23 °C:ssa. Tuloksena olevaa proteiiniblottia in-kuboitiin yön yli maitopohjaisessa seoksessa BLOTTO [John-15 son et ai., Gene Anal.Techn., 1 s. 3 - 8]. Antiseerumi laimennettiin BLOTTO:11a ja lisättiin hiottiin peptidi III -ylimäärän läsnä tai poissa ollessa. Inkubointia vasta-aineen kanssa jatkettiin usein sekoittaen 2-3 tuntia lämpötilassa 23 °C. Sitten blotti pestiin, sitä inkuboi-20 tiin 125I-proteiinin kanssa (4 x 106 cpm/ml, 4 x 107 cpn/pg) 1 tunti lämpötilassa 23 °C, ja pestiin BLOTTO: 11a. Vcista-aineen sitoutumiskohdat visualisoitiin tekemällä autora-diografia Kodak XAR-5 -filmille lämpötilassa -70 °C käyttämällä kuvanvahvistuslevyjä.
25 Edellä kuvatun radioimmuunianalyysin yhteydessä li sätty 125I-peptidi III saostui lähes kvantitatiivisesti antiseerumin laimennusasteen ollessa pieni; antiseerumille saatiin tiitteri > 10 000. Vasta-aineaffiniteetti mitattiin inkuboimalla antiseerumia suhteessa 1/5000 laimennet-30 tuna vaihtelevien 125I-peptidi III -pitoisuuksien läsnä ollessa. Näiden tulosten analysointi Scatchardin menetelmällä antoi tulokseksi yhden ryhmän sitoutuvaa/sitoutuvia komponenttia/komponentteja, jonka affiniteettivakio (Ka) i25I-peptidi III:n suhteen oli 8,3 x 108 M'1.
II
35 43 81 365 RIA;n spesifisyys RIA:n spesifisyyden määrittämiseksi tutkittiin erilaisista peptideistä niiden kyky estää 125I-peptidi III:n saostuminen. Leimaamaton peptidi III esti 125I-peptidi III:n 5 saostumisen suurin piirtein lineaarisesti alueella 0,13-11 nmol/1; leimaamattoman peptidi III:n pitoisuus, joka sai aikaan puolet saostumisen maksimi-inhibitiosta, oli 0,7 nmol/1. Peptidi IV oli vain hieman tehottomampi saostumisen estäjänä kuin peptidi III, kun taas peptidi II oli 10 täysin tehoton pitoisuuksiin 1,1 pmol/l asti. Myös peptidi I, joka vastaa 11 aminoterminaalista ryhmää, oli tehoton kilpailijana. Nämä tulokset osoittavat, että tavanomaisissa koeolosuhteissa detektoitu epitooppi oli paikallistuneena peptidi III:n 11 karboksiterminaaliseen aminohap-15 poon. Taulukossa V esitetään yhteenveto eri peptidien suhteellisista inhiboivista pitoisuuksista.
Taulukko V
Lisäys Suhteellinen inhibointiaktiivisuus 20 peptidi III 1 peptidi IV 3,5 peptidi I > 1500 peptidi II > 1500 rTGF 0 ditiotreitoli 1 25 rTGF - ditiotreitoli 20 mEGF > 1500
Ilmoitetuista lisätyistä aineista tutkittiin niiden kyky estää standardi-RIA edellä kuvatulla tavalla. Kullekin 30 lisätylle aineelle määritettiin pitoisuus, joka tarvittiin saamaan aikaan puolet saostumisen maksimi-inhibitiosta, ja se ilmoitetaan suhteessa peptidi III -pitoisuuteen, joka vaaditaan saamaan aikaan vastaava inhibitio. Merkintä ">" osoittaa suurimman tutkitun pitoisuuden. (Peptidien I-IV 35 inhibitioaktiivisuuteen ei vaikuttanut ditiotreitolin läsnäolo määrityksessä.) 44 81 365
Myös rTGFrn kyky estää 125I-leimatun peptidi III:n saostuminen tutkittiin. Synteettinen rTGF, joka vastasi biologiselta aktiivisuudeltaan täysin luontaista molekyyliä, oli yhtä tehokas (molaarisen pitoisuuden perusteella 5 arvioituna) inhibiittorina kuin peptidi III. rTGFrn suhteellinen inhibitiokapasiteetti aleni merkittävästi, kun pelkistin jätettiin pois reaktioseoksesta (taulukko). mEGF oli täysin tehoton kilpailijana pitoisuuksiin yli 1 μπιοΐ/ΐ asti. Tämä osoittaa, että tässä kuvattu RIA eroaa muista 10 käytettävissä olevista TGF-määrityksistä siinä suhteessa, että se on spesifinen TGF:lle muttei EGFrlle.
Jotta osoitettaisiin suoraan, että antiseerumi sitoo rTGF:ää, korvattiin 125I-peptidi III 125I-leimatulla rTGFrllä tavanomaisessa RIArssa. Havaittiin annoksesta 15 riippuva 125I-TGF:n saostuminen, jota esti oleellisesti yli-mää-räisen peptidi III:n lisääminen. Tällä tavalla saatujen sitoutumistulosten Scatchard-analyysi osoitti, että antiseerumin Ka 125I-TGF:n suhteen oli 2,3 x 108 M'1. Tämä arvo sopii kohtuullisen hyvin yhteen 125I-peptidille III 20 määritetyn Ka:n kanssa (8,3 x 108 M"1), ja osoittaa, että antiseerumi sitoutuu rTGF:ään.
rTGFrn toteaminen transformoitujen solujen modifioidusta kasvualustasta
Eräs TGF-lähde on RNA-kasvainviruksilla transfor-25 moitujen solujen kasvualusta. rTGFrn toteamiseksi viljeltyjen transformoitujen solujen modifioidusta kasvualustasta käytettiin seuraavaa menettelyä. Kissan sarkoomaviruksen Snyder-Theilen -kannalla (ST-FeSV FRE klooni 10) transformoidun Fischer-rotan alkiosolulinjan on aiemmin 30 osoitettu tuottavan kohonneita määriä rTGFrää [Gray et ai., Nature 303 (1983) 722-725]. Kerättiin seerumiton modifioitu alusta, käsiteltiin se ja väkevöitiin edellä kuvatulla tavalla. Osalle alustasta tehtiin sitten geelisuo-datuskromatografia Bio-Gel P-10:llä happamissa olosuhteis-35 sa. Fraktiosta analysoitiin rTGF EGF-reseptorikilpailumää-rityksellä tai RIA:11a.
45 81 365 Näissä olosuhteissa havaittiin EGF:n kanssa kilpailevaa aktiivisuutta kahdessa molekyylikokoryhmässä, toinen noin Mr = 10 000 ja toinen Mr = 20 000; kuminatkin molekyy-lilajit eluoituivat selvästi näytteen proteiinin pääosan 5 jälkeen. Kumpikin kokoluokka, jolla oli EGFrn kanssa kilpaileva aktiivisuus, oli myös immunologisesti aktiivinen. Immunologista aktiivisuutta havaittiin lisäksi kolonnin patsaan tilavuudessa, jossa ei havaittu EGF:n kanssa kilpailevaa aktiivisuutta. Nämä havainnot osoittavat, että 10 edellä kuvatut rTGF-kokoryhmät ovat aktiivisia RIArssa. EGF:n kanssa kilpaileva aktiivisuuden suhde immunologiseen aktiivisuuteen pieneni voimakkaasti suurimolekyylisissä TGF-fraktioissa, mikä osoittaa, että näiden TGF-molekyyli-lajien biologinen aktiivisuus on pienempi kuin pienimole-15 kyylisten fraktioiden.
Sen vahvistamiseksi, että immunologinen aktiivisuus esiintyi samassa molekyylilajissa kuin EGFrn kanssa kilpaileva aktiivisuus, tehtiin RP-HPLC yhdistetyille fraktioille, jotka saatiin toistamalla tämä koe preparatiivi-20 sessa mittakaavassa ja jotka sisälsivät rTGF-kokoryhmät Mr = 10 000 ja Mr = 20 000; käytetyt olosuhteet olivat samanlaiset kuin ne, joita käytettiin rTGFrn puhdistamiseen Marquardtin et ai. mukaisesti [Proc. Natl. Acad. Sei., 80 (1983) 4684-4688]. Yhdistettyjen TGF-fraktioiden, joiden Mr 25 oli 10 000, ollessa kyseessä sekä EGFrn kanssa kilpaileva että immunologinen aktiivisuus puhdistuivat rinnakkain suurin piirtein kvantitatiivisella saannolla. Kummankin aktiivisuuden puhdistuminen rinnan sekä geelisuodatuskro-matografiässä että HPLCrssä viittasi vahvasti siihen, että 30 kumpikin aktiivisuus esiintyy samassa molekyylilajissa. Kun EGFrn kanssa kilpailevalle kokoryhmälle Mr = 20 000 tehtiin HPLC, havaittiin samanlainen EGFrn kanssa kilpailevan ja immunologisen aktiivisuuden rinnakkaispuhdistumi-nen. Nämä kokeet osoittavat, että suuri osa immunologises-35 ta aktiivisuudesta, joka havaittiin St-FeSV-FRE-kloonin 10 käsitellyssä kasvualustassa, oli rTGFrn aiheuttamaa.
46 81 365
Eri rTGF-kokoryhmien immunoblotting-analyysi
Retroviruksilla transformoitujen rotan solujen käsitellyssä alustassa esiintyvät suuremmat TGF-kokoryhmät voisivat edustaa joko aggregoituneita tiloja tai TGF-mole-5 kyylin erillisiä molekyylimuotoja. Näiden kahden vaihtoehdon erottamiseksi toisistaan tehtiin synteettiselle rTGF:lie ja luonnon TGF:n kokoluokille Mr = 10 000 ja Mr = 20 000 immunoblottinganalyysi, kun polypeptidikomponentit oli erotettu SDS-PAGE:lla pelkistävissä olosuhteissa. Im-10 muunireaktiivinen synteettinen rTGF ja pienimolekyylinen luonnon rTGF liikkuivat rinnakkain kumpikin yhtenä poly-peptidiketjuna, jonka Mr oli 6 000, ja antiseerumin inku-bointi peptidi lii -ylimäärän kanssa salpasi näiden molekyylien immunologisen reaktiivisuuden. Suurimolekyylinen 15 kokoluokka sitä vastoin sisälsi kolmea immuunireaktiivista peptidiä, Mr = 24 000, Mr = 40 000 ja Mr = 42 000; peptidi III -ylimäärän lisääminen salpasi myös näiden peptidien immunologisen reaktiivisuuden. Kaikissa kaistoissa havaittiin radioaktiivinen vyöhyke, jonka liikkumisnopeus vasta-20 si Mr:a 43 500. Peptidi III -ylimäärän lisääminen poisti epätäydellisestä tämän materiaalin, ja se havaittiin yhtäläisesti kaikissa kokeissa analysoitavasta näytteestä riippumatta; siksi se näyttää edustavan kokeessa muodostunutta keinotekoista tuotetta. On huomionarvoista, ettei 25 suurimolekyylisessä kokoluokassa havaittu TGF:ää, jonka Mr = 6000. Nämä tulokset osoittavat, että suurempimolekvyli-set rTGF-kokoluokat edustavat erillisiä TGF:n muotoja.
Esimerkki IX
Synteettinen rTGF-fragmentti, joka sitoutuu resep-30 toreihin ja on antigeeninen
Peptidit
Hiiren leuanalussylkirauhasista eristettiin EGF uuttamalla 1 M HClrlla, joka sisälsi 1 % trifluorietikka-happoa (TFA), 5 % muurahaishappoa ja 1 % NaCl:a, konsent-35 roimalla Sep-Pak-kolonneilla (Waters) ja tekemällä RP- HPLC Bondapak C-18 -kolonneilla (Waters) Elson et ai.'in
II
47 81365 kuvaamalla tavalla [Biochemistry Int., 8 (1984) 427 - 43- 5]. Luonnon rotta-TGF:n kokonaissynteesiä on kuvattu edellä esimerkissä IV.
Synteettiset peptidifragmentit valmistettiin 1 % 5 divinyylibentseeniä sisältävällä kloorimetyyli-polystyree- nihartsilla (Bio-Rad) käyttämällä Na-t-butoksikarbonyyli-suojausta. Peptideistä poistettiin suojaus ja ne irrotettiin hartsista käyttämällä HF:a tai, C-päästä suojattujen analogien ollessa kyseessä, peptidi irrotettiin ensin am-10 monolyysillä (NH3/MeOH). Raakapeptidit, joista oli poistettu suojaus, laimennettiin ja syklisoitiin disulfidimuotoon hapettamalla 0,01 M K3Fe(CN)6:lla. Peptidiliuos laitettiin Bio-Rex 70 -kationinvaihtokolonnille, pestiin H20:lla (300 ml) ja eluoitiin AcOH-gradientilla (-> 50 %). Peptidi puh-15 distettiin preparatiivisella HPLCrllä kolonnissa (2,5 x 100 cm Altex), joka oli täytetty Vydac 218TP C-18:lla, käyttäen eluenttina 20-%:ista CH3CN-liuosta, joka sisälsi 0,03 mol/1 NH40Ac:a (pH 4,5) (10). Peptidit 1 ja 2 edustavat rTGF:n aminohapposekvenssejä 34 - 43, joilla on suo-20 jaamattomat tai vastaavasti suojatut päät (N Ac, C - amidi). Peptidi 3 on vastaavan hTGF-silmukan metyyliesteri (Ac-Cys-His-Ser-Gly-Tyr-Val-Gly-Ala-Arg-CysOMe), joka on valmistettu siirtotesteröinnillä hartsista (emäs/MeOH).
Immunogeenin valmistus ja immunologinen määritys 25 TGF-peptidi 1 liitettiin tulivuorikotilon hemosya- niinin (KLH) tai naudan seerumialbumiiniin tioli/maleimi-disidoksella [King et ai., J. Immunol. Methods 28 (1979) 201 - 206]. Kantaja-peptidikompleksit puhdistettiin geeli-suodatuksella. Saatiin keskimäärin 60 mol peptidiä/1 mol 30 KLH:a ja 20 ml peptidiä/1 mol BSA:a. Kaniinit immunisoitiin KLH:n ja peptidin 1 konjugaatilla injektoimalla useaan kertaan 2 mg proteiinia täydellisessä Freundin apuaineessa ihonalaisesti (s.c.) tai lihaksensisäisesti (i.m.). Kaniineille annettiin tehosteet kahden viikon vä-35 liajoin injektoimalla s.c. immunogeenia epätäydellisessä Freundin apuaineessa. Viiden tehosteen jälkeen kerätyn 48 81 365 antiseerumin IgG-fraktio käytettiin immunologisiin määrityksiin ja se leimattiin radionuklidilla käyttämällä Na125I:a (NEN) ja Enzymobeads-helmiä (Bio-Rad) siten, että laskentatulos oli 4 x 105 cpm/pg proteiinia. 92-kuoppaiset 5 polyvinyylikloridilevyt (Costar) päällystettiin liuoksella, joka sisälsi 200 pg/ml BSA:n ja peptidin 1 konjugaat-tia, ja vastapäällystettiin fosfaattipuskuroidulla fvsio-logisella suolaliuoksella, joka sisälsi 10 % normaalin kaniinin seerumia. Levyjä inkuboitiin 4 tuntia lämpötilas-10 sa 37 °C [125l]anti(KLH - peptidi l)-IgG:n kanssa (!50000 cpm/syvennys) inhibiittorien läsnä tai poissa ollessa, pestiin ja tehtiin yksittäisille kuopille laskenta.
Radioreseptorimääritys
Ihmisen epidermoidikarsinoomasoluja A-431 tai ih-15 misen esinahkatibroblasteja (HFF), jotka oli kerätty pri-maariviljelmistä, kasvatettiin yhtenäiseksi pinnaksi 24-kuoppaisissa ryhmämaljoissa (Costar) Dulbeccon minimialus-tassa (Dulbecco's minimal essential medium, DMEM, Gibco), joka sisälsi 10 % naudan sikiöseerumia (FCS, Hyclone). EGF 20 leimattiin radiojodilla edellä kuvatulla tavalla pulssi-määrään 4 x 104 - 8 x 104 cpm/mg proteiinia. Soluja inkuboitiin lämpötilassa 4 °C 60 min DMEM:ssä (pH 7,4 20 mmol/1 Hepesiä), joka sisälsi 1 mmol/1 [125I]-EGF:ää ja 0,1 % BSArta, inhibiittoripeptidien läsnä ollessa. Solut 25 pestiin kolmesti kylmällä puskuriliuoksella, hajotettiin 0,1 N NaOH:lla, ja mitattiin soluihin kytkeytynyt radioaktiivisuus (gammalaskuri). Epäspesifinen sitoutuminen, joka määritettiin 100-kertaisen ylimäärän kylmää EGF:ää läsnä ollessa, oli alle 5 % ja alle 10 % spesifisestä sltou-30 tumisesta A431-soluille ja vastaavasti HFF-soluille.
Solujen proliferaatiomääritys HFF-soluja kasvatettiin yhtenäiseksi kerrokseksi 48 kuoppaisissa ryhmämaljoissa DMEM:ssä, joka sisälsi 10 % FCS:a, ja lisääntyminen pysäytettiin pitämällä soluja 2 35 vrk ravintovajauksessa DMEM:ssä, joka sisälsi 0,5 % FCS:a. Mitogeeneja ja peptidejä inkuboitiin solujen kanssa lämpö- 49 81 365 tilassa 37 °C 18 tuntia ennen 4 tunnin käsittelyä 1 pCirllä [3H]-metyylitymidiiniä (NEN) ja määritettiin tri-kloorietikkahapolla saostuva radioaktiivisuus.
KLH:n ja peptidin 1 konjugaattia vastaan muodoste-5 tut kaniinin vasta-aineet reagoivat BSA-TGF-peptidin kanssa kiinteäfaasi-RIA:n mukaan. Tätä reaktiota inhiboi kon-sentraatiosta riippuvalla tavalla peptidi 1 ja hieman vähemmän luonnon TGF. EGF ei sitä vastoin aiheuttanut merkittävää inhibitiota.
10 Rotan TGF syrjäyttää kompetitiivisesti EGF:n sitou tumisen reseptoreihinsa. TGF-peptidien kyky kilpailla [125I]-EGF:n kanssa sitoutumisesta joko A-431-soluihin tai HFF-soluihin arvioitiin. Peptidi 1 esti osittain [125I]-EGF:n sitoutumisen A-431-soluihin pitoisuuden ollessa 15 > 10‘6 mol/1. Peptidien 2 ja 3 kyky estää sitoutumista oli parempi; IC50-arvot olivat 4 x 10"6 mol/1 ja vastaavasti 4 x 10'7 mol/1 (ts. noin 0,02 ja 0,2 % EGF:n tai TGF-a:n sitoutumistehosta). Samanlaisia havaintoja tehtiin EGF:n inhibitiosta HFF-soluilla (taulukko VI). Näiden vuorovai-20 kutusten reseptorispesifisyyttä valaisee näiden peptidien kyvyttömyys estää endoteelisolukasvutekijän sitoutuminen tai mitogeeninen vaikutus HFF-soluihin (ei esitetä).
Millään TGF-peptideistä ei ollut luontaisia mito-geenisia ominaisuuksia pitoisuuteen 10'5 mol/1 asti inku-25 hoitaessa niitä lisääntymättömien HFF-solujen kanssa (tuloksia ei esitetä). TGF-peptidit estivät kuitenkin pitoisuudesta riippuvalla tavalla DNA-synteesin indusoinnin lisääntymättömissä HFF-soluissa EGF:n vaikutuksesta. Nämä antagonistit olivat yhtä tehokkaita käytettäessä TGF:ää 30 mitogeenina (taulukko VI). Samoin kuin sitoutumistehokin TGF-peptidien antagonistinen teho parani suljettaessa amino- ja karboksipäät.
35 so 81365
Taulukko VI
Synteettisten TGF-fragmenttien biologinen aktiivisuus _ . - b
Mitogeneesin esto g Sitoutuminen3 IC^q (M) IC50 ^ _A-431_HFF_EGF_TGF <-__
Peptidi 1 8 2 x 10 ^ 6 1 2 x 10 ^ >10 >10
Peptidi 2 4 + 2 x 10_6 2 + 2 x 10~6 5 + 2 x 10~6 3 + 1 x lo”6 -7 -7 -7 -7
Peptidi 3 4 + 1x 10 3 + 1 x 10 6 + 2 x 10 5 + 3 x 10 10______________ eIC50-arvot laskettu inhibitiokäyristä, jotka kuvaavat [125I]-EGF:n (1 nM) sitoutumista soluihin. bIC50-arvot ovat pitoisuuksia, jotka alentavat puoleen vertailunäyt-teen kyvyn edistää [3H]-metyylitymidiin ottoa lisääntymät-15 tömiin HFF-soluihin, jotka on indusoitu EGFrllä tai TGF:llä (1 nM).
Esimerkki X
TGF stimuloi luun resorptiota in vitro Muuntavaa kasvutekijää sisältävät valmisteet puh-20 distettiin ihmisen melanoomasoluja sisältävästä käsitellystä alustasta ja ihmisen verihiutaleista esimerkissä I kuvatulla tavalla ja synteettinen rotan TGF valmistettiin edellä esimerkissä II kuvatulla tavalla. TGF-valmisteiden ja synteettisen TGF:n biologista aktiivisuutta seurattiin 25 käyttämällä EGF-radioreseptorimääritystä tai pehmytagaril- la tapahtuvan pesäkkeenmuodostuksen avulla samoin esimerkissä I kuvatulla tavalla.
Synteettinen rotan TGF (MP = 5600) resorboi luuta pitoisuudesta riippuvalla tavalla. Pitoisuudet yli 2 ng 30 EGF-ekvivalenttia/ml stimuloivat luun resorptiota kolmessa eri kokeessa. Synteettinen TGF vaati vähintään 72 tuntia stimuloidakseen luun resorptiota. Tässä suhteessa synteettinen muoto näyttää olevan samanlainen kuin EGF, joka resorboi luuta saman ajanjakson kuluessa tässä biologisessa 35 kokeessa (Tashjian et ai., Biochem. Biophys. Res. Commun., 85 (1978) 966).
Il si 81365
Ihmisen melanoomasolulinjasta valmistetut osittain puhdistetut valmisteet, jotka sisälsivät suuri- ja pienimolekyylisiä TGFriä, tutkittiin myös luun resorptiokokeel-la. Sekä suurimolekyyliset (27 000 daltonia) että pieni-5 molekyyliset (6 000 daltonia) muodot stimuloivat luun re-sorptiota. Suurimolekyylinen muoto stimuloi resorptiota 48 tunnin kuluessa, kun taas pienimolekyylinen muoto vaati 72 - 96 tuntia resorption stimulointiin, mikä on sama kuin rotan synteettisen TGF-I:n ja EGF:n vaatima aika 10 (Tashjian, yllä)
Tulokset osoittavat, että TGF pystyy stimuloimaan luun resorptiota in vitro. Synteettistä rotan TGF:ää ja pienimolekyylistä ihmisen TGF:ää sisältävät valmisteet käyttäytyivät samalla tavalla kuin EGF, sillä ne vaativat 15 pitkähköjä inkubointijaksoja resorption stimulointiin. Ne olivat tehokkaita noin yhtä kertaluokkaa pienempinä pitoisuuksina kuin EGF. Suurimolekyylinen ihmisen melanooma-TGF stimuloi luun resorptiota 48 tunnissa.
Esimerkki XI
20 Synteettisen muuntavan kasvutekijän aikaansaama luun resorption stimulointi in vitro
Synteettinen rotan TGF valmistettiin edellä esimerkissä IV kuvatulla tavalla. Proteiinin puhtaus varmistettiin natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidigeelie-25 lektroforeesilla, aminohappoanalyysillä ja RP-HPLC:llä.
TGF-valmisteiden ja synteettisen TGF:n biologista aktiivisuutta seurattiin EGF-radioreseptorimäärityksen avulla (Todaro et ai.. Nature 264 (1976) 26). Luun resorptio määritettiin mittaamalla 45Ca:n vapautuminen ennalta leima-30 tuista rotan sikiön pitkistä luista. Tiineisiin rottiin injektoitiin 18. raskauspäivänä 200 pCi 45Ca:a (Raisz, J., Clin. Invest., 44 (1975) 103). Emot tapettiin 19. raskaus-päivänä ja sikiöt poistettiin. Värttinä- ja kyynärluiden mineralisoituneet varret leikattiin vapaiksi ympäröivästä 35 kudoksesta ja rustosta ja sijoitettiin elinhauteeseen.
Luita inkuboitiin BGJb-alustassa (Irvine Scientific) 24 52 8 Ί 3 6 5 tuntia 37 °C:ssa, kostutetussa atmosfäärissä, joka sisälsi 5 % C02:a ja 95 % ilmaa, heikosti kompleksoituneen 45Ca:n vaihtumisen mahdollistamiseksi. Sitten luita kasvatettiin 48 - 120 tuntia BGJb-alustassa, jota oli täydennetty 5 5 %:lla naudan sikiöseerumia (KC Biologicals), joka sisälsi vertailu- tai tutkittavia aineita. Luun resorbointiaktii-visuus mitattiin alustaan vapautuneen 45Ca:n prosenttiosuutena kokonaismäärästä, ja ilmoitettiin käsitelty/vertailu-näytesuhteena. Tilastollinen merkitsevyys määritettiin 10 parittomille tuloksille tehdyllä Studentin testillä.
Synteettinen rotan TGF (molekyylipaino 5 600) stimuloi luun resorptiota pitoisuuksina yli 2 ng EGF-ekviva-lenttia/ml pitoisuudesta riippuvalla tavalla kolmessa eri kokeessa. Synteettinen TGF ei aiheuttanut merkittävää luun 15 resorboitumista luun viljelyn 48 ensimmäisen tunnin aikana, mutta stimuloi selvästi resorptiota seuraavien 3 vrk:n aikana. Tässä suhteessa TGF:n synteettinen muoto näyttää olevan samanlainen kuin EGF, joka resorboi luuta samanlaisen ajanjakson kuluessa tässä biologisessa kokeessa 20 (Raisz,et ai.. Endocrinology 107 (1980) 270). TGF:n vaikutus luun resorptioon näytti olevan riippumaton prostaglan-diinisynteesistä.
Koska rotan TGF resorboi luuta in vitro, tutkittiin myös ihmisvalmisteista, jotka sisälsivät TGF-aktii-25 visuutta, niiden vaikutus luuhun. Suuri- ja pienimolekyylistä TGF:ää sisältävät osittain puhdistetut valmisteet preparoitiin ihmisen melanoomasolulinjasta (Marquardt et ai., J. Biol. Chem. 275 (1982) 5220). Nämä valmisteet puhdistettiin osittain happouutolla ja geelisuodatuskromato-30 grafiällä. Sekä suurimolekyyliset (13 000) että pienimole kyyliset (6 000) muodot stimuloivat luun resorptiota.. Suu-rimolekyylinen muoto stimuloi resorptiota 48 tunnissa, kun taas pienimolekyylinen muoto vaati 72 - 92 tuntia resorption stimulointiin, mikä on sama aika kuin rotan TGF:n ja 35 EGF:n vaatima.
Il 53 8 1 3 6 5
Esimerkki XII
Vacciniaviruksella infektoidut solut vapauttavat uutta polypeptidiä, joka on toiminnallisesti muuntavan ja ihokasvutekijän sukulaisaine 5 Cercopithecus-apinan munuaissolujen (BSC-1) yksi- kerrosviljelmiä pidettiin yllä naudan sikiöseerumilla (10 %) täydennetyssä Eagle'n väliaineessa. Vacciniavirusta (W) (kanta WR) kasvatettiin Hela-soluissa ja puhdistettiin sedimentoimalla sakkaroositiheysgradientin läpi (Moss 10 teoksessa Gene Amplification and Analysis, voi. 2., toim. Chirickjian ja Papis, Elsevier/North Holland, New York, 1981, s. 253 - 266).
BSC-l-yksisolukerroksia inkuboitiin lämpötilassa 37 °C puhdistetun viruksen kanssa Eaglesin perusalustassa, 15 joka oli täydennetty naudan sikiön seerumilla (2 %). Soluviljelmien supernatantit selkeytettiin sentrifugoimalla pienellä kierrosnopeudella ja kylmäkuivattiin. Jäännös suspendoitiin sitten 1 M etikkahappoon ja dialysoitiin perusteellisesti 0,2 M etikkahappoa vastaan. Liukenematon 20 materiaali poistettiin sentrifugoimalla, supernatantti kylmäkuivattiin, suspendoitiin uudelleen 1 M etikkahappoon, jota käytettiin sadasosa alkuperäisestä tilavuudesta, ja säilytettiin lämpötilassa 4 °C.
Geelisuodatus tehtiin Biol-Gel P-10 -kolonneilla 25 (BioRad, Richmond, CA), jotka oli tasapainoitettu 1 M e-tikkahapolla). HPLC-loppupuhdistukseen käytettiin kahta sarjaan kytkettyä Bio-Sil TSK-250 -kolonnia (BioRad).
Eristetyllä materiaalilla, joka nimettiin V a c-ciniaviruksen kasvutekijäksi (VGF), oli edellä esimerkis-30 sä V esitetty aminohapposekvenssi.
Käytetty radioreseptorimääritys oli edellä esimerkissä I kuvatun kaltainen. TGF- ja VGF-pitoisuudet ilmaistiin määränä, joka tarvitaan saamaan aikaan tunnetun EGF-määrän kanssa ekvivalenttinen 125I-EGF:n sitoutumisen esto. 35 Käytetty RIA oli edellä esimerkissä VIII kuvatun kaltainen.
54 8 1 3 6 5 EGF:n kanssa kilpailevan aktiivisuuden esiintyminen W:lla infektoitujen solujen kasvualustassa
Supernatantista, joka saatiin BSC-l-viljelmästä 24 tunnin kuluttua W-infektoinnista, tutkittiin, sisältääkö 5 se materiaalia, joka pystyy kilpailemaan 125I-leimatun EGF:n kanssa sitoutumisesta runsaasti EGF-reseptoreita sisältäviin ihmisen ihokarsinoomasoluihin (A431). W-infektoidut solut vapauttivat voimakkaan EGF:n kanssa kilpailevan aktiivisuuden, joka saa aikaan suurin piirtein täydellisen 10 kyllätystilan (>10 ng) kokeessa, jossa käytettiin ainemäärää, joka vastasi 10 ng:aa 0,5 miestä viljelmänestettä suspendoitua materiaalia. Aktiivisuus nimettiin VV-kas-vutekijäksi (VGF). (Valeinfektoidut BSC-l-vertailuvil-jelmät sitä vastoin sisälsivät hyvin vähän EGF:n kanssa 15 kilpailevaa aktiivisuutta jopa pienimmän tutkitun laimen-nusasteen ollessa kyseessä.)
Seuraavien testien tarkoituksena oli tutkia VGF-tuotannon kinetiikkaa. Varhaisimpana tutkimushetkenä, 2 tuntia infektoinnin jälkeen, kasvualustassa esiintyi jo 20 kasvaneita pitoisuuksia EGF:n kanssa kilpailevaa aktiivisuutta, mikä viittaa VGF:n nopeaan syntetisoituniiseen ja vapautumiseen. Tämän aktiivisuuden määrä oli korkeimmillaan viljelmäsupernatanteissa 12 tunnin kuluessa; 24 tunnin kuluttua määrä oli noussut vain hieman. Koska W:n 25 koodaama polypeptidi, jonka rakenne on homologinen EGF:n ja TGF:n kanssa, on varhaisen geenin tuote, seurattiin VGF-geenin ilmentymistä BSC-l-soluviljelmissä, joita käsiteltiin sytosiiniarabinosidilla (AraC) heti viruksen adsorboi tumisj akson (1 tunti) jälkeen. AraC:n aiheuttama 30 DNA-synteesin esto salpaa myöhäisten Vacciniageenien ilmentymistä, kun taas varhaisten geenien ilmentyminen ei häiriinny samalla tavalla. VGF:n tuotanto ei estynyt AraC:11a käsitellyissä viljelmissä, vaan lisääntyi yli kaksinkertaiseksi infektoituihin vertailuviljelmiin nähden 35 mitattuna 13 ja 24 tuntia infektoinnin jälkeen. VGF:n tuotantomäärä oli riippuvainen myös virusinokulaatista (tau-
II
55 81 365 lukko VII). Pesäkkeenmuodostusyksiköiden (PFU) suhteen soluihin ollessa 20:1, havaittiin viljelmäsupernatanteissa noin 3 ng-EGF-ekvivalenttia VGF:ää/ml 24 tunnin kuluttua infektoinnista. VGF-tuotanto oli verrannollinen infektoi-5 vien yksiköiden lukumäärään; BSC-l-viljelmissä, jotka in-fektoitiin määrillä 40 ja 80 PFU/solu havaittiin noin 6 ja vastaavasti 10 ng-EGF-ekvivalenttia tuotetta.
Taulukko VII: Infektoivan viruksen määrän vaikutus VGF:n vapautumiseen 10
Virusmäärä_ Vapautunut VGF_ PFU/solu EGF-ekvivalentteja __(ng/ml)_ 0 15 10 2,7 20 4,5 40 6,1 80 10,0 20 VGF:n osittainen puhdistus VV-infektoiduissa BAS-l-soluissa esiintyvä EGF:n kanssa kilpaileva aktiivisuus eristettiin osittain puhdistuneena uuttamalla viljelmäsupernatantit hapolla 24 25 tunnin kuluttua infektoinnista. VV-infektoitujen soluviljelmien supernatanteissa saadut, hapolla liuenneeseen muotoon saatetut polypeptidit (10,5 mg) laitettiin BioGel P-10 -kolonniin, joka oli tasapainotettu 1 M etikkahapolla, ja tutkittiin kustakin fraktiosta EGF:n kanssa kilpaileva 30 aktiivisuus. Pääosa EGF:n kanssa kilpailevasta aktiivisuudesta (fraktio 42) eluoitui vähän hiilihappohydraasimark-kerin (MP = 29 000) jälkeen, ja sen näennäinen molekyyli-paino oli 25 000. Fraktioissa, jotka vastasivat EGF:n tai rotan TGF:n tunnettuja eluoitumiskohtia (fraktio 100 ja 35 vastaavasti 78), ei havaittu merkittävää aktiivisuutta tällä pylväällä. VGF-aktiivisuushuippu (fraktio 42 - 44) 56 81 365 käytettiin myöhempiin biologisiin kokeisiin. Molekyylipai-no varmistettiin käyttämällä peräkkäin kytkettyjä Bio-Sil TSK 250 -HPLC-loppupuhdistuskolonneja, EGF:n kanssa kilpaileva aktiivisuus eluoitui kokonaan suurimpana piikkinä 5 alueella, joka vastasi proteiinimarkkeria MP = 25 000. EGF:n ja TGF:n immunologinen vertailu TGF:n ja VGF:n vertailemiseksi tarkemmin viimeksi mainittu tutkittiin edellä kuvatulla tavalla kompeti-tiivisella radioimmuunimäärityksellä TGF:n suhteen. Määri-10 tyksellä pystytään erottamaan EGF TGFistä ja tunnistamaan rotta- ja ihmis-TGF:n pieni- ja suurimolekyyliset muodot (Linsley et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82 (1985) 365 -369). Rotan TGF kilpaili tehokkaasti 125I-leimatun TGF-pep-tidin kanssa sitoutumisesta vasta-aineeseen; käyrä oli 15 samanlainen kuin leimaamattoman TGF-peptidin. Havaittiin antigeenin 50-%:inen syrjäytyminen vasta-aineesta antigee-nipitoisuuden ollessa noin 0,2 - 0,3 ng-EGF-ekvivalenttia. Kun tutkittiin VGF:ää vastaavina pitoisuuksina, ei havaittu kilpailua, mikä viittaa siihen, ettei VGF ole TGF-pep-20 tidiryhmän jäsen ainakaan immunologisten ominaisuuksien suhteen. Kompetitiivisessa radioimmuunimäärityksessä luonnon EGF;n suhteen VGF-valmisteet saivat aikaan hyvin pienen (<10 %) 125I-leimatun EGF:n syrjäytymisen luonnon EGF:n polyklonaalisesta vasta-aineesta.
25 VGF:n biologinen aktiivisuus
Havaitun VGF:n määrä (>2 000 ng/1) oli vähintään yhtä kertalukua suurempi kuin TGF-määrä parhaimmassa TGF:n tuottajassa, Snyder-Theilen -kissan sarkoomaviruksella ei-produktiivisesti transformoiduissa Fischer-rotan alkioso-30 luissa (FRE).
TGF:stä riippuvassa pehmytagarkokeessa, jossa mitataan tarttumiskohdasta riippumatonta solukasvua, VGF stimuloi rotan munuaissolut muodostamaan progressiivisesti kasvavia pesäkkeitä pehmytagariin. Nanogrammaekvivalenttia 35 kohden laskettuna osittain puhdistettu VGF-valmiste tuotti 102 pesäkettä, kun taas EGF ja TGF tuottivat 120 ja vas-
II
5? 81365 taavasti 154 pesäkettä. (On mahdollista, että osittain puhdistetuissa VGF-valmisteissa esiintyvät kontaminoivat aktiivisuudet vaikuttavat kvantitatiiviseen tulokseen tämän tyyppisessä biologisessa kokeessa.) 5 VGF oli myös voimakkaasti mitogeeninen tutkittuna erilaisten viljeltyjen fibroblastien suhteen. Käytettäessä määriä, jotka saavat aikaan vastaavan sitoutumisen EGF-re-septoreihin, seerumivajauksessa viljellyille (48 tuntia) minkin fibroblasteille (jotka sisältävät suhteellisen run-10 säästi kalvon EGF-reseptorikohtia), VGF sai aikaan DNA-synteesin lisääntymisen 78 %:lla verrattuna stimuloimat-tomiin seerumivajauksessa kasvatettuihin soluihin, kun taas hiiren leuanalussylkirauhas-EGF:llä havaittiin deok-siuridiinin oton lisääntyminen 59 %:lla. VGF:n mitogeeni-15 nen vaikutus on siten vähintään yhtä voimakas kuin EGF:n.
Claims (7)
1. Menetelmä biologisesti aktiivisten polypepti-dien valmistamiseksi, joilla on kaava 5 5 10 Val-Val-Ser-His-Phe-Asn-R-Cys-Pro-Asp-Ser-His-Thr- 15 20 25 Gln-R'-Cys-Phe-His-Gly-Thr-Cys-Arg-R"-Leu-Val-Gln- 30 35
10 Glu-R1-Lys-Pro-Ala-Cys-Val-Cys-His-Ser-Gly-R'"- 40 45 50 Val-Gly-R2-Arg-Cys-Glu-His-Ala-Asp-Leu-Leu-Ala jossa R on Asp tai Lys, R' on Phe tai Tyr, R" on Ser tai 15 Phe, R'" on Phe tai Tyr, R1 on Asp tai Glu ja R2 on Ala tai Vai, tai näiden polypeptidien aminohapposekvenssin 1 - 13, 34 - 43, 34 - 50 tai 39 - 50 käsittävien oligopeptidifrag-menttien valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) aminohapot liitetään peräkkäin polypeptidin tai 20 oligopeptidin kaavan mukaisessa järjestyksessä tavanomai sella kiinteäfaasimenetelmällä sopivalla kantajalla, tai b) muodostetaan synteettisesti kaksisäikeinen DNA-sekvenssi, joka koodaa polypeptidirakenteen aminohapposekvenssiä, kaksisäikeinen DNA liitetään kloonausvälineen tai 25 -vektorin sopivaan kohtaan yhdistelmä-DNA-molekyylin muo dostamiseksi ja transformoidaan sopiva isäntä mainitulla yhdistelmä-DNA-molekyylillä polypeptidin ilmentymisen aikaansaamiseksi, tai c) eristetään homogeeninen muuntokasvutekijä- 30 polypeptidi vesipitoisesta väliaineesta, joka sisältää tämän muuntokasvutekijäpolypeptidin epäpuhtaassa muodossa, menetelmällä, joka käsittää seuraavat vaiheet: (1) dialysoidaan vesipitoinen väliaine, joka sisältää muuntokasvutekijän epäpuhtaassa muodossa, vesipitoista 35 etikkahappoa vastaan antamaan liuotinfaasi, joka sisältää muuntokasvutekijäpolypeptidiä ja joka faasi väkevöidäSn ja valinnaisesti selkeytetään, II 59 81 365 (2) muodostetaan vaiheen 1) väkevöity liuotinfaasi uudelleen vesipitoisella etikkahapolla ja saatetaan uudel-leenmuodostettu liuos geelisuodatuskromatografiaan viemällä uudelleenmuodostettua liuosta geelisuodatuskromatogra- 5 fiapylvääseen, jota on tasapainotettu vesipitoisella etikkahapolla, ja eluoidaan vesipitoisella etikkahapolla elu-aatin valittujen fraktioiden saamiseksi, jotka sisältävät muuntokasvutekijäpolypeptidiä puhtaampana, ja valitut fraktiot yhdistetään ja väkevöidään, jolloin saadaan osit-10 tain puhdistettu, muuntokasvutekijäpolypeptidiä sisältävä tuote, (3) saatetaan vaiheen (2) osittain puhdistettu, muuntokasvutekijäpolypeptidiä sisältävä tuote peräkkäiseen käänteisfaasikorkeapainenestekromatograf iaan viemällä tuo- 15 te, uudelleenmuodostamisen jälkeen vesipitoiseen tri-fluorietikkahappoon, yhden tai useampien hiilivetysidot-tujen piihappomatriisipylväiden läpi, jotka on tasapainotettu vesipitoisella trifluorietikkahapolla, korkeapaine-nestekromatografian olosuhteissa, jolloin pylvään alkuelu-20 ointi suoritetaan käyttäen lineaarista asetonitriiligradi- enttia vesipitoisessa trifluorietikkahapossa ja sen jälkeen pylväseluointi, joka suoritetaan ensimmäisestä kor-keapainenestekromatografiavaiheesta saaduille, yhdistetyille, muuntokasvutekijäpolypeptidiä sisältäville frak-25 tioille, toteutetaan käyttäen lineaarista 1-propanoligra-dienttia vesipitoisessa trifluorietikkahapossa, jolloin 1-propanolin gradienttia nostetaan riittävän pieninä 1-pro-panolin väkevyyslisäyksinä antamaan muuntokasvutekijäpoly-peptidi yhtenä ainoana selvänä huippuna homogeenisenä po- 30 lypeptidinä.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R on Asp, R' on Phe, R'" on Tyr, R1 on Asp ja R2 on Ala.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että valmistetaan oligopeptidifrag- 60 81 365 mentti, joka käsittää aminohapposekvenssin A) Val-Val-Ser-His-Phe-Asn-Lys-Cys-Pro-Asp-Ser-His-Thr B) Cys-His-Ser-Gly-Tyr-Val-Gly-Val-Arg-Cys
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan oligopeptidi- 10 fragmentti, joka käsittää aminohapposekvenssin Cys-His-Ser-Gly-Tyr-Val-Gly-Ala-Arg-Cys.
5. Patenttivaatimuksen 1 kohdan c) mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vesipitoinen väliaine, joka sisältää muuntokasvutekijäpolypeptidiä epäpuh- 15 taassa muodossa, on kehon neste, joka sisältää muuntokas-vutekijän, tai vesipitoinen väliaine, joka on käsitelty muuntokasvutekijää tuottavalla solulinjalla.
5 C) Cys-His-Ser-Gly-Tyr-Val-Gly-Val-Arg-Cys-Glu-His- Ala-Asp-Leu-Leu-Ala tai D) Val-Gly-Val-Arg-Cys-Glu-His-Ala-Asp-Leu-Leu-Ala.
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että homogeeninen muuntokasvuteki- 20 jäpolypeptidi on ihmisen muuntokasvutekijäpolypeptidi.
7. Patenttivaatimuksen 1 kohdan c) mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vesipitoinen väliaine, joka sisältää muuntokasvutekijäpolypeptidiä epäpuhtaassa muodossa, on seerumiton väliaine, joka sisältää muuntokas- 25 vutekijää tuottavan elinkykyisen solulinjan. Il 61 81365
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FI883765A FI81497C (fi) | 1983-05-09 | 1988-08-12 | Antikroppar mot biologiskt aktiva polypeptider och deras anvaendning vid diagnostiska foerfaranden. |
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US49275183A | 1983-05-09 | 1983-05-09 | |
US49275183 | 1983-05-09 | ||
US59813684A | 1984-04-12 | 1984-04-12 | |
US59813684 | 1984-04-12 |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI841649A0 FI841649A0 (fi) | 1984-04-26 |
FI841649A FI841649A (fi) | 1984-11-10 |
FI81365B true FI81365B (fi) | 1990-06-29 |
FI81365C FI81365C (fi) | 1990-10-10 |
Family
ID=27050855
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI841649A FI81365C (fi) | 1983-05-09 | 1984-04-26 | Foerfarande foer framstaellning av biologiskt aktiva polypeptider. |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0132021B1 (fi) |
JP (1) | JPH07173193A (fi) |
AU (1) | AU575049B2 (fi) |
CA (2) | CA1341535C (fi) |
DE (1) | DE3485219D1 (fi) |
DK (1) | DK227384A (fi) |
ES (1) | ES532286A0 (fi) |
FI (1) | FI81365C (fi) |
GR (1) | GR82078B (fi) |
IE (1) | IE57724B1 (fi) |
IL (1) | IL71702A (fi) |
NO (1) | NO169348C (fi) |
NZ (1) | NZ207983A (fi) |
PT (1) | PT78571B (fi) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3587022T2 (de) * | 1984-02-17 | 1993-06-17 | Genentech Inc | Menschlicher transformationswachstumsfaktor und vorlaeufer oder fragment hiervon, zellen, dna, vektoren und verfahren zu ihrer herstellung, zusammensetzungen und produkte, die diese enthalten, sowie davon abgeleitete antikoerper und diagnostizierverfahren. |
AU5249786A (en) * | 1985-01-29 | 1986-08-07 | Oncogen | Wound healing compositions |
US4686283A (en) * | 1985-04-16 | 1987-08-11 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Analogs of transforming and epidermal growth factor fragments for therapy and diagnosis |
NZ222168A (en) * | 1986-10-20 | 1991-05-28 | Oncogene Science Inc | Tumour growth inhibiting protein related to tgf-#b#1 and tgf-#b#2, preparation by genetic engineering methods, antibodies and pharmaceutical compositions |
US4931548A (en) * | 1987-01-30 | 1990-06-05 | Techne Corporation | Heterodimer form of transforming growth factor-beta |
AU1539188A (en) * | 1987-05-04 | 1988-11-10 | Bristol-Myers Squibb Company | TGF-B2 and novel compositions having anti-neoplastic activity |
AU6870791A (en) * | 1989-10-18 | 1991-05-16 | Creative Biomolecules, Inc. | Biosynthetic constructs of tgf-beta |
US6040431A (en) * | 1995-06-07 | 2000-03-21 | Stryker Corporation | Single chain analogs of the TGF-β superfamily (morphons) |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6058960B2 (ja) * | 1978-10-09 | 1985-12-23 | サントリー株式会社 | ウィルスの検出,定量剤 |
EP0105014B1 (en) * | 1982-09-24 | 1992-05-20 | THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the Secretary United States Department of Commerce | Repair of tissue in animals |
-
1984
- 1984-04-25 IE IE999/84A patent/IE57724B1/en not_active IP Right Cessation
- 1984-04-26 FI FI841649A patent/FI81365C/fi not_active IP Right Cessation
- 1984-04-26 EP EP84302819A patent/EP0132021B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-04-26 CA CA000452799A patent/CA1341535C/en not_active Expired - Fee Related
- 1984-04-26 DE DE8484302819T patent/DE3485219D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-04-26 CA CA000590515A patent/CA1341508C/en not_active Expired - Fee Related
- 1984-04-27 NZ NZ207983A patent/NZ207983A/xx unknown
- 1984-04-30 IL IL71702A patent/IL71702A/xx not_active IP Right Cessation
- 1984-04-30 AU AU27513/84A patent/AU575049B2/en not_active Ceased
- 1984-05-04 GR GR74608A patent/GR82078B/el unknown
- 1984-05-08 NO NO841827A patent/NO169348C/no unknown
- 1984-05-08 ES ES532286A patent/ES532286A0/es active Granted
- 1984-05-08 DK DK227384A patent/DK227384A/da not_active Application Discontinuation
- 1984-05-09 PT PT78571A patent/PT78571B/pt not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-09-22 JP JP6254765A patent/JPH07173193A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
IL71702A0 (en) | 1984-07-31 |
ES8600518A1 (es) | 1985-09-16 |
DK227384D0 (da) | 1984-05-08 |
AU575049B2 (en) | 1988-07-21 |
IE840999L (en) | 1984-11-09 |
ES532286A0 (es) | 1985-09-16 |
FI81365C (fi) | 1990-10-10 |
GR82078B (fi) | 1984-12-13 |
JPH07173193A (ja) | 1995-07-11 |
AU2751384A (en) | 1984-11-15 |
PT78571A (en) | 1984-06-01 |
IE57724B1 (en) | 1993-03-24 |
CA1341508C (en) | 2006-06-13 |
PT78571B (en) | 1986-06-26 |
EP0132021A1 (en) | 1985-01-23 |
NZ207983A (en) | 1991-09-25 |
EP0132021B1 (en) | 1991-10-30 |
CA1341535C (en) | 2007-07-24 |
NO841827L (no) | 1984-11-12 |
DK227384A (da) | 1984-11-10 |
NO169348B (no) | 1992-03-02 |
FI841649A (fi) | 1984-11-10 |
NO169348C (no) | 1992-06-10 |
FI841649A0 (fi) | 1984-04-26 |
DE3485219D1 (de) | 1991-12-05 |
IL71702A (en) | 1988-01-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4816561A (en) | Biologically active polypeptides | |
US5240912A (en) | Transforming growth factor (TGF) peptides | |
US4863899A (en) | Biologically active polypeptides | |
JP3253966B2 (ja) | 幹細胞増殖因子 | |
GB2214185A (en) | Proteins and methods for their production | |
US20160046704A1 (en) | Glycoproteins having lipid mobilising properties and therapeutic applications thereof | |
HUE025169T2 (en) | A method for detecting proBNP with a monoclonal antibody | |
FI81365B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av biologiskt aktiva polypeptider. | |
Freeman et al. | Pancreatic secretory trypsin inhibitor stimulates the growth of rat pancreatic carcinoma cells | |
EP0687270B1 (en) | Osteogenic growth oligopeptides and pharmaceutical compositions containing them | |
Lin et al. | Growth inhibition by vaccinia virus growth factor. | |
FI91484C (fi) | Menetelmä uuden solun kasvua säätelevän tekijän, onkostatiini M:n valmistamiseksi | |
FI89061C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt aktiva antikroppar av biologiskt aktiva polypeptider samt i foerfarandet anvaenda polypeptider och oligopeptider | |
FI81497B (fi) | Antikroppar mot biologiskt aktiva polypeptider och deras anvaendning vid diagnostiska foerfaranden. | |
CA1341536C (en) | Transforming growth factor peptides | |
AU745894C (en) | In vitro and in vivo growth-promoting proteins and peptides for kidney epithelial cells | |
NZ231140A (en) | Transforming growth factor (tgf) and its isolation | |
WO1993025576A2 (en) | Peptides having platelet-derived growth factor (pdgf) activity | |
US5147798A (en) | Monophenotypic xenograft of megakaryocytic lineage and origin | |
JPH02164900A (ja) | ヒト上皮細胞形質転換成長因子 | |
CA1296275C (en) | Monoclonal antibody, hybridoma, their production and use thereof | |
CA2191321A1 (en) | Gene coding for modified bone morphogenic protein receptor | |
EP0646600B1 (en) | A cell growth-inhibiting protein | |
AU2005244575B2 (en) | Human Vascular Endothelial Growth Factor 2 | |
AU611614B2 (en) | Growth factors |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM | Patent lapsed | ||
MM | Patent lapsed |
Owner name: TODARO, GEORGE JOSEPH |