NO169348B

NO169348B - Analogifremgangsmaate for fremstilling av en polypeptid-transformerende vekstfaktor

Info

Publication number: NO169348B
Application number: NO841827A
Authority: NO
Inventors: George Joseph Todaro
Original assignee: George Joseph Todaro
Priority date: 1983-05-09
Filing date: 1984-05-08
Publication date: 1992-03-02
Also published as: PT78571A; CA1341535C; EP0132021B1; DK227384A; CA1341508C; GR82078B; PT78571B; EP0132021A1; ES532286A0; NO169348C; AU575049B2; FI81365C; AU2751384A; IL71702A0; IL71702A; FI841649A0; NO841827L; NZ207983A; DK227384D0; ES8600518A1

Description

Denne oppfinnelse vedrører fremstilling av biologisk

aktive polypeptider fra naturlige eller syntetiske kilder. Det skal beskrives forbindelser med en generell polypeptidstruktur som definerer proteiner som har cellevekstfremmende virkning og en ny klasse av transformerende vekstfaktor (TGF)-polypeptider som har den egenskap av de overfører den transformerte fenotype på normale celler reversibelt in vitro og således viser seg å

være passende effektorer av den maligne fenotype. Det skal også beskrives antigene oligopeptider oppnådd fra TGF-polypeptidene og antistoffer dannet mot de antigene oligopeptider og de assosierte TGF-polypeptider som er anvendbare i oppdagelsen og behandlingen av maligniteter. Videre skal det beskrives oligopeptider som har evne til å binde seg til cellulære vekstfaktor-reseptorer og således potensielt vil interferere med transformering av bestemte cellelinjer til en cancerøs tilstand. Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen omfatter å isolere TGF-polypeptider i homogen form- fra både transformerte humane og murine cellelinjer og kroppsvæsker og mot de homogene TGF-polypeptider som fåes på denne måte. Produkter fremstilt ved oppfinnelsen kan anvendes for oppdagelse og behandling av cancer og andre proliferative sykdommer og for cellevekst-assosiert behandling, f.eks. helbredelse av skader og sår-behandling. De kan også anvendes ved behandling og påvisning av bentapsykdommer, f.eks. osteoporose og hypercalcemi.

Et antall av polypeptid-hormon og hormon-lignende vekstfaktorer er blitt funnet i vevsvæsker, og deres relasjon i kontrollen av normal cellevekst eller mitose er blitt bestemt. Disse mitogene polypeptidvekstfaktorer inkluderer insulin, insulin-lignende vekstfaktorer, vekstfaktor fått fra blodlegemer, nervevekstfaktor, fibroblastvekstfaktor og epidermalvekstfaktor (EGF). I det minste noen av disse kjente vekstfaktorene har en virkning på veksten av transformerte celler, men på basis av in vitro-forsøk, viser det seg at transformerte celler trenger mindre av disse kjente vekstfaktorer for optimal vekst og formering enn normale celler gjør. Spesielt er det blitt vist i eksperimenter i cellekultur at tilsetning av eksogene vekstfaktorer såsom insulin og EGF kan få normale celler til å etterligne noen forandringer i cellulære egenskaper som er analoge til transformering; imidlertid er de ikke i stand til å produsere alle forandringer forbundet med den transformerte fenotype, f.eks., se Sporn et al., (1981) The New Eng. J. of Med., nr. 15, s. 878-880.

Nylig er nye typer av polypeptidvekstfaktorer betegnet som transformerende vekstfaktorer eller TGF blitt funnet i visse humane og animale carcinomer og sarkomceller som har en større utfyllelse av egenskapene som viser seg nødvendig for fenotypisk transformering (Roberts et al., (1980) Proe. Nati. Acad. Sei.

USA 77, s. 3494-3498 og Todaro et al., (1980) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77, s. 5258-5262). TGF-polypeptidene som en klasse er karakterisert ved forandringene som de forårsaker når de anvendes på utransformerte, ikke-neoplastiske indikatorceller som vokser i kultur. Disse forandringer inkluderer a) tap av tetthets-avhengig inhibering av cellevekst i monolag-kultur, b) overvekst av celler i monolag-kultur, c) forandring i celleform, med det resultat at indikatorcellene antar den neoplastiske fenotype,

og d) ervervelse av festepunkt-uavhengighet med resulterende evne til å vokse i bløt agar. Evnen til festepunkt-uavhengig vekst av celler i kultur har en spesielt høy korrelasjon med neoplastisk vekst in vivo. I det minste noen av TGF-polypeptidene viser noe slektskap med EGF ved det at de er både varmestabile og syre^. stabile peptider, følsomme for reduserende stoffer og proteaser og de viser seg spesifikt å reagere med, og produsere biologiske virkninger gjennom cellulær membran EGF-reseptorer, idet TGF konkurrerer med EGF om binding til den cellulære EGF-reseptor. Imidlertid kan TGF skilles fra EGF i flere viktige henseender. Spesielt induserer EGF ikke festepunkt-uavhengig vekst av celler i kultur og antistoffer mot EGF påviser heller ikke TGF i hverken radioimmunoassay eller immunopresipitasjonstester. Videre har EGF bare en svak virkning på fenotypen av celler i kultur, mens TGF produserer en mer uttalt fenotypisk forandring i celler i kultur og overfører til dem evnen til å oppføre seg som transformerte celler. Interessant nok er transformeringen produsert

av TGF ikke permanent men reversibel i fravær av TGF, og det er intet bevis for at TGF virker som et fullstendig carcinogen selv.

(Todaro et al., (1981) J. of Supramolecular Structure and Cell Biochem. 15, s. 287-301).

Således er TGF-polypeptider en enestående klasse proteiner som kan skilles fra andre vekstfaktorer såsom EGF,både når det gjelder biologiske egenskaper og kjemisk struktur. Disse TGF har videre en rekke egenskaper av verdi eller potensiell verdi på det helsevitenskapelige område som inkluderer sterk men reversibel cellevekst eller mitogene egenskaper som finner anvendelse i cellereparering, inkluderende f.eks. helbredelse av skader og sårterapi. I tillegg er produksjonen av TGF-polypeptider eller forhøyede nivåer av produksjon karakteristiske for, hvis ikke nødvendige for, den morfologiske transformering av bestemte cellelinjer i både humant og murint vev og/eller væsker; derfor er TGF-polypeptidene eller antigene fragmenter av disse av verdi i differensiering av normale celler fra tumorceller og antistoffer dannet mot dem har anvendelse både i diagnose og behandling av maligniteter. Videre når man blir klar over at bestemte TGF-polypeptider spesifikt reagerer med og produserer sine biologiske virkninger gjennom cellulærmembran-EGF-reseptorer, reiser det muligheten med engang basis-TGF-polypeptidstrukturen er bestemt, til å korrelere strukturen med strukturen av EGF for å utvikle oligopeptider som har kjemiske karakteristika som tillater binding til EGF-reseptorene uten medfølgende fenotypisk transformering av cellen. Oligopeptider som har denne karakteristiske EGF-reseptorbindende evne, finner anvendelse i behandling av maligniteter siden oligopeptidet vil interferere eller konkurrere med TGF for oppnåelige reseptorsteder og derved forstyrre fremstillingen av de transformerte egenskaper av cellen.

Med den foreliggende oppfinnelse er det blitt utviklet en metode for å få TGF-polypeptider i tilstrekkelig mengde og renhet for å tillate fullstendig strukturbestemmelse og som et resultat av denne bestemmelse og andre observasjoner, hvilket inkluderer funn av stofflig homologi mellom human og murin TGF, er det blitt oppdaget en grunnpeptidstruktur som har bred anvendelse i celle-mitose og det beslektede bruksområde for cellevekst. Videre har man fått homogene TGF-polypeptider som har anvendelse i både cellevekstområdet og i oppdagelse og behandling av cancer og andre proliferative sykdommer. TGF-polypeptider, oligopeptider og antistoffer dannet mot disse polypeptider har også anvendelse ved påvisning og behandling av bentapsykdommer, f.eks. osteoporose, hypercalcemi og ben-resorpsjon. I tillegg fås antigene oligopeptider og oligopeptider som har evne til å binde cellulære vekstfaktor-reseptorer, fra basispeptidstrukturen og de bestemte TGF-polypeptidstrukturer. Til slutt er sammensetninger og metoder, inkluderende antistoffer dannet mot TGF-polypeptider og antigene oligopeptider fått fra disse gitt for anvendelse i helsevitenskapelige områder.

Marquardt og Todaro, J. of Bio. Chem. (1982) vol. 257,

nr. 9, s. 5220-5225, (publisert 10. mai 1982) beskriver isoleringen av et lavmolekylært humant TGF fra serumfritt medium kondisjonert ved en humanmetastatisk melanomtumorlinje ved en sekvens av reaksjonsskritt som inkluderer ekstrahering i IM eddiksyre og sekvensiell rensning på reversert fase-høytrykks-væskekromatografi idet man først eluerer med acetonitril-løsningsmiddel fulgt av eluering med 1-propanol for å frembringe et renset TGF som har karakteristisk TGF biologisk virkning, f.eks. induksjon av festepunkt-uavhengig cellevekst. Twardzik et al., Science (1982) vol. 216, s. 894-897 (publisert 21. mai 1982) rapporterer anvendelsen av samme metode for rensning for å rense et TGF fra en virustransformert rottecelle. Den biologiske virkning av det rensede materiale i cellekultur er også demonstrert. Pike et al., J. of Bio. Chem. (1982) vol. 257, nr. 24, s. 14628-14631 (publisert 25. desember 1982) bringer for dagen at både delvis renset rotte- og human TGF har evnen til å aktivere en protein kinase i human tumorcellemembraner og derfor stimulere fosforylering av syntetisk tyrosin-inneholdende peptid. De eneste andre molekyler så langt beskrevet som har denne virkning, er EGF, insulin og vekstfaktor fått fra blodlegemer, hvorav man tror at alle har viktige fysiologiske virkninger i menneske og dyr. Andre referanser av interesse er gjengitt i de forannevnte artikler.

En basisk proteinstruktur er nå blitt funnet, som definerer en ny klasse av biologisk aktive molekyler. Funnet av dette strukturpolypeptid som frembringer biologisk aktivitet,særlig i det cellevekstbefordrende område, er basert på oppdagelsen at en bestemt korrelasjon eksisterer mellom den tredimensjonale struktur av bestemte polypeptider, inkludert TGF, som inneholder multiple disulfidbindinger, og den biologiske virkning som kan tilskrives polypeptidet. Biologisk aktive polypeptider inneholder minst én peptidfrekvens av formel I:

hvor AA er en aminosyrerest valgt fra Val, Ser, His, Phe, Asn, Lys, Asp, Thr, Gin, Arg, Leu, Glu, Pro, Ala, Gly, Trp og Tyr, og a er 7, b er 4 eller 5, c er 10 og d er 8. Også tatt i betraktning er forbindelser i henhold til formel I hvor når b er 4, AA også kan være Ile eller Met, i tillegg til de nevnte aminosyrerester.

En,spesifikk klasse av polypeptider som har transformerende vekstfaktoregenskaper inkluderer forbindelser av formel II og IIA eller oligomerer av disse:

hvor R er Asp eller lys,"R<*> er Phe eller Tyr, R"' er Ser eller Phe og R'•<*> er Phe eller Tyr. Også innen rammen av oppfinnelsen er antigene oligopeptider oppnådd fra polypeptidene av formel II og IIA.

Polypeptidvekstfaktorer inneholder ett eller flere av følgende peptidfragmenter:

En klasse av oligopeptider har evne til å binde cellulære vekstfaktor-reseptorer og har derfor mulig anvendelse i behandling av maligniteter og andre forstyrrelser angående celleproliferasjon. Denne klasse av oligopeptider er basert på oppdagelsen av nøkkelsekvenser i større polypeptid-molekyler som viser både signifikant aminosyresekvens-homologi i den passende tredimensjonale struktur og har evne til å binde seg til cellulære vekstreseptorsteder. Slike oligopeptider har formel III:

hvor R er Phe eller Tyr og AA er en aminosyrerest valgt fra Val, Asn, His, Ser, Val, Ile, Gly, Leu, Asp, Asn, Cys, Thr, Ala, Tyr, Pro, Glu, Gin og Arg, og x er 0 eller et helt tall fra 1 til 5, y er 2, z er 3 og z' er 0 eller et helt tall fra 1 til 6.

Noe som også skal beskrives er biologisk aktive forbindelser og metoder som bruker polypeptid- og oligopeptid-strukturer gitt ovenfor, inkludert antistoffer mot polypeptidene av formel II og IIA og de antigene oligopeptider oppnådd fra disse, idet nevnte antistoffer er valgfritt merket med en markør som er i stand til å gi et påvisbart signal for anvendelse i diagnostiske metoder eller merket med et cytotoksisk stoff for anvendelse i cancer eller proliferativ sykdomsterapi. Andre forbindelser og metoder som anvender cellevekstfremmende egenskaper hos polypeptidene fremstilt ved foreliggende oppfinnelse, skal også beskrives.

I henhold til foreliggende oppfinnelse inkluderer fremgangsmåten å isolere homogene transformerende vekstfaktor-polypeptider fra mindre rene vandige løsninger som inneholder nevnte polypeptider, inkludert kroppsvæske og vandige medier kondisjonert med transformerende vekstfaktor-produserende celle-linjer like mye som de homogene transformerende vekstfaktor-polypeptider produsert ved dette og antistoffer dannet mot nevnte homogene polypeptider. Ved fremgangsmåten isoleres et homogent transformerende vekstfaktorpolypeptid fra et vandig medium som inneholder nevnte transformerende vekstfaktorpolypeptid i uren form ved hjelp av de følgende fremgangsmåtetrinn: (a) isolering fra et vandig medium som inneholder transformerende vekstfaktor-polypeptid i uren form, ved

(1) dialyse av det vandige medium som inneholder den transformerende vekstfaktor i uren form, mot en vandig, svak organisk syre for å gi en løsningsmiddelfase som inneholder transformerende vekstfaktor-polypeptid hvis fase er konsentrert og eventuelt klaret, idet det vandige medium som inneholder nevnte transformerende vekstfaktor-polypeptid i uren form, f.eks. er en kroppsvæske som inneholder transformerende vekstfaktor eller et vandig medium kondisjonert med en

transformerende vekstfaktor-produserende cellelinje,

(2) gjendannelse av den konsentrerte løsningsmiddelfase fra trinn (1) med en vandig, svak organisk syre og underkastelse av den gjendannede løsning for gelpermeasjonskromatografi ved å tilsette gjendannet løsning til en gelpermeasjons-kromatograf i-kolonne kondisjonert med en vandig, svak organisk syre og eluering med den vandige, svake organiske syre for å få valgte fraksjoner av eluat som inneholder transformerende vekstfaktor-polypeptid i en forøket renhetstilstand, idet nevnte valgte fraksjoner blir kombinert og konsentrert for å gi et delvis renset, transformerende

vekstfaktor-polypeptid-holdig produkt,

(3) å underkaste det delvis rensede, transformerende vekstfaktor-polypeptid-holdige produkt fra trinn (2) sekvensiell revers fase-høytrykks-kromatografi ved å la nevnte produkt, etter gjendannelse i en vandig, sterk syre, passere gjennom en eller flere hydrokarbonbundne silisiumdioksyd-matrikskolonner som er blitt likevektsinnstilt med vandig, sterk syre under høytrykks-væskekromatografibetingelser, idet den første eluering av kolonnen blir utført ved å bruke en lineær acetonitrilgradient i vandig, sterk syre, og den på-følgende kolonne-eluering, som blir utført på de kombinerte, transformerende vekstfaktor-polypeptid-holdige fraksjoner fra det innledende høytrykks-kronratografitrinn, blir utført ved å bruke en lineær 1-propanol-gradient i vandig, sterk syre, idet nevnte 1-propanol-gradient blir økt i tilstrekkelig små 1-propanol-konsentrasjonsforøkninger for å gi det transformerende vekstfaktor-polypeptid som en enkelt

distinkt topp i en tilstand av homogent polypeptid, eller (b) sekvensiell kobling av aminosyrer, i rekkefølgen gitt ved polypeptid- eller oligopeptid-formelen, på en passende bærer, idet bæreren fortrinnsvis er polystyrenharpiks.

Som vandig, svak organisk syre i trinn (a) (1) og (2) anvendes fortrinnsvis vandig eddiksyre, og som vandig, sterk syre i trinn (a) (3) anvendes fortrinnsvis vandig trifluoreddiksyre.

Peptid-sekvensen som karakteriserer basisproteinstrukturen inneholder seks cysteinrester plassert i kritiske posisjoner i polypeptidskjelettet. Det er tenkt at plasseringen av cystein-restene tillater polypeptidet å folde på en spesiell måte som et resultat av disulfidbroer mellom cysteinpar, og derfor å fremvise en tredimensjonal struktur som bidrar til den biologiske virkning av det resulterende protein. Det er noen tegn som tyder på en spesiell disulfid-bro-sekvens (nummereringen av Cys-restene i formel I ovenfor 1 til 6 og fra venstre til høyre) Cys-1 er bundet til Cys-3, Cys-2 er bundet til Cys-4 og Cys-5

er bundet til Cys-6 ved disulfidbindinger i biologisk aktive former av basisproteinstrukturen. Den nøyaktige kjemiske natur av aminosyrerestene nevnt for aminosyresekvensene plassert mellom Cys-restene i formel I, viser seg ikke å være spesielt avgjørende, forutsatt at minst 10 forskjellige aminosyrer fra gruppen nevnte for formel I anvendes, og ingen aminosyrer ble gjentatt mer enn fire, fortrinnsvis tre ganger som påfølgende rester i noen gitt sekvens. Av aminosyrerestene satt opp for formel I, er preferanse gitt til Val, Ser, His, Phe, Lys, Asp, Thr, Gin, Leu, Glu, Pro, Ala og Gly. En foretrukken gruppe av

biologisk aktive polypeptider som har minst én peptidsekvens av formel I, er polypeptider og oligomerer av disse av formel IV:

hvor AA er en aminosyrerest valgt fra Val, Ser, His, Phe, Asn, Lys, Asp, Thr, Gin, Arg, Leu, Glu, Pro, Ala, Gly, Trp og Tyr, og n er et helt tall på fra 4 til 10, m er 7, o er 4 eller 5,

p er 10, q er 8 og r er et helt tall på fra 6 til 12. I denne foretrukne gruppe er enda videre preferanse gitt til polypeptider eller oligomerer av disse hvor o er 4 og n og r er 7. Med denne foretrukne gruppe kan aminosyrerestene betegnet med AA også være Ile og/eller Met, i tillegg til aminosyrerestene nevnt tidligere for formel IV. Mest foretrukne er polypeptider hvor aminosyrerestene i sekvensene plassert mellom Cys-restene, er valgt fra Val, Ser, His, Phe, Lys, Asp, Thr, Gin, Leu, Glu, Pro, Ala og Gly. Typisk vil polypeptidene i henhold til formel I og IV ha molekylvekter som varierer fra ca. 5.000 til

ca. 35.000. Foretrukne polypeptider i dette henseende har molekylvekter i området fra 5.000 til 8.000.

Som anmerket ovenfor betraktes også en ny klasse av TGF-polypeptider og oligomerer av disse av formelen (formel II og IIA ovenfor):

hvor R er Asp eller Lys, R' er Phe eller Tyr, R'* er Ser eller Phe og R'<*>' er Phe eller Tyr. Denne nye klasse av polypeptider har man fått ut fra det funn at noe TGF fått fra en rekke patte-dyrarter (både murine og humane) har stofflig homologi i amino-

syreoppbyggingen av peptidsekvensen (mer enn 90% av sekvensene er identiske) og også de samme biologiske egenskaper. Spesielt forårsaker TGF-polypeptider i henhold til formelen gitt ovenfor, tap av tetthets-avhengig inhibering av cellevekst i monolag-kultur, overvekst i monolag-kultur, karakteristisk forandring i cellulær morfologi og ervervelse av festepunkt-uavhengig vekst når anvendt på utransformerte, ikke-neoplastiske indikatorceller dyrket i kultur. I tillegg til å være ekstremt potente cellevekst-fremmere og utførere av celletransformering konkurrerer TGF-polypeptidene i henhold til formelen ovenfor med EGF for binding til cellulær EGF-reseptor og har også evnen til å aktivere et enzym, en protein kinase, i humane tumorcellemembraner. Foretrukne TGF-polypeptider av formel II ovenfor inkluderer dem hvor R er Asp, R<1> er Phe, R'<1> er Ser og R''' er Phe eller hvor R er Lys, R' er Tyr, R" er Phe og R11' er Tyr. Foretrukne TGF-polypeptider av formel IIA ovenfor inkluderer slike hvor R er Asp, R' er Phe, R" er Phe og R<1>" er Tyr. Som vil bli diskutert mer detaljert nedenfor, kan disse TGF-polypeptider fås på en passende måte fra en rekke transformerte humane og murine cellelinjer, noen embryoniske cellelinjer og kroppsvæsker av tumor-bærende pattedyr som bruker isolasjonsfremgangsmåten av oppfinnelsen eller ved konvensjonelle syntetiske eller rekombi-nante måter for å syntetisere polypeptider. Typisk vil molekylvekten av TGF-polypeptidene og oligomerene av disse av formel II og IIA være i området fra ca. 5.000 til ca. 35.000. Med hensyn på dette er fortrinn gitt til TGF-polypeptider som har en molekylvekt på fra ca. 5.000 til 8.000.

Gjenkjennelse av den reelle peptidsekvenshomologi i den

nye klasse av TGF-polypeptider av formel II og IIA ovenfor og likheten i biologiske egenskaper assosisert med den, tillater videre definering av en klasse polypeptidvekstfaktorer som er innen rammen av foreliggende oppfinnelse. Disse polypeptidvekstfaktorer er definert som å minneholde ett eller flere av de følgende peptidfragmenter:

Foretrukne polypeptider i dette henseende inkluderer polypeptider som inneholder en kombinasjon av peptidfragmenter A og C eller B og E og polypeptider som inneholder en kombinasjon av peptidfragmenter B og C. Mest foretruknne er polypeptider som inneholder fragmenter B, C og D eller B og E. Igjen vil polypeptidfaktorene som inneholder ett eller flere av peptidfrag-mentene A, B, C, D, E og F generelt ha en molekylvekt i området fra ca. 1.000 til 35.000, fortrinnsvis fra 1.000 til 8.000. Den nedre ende av molekylvektområdet vil inkludere de ovenfor spesifiserte peptidfragmenter selv som fullstendige polypeptider som har den karakteristiske vektfaktor-biologiske aktivitet.

Tidligere er det blitt anmerket at TGF-polypeptidene av foreliggende oppfinnelse er av verdi i oppdagelsen av maligniteter i pattedyr siden produksjonen og/eller forhøyde nivåer av produksjon av TGF-polypeptider er karakteristisk for morfologisk transformasjon av bestemte humane og murine cellelinjer. I dette henseende har antistoffer til TGF-polypeptidene anvendelse i diagnostikk av maligniteter siden de kan anvendes til å påvise ekstremt lave nivåer av TGF-polypeptid som er til stede i tumorceller eller kroppsvæsker. Mens hele TGF-polypeptidmolekylet kan anvendes for å danne antistoffer (både polyklonale og monoklonale) er det også mulig og fordelaktig med henblikk på omkost-ninger og teknisk utførelse å bestemme forskjellige områder i TGF-polypeptidsekvensen som er sannsynlig å være determinant-steder og å bruke disse oligopeptidene på minst ca. 8 aminosyrer, typisk minst ca. 10 og ikke mer enn ca. 20 aminosyrer, til å definere et hapten som kan brukes til å indusere antistoff-dannelse. Som videre diskutert nedenfor er oligopeptidet bundet til et passende immunogen og ført inn i et virveldyr for å produsere de ønskede antistoffer. Følgelig gir den foreliggende oppfinnelse også en rekke oligopeptider som svarer til de antigene områdene i TGF-polypeptidene. Eksempler på typer av de antigene oligopeptider som er anvendbare i dannelse av antistoffet i henhold til foreliggende oppfinnelse, er satt opp nedenfor.

Et annet sammensetningsaspekt er en klasse av oligopeptider som har terapeutisk verdi i behandling av maligniteter. Disse oligopeptider har evne til å binde cellulære vekstfaktor-reseptorer uten å forårsake feno-typisk transformering av cellen, og derfor kan de effektivt konkurrere med TGF-polypeptider om tilgjengelige reseptorsteder på cellen og avbryte eller minske celletransformering som er karakteristisk for TGF-binding til cellereseptorer. 01igopeptidene som fremstilles ved oppfinnelsen som har evne til å binde cellulære reseptorer, er av formelen (formel III ovenfor):

hvor R er Phe eller Tyr og AA er en aminosyrerest valgt fra Val, Asn, His, Ser, Lys, Ile, Gly, Leu, Asp, Asn, Cys, Thr, Ala, Tyr, Pro, Glu, Gin og Arg, og x er 0 eller et helt tall på fra 1 til

6, y er 2, z er 3 og z' er 0 eller et helt tall på fra 1 til 6. Foretrukne oligopolypeptider i henhold formelen ovenfor inkluderer disse hvor x og z<*> er 0 og AA er en aminosyrerest valgt fra Val, His, Ser, Ile, Gly og Asp. En ønsket gruppe av biologisk aktive oligopeptider beslektet med dem av formel II er de som inneholder to glycinrester i tillegg til å ha en sekvens av den følgende

formel:

hvor aminosyrerestene betegnet med AA, er de samme som dem som er nevnt i formel III ovenfor men inkluderer Phe, og betegnelsene x og z' er som gitt for formel III ovenfor. Disse oligopeptider antar en felles tredimensjonal struktur som kan tilskrives disul-fidbroene mellom de to cysteiner. Denne disulfidbroen karakteriserer de biologisk aktive former av oligopeptidene. Spesielt foretrukne oligopeptider i dette henseende er valgt fra klassen som består av

Polypeptidene og oligopeptidene fremstilt ved oppfinnelsen som definert ved de strukturelle formler (formler I til IV) og peptidsekvenser gitt ovenfor kan bli fremstilt ved syntetiske teknikker, teknikker hvorved peptidet blir islolert fra en naturlig forekommende kilde, f.eks. cellelinjer og kroppsvæsker, og ved teknikker som anvender hybrid DNA teknologi. For disse polypeptider og oligopeptider av oppfinnelsen som inneholder opp til ca. 50 aminosyrerester, har det passet å anvende konvensjonell fast fase peptidsyntese. I denne generelle syntetiske fremgangsmåte for å lage peptider som er beskrevet f.eks. i US-patent

4.341.761 til Ganfield et al., anvendes kjente sidekjede-

beskyttende grupper og konvensjonelle polystyrenharpiksbærere - f.eks. klormetylerte harpikser, hydroksymetylharpikser eller benzhydrylaminharpikser - for å utføre aminosyrekoblingen. For polypeptider som inneholder overskudd på ca. 50 aminosyrerester kan fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen for å isolere homogen TGF fra naturlige kilder, som er beskrevet i detalj nedenfor, passende anvendes for å få rene former av det ønskede peptid. I dette henseende inkluderer spesielt passende kilder for TGF-polypeptider i henhold til oppfinnelsen, serum-fritt medium kondisjonert med retrovirus-transformerte Fischer rotte-embryofibroblaster, spesielt fibroblaster transformert med Snyder-Theilen felin - sarkomvirus, Moloney murin-sarkomvirus-transformerte mus 3T3-celler og humane metastatiske mélanom-cellelinjer A2058 og A375. Kilder og metoder for passende murine cellelinjer er beskrevet i DeLarco et al., (1980) J. Biol. Chem. 255, s. 3685-3690 og Ozanne et al., (1980) J. Cell. Physiol. 105, s. 163-180. Kilder og metoder for humane cellelinjer er på samme måte beskrevet i Todaro et al., (1980) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77, s. 5258-5262 og Giard et al. (1973) J.Natl. Cancer Inst., 51, s. 1417-1423. Isoleringsfremgangsmåten av oppfinnelsen beskrevet nedenfor, kan også anvendes til å få TGF-polypeptider fra forskjellige kroppsvæsker slik som urin, serum, plasma, fullblod eller cerebrospinalvæske fra mennesker eller mus som bærer maligniteter, eller transformerte celler som produserer de nye TGF-polypeptider. I dette henseende er en passende kilde for TGF-polypeptidene urin eller andre kroppsvæsker av mus som er blitt inokulert med tumorceller (humant melanom eller transformert rotte) kjent for å produsere TGF-poypeptider. I alle tilfelle kan identifiseringen og renheten av TGF-polypeptidene kontrolleres ved en radio-reseptorprøve basert på reseptor kryss-reaktivitet med EGF (se eksperimentelle eksempler nedenfor). I teknikker som anvender rekombinant eller hybrid DNA-teknologi kan oligopeptidene fremstilt i henhold til oppfinnelsen eller segmenter av slike polypeptider, som inneholder opptil f.eks. 20 aminosyrer , anvendes til å dedusere kodesekvensen for enkelt-trådet nukleotid-(DNA)-prøver. Disse nukleotidprøver kan bli syntetisert ved å bruke kjente syntetiske teknikker og brukt som prøve til å få messenger RNA til å kode for vekstfaktor-type polypeptider i både normale og transformerte celler eller kroppsvæsker som inneholder nevnte peptider. Så snart messenger RNA er fått,

kan konvensjonelle teknikker brukes til revers transskribering av mRNA til cDNA og etterfølgende kloning av cDNA i en passende vektor for å få fremstilling av det ønskede polypeptid.

Prosessen i henhold til oppfinnelsen gir en enestående effektiv metode for å oppnå TGF-polypeptider i homogen form fra forskjellige vandig baserte væsker som inneholder mindre rene former av TGF-polypeptidene slik som serum-frie medier kondisjonert med transformerte cellelinjer som produserer TGF-polypeptider eller kroppsvæsker, f.eks. urin fra pattedyr som bærer maligniteter eller transformerte celler som produserer TGF-polypeptidene. Viktige aspekter av denne unike isolering eller rensningsprosess inkluderer et initielt ekstraksjons eller dialyseskritt som anvender vandig eddiksyre, påfølgende gelpermeasjons-kromato-grafering av den syre-løselige TGF-inneholdende aktivitet, og til slutt, revers fase-høytrykks-væskekromatografi som anvender sekvensielt acetonitril og 1-propanol i nærvær av vandig trifluoreddiksyre. Vidt definert involverer denne fremgangsmåte isolering av et homogent transformerende vekstfaktor-polypeptid fra et vandig medium som inneholder nevnte transformerende vakstfaktor-polypeptid i uren form ved fremgangsmåteskritt som innbefatter: (1) dialyse av det vandige medium som inneholder den transformerende vekstfaktor i uren form mot vandig eddiksyre for å gi en løsningsmiddelfase som inneholder transformerende vekstfaktorpolypeptid hvis fase er konsentrert og mest mulig oppklarnet, (2) å gjenoppløse den konsentrerte løsningsmiddelfase av skritt 1) med vandig eddiksyre og underkaste den gjendannede løsning gelpermeasjons-kromatografi ved å tilsette gjendannet løsning til en gelpermeas jons-kromatograf ikolonne kondisjonert med eddiksyre og eluere med vandig eddiksyre for å få selekterte fraksjoner av eluat som inneholder transformerende vekstfaktorpolypeptid i en forøket renhetstilstand, idet nevnte selekterte fraksjoner blir ført sammen og konsentrert for å gi et delvis renset, transformerende vekstfaktorpolypeptid-inneholdende produkt, (3) å underkaste det delvis rensede, transformerende vekstfaktorpolypeptid-inneholdende produkt av skritt

2) sekvensiell revers fase-høytrykkskromatografi ved

å la nevnte produkt passere etter gjenoppløsning i vandig trifluoreddiksyre, gjennom en eller flere hydrokarbonbundne silisiumdioksyd-matrikskolonner som er blitt ekvilibrert med vandig trifluoreddiksyre under høytrykks-væskekromatografibetingelser, idet den initielle kolonne-eluering blir utført ved å anvende en lineær acetonitrilgradient i vandig trifluoreddiksyre og den påfølgende kolonne-eluering som blir utført på de kombinerte, transformerende vekstfaktorpolypeptid-inneholdende fraksjoner av det initielle høytrykks-kromatografiskrittet, idet den blir utført ved å anvende en lineær 1-propanolgradient i vandig trifluoreddiksyre, idet nevnte 1-propanolgradient økes i tilstrekkelig små 1-propanol-konsentrasjonstilvekster for å gi det transformerende vekstfaktorpolypeptid som en enkelt distinkt topp i tilstand av et homogent polypeptid.

Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen kan anvendes for å isolere homogen TGF fra serumfritt medium kondisjonert ved transformerte, TGF-produserende cellelinjer.

I denne foretrukne anvendelse er det kondisjonerte medium passende oppklaret, f.eks. ved sentrifugering og konsentrert forut for dialyse og den TGF-inneholdende løsningsmiddel-

fase fra dialyse er passende oppklaret, f.eks. ved sentrifugering og også konsentrert forut for gelpermeasjonskromatografi. I alle tilfeller blir dialysen passende utført ved å anvende et vandig eddiksyreløsningsmiddel som har en eddiksyrekonsentrasjon på fra 0,01 til 1 molar, med 0,1 molar eddiksyre som det foretrukne. Gelpermeasjonskromatografien kan utføres ved å bruke en rekke geler konvensjonelt anvendt til å separere proteiner eller polypeptider basert på molekylær størrelse. Passende geler inkluderer dekstrangeler, agarosegeler og polyakrylamidgeler. I dette henseende er fortrinn gitt til polyakrylamidgel-filtreringsharpikser (Bio-Gel®) slik som Bio-Gel- P-10, Bio-Gel P-30 og Bio-Gel P-60, Bio-Gel P-10 som spesielt er foretrukne.

Den vandige eddiksyre anvendt for å kondisjonere kolonnen og til å eluere de TGF-inneholdende fraksjoner, har passende en eddiksyrekonsentrasjon på fra 0,2 til 2,0 molar, med 1,0 molar eddiksyre som det foretrukne. De TGF-inneholdende fraksjoner som eluerer fra kolonnen, kan bli identifisert ved å bestemme deres EGF-konkurrerende virkning og vekstfremmende virkning i bløt agar (se eksperimentelle eksempler nedenfor). Etter gelpermeas jonskromatograf i blir fraksjonene som inneholder TGF-polypeptider i en forøket tilstand av renhet, samlet sammen og konsentrert, f.eks. ved lyofilisering som et forberedende skritt for videre rensning ved revers fase-høytrykks-væskekromatografi

(HPLC).

Sluttstadiet av rensningsprosessen av oppiinnelsen involverer sekvensiell HPLC med acetonitril og 1-propanol i nærvær av vandig trifluoreddiksyre. Denne sekvensielle HPLC kan utføres ved å bruke en eller flere HPLC-kolonner, men det er foretrukket å utføre de sekvensielle HPLC-skritt ved å anvende en enkelt HPLC-kolonne. Kolonnepakningen som anvendes, er mest passende en porøs silisium-matriks til hvilken et langkjedet hydrokarbon, f.eks. hydrokarbon som inneholder 16-22 karbonatomer, er bundet. Foretrukne pakninger er yBondapak hydrokarbonkolonner, spesielt yBondapak-C^g-kolonne (10-ym partikkelstørrelse,

0,39 x 30 cm, Waters Associates). Typisk blir fremgangsmåten utført under trykk, fortrinnsvis i området på fra ca. 3,5 til ca. 350 kg/cm 2. Forut for tilsetning til kolonnen, blir de konsentrerte TGF-inneholdende fraksjoner gjenoppløst i en vandig 1 til 10% trifluoreddiksyre og justert til en pH i området 2-5, fortrinnsvis 3,5, ved tilsetning av trifluoreddiksyre. Kolonnen blir passende ekvilibrert med 0,01 til 0,1% vandig trifluoreddiksyre, fortrinnsvis 0,05% trifluoreddiksyre før injeksjon av prøve. Den første elueringen blir utført med acetonitril i en 0,ol til 0,1%, fortrinnsvis 0,05% trifluoreddiksyre som bruker en lineær acetonitrilgradient (acetonitrilkonsentrasjon økt lineært ved en gradient i området på ca. 0,1%/min. til ca. 1%/min.). Elueringen blir utført over en tidsperiode på fra 0,2 til 3 timer ved en strømningshastighet på ca. 0,2-2 ml/min. og ved en temperatur på fra 10 til 50°C, fortrinnsvis ca. 40°C. De samlede fraksjoner som inneholder TGF-aktivitet som bestemt

ved EGF-konkurrering og bløt agarprøve, ble konsentrert, f.eks. ved lyofilisering, forut for det andre skritt av HPLC idet man anvender 1-propanol-løsningsmiddel. For det andre skritt av den sekvensielle HPLC blir de samlede og konsentrerte fraksjoner fra den første HPLC-eluering gjenoppløst i 0,01-0,1% trifluoreddiksyre og rekromatografert på samme kolonne eller en annen kolonne som er ekvilibrert med trifluoreddiksyre på en måte som er identisk til den som ble anvendt for den første kolonne. Denne andre eluering blir utført med 1-propanol i en 0,01-0,1%, fortrinnsvis 0,035% trifluoreddiksyre som anvender en lineær 1-propanolgradient. Det er viktig for optimale resultater å anvende en grunn lineær 1-propanolgradient i dette skritt. Spesielt bør 1-propanolkonsentrasjonen økes lineært ved en gradient som ikke overstiger 0,1%/min. og fortrinnsvis bør den lineære 1-propanolgradient holdes mellom 0,01%/min. og 0,05%/min. under elueringen. Denne andre eluering bør passende utføres over en tidsperiode på fra 1 til 5 timer ved en strøm-ningshastighet på ca. 0,5-5 ml/min. og ved en temperatur på fra 10 til 60°C, fortrinnsvis ca. 40°C. Ved å kontrollere den lineære 1-propanolkonsentrasjonsgradient ved de lave nivåene gitt ovenfor er det mulig å eluere TGF-polypeptider som vel-definerte topper av TGF-aktivitet i form av homogene polypeptider.

Med isolasjonsfremgangsmåten av oppfinnelsen er det mulig

å gjenvinne opptil ca. 70% av utgangs-TGF-aktiviteten i det urene startmateriale mens man oppnår grader av renselse på mer enn 200.000 fold. De homogene TGF-polypeptider fått ved isolasjons-prosessen av oppfinnelsen har typisk molekylvekter i området på ca. 5.000 til ca. 35.000 og er av tilstrekkelig renhet til å tillate dannelse av peptidsekvenser. Foretrukne homogene TGF-polypeptider som fås med fremgangsmåten av oppfinnelsen inkluderer TGF som har tydelige molekylvekter på 7.400, 20.000 og 30.000 til 35.000. Disse homogene TGF-polypeptider viser karakteristiske biologiske egenskaper av TGF-polypeptider når de anvendes på utransformerte, ikke-neoplastiske indikatorceller som vokser i kultur som inkluderer ervervelse av festepunkt-uavhengighet med resulterende evne til å vokse i bløt agar. Videre kan de homogene TGF-polypeptider brukes til å danne antistoffer (se nedenfor) som har verdi i oppdagelse og behandling av cancer og andre

proliferative sykdommer. I dette henseende er det ikke nødvendig at hver av formene av TGF blir renset til homogenitet for å kunne produsere antistoffer mot de forskjellige TGF-peptider. Disse forskjellige former av antistoffer mot TGF-polypeptidene

er også betraktet i denne oppfinnelse.

Antistoffer kan inkludere både monoklonale og polyklonale antistoffer dannet mot TGF-polypeptider av formel II gitt ovenfor, antigene oligopeptider fått fra TGF-polypeptidene av formel II og de homogene TGF-polypeptider fått ved å bruke isolasjonsfremgangsmåten av oppfinnelsen fra forskjellig transformerte cellelinjer og kroppsvæsker av pattedyr som bærer maligniteter eller transformerte celler. Antistoffene kan fremstilles på en rekke måter av kjent

metode, avhengig av om monoklonale eller polyklonale antistoffer er ønsket. For polyklonale antistoffer blir et virveldyr, typisk et husdyr, hyperimmunisert med antigen og blodet samlet kort etter gjentatte immuniseringer og gamma-globulinet isolert. Passende metoder for å fremstille polyklonale antistoffer er beskrevet i Handbook of Experimental Immunology, 3. utgave, Weir, Editor, Blackwell Scientific publi-cations, Oxford og London, 1978. For monoklonale antistoffer blir et lite dyr, typisk en mus eller rotte, hyperimmunisert med antigen, milten fjernet og lymfocyttene sammensmeltet med myelomceller i nærvær av en passende fusjonsfremmer. De resulterende hybridceller eller hybridomer blir filtrert for å isolere individuelle kloner, hvorav hver utskiller en enkel type antistoff mot antigenet. Den enkelte antistofftype som fås på denne måte er hver produktet av en enkelt B-celle fra det immune dyr dannet som svar på et spesifikt antigensted gjenkjent på det immunogene stoff. Den generelle fremgangsmåte for å få monoklonale antistoffer, inkludert de som følger oppfinnelsen, er beskrevet av Kohler og Milstein (1975) Nature 256,s.495-497. Polypeptidene og de antigene oligopeptider fremstilt ved oppfinnelsen kan anvendes direkte i immuniseringsfremgangsmåten eller de kan bindes til et passende bærerprotein idet man bruker metoder som er kjent i teknikken, f.eks. se US-patent 4.341.761 til Ganfield et al. Anvendelse av et bæreprotein er spesielt foretrukket når immuniseringen blir utført ved å bruke de antigene oligopeptider av oppfinnelsen.

Antistoffene kan brukes på en rekke måter.

I en foretrukket anvendelse kan de brukes for diagnose av maligniteter og andre proliferative sykdommer. I tilfeller hvor antigenet kan finnes i en fysiologisk væske eller ved en konsentrasjon som kan differensieres bare når malignitet eller andre proliferative sykdommer eksisterer, kan fysiologisk væske såsom serumplasma, fullblod eller cerebrospinalvæske prøves. Antistoffer anvendt i prøver kan være merket eller umerket. Umerkede antistoffer kan anvendes i agglutinasjon; merkede antistoffer kan anvendes i en lang rekke prøver, idet man anvender en lang rekke markører, såsom radionuklider, enzymer, fluorescerende stoffer, enzymsubstrater eller kofaktorer eller lignende. Disse teknikker er rikelig beskrevet i litteraturen og eksempelvise prøver kan finnes i US-patenter nr. 3.817.834; 3.935.074; 4.233.402 og 4.318.980, for å illustrere.

I noen teknikker vil det være nyttig å merke antigenet

eller fragmentet av dette, heller enn antistoffet, og ha en konkurranse mellom merket antigen og antigen i prøven om antistoff. I denne situasjon er det vanlig å frembringe kar som har kombinasjonen av det merkede antigen eller merkede fragment og antistoffet i mengder som gir optimum sensivitet og nøyaktighet.

I andre situasjoner er det ønskelig å ha en fast bærer hvor

enten antigen eller antistoff er bundet. Et polyepitopisk antigen kan tjene som en bro mellom antistoff bundet til en bærer og merket antistoff i prøvemediet. Alternativt kan man ha en konkurranse mellom merket antigen og et hvilket som helst antigen i prøven om en begrenset mengde av antistoff.

Hvor antigenet ikke kan finnes i en fysiologisk væske eller hvis funnet der, ikke.er diagnostisk for malignitet eller den mål-proliferative sykdom, da vil cellene måtte isoleres og cellene prøves for nærvær av antigen. For oppdagelse av antigen kan vevsprøven bli lysert ved konvensjonelle metoder, f.eks. base, rensemidler eller lignende, cellulære rester separeres ved filtrering eller sentrifugering og filtratet eller supernatanten isoleres og gjennomgår prøve.

For terapiformål kan enten xenogeneiske eller allogeneiske antistoffer anvendes, avhengig av behandlingens natur, og om de fremmede antistoffer vil indusere en immunrespons. Litteraturen har beskrevet et stort antall måter for å lage humane antistoffer, hvor man har funnet at mus eller andre pattedyr-antistoffer ikke er tilfredsstillende. Antistoffene kan anvendes på en lang rekke måter. Ved å anvende det passende IgG (andre enn IgG^) kan man indusere lysis gjennom den naturlige komplementprosess. Alternativt kan den lyserende del av toksin bli forenet med antistoffene, spesielt et Fab-fragment. Antistoffene kan bli bundet til liposomer for å rette liposomene mot de maligne cellene slik at de blir fordøyet av cellene ved sammensmeltning av membranene. Andre merker kan også bindes til antistoffene, slik som radionuklider, fluorescerende stoffer, enzymer og lignende. Ved å introdusere antistoffene in vivo vil antistoffene rette merkingen mot den maligne celle hvorpå nærvær av malignitet kan diagnosti-seres eller behandles.

Dannelsen av antistoffer vil variere sterkt, avhengig av naturen av merkingen, virkningen av antistoffene, stedet som antistoffene er rettet mot og lignende. Vanligvis vil antistoffene bli dannet i en fysiologisk akseptabel bærer, f.eks. saltløsning eller fosfatbuffer-saltløsning, og injisert inn i verten, når mulig på det ønskede sted, og når dette ikke er mulig inn i et sirkulerende system slik som blod.

Antistoffene kan også brukes for å isolere celler

som fremstiller TGF-polypeptider og til å fjerne celler in vitro fra en heterogen cellepopulasjon som inneholder celler som fremstiller et TGF-polypeptid. Separering kan oppnås med en fluorescens-aktivert cellesorterer (FACS).

Denne samme teknikk kan anvendes for å identifisere og

isolere celler som fremstiller et TGF-polypeptid. For å fjerne celler som fremstiller et TGF-polypeptid fra en blanding av celler kan de ansvarlige antistoffer kombineres med kompliment, bundet til det lyserende fragment (A-fragment) av et toksin

(se E.P.O.-søknad nr. 17.507 og britisk patentsøknad nr. 2.034.324)

eller cellene kan agglutineres og separeres på fysikalske måter.

Metodene og sammensetningene som anvender de

biologisk aktive, nye polypeptider og oligopeptider blir også frembragt for behandling av cancer og andre proliferative sykdommer og for terapiformer hvor cellevekstfremmelse er fordelaktig. Spesielt blir det fremskaffet sammensetninger som anvender oligo-

peptider av formel III ovenfor for behandling av maligniteter. Videre sammensetninger som inneholder biologisk aktive polypeptider av formler I, II og IIA for behandling av cancer og andre proliferative sykdommer og for anvendelse av cellevekstfremmelse, f.eks. helbredelse av skader og sårterapi gis også. Disse terapeutiske sammensetninger innbefatter effektive mengder av de angitte oligopeptider og polypeptider i blanding med farmasøytisk akseptable bærere. Spesielt vil farmasøytiske sammensetninger som inneholder oligopeptidene og/eller polypeptidene av oppfinnelsen som en aktiv ingrediens, normalt bli dannet med en passende faststoff- eller væskebærer avhengig av den spesielle administrasjonsmåte som brukes. For eksempel er parenterale utforminger vanligvis injiserbare væsker som anvender farmasøytisk og fysiologisk akseptable væsker slik som fysiologisk saltvann, balanserte saltløsninger eller lignende som en bærer. Orale utforminger på den annen side kan være faste stoffer, f.eks. tabletter eller kapsler eller væskeløsninger eller suspensjoner.

I de terapeutiske metoder kan oligopeptidene

og/eller polypeptidene administreres til mennesker på forskjellige måter såsom oralt, intravenøst, intramuskulært, intraperitonealt, intranasalt, intradermalt og subkutant. Den spesielle administrasjonsmåte og doseringskur vil bli valgt av den nærværende lege som tar i betraktning særegenhetene av pasienten, naturen av behandlingen som trengs, og/eller sykdommen og den involvertes sykdomstilstand. For eksempel blir ødelagt vev fra sår vanligvis behandlet ved daglige eller to ganger daglige doser over noen få dager til noen få uker; mens tumor eller cancerbehandling involverer daglig eller flere ganger daglige doser over måneder eller år. Oligopeptid og/eller poly-peptidterapien av oppfinnelsen kan kombineres med andre behand-linger og kan kombineres med eller anvendes sammen med andre kjemoterapeutiske eller kjemopreventive stoffer for å gi terapi mot proliferative sykdommer, neoplasmer eller andre tilstander som de er effektive mot.

TGF-oligopeptider, polypeptider og antistoffer dannet mot disse peptider er også effektive ved påvisning og behandling av bentapsykdommer. F.eks. er TGF-aktivitet til stede i det materiale som er ansvarlig for ben-resorberende aktivitet i tumorer som assosieres med hypercalcemi (Ibbotson et al. (1983) Science 221, 1292). Øket ben-resorpsjon kan være en endokrin effekt av TGF utsondret av tumorceller.

I tillegg stimulerer forhøyede nivåer av TGF ben-resorpsjon via kalsiumlekkasje, hvilket assosieres med slike sykdommer som osteoporose. Osteoporose er en sykdom som vanligvis ses hos eldre individer, som forårsaker bentap. Anvendelse av antistoffer mot TGF kan være indikative på eksistens av osteoporose. Derfor er TGF-antistoffer nyttige i analyse og terapi av denne betydelige sykdom.

En fremgangsmåte for påvisning av bentap i en menneskevert omfatter å bringe celler eller kroppsfluider i kontakt med et antistoff av TGF og bestemme nivået av binding av nevnte antistoff til nevnte celler eller celleprodukter i kroppen som diagnostisk for en vert med bentap. Det kan lages preparater for behandling av bentapsykdom, hvor det anvendes effektive mengder av oligopeptidene, polypeptidene eller antistoffer av TGF sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer for disse.

De følgende eksempler er gitt for å illustrere.

Eksempel 1

Produksjon/ rensing og karakterisering av

en lavmolekylvekt human- transformerende

vekstfaktor ( hTGF)

A. Eksperimentell fremgangsmåte

Kilde for hTGF

hTGF ble renset fra serumfritt medium kondisjonert ved en human metastatisk melanomlinje A2058 (Todaro et al., (1980) Proe.Nati. Acad. Sei. USA 77, s.5258-5262) fått fra en hjerne-metastase i en 43 år gammel mann. Celler ble dyrket til 90% sammenflytning i rundkolber som inneholdt Dulbecco's modified Eagle's medium (Grand Island Biological Co., 430-2100),tilsatt

10% kalveserum (Colorado Serum Co.,) ved 37°C. Cellene ble vasket i 1 time med 50 ml serum-fritt Waymouth's medium (Grand Island Biological Co., MD 705/1. Dette og en annen oppsamling

av supernatantvæske ble kassert 24 timer senere. Videre oppsamlinger ble gjort annen hver dag eller hver tredje dag over en 2 ukers periode.

Mediet ble oppsamlet ved dekantering, lagret i opp til

24 timer ved 4°C i nærvær av proteaseinhibitoren fenylmetan-sulfonylfluorid (1 ug/ml) og renset ved kontinuerlig strøm-sentrifugering ved 32.000 opm ved 4°C. Strømningshastigheter på 5 liter/time i CF-32 kontinuerlig strømningsrotor (Beckman) i modell L5-50 ultrasentrifuge (Beckman) ble anvendt. Supernatanten etter sentrifugering ved høy hastighet, vil bli referert til som A2058-kondisjonert medium.

Det A2058-kondisjonerte medium ble øyeblikkelig konsentrert i den hule fiber Dialyzer/Konsentrator (Model DC10, type H1095-20 cartridge, Amicron Corp.) ved 10°C. Konsentratet ble vasket etter en 150 gangers reduksjon i volum. Patronen ble vasket med 1000 ml Waymouth's medium. Ultrafiltratet ble kassert.

Rensing av hTGF

Dialyse og sentrifugering

Den kombinerte gjenværende del og patronvask etter ultrafiltrering av A2058-kondisjonert medium ble dialysert i 60 timer mot 0,1M eddiksyre i Spectrapor 3 dialysetube (Spectrum Medical

Industries). Den gjenværende del ble sentrifugert ved

100.000 x g i 1 time ved 4°C. Pelleten ble kassert. Supernatanten ble konsentrert ved lyofilisering og gjenoppløst i 0,5 ml IM eddiksyre/liter av opprinnelig A2058-kondisjonert medium.

Kromatografi på Bio- Gel P- 10

Etterfølgende konsentrasjon, dialyse og sentrifugering

ble supernatanten som inneholdt hTFG-aktivitet videre renset ved gel-permeasjons-kromatografi på en kolonne (2,5 x 85 cm)

(420 bed volum) av Bio-Gel P-10 (200-400 mesh, Bio-Rad Laboratories) . Kolonnen ble ekvilibrert med IM eddiksyre ved 22°C. Prøver på protein (65-115 mg) i IM eddiksyre (5 ml) ble tilsatt til kolonnen. For å sikre en konstant strømningshastighet ble kolonneutløpet regulert til 12 ml/time med en peristaltisk pumpe. 4,8 ml fraksjoner ble samlet. Alikvoter ble lyofilisert for etterfølgende bestemmelser av EGF-konkurrerende virkning og vekst-fremmende virkning i bløt agar. Fraksjoner som representerte hoveddelene av en gitt topp ble samlet og konsentrert ved lyofilisering.

Revers fase- høytrykks- væskekromatografi

Sluttrensningen av hTGF ble oppnådd ved revers fase HPLC ved å anvende den generelle fremgangsmåte beskrevet i Marquardt et al., (1981) J. of Biol. Chem. 256, s. 6859-6865. Alle separeringer ble utført på en yBondapak-C^g-kolonne (10 <y>m partikkelstørrelse, 0,39 x 30 cm, Waters Associates) ved en strømningshastighet på 1 ml/min ved 40°C. Lyofiliserte prøver ble gjenoppløst i 0,05% (v/v) trifluoreddiksyre i vann, justert til pH 2 med 10% (v/v) trifluoreddiksyre og tilsatt gjennom prøveinjektoren til kolonnen som var ekvilibrert med 0,05% trifluoreddiksyre. Kolonnen ble så eluert med en lineær acetonitril-gradient i 0,045% trifluoreddiksyre. Kolonneutløpet ble samlet i 1,5 ml fraksjoner. Alikvoter ble lyofilisert for etterfølgende EGF-konkurrering og vekststimuleringsprøver. Opp-samlingen av fraksjoner som innbefattet hoved-hTGF-aktiviteten ble konsentrert ved lyofilisering.

hTGF-inneholdende oppsamlinger ble gjenoppløst i 0,05% trifluoreddiksyre og rekromatografert på den samme kolonne,

på forhånd ekvilibrert med 0,05% trifluoreddiksyre i vann.

Kolonnen ble så eluert med en lineær 1-propanol-gradient i

0,035% trifluoreddiksyre. Kolonne-effluenten ble samlet i 1,5 ml fraksjoner. Alikvoter ble lyofilisert for EGF-konkurranse og vekststimuleringsprøver.

SDS- polyakrylamid- gelelektroforese

SDS-polyakrylamid-gelelektroforese ble utført som beskrevet

i Laemmli (1980) Nature (Lond) 227, s. 680-685. En 15-30% akrylamidgradientplate (140 x 120 x 0,75 mm) ble tillaget med en 4% gel lagt oppå. Gelene ble kjørt ved 30 volt med en elektrode-buffer som inneholdt tris (0,05M), glycin (0,38M) og SDS

(0,1 vekt/vol%) inntil sporfarven (bromfenolblått) hadde løpt ut av enden av gelen. Etter elektroforese ble gelene fiksert i 50% metanol, 10% eddiksyre i 2 timer, vasket i 5% metanol, 7% eddiksyre over natten, og farvet med sølv (Oakley et al., (1980)

Anal. Biochem. 105, s. 361-363.

Proteinbestemmelse

Totalt protein ble bestemt ved å bruke bovint serum-

albumin som standard. Forut for proteinbestemmelse ble utgangs-materialet dialysert mot fosfatbuffer-saltvann for å fjerne komponentene av kulturmediet som interfererte med farve-reaksjonen eller lyofiliserte hvis prøvene var blitt løst i flyktige syrer. Proteinet ble også bestemt ved aminosyreanalyse. Lyofiliserte prøver ble hydrolysert ved 110°C i 24

timer i uttømte Pyrex-tuber med 0,1 ml 6N HC1 som inneholdt 0,1% fenol i væskeform, og analysert med en Durrum D-500-analysator utstyrt med en PDP 8/A computing integrator som brukte o-ftalaldehyd til den fluorogene oppdagelse av primære aminer (Bensen et al., (1975) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 72,

s. 619-622).

Radioreseptorprøve

loe

Renset EGF ble merket med Na I ved en modifisering av kloramin-T-metoden som beskrevet i DeLarco et al., (1978)

Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75, s. 4001-4005. <125>I-EGF-bindings-prøven ble utført på subkonfluente monolag av formalin-fiksert A431 humane carcinom-celler som tidligere beskrevet (i DeLarco et al., (1980) J. of Biol. Chem. 255, s. 3685-3690). De fikserte cellene ble vasket to ganger med 0,5 ml av bindende buffer (Dulbecco's modifiserte Eagle's medium som inneholdt 1 mg/ml

av bovint serum-albumin og 50 mM 2-[bis(2-hydroksyetyl)amino]-etansulfonsyre, pH 6,8). Konkurranse ble initiert ved tilsetning av 0,2 ml av bindende buffer som inneholdt 0,4 ng av 125

I-EGF med eller uten potensial inhibitor. Etter inkubering

i 1 time ved 22°C ble den spesifikt bundne 12<5>I-EGF bestemt. TGF-innholdet ble uttrykt ved dens grad av inhibering av binding

125

av I-EGF til EGF-reseptoren. En EGF-konkurrerende aktivitets-enhet er definert som mengden av protein som inhiberer bindingen

125

av I-EGF til dens reseptor med 50%.

Bløt- agarveks tprøve

Prøven for kolonivekst i bløt agar som bruker normal rotte-nyre-fibroblaster, klone 49F, ble utført som gjengitt i Todaro et al., (1980) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77, s. 5258-5262. Lyofiliserte prøver som skulle testes ble gjenoppløst i 0,5 ml av Dulbecco's modifiserte Eagle's medium anriket med 10% kalveserum. 1,5 ml av 0,5% (w/v) agar (Difco) i det anrikede mediet og 0,5 ml av anriket medium som inneholdt 2,3 x 10 4 celler, ble tilsatt. 2,3 ml av den resulterende blanding ble pipettert på et 2 ml basislag (0,5% agar i anriket medium) i 60 mm Petri-skåler (Falcon). Cellene ble inkubert ved 37°C i en fuktig 5% C02/9 5% luftatmosfære. Prøven ble avlest ufiksert og ufarvet ved 5 dager og ved 10-14 dager.

B. Resultater

Kilde, konsentrasjon og utgangs-

fraksjonering av hTGF

hTGF ble isolert fra serum-fritt kondisjonert medium av den sterkt transformerte humane metastatiske melanom-cellelinje, A2058. Mengden av hTGF ble basert på to av dens egenskaper: evnen til å indusere festepunkt-uavhengig vekst av normale rotte-nyre-fibroblaster i bløt agar, og evnen til å konkurrere med <125>I-EGF om EGF-reseptorstedene på A431 humane carcinom-celler. Et sammendrag av skrittene som fører til isoleringen av hTGF og dets gjenvinnelse er presentert i tabell I.

For å fjerne serumproteiner ble A2058-celler sterkt vasket med Waymouth's medium før de ble kultivert i serum-fritt medium. Supernatantvæskene ble samlet annen hver dag over en 2 ukers periode. Kulturbetingelsene var slik at ved enden av kultur-perioden var mere enn 90% av cellene fortsatt levende og festet seg som monolag.Det initielle oppklarede A2058-kondisjonerte medium på 136 liter, som inneholdt 1,02 g av totalt protein og 4525 enheter av EGF-konkurrerende aktivitet, ble konsentrert til omtrent 900 ml ved å bruke en hul fiberkonsentrator med patroner på 5000 molekylvekt cutoff. Den totale EGF-konkurrerende aktivitet ble bevart og en gjenvinning over 9 5% ble oppnådd.

Dialyse av det konsentrerte A2058-kondisjonerte medium mot eddiksyre og påfølgende sentrifugering resulterte i 95% gjenvinning av den initielle totale EGF-konkurrerende aktivitet.

18% av proteinet var syre-uløselig og ble kastet. Det syre-løselige, delvis rensede hTGF ble underkastet gelpermeasjons-kromatograf i på Bio-Gel P-10. Kolonnen ble eluert med IM eddiksyre. Hovedmengden av det forurensende protein ble eluert i ekslusjonsvolumet av kolonnen og også separert fra den EGF-konkurrerende virkning og vekst-stimulerende virkning. To aktivitetstopper ble funnet å være godt løst fra hverandre. Fraksjoner med både EGF-konkurrerende og vekst-stimulerende virkning (P-10-A og P-10-B) hadde tydelige molekylvekter på

10.500 og 6.800, resp. Fraksjoner som bare hadde én av de to virkninger, ble ikke observert. hTGF-inneholdende fraksjoner ble samlet som angitt, lyofilisert, og videre renset. Den større molekylvekt TGF som ble eluert fra kolonnen i en bred topp (P-10-A) — viste seg å være assosiert med polypeptider av forskjellige størrelser. P-10-A inneholdt 46% av den initielle EGF-konkurrerende aktivitet. Den mindre molekylvekt TGF som ble eluert fra kolonnen i en skarp topp (P-10-B) — representerte 4 5% av den initielle totale EGF-konkurrerende aktivitet. Det oppsamlede utbytte av total input EGF-konkurrerende aktivitet fra skritt 1 gjennom gelpermeasjonkromatografiskrittct var 91% (tabell I).

hTGF ble eluert som to distingte hovedtopper som varierte kvantitativt fra én fremstilling til en annen. I noen fremstillinger av A2058-kondisjonert medium var i hovedsak all vekstfremmende aktivitet i hTGF-området.

Rensing av hTGF

hTGF ble videre renset med revers fase PHLC. Den samlede P-10-B ble etter gelpermeasjonskromatografi av den syreløselige EGF-konkurrerende aktivitet av konsentrert A2058-kondisjonert medium på Bio-Gel P-10 gjenoppløst i 0,05% trifluoreddiksyre i vann og så kromatografert på en yBondapak C^g-kolonne. EGF-konkurrerende og vekst-stimulerende aktiviteter i bløt agar av individuelle fraksjoner ble bestemt. hTGF ble godt separert fra hovedmengden av det forurensende protein som eluerte ved høyere konsentrasjoner av organisk løsningsmiddel. Fraksjoner som inneholdt hTGF, ble samlet, lyofilisert, og rekromatografert. En 57 gangers rensing av hTGF etter gelpermeasjonskromatografi ble oppnådd. 80% av den initiale EGF-konkurrerende aktivitet i samlet P-10-B ble gjenvunnet (tabell I).

Rekromatografi av de hTGF-inneholdende fraksjoner på yBondapak C-^g-bærer ble valgt for sluttrehsingsskrittet siden bare relativt små tap av EGF-konkurrerende aktivitet ble observert på disse kolonner. For å få en klar adskillelse av hTGF fra uren-heter var det nødvendig å bruke en grunn lineær 1-propanol-gradient i 0,035% trifluoreddiksyre. Hovedmengden av forurensende peptidmateriale ble separert fra en veldefinert aktivitets-topp. EGF-konkurrerende og vekst-stimulerende aktiviteter ble renset sammen med en klar absorberingstopp ved 13% 1-propanol. Fraksjoner som inneholdt hTGF ble samlet og videre analysert. Rensingen av hTGF var tilnærmet 7000 ganger etter gelpermeasjons-kromatografi med et utbytte på 33% av den initielle totale EGF-konkurrerende aktivitet. Den fullstendige gjenvinnelse av hTGF fra skritt 3 gjennom det siste revers fase HPLC-skrittet var 73% og gjenvinningsområdet pr. skritt var 80-100% (tabell I).

Karakterisering av hTGF

Renheten av den siste hTGF-fremstillingen ble bestemt ved analytisk SDS-polyakrylamid gel-elekroforese. Gelen ble farvet med sølv. Én hovedpolypeptidbinding med en tydelig M^. = 74 00

ble observert. Det samme mønster ble oppnådd når prøver ble tatt etter elektroforese under ikke-reduserende betingelser som indikerte at TGF er et enkeltkjedet molekyl.

Reseptor-reaktiviteten av hTGF ble sammenlignet med EGF i radioreseptorprøven. Kvantiseringen av hTGF var basert på aminosyreanalyse av en medfølgende alikvot. Både hTGF og EGF og <125>I-EGF konkurrerte for EGF-reseptorstedene på A431 humane carcinomceller som vist i fig. 3A. Den spesifikke EGF-konkurrerende aktivitet av hTGF ble funnet å være 1-1,5 x 10 g enheter pr. mg; 1,1 ng av hTGF eller EGF var nødvendig for å inhibere EGF-binding med 50%.

hTGF gjorde normale festepunkt-avhengige rottenyreceller, klone 49F, i stand til å vokse i bløt agar. Det halv-maksimale svar av hTGF i bløt agar ble nådd med 1 EGF-konkurrerende enhet, eller 1,1 ng av hTGF, mens EGF ikke stimulerer vekst av disse celler i bløt agar selv når de blir testet med onp til 10 yg.

Eksempel 2

Større skalaproduksjon, rensing og aminosyre-

sekvensering av human ( hTGF), rotte ( rTGF), og mus ( mTGF)- transformerende vekstfaktorer

A. Eksperimentelle fremgangsmåter

Kilde for TGF

rTGF, mTGF og hTGF ble renset fra serum-fritt medium kondisjonert med Fisher-rotte-embryofibroblaster, FRE C110, en subklone av FRE 3A (Sacks et al., (1979) Virology 97, s. 231-240), ikke-produktivt transformert ved Snyder-Theilen felin sarkom-virus (Snyder et al., (1969) Nature (Lond) 221, s. 1074-1075),

en Moloney murin sarkomvirus-transformert 3T3 cellelinje,

3B11-1C (Bassin et al., (1970) Int. J. Cancer 6, s. 95-107), og to humane metastatiske melanomlinjer, A2058 (se eks. I), og A375 (Girad et al., (1973) J. Nati. Cancer Inst. 51, s. 1417-1423), resp. Celler ble dyrket i 2-liters plastikkrundkolber som inneholdt Dulbecco's modifiserte Eagle's medium anriket med 10% kalveserum og deretter holdt i serum-fritt Waymouth's medium som beskrevet i DeLarco et al., (1978) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75, s. 4001-4005. Serum-fritt kondisjonert medium ble samlet hver 24 time i en 3-dagers periode, oppklaret ved kontinuerlig strømningssentrifugering og supernatanten konsentrert (Marquardt et al., (1980) J. of Biol. Chem. 255, s. 9177-9181). Konsentratet av kondisjonert medium var startmaterialet for rensingen av TGF.

Rensing av TGF

TGF ble fremstilt hovedsakelig ved metodene tidligere beskrevet i Eksempel I for rensing av hTGF fra melanom. Den tilbakeholdte del etter ultrafiltrering av kondisjonert medium ble dialysert mot 0,1M eddiksyre, og supernatanten etter sentrifugering konsentrert ved lyofilisering og gjenoppløst i IM eddiksyre for påfølgende gelpermeasjonskromatografi på en kolonne (2,5 x 85 cm) av Bio-Gel P-10 (200-400 mesh, Bio-Rad Laboratories). Kolonnen ble ekvilibrert med IM eddiksyre. Fraksjoner som innbefattet hoved-EGF-konkurrerende aktivitet med en tydelig molekylvekt på ca. 7.000, ble samlet og lyofilisert.

Sluttrensingen av rTGF, mTGF og hTGF ble oppnådd ved revers fase HPLC ved å bruke kromatografisystemet som beskrevet i eks. I. Separasjonene ble utført på en yBondapak-kolonne (10 ym partikkel-størrelse, 0,39 x 30 cm, Waters Associates). Den mobile fase var 0,05% trifluoreddiksyre, og den mobile fase-modifiserer var acetonitril som inneholdt 0,045% trifluoreddiksyre. Konsentrasjonen av acetonitril ble økt lineært (0,083%/min) i løpet av 2 timer ved en strømningshastighet på 1 ml/min ved 4°C for eluering av peptider. TGF-inneholdende oppsamlinger ble lyofilisert og gjenløst i 0,05% trifluoreddiksyre og rekromatografert på den samme kolonne, idet man som den mobile fase-modifiserer brukte 1-propanol som inneholdt 0,035% trifluoreddiksyre. 1-propanol-konsentrasjonen ble økt lineært (0,05%/min) i løpet av 2 timer ved en strømningshastighet på 1 ml/min ved 40°C. Oppsamlinger av fraksjoner som innbefattet hoveddelen av EGF-konkurrerende aktivitet, ble lyofilisert.

Prøve for TGF

TGF ble kvantifisert i en radioreseptorprøve basert på reseptor-kryssreaktivitet med submaxillar kjertel-epidermal-

125 vekstfaktor fra mus (mEGF). Renset mEGF ble merket med Na I ved modifisering av kloramin-T-metoden som beskrevet i eksempel I. 125

I-EGF-bindingsprøven ble utført på formalin-fikserte A431 humane carcinomceller, 8 x 10"^ i Micro Test II-plater (Falcon) . Konsentrasjonen av TGF ble uttrykt i mEGF ng ekvivalenter/ml og var basert på mengden av TGF som var nødvendig for å produsere

125

lik inhibering av I-EGF-binding til A4 31-celler som en k^ent

mengde av umerket mEGF.

Aminosyresekvensbestemmelse av TGF

For aminosyresekvensanalyse ble rTGF (3 ug) redusert med ditiotreitol (20 mM) i 100 1 av tris-HCl-buffer (0,4M) som inneholdt guanidin-HCl (6M) og Na2~EDTA (0,1%), pH 8,5, i 2 timer ved 50°C og påfølgende S-karboksamidometylert med jodacetamid (45 mM) i 30 min. ved 22°C. Den S-karboksamidometylerte rTGF ble avsaltet på en uBondapak C^g-kolonne. Peptid ble eluert med en gradient av vandig acetonitril som inneholdt 0,04 5% trifluoreddiksyre. Konsentrasjonen av acetonitril ble økt lineært (1%/min) i løpet av 1 time ved en strømningshastighet på 1 ml/min ved 40°C.

Automatisert sekvensanalyse (Edman et al., (1967) Eur. J. Biochem. 1, s. 80-91) av S-karboksamidometylert rTGF og umodi-fisert mTGF og hTGF ble utført med en gassvæske-fastfase-mikro-sekvenator (Hewick et al., (1981) J. of Biol. Chem. 256, s. 7990-7997) . Sekvenatorfraksjoner ble analysert ved revers fase HPLC (Hunkapiller et al., (1983) Science 219, s. 650-659).

B. Resultater

Rensning av TGF

Rensede fremstillinger av lavmolekylvekt rTGF, mTGF og hTGF ble oppnådd fra det kondisjonerte medium av retrovirus-transformerte rotte- og mus-fibroblaster og to humane melanom-cellelinjer, resp. Rensingen ble oppnådd ved gelpermeasjons-kromatografi av den syreløselige EGF-konkurrerende aktivitet på Bio-Gel P-10 i IM eddiksyre, fulgt av revers fase HPLC på uBondapak C-^g-bærer som brukte sekvensielt en lineær gradient av vandig acetonitril og deretter 1-propanol som inneholdt 0,035% trifluoreddiksyre. Elueringsmønstrene av det siste rensnings-skrittet for rTGF, mTGF og hTGF viser at EGF-konkurrerende aktivitet renset sammen med en distinkt absorberingstopp, ble effektivt adskilt fra forurensende UV-absorberende materiale. Hovedproteintoppen i rTGF, mTGF og hTGF-fremstiIlinger eluerte fra en uBondapak C-^g-kolonne under standardbetingelser mellom 4 8 og 55 min.

Gelpermeasjonskromatografi på Bio-Gel P-10 besørget en separering av lavmolekylvekt-TGF fra større molekylvekt-TGF og reduserte mengden av protein tilsatt til en uBondapak C^g-;olonne i det følgende rensingsskritt. Små molekylvekt-TGF representerte 45-80% av den initielle totale EGF-konkurrerende iktivitet. Revers fase HPLC av TGF på uBondapak C-^g-bærer i de følgende to rensningsskritt var meget effektiv, idet hver i en typisk fremstilling ga et gjenvinningsområde på 80-100% pr. skritt. Den siste gjenvinningen av lavmolekylvekt-TGF var tilnærmet 70%, basert på den maksimale totale EGF-konkurrerende aktivitet oppdaget i løpet av rensingen. Gjennomsnittsutbytte av renset rTGF var 90 ng/liter, av mTGF 50 ng/liter og av hTGF

LO ng/liter av kondisjonert medium. Denne utregning er basert

?å den spesifikke aktivitet bestemt for isolert TGF og på antagelsen at EGF-konkurrerende aktivitet målt i radioreseptor-orøven, gir bare et bilde av nivået av total stor og liten nolekylvekt-TGF. Ingen immunoreaktiv mEGF ble oppdaget i kondisjonert medium.

Renhet av TGF

Renheten av rTGF, mTGF og hTGF angitt ved de kromatografiske elueringsprofiler, ble prøvet i EGF-radioreseptorprøven og ved aminosyresekvensanalyse. rTGF, mTGF og hTGF konkurrerte med <125>I-EGF for EGF-reseptorstedene på A4 31 humane carcinomceller og kunne kvalitativt og kvantitativt nesten ikke skilles fra mEGF. Derfor har man trodd at de siste TGF-fremstillinger var høyt renset og hovedsakelig homogene. En enkelt amino-terminal-sekvens ble bestemt ved automatisert Edman-degradering for rTGF, mTGF og hTGF. En hvilken som helst ublokkert minor peptidsekvens til stede ved >5% kunne ha blitt oppdaget ved metodene som ble anvendt. Homogeniteten av hTGF ble i tillegg stadfestet ved analytisk natriumdodecylsulfatpolyakrylamid-gelelektroforese.

Det rensede preparat gav én hovedpolypeptidbinding.

Aminosyresekvensering av TGF

Den fullstendige sekvensering av rTGF, mTGF og hTGF ble fullført, og aminosyresekvensene for de tre polypeptider er gitt nedenfor. Det vil bli lagt merke til fra sekvensene som er gjengitt, at rTGF og mTGF er identiske i kjemisk oppbygning og videre at reell homologi eksisterer mellom murin-TGF og hTGF

med forskjellige aminosyrerester som forekommer bare i posisjoner

7, 15, 28 og 41 i sekvensene.

(1) rTGF

(2) mTGF (3) hTGF

Eksempel 3

Produksjon av TGF in vivo og dets isolering Tumorcellelinjer (1 x 10 ) kjent for å produsere TGF (humant melanom og transformert rotte) ble inokulert i atymisk "nakne" mus og tumorer fikk anledning til å utvikles. Urin fra de tumor-bærende mus ble samlet og analysert for nærvær av TGF idet man brukte isolasjonsprosedyren og analytiske teknikker gitt i eksempel 1 ovenfor. TGF ble oppdaget i urinen av de tumor-bærende mus, som har den samme størrelse og elueringsegenskaper på HPLC som cellekulturen fått fra TGF som er beskrevet i eksempel 1 og 2 ovenfor. Videre, idet man anvendte fremgangsmåten beskrevet i eksempel 1 ovenfor, ble TGF til stede i museurin funnet å ha de karakteristiske TGF-biologiske egenskaper, ved at den stimulerer festepunkt-uavhengig vekst av celler og binder seg til EGF-reseptoren. Videre ble tumorene fjernet fra de tumor-bærende mus, og urinen fra musene etter at tumoren var fjernet ble testet for nærvær av TGF, idet man anvendte de ovenfor nevnte fremgangsmåter. I dette tilfelle ble det ikke funnet noe TGF

som hadde de karakteristiske elueringsegenskaper på HPLC eller TGF-lignende biologisk aktivitet. Disse resultater demonstrerer at tumorceller produserer TGF i levende dyr like meget som i cellekulturer, og at TGF kan oppdages i og isoleres fra kroppsvæsker ved å bruke fremgangsmåten av oppfinnelsen. Lignende eksperimenter ble også utført med rotter som hadde kjemisk carcinogen-induserte tumorer, og de ble funnet å ha TGF i urinen, basert på de biologiske og biokjemiske egenskaper satt opp nedenfor, mens ubehandlede rotter ikke hadde det.

Eksempel 4

Inhibering av retroviral transformert

cellevekst in vitro med antistoffer

mot antigen TGF oligopeptid

Et oligopeptid som har den følgende aminosyresekvens

(som tilsvarer aminosyresekvenser 34 til 50 av rotte-TGF): Cys-His-Ser-Gly-Tyr-Val-Gly-Val-Arg-Cys-Glu-His-Ala-Asp-Leu-Leu-Ala

ble syntetisert ved å bruke fast-fase-teknikken av Ohgak et al.,

(1983) Journal of Immunol. Meth. 57, s. 171-184. Dette oligopeptid ble så koblet til nøkkel-limpet-hemocyanin i henhold til fremgangsmåten til Baron et al., (1982) Cell 28, s. 395-404, og anvendt til å immunisere kaniner (Baron et al., (1982), cell 28, s. 395-404) og sauer (Lemer (1982) Nature 299, s.592-596). Antisera ble prøvd mot peptid ved hjelp av en peroksydase-bundet immunoassay (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersberg, MD) og mot homogen rotte-TGF (renset i henhold til eksempel 2 ovenfor) ved immunopresipitasjon (Bister et al., (1980) J. Virol. 36,

s. 617-621) og Western blotting techniques (Burnett (1981) Analyt.

12 R

Biochem. 112, s. 195-203). Binding av -I-merket rotte-TGF og muse-EGF (Bethesda Research Labs, Bethesda, MD) til A431-celler dyrket i 96-brønn-mikrotiter-plater, var som beskrevet i Pruss et al., (1977) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74, s. 3918-3921. Antisera fremstilt i én rotte og to sauer reagerte med det tilsvarende peptid i peroksydase-bundne immunoassays i titere på minst IO<4>. Reaksjoner av kanin-antiserum med rotte-TGF ble dokumentert ved immunopresipitasjon og stadfestet ved Western blotting. Antipeptid antisera sammen med jodinert muse-EGF gav ikke immunopresipitat i dette studium.

Humane epidermoid A431-celler har i overskudd av 10 g EGF-reseptorer pr. celle (Fabricant et al., (1977) Proe.Nati. Acad. Sei. USA 74, s. 565-569). TGF konkurrerer med EGF for binding

til disse reseptorer. Binding av <1>25I-merket rotte-TGF til disse celler ble blokkert ved et overskudd av umerket EGF og ved antiserum til peptid. En blokkerende effekt av antiserum på TGF-binding ble observert selv om antistoff-TGF-komplekset ikke ble fjernet fra mediet som omgav A431-cellene ved S. aureus protein A-fasilitert immunopresipitasjon. Blokkering ved hjelp av antistoffet var et resultat av interaksjon med TGF-molekylet heller enn med reseptoren, siden antisera ikke reagerte i immuno-presipitas jonsprøver med renset jodinert EGF-reseptor. Som man regnet med fra immunopresipitasjonsdata interfererte antiserum mot peptid ikke med binding av murin EGF til A431-celler.

Med anvendeligheten av antisera som blokkerte cellulær binding av TGF men ikke EGF, var det mulig å teste om TGF-funksjoner ved en autokrin mekanisme stimulerer veksten av maligne celler og om antistoff således kan inhibere slik vekst in vitro. Følgelig ble utransformerte normale rottenyreceller (NRK) og en rekke retrovirale cellelinjer platet ut ved lave tettheter (500 til 2.000 celler pr. skål) i serum-inneholdende medium, og etter en kort periode med vedhengning ble de flyttet til serumfritt medium. Sau- eller kanin-antistoff mot TGF-peptid eller mot forskjellige uvedkommende ikke-kryss-reagerende peptider ble tilsatt til mediet, og virkningen på cellevekst, på mikro-skopisk og makroskopisk kolonidannelse og på kolonimorfologi ble observert. Alt antistoff ble affinitetsrenset på peptidkolonner, ekstensivt dialysert, konsentrert og gjenoppløst til en antipeptid-titer på 10 til 10 . Resultatene er gitt i tabell II nedenfor. Som det sees i tabell II ovenfor inhiberte hverken kanin eller sau - anti-TGF oligopeptid kolonidannélse ved NRK-celler, men innen 4 8 timer inhiberte de vekst av Kirsten-transformerte NRK-celler, felin-sarkom-virus-transformerte rotte-embryofibroblaster (CLIO-celler) og Rous-sarkom-virus-transformerte 3T3-celler. CLlO-celler var kjent å være produktive produserere av TGF (Marquardt et al., (1983) Proe. Nati. Acad. Sei.USA 80, s.4684-4688) . De få overlevende koloniene i anti-TGF antistoff-behandlede celler tenderte til å være mindre og manglet det robuste utseende av normale kolonier. Ikke-adherente ulyserte celler fløt fritt i mediet. Denne inhibering ble delvis reversert når TGF-peptidet, men ikke når ikke-kryss-reagerende uvesentlig peptid, ble tilsatt samtidig med antistoff til TGF. Kanin- og sau-antistoff mot fire forskjellige ikke-kryss-reagerende peptider hadde ingen virkning på vekst av kolonier av NRK eller retrovirale transformerte cellelinjer. Utskiftning av antistoff-inneholdende medium med ferskt antisoff-fritt medium etter 72 timer utelot å reversere inhiberingen av kolonidannélse, men de overlevende kolonier vokste kraftig.

Eksempel 5

Syntese og karakterisering av rotte- TGF

Den kjemiske syntese av rotte-TGF (rTGF), som har den kjemiske formel gitt i eksempel 2, ble utført manuelt ved skritt-vis faststoff-fasetilnærming i henhold til de generelle prin-sipper beskrevet av Merrifield (1963) J. Amer. Chem. Soc. 85,

s. 2149-2156. Den differensielle syre-labile beskyttergruppe-strategi ble tilpasset for denne syntese med den konvensjonelle kombinasjon av tert.-butyloksykarbonyl for N-amino terminus og benzylalkoholderivater for sidekjedene. En mer syre-stabil benzylesterbinding som festet beskyttet aminosyrer til den polymere bærer, ble anvendt for å minimalisere tap ev peptider i løpet av de gjentatte syrebehandlinger (Mitchell et al., (1976) J. Amer. Soc. 92, s. 7357-7362). Fullstendig deproteksjon og fjernelse av peptid fra harpiksen var ved lav-høy HP-metoden av Tam et al., (1982) Tetrahedron Lett. 23, s. 4435-4438, som var forskjellig fra den konvensjonelle HF-deproteksjonsmetode og fjernet benzyl-beskyttende grupper ved SN2-mekanismen i fortynnet HF-løsning for å minimalisere alvorlige sidereaksjoner forårsaket av karbokationer som oppsto i den konvensjonelle SNl-deproteksjonsmetode. Videre har.den også til hensikt å redusere mange cysteinyl-reaksjoner som ofte hindrer syntesen av proteiner som inneholder multiple disulfidbindinger.

Etter HF-behandling og forut for noen rensning ble den uferdige og reduserte syntetiske rTGF oksydert og gjenoppløst ved den blandede disulfidmetode i nærvær av en kombinasjon av redusert og oksydert glutation (Ahmed et al., (1975) J. Biol. Chem. 250,

s. 8477-8482). Dette hindret dannelse av polymere materialer i løpet av renselsen. Det gjenoppløste, uferdige rTGF-I inneholdt 40-50% av EGF-radioreseptor og tyrosin-spesifikt protein-kinase-aktiviteter sammenlignet med det naturlige rTGF-I.

Uferdig syntetisk rTGF-I ble renset til homogenitet i tre skritt: (1) gelfiltrering på en Bio-Gel P-10-kolonne; (2) ioneutvekslings-kromatografi på en CM-Sephadex-kolonne og (3) forberedende høy-trykksvæskekromatografi (HPLC) på en C-18 revers fasekolonne.

Et totalt utbytte, basert på start-tilsetning av Ala til harpiks, var 31%.

Under reduserende eller ikke-reduserende betingelser ble det rensede, syntetiske rTGF-I funnet å gi en enkelt binding med en tilsynelatende M.W. på 7.000 på SDS-PAGE-elektroforese. Aminosyreanalyse ved 6N HC1 og enzymatisk hydrolyse gav det forventede teoretiske molare forhold av den antatte sekvens.

Ikke noe fritt tiol ble oppdaget ved Ellman's metode av sulf-hydrylbestemmelse på syntetisk rTGF, men ved tiolytisk reduksjon fikk man den forventede teoretiske verdi på seks cysteiner.

Disse funn understøtter konklusjonen at syntetisk rTGF er et enkeltkjedet polypeptid som inneholder seks cysteiner i disulfidbroer, som er i overensstemmelse med de forventede kjemiske egenskaper av det naturlige rTGF. I tillegg eluerte syntetisk rTGF sammen med det naturlige rTGF som en enkelt symmetrisk topp i C-18 revers fase HPLC.

Syntetisk rTGF fremstilt i henhold til dette eksempel ble sammenlignet med naturlig rTGF i tre prøver for biologiske egenskaper av den antatte transformerende vakstfaktor. I mitogen-prøven ble stimulering av vekst av serumfattige normale rottenyreceller ved rTGF målt ved inkorporering av <125>I-jod-deoksyuridin.

I bløt agar-prøven i nærvær av fetalt bovin-serum og et annet TGF, TGF-3, kunne de morfologiske og fenotypiske forstyrrelsene ved rTGF måles kvantitativt ved kolonidannélse i bløt agar.

Den siste transformerende prøve er blitt vist å korrelere godt med tumorigenisitet (Stoker et al., (1968) Int. J. Cancer 3,

s. 683-693). Fetalt bovin-serum eller TGF-3 alene induserer ikke transformering av NRK-celler i kultur. På samme måte produserer ikke TGF, naturlig eller syntetisk, noen slik virkning i fravær av TGF-3- Både syntetisk og naturlig rTGF fremviste like dose-responskurver og halv-maksimalaktiviteter i disse to prøver.

Siden rTGF konkurrerer med mEGF for binding av EGF-reseptorer på cellulære membraner, ble syntetisk rTGF sammenlignet med det naturlige rTGF for binding på A431 humane carcinomceller. Igjen ble responsen og aktivitetene av det naturlige syntetiske rTGF funnet å være uadskillelig fra hverandre. Konsentrasjonen

125

som var nødvendig for 50% inhibering av I-EGF-binding, ble funnet å være 3,5 og 4,1 nM for det naturlige og syntetiske rTGF, resp. En konsekvens av TGF eller EGF-binding til EGF-membran-reseptorene er stimulering av fosforylering av tyrosinrester av

syntetiske peptider eller endogene substrater (Pike et al.,

(1982) J. Biol. Chem. 257, s.. 14628-14631). Syntetisk rTGF

ble funnet å stimulere fosforyleringen av syntetisk angiotensinyl-peptidsubstrat med en halv-maksimal aktivitet på 0,3 nM, en aktivitet sammenlignbar med verdien for naturlig rTGF, rapportert ved Reynold et al., (1981) Nature 292, s. 259-261).

Eksempel 6

Sårhelinq under anvendelse av TGF

Human-EGF (hEGF), rotte-TGF, analog human TGF, naturlig vaccinia virus, vekstfaktor (VGF) og rekombinant VGF ble anvendt i en sårhelingstest, i henhold til nedenstående fremgangsmåte, Sor å bestemme helingseffektene til hver faktor på annengrads forbrenninger. Rotte-TGF ble syntetisert som beskrevet ovenfor i eksempel 5, og hadde den kjemiske formel som er gitt i eksempel 2. Analogen til human-TGF, som ble fremstilt under anvendelse av standard-rekombinant-teknikker, hadde følgende aminosyresekvens:

Naturlig VGF ble renset som beskrevet nedenunder i

eksempel 15. Rekombinant VGF ble også produsert under anvendelse av standard rekombinant-teknikker. Det naturlige VGF er et 25 kd protein som inneholder følgende aminosyresekvens som faller innen omfanget av formel I ovenfor:

Den fulle aminosyresekvens for VGF-molekylet som er renset som beskrevet nedenunder i eksempel 15 (og det som er uttrykt via rekombinant-teknikk) er som følger:

Tre hun-smågriser som veide tilnærmet 4,5 kg hver ble anestetisert med Ketamine og Rompum, og deres rygger ble barbert og det gjenværende hår totalt fjernet med en kommersiell hår-fjerningskrem. En messingskabelon (3x3 cm, 147 gram) ble likevektsinnstilt i et 70°C vannbad og så anbragt i fast kontakt med den bare hud i nøyaktig 10 sekunder. 5 sår ble laget på hver side av ryggsøylen og i en avstand av tilnærmet 2,5 cm fra hverandre. Toppen av hver resulterende blemme ble fullstendig fjernet, og sårene ble behandlet to ganger pr. dag med Silvadene alene, Silvadene inneholdende én av vekstfaktorene, eller ble ikke behandlet. Smågrisene fikk spise og drikke etter ønske.

Etter 9 eller 10 dager ble smågrisene anestetisert og skorpen fra hvert brannsår fjernet. Alle brannsår ble foto-grafert, og det ble tatt en punch-biopsi innenfor hvert brannsår.

Følgende tabell indikerer den tilnærmede prosent av hvert brannsår som ble epitelialisert ved hjelp av visuell bedømmelse.

Som vist i tabell III, var TGF svært effektivt med hensyn

til å hele sår, sammenlignet med de ubehandlede kontrollprøver eller endog sammenlignet med Silvadene alene.

Eksempel 7

Sårhelina

Et annet eksperiment ble utført for å måle effekten av den analog til human-TGF som er beskrevet ovenfor, på heling av annengradsforbrenninger. De eksperimentelle betingelser var lik dem som er beskrevet ovenfor. Imidlertid ble følgende endringer gjort i metodene: Én Yorkshire-smågris ble anestetisert med Ketamine, og hvert av 12 brannsår ble laget ved hjelp av skabelonen i 11 sekunder pr. brenning. Etter at hver blemme ble fjernet,

ble sårene behandlet én gang pr. dag med et av følgende:

a. l ug/ml av TGF i Silvadene; b. 0,1 ug/ml av TGF i Silvadene; c. ubehandlet; d. Silvadene alene;

e. l ug/ml av hEGF i Silvadene; og

f. 0,1 ug/ml av hEGF i Silvadene.

Etter 7 dager ble brannskorpen fjernet. Prosent sårheling, beregnet ut fra planimetriresultater, er vist nedenunder. TGF var svært effektivt som sårhelende middel.

Eksempel 8

Hornhinnesårheling av rTGF

A. Fremstillin<g> av rTGF- polypeptid

TGF-polypeptidet ble syntetisert basert på den aminosyre-sekvens som er rapportert i eksempel 2 ovenfor, for TGF renset fra det kondisjonerte medium av Fisher-rotte-embryo-fibroblaster transformert med felin sarcoma virus. Den kjemiske syntese av rTGF ble utført som beskrevet i eksempel 5 ovenfor.

B. Fremstilling av behandlingsblanding

rTGF~cx-polypeptidet ble kombinert med isotonisk (285 m osmol) steril fosfatpufret saltløsning (pH 7,4) ved en konsentrasjon på 50 ng/ml.

C. Hornhinne- stromal- innsnitt

Totalt gjennomtrengende innsnitt med lengde 5 mm, som strakk seg inn i forkammeret langs hele sin lengde, ble laget i senter-hornhinnen til voksne Macaca fasicularis hun-primater. De høyre øyne tjente som kontroll og ble behandlet tre ganger hver dag med to dråper isotonisk (285 m osmol) steril fosfatpufret saltløsning (pH 7,4) uten rTGF. De venstre øyne ble behandlet etter samme plan med den behandlingsblanding som er beskrevet ovenfor. Etter tre dagers behandling, ble styrken på sårene målt kvantitativt ved å innføre en nål med liten boring (25 gauge) inn i forkammeret gjennom hornhinnens limbus. Nålen ble forbundet med et aneroid-manometer, og trykket ble langsomt og vedvarende øket inntil sårene først begynte å renne og deretter briste. Denne fremgangsmåte er beskrevet i detalj av Weene (1983) Anal. Ophthalmol. 15, 438.

D. Resultater

De resultater som er vist i tabell V viser at bristestyrken for TGF-behandlede hornhinner er signifikant sterkere enn de saltløsningbehandlede kontrollhornhinner.

Eksempel 9

In vivo studier med anti- TGF- antistoff

Et anti-TGF-serum ble fremstilt ved å immunisere en kanin med et glutaradehyd-konjugat av den 17-aminosyrers sekvens av rTGF som er beskrevet i eksempel 4 ovenfor, og KLH (keyhole limpet hemocyanin), og så ble Ig-fraksjonen fremstilt ved å utfelle serum to ganger med en 45%ig mettet løsning av ammonium-sulfat, gjenoppløse den til det opprinnelige volum og dialysere mot PBS.

Anti-TGF-serum og et kontrollserum ble fortynnet fra sitt opprinnelige volum på 0,5 ml til 3 ml. De resulterende volumer ble anvendt for å injisere mus intraperitonealt i en dosering av 0,1 ml pr. mus. Ti mus, ca. 3 måneder gamle, ble hver på forhånd transplantert subkutant med to småbiter av en rotte-tumor som stammet fra Snyder-Theilen feline sarcoma virus. (Hvert trans-plantat ble tellet som ett punkt, hvilket resulterer i 20 totale punkter med 10 punkter for kontrollgruppen og 10 punkter for den behandlede gruppe). Musene ble injisert med start dagen etter transplanteringen og ble også injisert på dagene 4, 7 og 11.

Med start på dag 7 ble tumordiametrene målt i to retninger med passer. Tumorene ble målt ved regelmessige intervaller på dagene 9, 11, 14, 16, 18 og 24.

Ved tidspunktet for første måling hadde 7 av de 10 punkter for kontrollgruppen tegn på tumorvekst, mens bare 4 av de 10 punkter for den behandlede gruppe hadde tumorvekst. I tillegg hadde 6 av de 10 punkter i kontrollgruppen tumorer som var minst 3 mm i diameter, mens bare 3 punkter i den behandlede gruppe hadde tumorer av nevnte størrelse. 4 punkter i kontrollgruppen var minst 5 mm i diameter på dag 9, mens bare 2 punkter i den behandlede gruppe hadde denne størrelse. Ved dag 11 hadde kontrollgruppen og den eksperimentelle gruppe lignende tumorer.

Eksempel 9a

Påvisning av TGF- aktivitet i urin fra kreftpasienter

Diverse urinprøver ble forhåndsbehandlet ved 90°C i ett minutt etter tilsetning av 1/9 volum av 20% SDS, 0,4 M DTT, 0,4 M Hepes, 0,08 M natriumklorid, 1 mM EDTA, til pH 7,4. En 20 ul prøve ble satt til en inkubasjonsblanding (50 ul i alt) modifisert for å inneholde 1% NP-40. Inkubering av prøve, antistoff dannet mot 17-aminosyre-sekvensen i rotte-TGF i eksempel 4 og <125>i-merket syntetisk 17-aminosyre-sekvens ble foretatt i 96 brønners plater i 60 minutter, fulgt av 30 minutter med Pansorbin. Antistoff-bundet peptid ble pelletert på en pute av de dibutyl-ftalat, og disse pellets ble tellet i en gammateller ved anvendelse av 3,2 mm tykke blystrømper for beskyttelse av den upelleterte isotop.

TGF-nivåer ble standardisert ved anvendelse av den syntetiske sekvens og human-melanom (A375 cellelinje) TGF fra konsentrert serumfritt kondisjonert dyrkningsmedium. TGF-nivåer ble beregnet som ng av TGF pr. mg av kreatinin. I hvert forsøk ble en eller flere normale prøver analysert, og den gjennomsnittlige normalverdi ble gitt en verdi av en relativ TGF-ekvivalent.

A. Prøvepreparering

Friske, ikke-klarnede urinprøver ble lagret i 25 ml alikvoter ved -70"C i opptil 6 måneder. I de fleste tilfeller ble prøvene hurtig tinet og umiddelbart behandlet med protease-inhibitorer (0,5 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 0,05 mM pepstatin A. Sigma Chemical Co.) i 30 minutter ved 4°C. 10 ml prøver ble så dialysert ved 4°C mot enten 0,1 M eddiksyre eller 0,1 M ammoniumbikarbonat. Dialyserør med tre forskjellige porestør-reiser ble brukt: 3.500; 6.000-8.000; eller 12.000-14.000. (I noen tilfeller ble urinen innledningsvis lyofilisert og ekstra-hert, men nøytralisasjons- og etanol-eter-utfellingstrinnet ble utelatt.)

Etter 2 til 4 dager med dialyse ble urinprøvene klarnet (10.000 xG i 10 minutter), lyofilisert, gjenoppløst ved 50 ganger den opprinnelige konsentrasjon i 5 mM maursyre, samt 50 mM natriumklorid, deretter klarnet kort (12.000 xG, ett minutt) før forhåndsbehandling.

B. Kreatinin- assavs

En ubehandlet alikvot av hver prøve ble testet dobbelt med hensyn på kreatinin, under anvendelse av en manuelle kolori-metrisk test.

C. Resultater

Prøvene ble standardisert for kreatinin-nivåer. For hvert av 6 eksperimenter indikerte statistisk analyse (T-test) signifi-kante forskjeller mellom kreftpasienter og normale (P<0,001, 0,001, 0,001, 0,001, 0,01, 0,05). I de 6 eksperimenter var TGF-konsentrasjonen i urinen fra normale individer på et gjennomsnitt av 0,18 ng av TGF pr. mg kreatin, mens urinen fra alle kreftpasienter hadde et gjennomsnitt av 0,64 ng av TGF. Forhøyede TGF-nivåer ble observert hos de fleste kreftpasienter. Resultater i hvert eksperiment ble også normalisert i forhold til den gjennomsnittlige normale verdi i eksperimentet. Dataene er vist numerisk i tabell VI. Anvendelse av en vilkårlig avkutting av det dobbelte av det gjennomsnittlige normale nivå av TGF, gjør at i 81% av de forskjellige krefttilfeller som ble testet, ble det påvist høyere TGF-nivåer enn normalt.

Eksempel 10

Påvisning av TGF- aktivitet i urin fra kreftpasienter

Human-urin fra 50 personer (25 normale og 25 individer med fremskreden kreft) ble utsatt for immuno-assay ved anvendelse av antistoff mot TGF under anvendelse av den metode som er beskrevet ovenfor i eksempel 9. Ved denne undersøkelse ble 100 ml urin fra individene som skulle testes, oppsamlet, dialysert mot 1,0 molar eddiksyre og konsentrert ca. 100 ganger. Denne konsentrerte urin ble så underkastet immuno-assay under anvendelse av kanin-polyklonalt antistoff dannet mot det 17-aminosyrers oligopeptid som i eksempel 4 ovenfor, og resultatene er vist i nedenstående tabell.

I denne test var nivået av TGF i urin hos majoriteten av kreftpasienter minst 5 ganger høyere enn det hos normale individer som ble testet.

Eksempel 11

Påvisning av TGF med et monospesifikt antiserum rettet mot et syntetisk peptid

Pept idsyntese

Peptider, tilsvarende aminosyrer fra deler av rTGF-aminosyre-sekvens, beskrevet ovenfor i eksempel 2, ble syntetisert kommer-sielt (Peninsula Labs) ved standard-fastfaseteknikken til Ohgak et al. (1983) Journal of Immunol. Meth. 57, s. 171-184. Om nødvendig, ble peptider renset ved revers fase-høyytelse-væskekromatografi (HPLC) før bruk.

De anvendte sekvenser var:

Peptidkoniugering og immunisering

En 10 mg prøve av peptid ble blandet med keyhole limpet hemocyanin (10 mg; Calbiochem) i 3,5 ml av 0,1 M natriumfosfat ved pH 7,4. 4 ml av 25 mM glutaraldehyd ble tilsatt, og blandingen ble inkubert under rysting i 1 time ved 23°C. Glycin ble så tilsatt til en endelig konsentrasjon av 0,1 M, og blandingen ble rystet natten over ved 23°C. Det resulterende konjugat ble blandet med samme volum av Freund's komplette adjuvant før injeksjon.

Kaniner ble immunisert ved subkutan injeksjon av 1 mg av konjugat injisert subkutant på fire separate punkter. To forsterker-injeksjoner ble administrert ved 2 x ukentlige intervaller etter den første injeksjon. Det serum som ble anvendt ved denne undersøkelse ble oppsamlet 80 dager etter den første injeksjon. En immunoglobulinfraksjon av dette serum ble fremstilt ved ammoniumsulfatutfelling. Produktet av antistoffer som er spesifikt for immunisering av peptid ble overvåket med en fastfase-enzym-forbundet immunoabsorbent-assay.

Radionoderin<g> av peptider

Peptider ble merket med Na<125>I under anvendelse av kloramin-T-metoden, i det vesentlige som beskrevet i Das et al. (1977)

Proe. Nati. Acad. Sei. 74, s. 2790-2794. Løsninger som inneholdt muse-submaksilær kjertel-EGF (mEGF) (170 p-mol), syntetisk rTGF

(4 p-mol) eller peptid (III (400 p-mol) ble blandet med 1-2 mCi Na<125>j (Amersham, 2 mCi/n mol) i 2 M kaliumfosfat ved pH 7,5. Kloramin T (50-100 ug) ble tilsatt og inkubering ved 4° ble fortsatt i 1 minutt (mEGF og rTGF) eller 7 minutter (peptid III). Reaksjonene ble avsluttet ved tilsetning av Na2S205 (10-20 ug),

og merkede proteiner ble separert fra uomsatt Na-<1-2>^ ved kromatografi på Sephadex G-10 (Pharmacia). Spesifikke aktiviteter av peptider merket på denne måte var: 1 x 10<10> cpm/n mol (EGF); 6 x IO<8> cpm/n mol (rTGF); og 1 x IO<9> cpm/n mol (peptid III).

Radioreseptor- assay

Bindingen av <125>i-EGF til dets reseptor på monosjikt av formalin-fikserte A431-celler ble målt som beskrevet ovenfor i eksempel 1. <125>I-EGF ble tilsatt ved en sluttkonsentrasjon av 0,33 nM i nærvær eller fravær av konkurrerende substanser. Tilsetning av umerket EGF ved 0,3-0,5 nM resulterte i halv-maksimal inhibering av <125>I-EGF-binding. TGF-konsentrasjoner ble uttrykt som den mengde som var nødvendig for å produsere en inhibering av <125>I-EGF-binding, ekvivalent med en kjent mengde av

TGF.

Radioimmuno- assay

Reaktanter ble blandet i et sluttvolum av 50 ul av en løsning som inneholdt: 20 mM natriumfosfat, ved pH 7,4; 200 mM NaCl; 40 mM ditiotreitol; 0,1% (vekt:volum) BSA; 0,1% (vekt:volum) NaN3; <125>I-peptid III; (IO<4> cpm); antiserum ved en sluttfortynning av 1/15.000; og andre tilsetninger, som spesifisert. Reaksjonen ble initiert ved tilsetning av antiserum og fortsatt ved 23°C i 90 minutter. Samme volum av 10% formalin-fiksert Staphalococcus A (Pansorbin, Calbiochem) ble så tilsatt, og inkuberingen ble fortsatt i ytterligere 30 minutter ved 23"C. Immunoadsorbanten ble fjernet ved sedimentering gjennom en pute av 10% (vekt:volum) sukrose, og mengden av bundet <125>I-peptid III ble bestemt ved hjelp av en gammateller. Under disse betingelser ble tilnærmet 25% av <125>I-peptid bundet av antistof i fravær av konkurrent. Mengden av bundet peptid III ble korrigert for ikke-spesifikk binding målt i fravær av antistoff (mindre enn 5% av det totale) og uttrykt som prosent av maksimal binding. Konsentrasjoner av konkurrenter ble uttrykt som mengden av peptid III som kreves for å gi en ekvivalent inhibering av utfelling.

Krornatogra f i

Gelfiltreringskromatografi ble utført i henhold til produ-sentens instruksjoner på kolonner av Bio Gel P-10 (BioRad) ekvilibrert i 1 N eddiksyre. HPLC ble utført på en Novapak C18 kolonne (0,39 x 10 cm; Waters Associates) ved anvendelse av en strømningshastighet av 1 ml/min ved 23'C.

Fremstilling av kondisjonert medium

Serumfritt kondisjonert medium fra Snyder Theilen-transformerte Fischer rotte-embryoceller (ST-FrSV-FRE klon-10) ble oppsamlet som beskrevet tidligere av Twardzik et al. (1983) Virology 124, s. 201-207. Mediet ble klarnet ved lavhastighets-sentrifugering og lyofilisert. Resten ble så resuspendert i 1 N eddiksyre og dialysert uttømmende mot 0,1 N eddiksyre. Uløselig protein ble fjernet ved sentrifugering, og supernatanten ble lyofilisert. Til slutt ble resten resuspendert i 1/100 av det opprinnelige volum av 1 N eddiksyre og lagret ved 4°C.

Immunoblottinq- analvse

Prøver som skulle analyseres ble først underkastet natrium-dodecylsulfat-polyakrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE) på en 15-20% akrylamidgradient, og så kjørt under reduserende betingelser, under anvendelse av det system som er beskrevet av Laemmii (1970) Nature 227, s. 680-682. Etter separasjon ble proteiner overført elektroforetisk til nitrocellulose (Schleicher and Schuell, BA85, 0,45 u) som beskrevet av Burnette (1981) Anal. Biochem. 112,

s. 195-203. Overføringen ble foretatt ved tilnærmet 5V/cm i et tidsrom av 3-4 timer ved 23"C. Den resulterende protein-blot ble inkubert natten over i en melkebasert cocktail, BLOTTO

(Johnson et al. Gene Anal. Techn. 1, s. 3-8). Antiserum ble fortynnet i BLOTTO og satt til blot'en i nærvær eller fravær av overskudd av peptid III. Inkubering med antistoff ble fortsatt med hyppig agitering i 2-3 timer ved 23°C. Blot'en ble så vasket og inkubert med 12<5>I-protein A (4 x IO<6>cpm/ml; 4 x IO<7> cpm/ug i 1 time ved 23°C og vasket med BLOTTO. Antistoffbindingspunkter ble visualisert etter autoradiografi på Kodak XAR-5 film ved

-70°C under anvendelse av intensifiseringsskjermer.

Resultater

Ved anvendelse av den radioimmuno-assay som er beskrevet ovenfor, ble inngående <125>I-peptid III nær kvantitativt utfelt ved lav fortynning av antisera; antiserumet viste en titer på

>10.000. Antistoff-affinitet ble målt ved inkubering av antiserumet ved en sluttfortynning på 1/5.000 med varierende konsentrasjoner av <125>I-peptid III. Analyse av disse data ved metoden til Scatchard avslørte en enkelt klasse av bindings-komponent(er) med affinitetskonstant (Ka) på 8,3 x IO<8> M-<1> for <125>I-peptid III.

Spesifisitet av radioimmuno- assay

For å bestemme spesifisiteten til radioimmuno-assay ble forskjellige peptider testet med hensyn på sin evne til å

inhibere utfelling av <125>I-peptid III. Umerket peptid III inhiberte utfelling av <125>I-peptid III på tilnærmet lineær måte i området 0,13-11 nM; konsentrasjonene av umerket peptid III, som produserte halv-maksimal inhibering av utfelling, var 0,7 nM. Peptid IV var bare litt mindre effektivt som inhibitor for utfelling enn peptid III var, mens peptid II var totalt ineffektivt ved konsentrasjoner opp til 1,1 uM. Peptid I, tilsvarende amino-terminal-ll-restene, var også ineffektivt som konkurrent. Disse resultater indikerer at den epitop som er påvist under standard-assay-forhold var lokalisert til karboksy-terminal-ll-aminosyrene i peptid III. En oppsummering av de relative inhiberende konsentrasjoner av forskjellige peptider er presentert i tabell VIII.

De indikerte tilsetninger ble testet med hensyn på evne til å inhibere standard-RIA som beskrevet ovenfor. Konsentrasjonen av hver tilsetning som er nødvendig for oppnåelse av halv-maksimal inhibering av utfelling ble bestemt og er uttrykt i forhold til konsentrasjonen av peptid III som kreves for å gi samme inhibe-ringsnivå. Symbolet ">" indikerer den høyeste konsentrasjon som ble testet. (De inhiberende aktiviteter for peptidene I-IV var uaffisert av innlemmelse av ditiotreitol i denne assay).

rTGF ble også testet med hensyn på sin evne til å inhibere utfelling av <125>I-merket peptid III. Syntetisk rTGF, som kunne skjelnes fra det native molekyl i biologisk aktivitet, var like effektivt (på molbasis) som inhibitor som peptid III var det. Den relative inhiberende kapasitet for rTGF var betydelig nedsatt da et reduksjonsmiddel var utelatt fra reaksjonsblandingen (tabell). mEGF var totalt ineffektiv som konkurrent, ved konsentrasjoner som varierte opp til mer enn 1 uM. Dette

indikerer at RIA som her er beskerevet avviker fra andre tilgjengelige assays for TGF ved det at det er spesifikt for TGF men ikke for EGF.

For å vise direkte at antiserumet binder rTGF, ble <125>i-merket rTGF benyttet istedenfor <125>I-peptid i standard RIA. En doseavhengig utfelling av <125>I-TGF ble observert, som ble inhibert vesentlig ved tilsetning av overskudd av umerket peptid III. Scatchard-analyse av bindingsdataene som er oppnådd på denne måte, indikerte at antiserumet viste en Ka-verdi på

2,3 x IO<8> M<-1> for <125>I-TGF. Denne verdi var i rimelig overensstemmelse med den Ka-verdi som ble bestemt for <125>I-peptid III (8,3 x IO<8> M-<1>) og indikerte at antiserumet binder seg til rTGF.

Påvisning av rTGF i kondisjonert medium av transformerte celler

Én kilde for TGF er det dyrkningsmedium av celler som er transformert av RNA-tumor-virus. For å påvise rTGF i kondisjonert medium fra dyrkede transformerte celler ble følgende fremgangsmåte benyttet: En Fischer-rotte-embryocellelinje transformert ved hjelp av Snyder-Theilen-stammen fra felin-sarcoma-virus (ST-FeSV FRE klon-10), er tidligere vist å produsere forhøyede nivåer av rTGF (Gray et al. (1983) Nature 303, s. 722-725). Serumfritt kondisjonert medium ble oppsamlet, forarbeidet og konsentrert som beskrevet ovenfor. En alikvot av medium ble så underkastet gelfiltreringskromatografi på Bio-Gel P-10 under sure betingelser. Fraksjoner ble analysert for rTGF ved hjelp av EGF-reseptor-konkurranse-assay eller ved RIA.

To størrelseklasser av EGF-konkurrerende aktivitet ble

påvist under disse betingelser, én av tilnærmet Mr = 10.000 og én med Mr = 20.000; begge arter eluerte godt bak hovedmengden av protein i prøven. Begge størrelseklasser av EGF-konkurrerende aktivitet viste også immunologisk aktivitet. Ytterligere immunologisk aktivitet ble funnet i det ekskluderte volum i kolonnen hvor ingen EGF-konkurrerende aktivitet ble påvist. Disse funn indikerer at tidligere beskrevne størrelseklasser av rTGF er aktive i RIA. Forholdet mellom EGF-konkurrerende og immunologisk aktivitet var i stor grad redusert i TGF-fraksjonene med høy

molekylvekt, hvilket indikerer at de biologiske aktiviteter for disse TGF(s)-arter er mindre enn for de fraksjoner med lavere mo1eky1vekt.

For å bekrefte at den immunologiske aktivitet ble utført ved de samme molekylære substanser som EGF-konkurranseaktivitet, ble oppsamlede fraksjoner som inneholdt størrelseklassene av rTGF med Mr = 10.000 og Mr = 20.000 fra en versjon av dette eksperiment i preparativ skala, underkastet reversfasekromatografi på HPLC; betingelsene som ble anvendt, var lik dem som ble anvendt ved rensing av rTGF som beskrevet av Marquardt et al. (1983) Proe. Nati. Acad. Sei., 80, s. 4684-4688. For de oppsamlede fraksjoner med Mr = 10.000 TGF ble både EGF-konkurrerende og immunologisk aktivitet vist å ko-rense med i det vesentlige kvantitative utbytter. Ko-rensningen av begge aktiviteter under både gelfiltreringskromatografi og HPLC antydet sterkt at begge aktiviter utføres av de samme molekylære substanser. Når Mr = 20.000 EGF-konkurranseaktiviteten ble utsatt for HPLC, ble en lignende ko-rensning av EGF-konkurrerende og immunologiske aktiviteter observert. Disse eksperimenter indikerer at hovedmengden av immunologisk aktivitet som finnes i kondisjonert medium av ST-FeSV-FRE-klon 10 skyldtes rTGF.

Immunoblottings- analyse av klasser av rTGF av forskjellig størrelse.

Klassene av større størrelse av TGF som ble funnet i kondisjonert medium fra retrovirale transformerte rotteceller kunne representere enten aggregerte tilstander eller distinkte molekylære former av TGF-molekylet. For å skjelne mellom disse alternativer ble syntetisk rTGF og størrelseklassene av nativt TGF med både Mr = 10.000 og Mr = 20.000 underkastet immunoblottingsanalyse, etter separering av komponent-polypeptider ved SDS-PAGE under reduserende betingelser. Immunoreaktivt syntetisk rTGF og lavmolekylært nativt rTGF ko-migrerte som enkelte polypeptidkjeder med Mr = 6.000, immuunologisk reaktivitet for disse molekyler ble blokkert ved inkubering av antiserum med overskudd av peptid III.

I motsetning til dette inneholdt størrelseklasse med stor molekylvekt tre immunoreagerte peptider med Mr = 24.000, Mr = 40.000

og Mr = 42.000; immunologisk reaktivitet for disse peptider ble også blokkert ved tilsetning av overskudd av peptid III. Et

annet radioaktivt bånd med en migrering på mer enn Mr = 43.500

ble notert i alle rader. Dette materiale ble ufullstendig fjernet ved innlemmelse av overskudd av peptid III og ble sett overensstemmende i alle eksperimenter, uten hensyntagen til den prøve som var analysert. Derfor synes det å representere en eksperimentell artifakt. Det er bemerkelsesverdig at intet Mr = 6.000 TGF ble påvist i størrelseklassen med stor molekylvekt. Disse resultater viser at størrelseklassene av rTGF med høyere molekylvekt representerer distinkte former av TGF.

Eksempel 12

Syntetisk fragment av rTGF med reseptorbinding og antigene egenskaper

Peptider

EGF ble renset fra muse-submaksilære kjertler ekstraksjon

med 1 M HCl som inneholdt 1% trifluoreddiksyre (TFA), 5% maursyre og 1% NaCl, konsentrasjon på Sep-Pak kolonner (Waters), og reversert fase-høyytelse-væskekromatografi på uBondapak C-18 kolonner (Waters) som i Elson et al. (1984) Biochemistry Int. 8,

s. 427-435. Den komplette syntese av nativ rotte-TGF er beskrevet ovenfor i eksempel 5.

De syntetiske peptidfragmenter ble fremstilt på klormetyl-polystyren-1% divinylbenzenharpiks (Bio-Rad) med Na<->t-butoksy-karbonyl-beskyttelse. Peptider ble avbeskyttet og splittet fra harpiksen ved anvendelse av HF eller, for analogene med blokkerte C-termini, ble peptidet først fjernet ved ammonolyse (NH3/MeOH).

De rå, avbeskyttede peptider ble fortynnet og cyklisert til disulfidformen ved oksydasjon med 0,01 M K3FeCN)6. Peptid-løsningen ble fylt i en Bio-Rex 70 kationebyttekolonne, vasket med 300 ml H20 og eluert med en gradient til 50% AcOH. Peptidet ble renset ved prep-HPLC på en 2,5 x 100 cm kolonne (Altex) av Vydac 218TP C-18 pakking under anvendelse av tilnærmet 2 0% CH3CN eluent, 0,03 M i NH4OAc ved pH 4,5 (10). Peptidene 1 og 2 representerer aminosyresekvensene 34 til 43 av rTGF med henholdsvis frie eller blokkerte (N-Ac; C-amid) ender. Peptid 3. er metyl-esteren av den tilsvarende sløyfe av hTGF (Ac-Cys-His-Ser-Gly-Tyr-Val-Gly-Ala-Arg-Cys-OMe) fremstilt ved transforestring fra harpiksen (base/MeOH).

Immunogenfremstilling og immuno- assay

TGF-peptid 1 ble koblet til keyhole limpet hemocyanin (KLH) eller bovin-serumalbumin (BSA) ved tiol/maleimid-binding (King et al. (1979) J. Immunol. Methods 28, s. 201-206). Bærer-peptidkomplekser ble renset ved gelfiltrering. Et gjennomsnitt av 60 mol peptid/mol KLH og 20 mol peptid/mol BSA ble oppnådd. Kaniner ble immunisert med KLH-peptid 1-konjugatet ved multiple subkutane (s.c.) og intramuskulære (i.m.) injeksjoner av 2 mg protein i komplett Freund's adj uvant. Kaniner ble forsterket s.c. hver 2 uker med immunogenet i inkomplett Freund's adjuvant. IgG-fraksjonen i antiserumet etter 5 forsterkninger ble anvendt for immuno-assay og radiomerket ved anvendelse av Na<125>I (NEN) og Enzymobeads (Bio-Rad) til 4 x IO<5> cpm/ug protein. Polyvinyl-klorid 96 brønners plater (Costar) ble belagt med 200 ug/ml BSA-peptid 1-konjugat og tellebelagt med 10% normalt kaninserum i fosfatpufret saltløsning. Plater ble inkubert i 4 timer ved 37"C med [12<5>I]-anti-KLH-peptid 1 IgG (50.000 cpm/brønn) i nærvær eller fravær av inhibitorer, vasket, og individuelle brønner ble tellet.

Radioreseptor- assay

A-431 human-epidermoide carcinomaceller eller human-forhud-fibroblaster (HFF), etablert fra primære kulturer, ble dyrket til konfluens i 24 brønners samleskåler (Costar) i Dulbecco's minimal-essensielle medium (DMEM, Gibco) inneholdende 10% føtalt kalveserum (FCS, Hyclone). EGF ble radio-jodert som angitt ovenfor, til mellom 4 x IO<4> og 8 x IO<4> cpm/ng protein. Celler ble inkubert ved 4°C i 60 minutter med 1 nM [<125>I]EGF i nærvær av inhibitorpeptider i DMEM (pH 7,4; 20 mM Hepes) inneholdende 0,1% BSA. Celler ble vasket 3x med kald puffer, lysert med 0,1 N NaOH, og celle-assosiert radioaktivitet ble målt (gamma-teller). Ikke-spesifikk binding fastslått i nærvær av 100x overskudd av kald EGF var mindre enn henholdsvis 5% og 10% av den spesifikke binding

for A-431 og HFF-celler.

Celle- formerinqs- assay

HFF-celler ble dyrket til konfluens i 48 brønners samleskåler i DMEM-10% FCS og bragt til ro ved utsulting i 2 dager i DMEM-0,5% FCS. Mitogener og peptider ble inkubert med celler ved 37°C i 18 timer før en 4 timers pulsering med 1 uCi [<3>H]metyl-tymidin (NEN) og trikloreddiksyre-utfellbar radioaktivitet ble målt.

Resultater

Kanin-antistoffer mot KLH-peptid 1-konjugatet reagerte med BSA-TGF peptid ved fastfase-RIA. Denne reaksjon ble inhibert på konsentrasjonsavhengig måte av peptid 1 og litt mindre av nativ TGF. Derimot forårsaket ikke EGF signifikant inhibering.

Rotte-TGF forskyver og konkurrerer med måte bindingen av EGF til dens reseptorer. Evnen hos TGF-peptider til å konkurrere med [<125>I]EGF-binding enten til A-431-celler eller HFF ble vurdert. Peptid 1 inhiberte delvis [<125>I]EGF-binding til A-431-celler ved

>10-<6> M. Peptidene 2 og 3, oppviste imidlertid en forbedret bindings-inhibering, med henholsvis IC50-verdier på 4 x 10~<6> M og 4 x 10~<7> M (dvs. tilnærmet 0,02 og 0,2% av bindingskraften til EGF eller TGF-cx) . Lignende observasjoner ble gjort for inhibering av EGF på HFF (tabell IX). Reseptorspesifisiteten til disse vekselvirkninger er illustrert ved disse peptiders uegnethet til å inhibere enten bindingen eller den mitogene effekt av endotelisk cellevekstfaktor på HFF (ikke vist).

Ingen av TGF-peptidene var i besittelse av iboende mitogene egenskaper opp til 10~<5> M når de ble inkubert med uvirksomt HFF (data ikke vist). Imidlertid inhiberte TGF-peptidene, på konsen-tras j onsavhengig måte, induksjon av DNA-syntese i uvirksomt HFF ved EGF. Disse antagonister var like kraftige når TGF ble anvendt som mitogen (tabell IX). Som det kan sees for bindingskraften, ble den antagonistiske kraft av TGF-peptidene forbedret ved tildekning av amino- og karboksy-terminalene.

Eksempel 13

TGFa stimulerer benresorpsion in vitro

Transformerende vekstfaktorpreparater ble renset fra human-melanomacelle-kondisjonert medium og human-småplater som beskrevet i eksempel 1 og syntetisk rotte-TGF ble fremstilt som tidligere beskrevet i eksempel 2. Biologisk aktivitet av TGF-preparatene og syntetisk TGF ble overvåket under anvendelse av en EGF-radioreseptor-assay eller under anvendelse av myk-agar-kolonidannelse, også som beskrevet i eksempel 1.

Syntetisk rotte-TGF (Mr = 5.600) resorberte ben på konsentrasjonsavhengig måte. Konsentrasjoner større enn 2 ng EGF ekvivalenter/ml stimulerte benresorpsjon i tre separate eksperimenter. Det syntetiske TGF krevet minst 72 timer for å stimulere benresorpsjon. I denne henseende viser den syntetiske form seg lik EGF som resorberer ben i et lignende tidsforløp i denne bio-assay. (Tashjian et al. (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 85, 966).

Delvis rensede preparater av høy- og lav-molekylære TGF fremstilt fra en human-melanom-cellelinje ble også testet i benresorpsjons-assay. Både høye (27.000 dalton) og lave (6.000 dalton) molekylvektformer stimulerte benresorpsjon. Den høyemolekylære form stimulerte resorpsjon i løpet av 48 timer, mens den lavmolekylære form krevet 72-96 timer for å stimulere resorpsjon, et lignende tidsforløp som for syntetisk rotte-TGF-I og EGF (se Tashjian, ovenfor).

Resultatene viser at TGF kan stimulere benresorpsjon in vitro. Syntetisk rotte-TGF og lavmolekylære human-TGF-preparater oppførte seg på lignende måte som EGF, siden de krevet forlengede inkubasjonsperioder for å stimulere benresorpsjon. De var effektive ved konsentrasjoner av ca. en størrelsesorden mindre enn EGF. Det høymolekylære human-melanom-TGF stimulerte benresorpsjon i løpet av 48 timer.

Eksempel 14

Stimulering av benresorpsjon in vitro ved syntetisk transformerende vekstfaktor

Syntetisk rotte-TGF ble fremstilt som beskrevet ovenfor i eksempel 5. Renheten til proteinet ble bekreftet ved natrium-dodecylsulfat/polyakrylamidgel-elektroforese, aminosyreanalyse og revers fase-høyytelse-væskekromatografi. Den biologiske aktivitet hos TGF-preparater og syntetisk TGF ble overvåket ved hjelp av en EGF-radioreseptor-assay (Todaro et al. (1976) Nature 264, 26.) Benresorpsjon ble fastslått ved måling av frigjøring av <45>Ca fra tidligere merkede lange knokler hos føtal rotte. Drektige rotter på dag 18 av drektigheten ble injisert med 200 yCi <45>Ca. (Raisz

(1975) J. Clin. Invest. 44, 103.) Mødrene ble avlivet på dag 19 av drektigheten, og fostrene ble fjernet. De mineraliserte knokkelskaft av spoleben og albuben ble dissekert fri for omgivende vev og brusk og anbragt i organkultur. Knoklene ble inkubert i BGJb-medium (Irvine Scientific) i 24 timer ved 37'C i fuktig atmosfære av 5% C02 og 95% luft for å tillate utbytting av løst kompleksdannet <45>Ca. Knoklene ble så dyrket i 48-12 0 timer i BGJb-medium supplert med 5% føtalt kalveserum (KC Biologicals) som inneholdt kontroll- eller testsubstanser. Benresorberende aktivitet ble målt som prosent av totalt <45>Ca frigjort inn i medium og ble uttrykt som et behandlet-til-kontroll-forhold. Statistisk signifikans ble bestemt ved hjelp av Student's t-test for upardannede data.

Syntetisk rotte-TGF (molekylvekt 5.600) i konsentrasjoner over 2 ng av EGF-ekvivalenter pr. milliliter stimulert benresorpsjon på konsentrasjonsavhengig måte i tre separate eksperimenter. Syntetisk TGF forårsaket ingen signifikant benresorpsjon i løpet av de første 48 timer av bendyrkningen, men tydelig stimulert resorpsjon i de følgende 3 dager. I denne henseende synes den syntetiske form av TGF å være lik EGF, som resorberer ben over et lignende tidsforløp i denne bio-assay. (Raisz et al. (1980) Endocrinology 107, 270.) Effekten av TGF på benresorpsjon syntes å være uavhengig av prostaglandin-syntese.

Siden rotte-TGF resorberte ben in vitro, ble humanpreparater som inneholdt TGF-aktivitet også testet med hensyn på deres effekter på ben. Delvis rensede preparater av høy- og lavmole-kylvekts TGF ble fremstilt fra en human-melanom-cellelinje (Marquardt et al. (1982) J. Biol. Chem. 275, 5220). Disse preparater ble delvis renset ved syreekstraksjon og gelfiltreringskromatografi. Både høy (13.000)- og lav (6.000)-molekylvekt-formene stimulerte benresorpsjon. Den høymolekylære form stimulerte resorpsjon i løpet av 48 timer, mens den lavmolekylære form krevet 72 til 96 timer for å stimulere resorpsjon - et tidsforløp lik det hos det syntetiske rotte-TGF og EGF.

Eksempel 15

Vaccinia virus- infiserte celler frigjør et nytt polypeptid som er funksjonelt beslektet med transformerende og epidermale vekstfaktorer, cellekultur og virus

Cercopithecus-ape-nyre (BSC-1)-celle-monosjikt ble holdt i Eagles basal-medium supplert med 10% føtalt kalveserum. Vaccinia virus (W) (stamme WR) ble dyrket i Hela-celler og renset ved sukrose-densitets-gradientsedimentering. (Moss (1981) In Gene Amplification and Analysis, vol. 2, eds., Chirickjian og Papis (Elsevier/North Holland, New York s. 253-266).

Fremstilling av kondisjonert medium

BSC-l-celle-monosjikt ble inkubert ved 37'C med renset virus i Eagles basal-medium supplert med 2% føtalt kalveserum. Cellekultur-supernatanter ble klarnet ved lavhastighets-sentrifugering og lyofilisert. Resten ble så resuspendert i en 1 M eddiksyre og dialysert uttømmende mot 0,2 M eddiksyre. Uløselig materiale ble fjernet ved sentrifugering, og supernatanten ble lyofilisert og resuspendert i 1/100 av det opprinnelige volum av 1 M eddiksyre og lagret ved 4°C.

Krornatoqraf i

Gelfiltrering ble utført på kolonner av Bio-Gel P-10 (BioRad, Richmond, CA) likevektsinnstilt i l M eddiksyre. Størrelsesortering på høytrykks-væskekromatografisystem benyttet to Bio-Sil TSK-250 kolonner (BioRad) i serie.

Det isolerte materiale, betegnet Vaccinia virus-vekstfaktor (VGF), hadde den aminosyresekvens som er gitt i eksempel 6 ovenfor.

Radioreseptor- assay

Den anvendte radioreseptor-assay var lik den som er beskrevet ovenfor i eksempel 1. TGF- og VGF-konsentrasjonene ble uttrykt som den mengde som kreves for å produsere en inhibering av <125>I-EGF-binding som er ekvivalent med en kjent mengde av EGF.

Radioimmuno- assav

Den anvendte radioimmuno-assay var lik den som er beskrevet ovenfor i eksempel 11.

Resultater

Nærvær av EGF- konkurrerende aktivitet i kulturmediet til W-infiserte celler

Supernatanten, som stammet fra BSC-l-celle 24 timer etter infeksjon med W, ble testet med hensyn på nærvær av materiale som kunne konkurrere med <125>I-merket EGF for binding til EGF-reseptor-rike human-epidermoide carcinomaceller (A431). W-infiserte celler frigjorde en kraftig EGF-konkurrerende aktivitet som vesentlig metter (>10 ng) assay'en med ekvivalenten av 10 ng materiale resuspendert fra 0,5 ml dyrkningsfluid. Aktiviteten ble betegnet W-vekstfaktor (VGF). (I motsetning til dette inneholdt narre-infiserte BSC-l-kontrollkulturer minimal EGF-konkurrerende aktivitet selv ved den laveste fortynning som ble testet.)

De neste eksperimenter ble lagt opp slik at de skulle undersøke kinetikken til VGF-produksjon. Ved det tidligste tidspunkt hvor det ble undersøkt, 2 timer etter infeksjon, var forsterkede nivåer av EGF-konkurrerende aktivitet allerede tilstede i dyrkningsmediet, hvilket antyder hurtig syntese og frigjøring av VGF. Ved 12 timer ble maksimale mengder av denne aktivitet funnet i kultur-supernatanter; bare en svak økning ble notert ved 24 timer. Siden det W-kodede polypeptid med struk-turell homologi til EGF og TGF er et tidlig genprodukt, ble VGF-ekspresjon overvåket i BSC-l-cellekulturer behandlet med cytosin-arabinosid (AraC) som startet umiddelbart etter den 1 time lange virus-adsorpsjonsperiode. Inhibering av DNA-syntese av AraC blokkerer ekspresjonen av sene vaccinia-gener, mens tidlige genprodukter ikke påvirkes på lignende måte. VGF-produksjon var ikke inhibert i AraC-behandlede kulturer, men var, i forhold til infiserte kontrollkulturer, forsterket mer enn 2 ganger ved 13 og 24 timer etter infeksjonen. Nivået av VGF-produksjon var også en funksjon av virus-inokulatet (tabell XI). Med et plaque-dannende enhet (PFU) - til - celle-forhold på 20:1 ble tilnærmet 3 ng EGF-ekvivalenter av VGF pr. ml påvist i kultur-supernatanter ved

24 timer etter infjeksjonen. VGF-produksjon var proporsjonal med multiplisitet av infeksjon, med ca. 6 og 10 ng ekvivalenter av EGF påvist i BSC-l-kulturer infisert ved forhold på henholdsvis 40 og 80 PFU/celle.

Delvis rensning av VGF

Den EGF-konkurrerende aktivitet som finnes i W-infiserte BAS-l-celler ble delvis renset fra syre-ekstraherte kultur-supernatanter ved 24 timer etter infeksjonen. Syresolubiliserte polypeptider (10,5 mg) fra W-infiserte cellekultur-supernatanter ble påført i en Bio-Gel P-10 kolonne likevektsinnstilt i l M eddiksyre, og prøver fra hver fraksjon ble testet med hensyn på VGF-konkurrerende aktivitet. Hovedtoppen for EGF-konkurranse (fraksjon 42) eluerte, litt etter karbonsyre-anhydrase-markøren ved Mr = 29.000, med en tilsynelatende molekylvekt på 25.000. Ingen signifikant aktivitet ble påvist i fraksjoner tilsvarende den kjente elueringsposisjon av EGF (fraksjon 100) eller rotte-TGF (fraksjon 78) på denne kolonne. Topp-VGF-aktivitet (fraksjon 42-44) ble anvendt for påfølgende biologiske studier. Molekylvekten ble bekreftet ved benyttelse av tandem-forbundet Bio-Sil TSK 250 HPLC størrelsesorterende kolonner. All den EGF-konkurrerende aktivitet eluerte som en hovedtopp i regionen til proteinmarkøren ved Mr = 25.000.

Immunologisk sammenligning mellom EGF og TGF

For ytterligere å sammenligne TGF med VGF ble sistnevnte testet i konkurrerende radioimmuno-assay med hensyn på TGF som beskrevet ovenfor. Denne assay kan skjelne EGF fra TGF og gjenkjenner både lav- og høy-molekylvektformer av TGF fra rotte og fra menneske-opprinnelse. (Linsley et al. (1985) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82, s. 365-369). Rotte-TGF konkurrerte effektivt med <125>I-merket TGF-peptid med hensyn på binding til antistoff med en skråkultur lik den for umerket TGF-peptid. En 50% forskyvning av antigen fra antistoff ble observert ved en antigenkonsentrasjon på tilnærmet 0,2-0,3 ng-ekvivalenter av EGF. Da VGF ble testet ved ekvivalente konsentrasjoner, ble det ikke observert noen konkurranse, hvilket antyder at VGF ikke er et medlem av TGF-familien av peptider, hva immunologiske egenskaper angår. I en konkurrerende radioimmuno-assay med hensyn på nativt EGF, oppviser VGF-preparater minimal forskyvning (<10%) av <125>i-merket EGF fra et polyklonalt antistoff til nativt EGF.

Biologisk aktivitet hos VGF

Minst én størrelsesorden mer VGF (>2000 ng/1) ble funnet i forhold til den høyeste TGF-produsent, Fisher-rottefosterceller (FRE) som var ikke-produktivt transformert av Snyder-Theilen Feline sarcoma virus.

I en TGF-avhengig myk-agar-assay for forankringsuavhengig cellevekst danner VGF-stimulerte nyreceller fra normal rotte progressivt voksende kolonier i myk agar. På ng-ekvivalent-basis produserte delvis rensede VGF-preparater 102 kolonier mens EGF og rotte-TGF produserte henholdsvis 120 og 154 kolonier. (Det er mulig at kontaminerende aktiviteter i delvis rensede VGF-preparater kan influere på kvantifisering i denne type av biologisk assay.)

VGF oppviste også kraftig mitogenisitet da det ble testet på et utvalg av dyrkede fibroblaster. Da det ble testet ved ekvivalente EGF-reseptorbindingsnivåer med serum-utsultede (48 timer) mink-fibroblaster (som har relativt høye antall EGF-membran-reseptorpunkter), utløste VGF en 78% økning i DNA-syntese i forhold til ustimulerte serum-berøvede celler, mens en 59% stimulering i deoksyuridin-inkorporering ble sett hos muse-submaksilær kjertel-EGF. Således er den mitogene effekt av VGF minst så sterk som verdien hos EGF.

Claims

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av en polypeptid-transformerende vekstfaktor, fortrinnsvis en human sådan, eller oligomerer derav med følgende formel: hvor R er Asp eller Lys, R' er Phe eller Tyr, R" er Ser eller Phe og R<11>' er Asp eller Glu, R<4> er Phe eller Tyr, og R<5> er Val eller Ala, karakterisert ved: (a) isolering fra et vandig medium som inneholder transformerende vekstfaktor-polypeptid i uren form, ved

(1) dialyse av det vandige medium som inneholder den transformerende vekstfaktor i uren form, mot en vandig, svak organisk syre for å gi en løsningsmiddelfase som inneholder transformerende vekstfaktor-polypeptid hvis fase er konsentrert og eventuelt klaret, idet det vandige medium som inneholder nevnte transformerende vekstfaktor-polypeptid i uren form, f.eks. er en kroppsvæske som inneholder transformerende vekstfaktor eller et vandig medium kondisjonert med en transformerende vekstfaktor-produserende cellelinje,

(2) gjendannelse av den konsentrerte løsningsmiddelfase fra trinn (1) med en vandig, svak organisk syre og underkastelse av den gjendannede løsning for gelpermeasjons-kromatograf i ved å tilsette gjendannet løsning til en gelpermeasjonskromatografi-kolonne kondisjonert med en vandig, svak organisk syre og eluering med den vandige, svake organiske syre for å få valgte fraksjoner av eluat som inneholder transformerende vekstfaktor-polypeptid i en forøket renhetstilstand, idet nevnte valgte fraksjoner blir kombinert og konsentrert for å gi et delvis renset, transformerende vekstfaktor-polypeptid-holdig produkt,

(3) å underkaste det delvis rensede, transformerende vekstfaktor-polypeptid-holdige produkt fra trinn (2) sekvensiell revers fase-høytrykks-kromatografi ved å la nevnte produkt, etter gjendannelse i en vandig, sterk syre, passere gjennom en eller flere hydrokarbonbundne silisiumdioksyd-matrikskolonner som er blitt likevektsinnstilt med vandig, sterk, syre under høytrykks-væskekromatografibetingelser, idet den første eluering av kolonnen blir utført ved å bruke en lineær acetonitrilgradient i vandig, sterk syre, og den påfølgende kolonne-eluering, som blir utført på de kombinerte, transformerende vekstfaktor-polypeptid-holdige fraksjoner fra det innledende høytrykks-kromatografitrinn, blir utført ved å bruke en lineær 1-propanol-gradient i vandig, sterk syre, idet nevnte 1-propanol-gradient blir økt i tilstrekkelig små 1-propanol-konsentrasjonsforøkninger for å gi det transformerende vekstfaktor-polypeptid som en enkelt distinkt topp i en tilstand av homogent polypeptid, eller (b) sekvensiell kobling av aminosyrer, i rekkefølgen gitt ved polypeptid- eller oligopeptid-formelen, på en passende bærer, idet bæreren fortrinnsvis er polystyrenharpiks.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det som den vandige, svake organiske syre i trinn (a) (1) og (2) anvendes vandig eddiksyre og i trinn (a) (3) som den vandige, sterke syre anvendes vandig trifluoreddiksyre.