JPS6058960B2 - ウィルスの検出，定量剤 - Google Patents
ウィルスの検出，定量剤Info
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- JPS6058960B2 JPS6058960B2 JP53124412A JP12441278A JPS6058960B2 JP S6058960 B2 JPS6058960 B2 JP S6058960B2 JP 53124412 A JP53124412 A JP 53124412A JP 12441278 A JP12441278 A JP 12441278A JP S6058960 B2 JPS6058960 B2 JP S6058960B2
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は一般式（一次構造式）
（但し上式中Ａｌａ，Ａｒ′Ｇ，Ａｓｎ，Ｃｙｓ，Ｇｌ
ｎ，Ｇｌｙ，？Ｕ，Ｌｙｓ，Ｐｈｅ，ＰｒＯ，Ｓｅｒ，
Ｔｈｒ，Ｔｙｒ，Ｖａｌ，は夫々Ｌ型のアラニン，アル
ギニン，アスパラギン，１ノ２シスチン，グルタミン，
グリシン，ロイシン，リジン，フェニルアラニン，プロ
リン，セリン，スレオニン，チロシン，及びバリン残基
を示し、Ｒ１〜Ｒ５も夫々以下のＬ−アミン酸残基を意
味する。
ｎ，Ｇｌｙ，？Ｕ，Ｌｙｓ，Ｐｈｅ，ＰｒＯ，Ｓｅｒ，
Ｔｈｒ，Ｔｙｒ，Ｖａｌ，は夫々Ｌ型のアラニン，アル
ギニン，アスパラギン，１ノ２シスチン，グルタミン，
グリシン，ロイシン，リジン，フェニルアラニン，プロ
リン，セリン，スレオニン，チロシン，及びバリン残基
を示し、Ｒ１〜Ｒ５も夫々以下のＬ−アミン酸残基を意
味する。
Ｒ１リジンのときＲ２：アスパラギン，Ｒ３：ロイシン
，Ｒ４：スレオニン，Ｒ５：アスパラギン酸。
，Ｒ４：スレオニン，Ｒ５：アスパラギン酸。
Ｒ１がアルギンニンのときＲ２，Ｒ５：グリシン、Ｒ３
：イソロイシン，Ｒ４：セリン。なお式中１＝ョは−Ｓ
−Ｓ一結合を示し、また各アミノ酸記号の傍に附記され
たアラビア数字はＮ末端から附されたアミノ酸配列番号
である。
：イソロイシン，Ｒ４：セリン。なお式中１＝ョは−Ｓ
−Ｓ一結合を示し、また各アミノ酸記号の傍に附記され
たアラビア数字はＮ末端から附されたアミノ酸配列番号
である。
）で示される新規ポリペプチドを有効成分として含むウ
ィルスの検出、定量剤に関、する。換言すれば、本発明
は第５，第２７，第３３，第３４，及び第４２アミノ酸
残基が相違する点を除き、結合アミノ酸の総数、Ｎ一末
端及びＣ一末端を含めアミノ酸の種類ならびに配列順序
が全く同様てある２種の類似体を有効成分として含むウ
ィルスの検出、定量剤に係る。第１番目の類似体（以下
ＳＰｌと仮称する。
ィルスの検出、定量剤に関、する。換言すれば、本発明
は第５，第２７，第３３，第３４，及び第４２アミノ酸
残基が相違する点を除き、結合アミノ酸の総数、Ｎ一末
端及びＣ一末端を含めアミノ酸の種類ならびに配列順序
が全く同様てある２種の類似体を有効成分として含むウ
ィルスの検出、定量剤に係る。第１番目の類似体（以下
ＳＰｌと仮称する。
）は４５個の単位アミノ酸より成り、一次構造式（式中
各アミノ酸残基記号の意味は上述のとおり）なる構造を
有し、その第３位と第３唯、第４位と第３１位、第１２
位と第２Ｖ．及び第１唯と第２蚊に存在する各システイ
ン分子対間のジスルフィド結合により架橋された特異な
四環構造を有する。第二番目の類似体（以下ＳＰ２と仮
称する）も４５個の単位アミノ酸より成り、一次構造式
（式中各アミノ酸記号の意味は上述のとおり。
各アミノ酸残基記号の意味は上述のとおり）なる構造を
有し、その第３位と第３唯、第４位と第３１位、第１２
位と第２Ｖ．及び第１唯と第２蚊に存在する各システイ
ン分子対間のジスルフィド結合により架橋された特異な
四環構造を有する。第二番目の類似体（以下ＳＰ２と仮
称する）も４５個の単位アミノ酸より成り、一次構造式
（式中各アミノ酸記号の意味は上述のとおり。
）なる構造を有し、これまた前記ＳＰｌと全く同様の四
環状化合物である。これら両類似体は、共に本出願人の
別途出願に係る昭和５坪特許願第２０５３９号・発明の
主題であるが、これらの以下の物理・化学的パラメータ
ーにより特徴づけられる。ＲｓｐｌＪ 外観：無色針状晶 等電点：約１０ 分子量：後述のアミノ酸配列決定の結果より４９１３を
計算される。
環状化合物である。これら両類似体は、共に本出願人の
別途出願に係る昭和５坪特許願第２０５３９号・発明の
主題であるが、これらの以下の物理・化学的パラメータ
ーにより特徴づけられる。ＲｓｐｌＪ 外観：無色針状晶 等電点：約１０ 分子量：後述のアミノ酸配列決定の結果より４９１３を
計算される。
但し沈降平衝法（ベツク マン社製ＳｐｉｎｃＯＭ
ＯｄｅｌＥ超遠心分離機 を用い、歳グアニジンを
含むＰＨ７．５の ０．０５Ｍトリス塩酸バッファー
中に１〜５Ｔｎ９／ｍｌの濃度に溶解して１７６００ｒ
′Ｐｍで測 定。
ＯｄｅｌＥ超遠心分離機 を用い、歳グアニジンを
含むＰＨ７．５の ０．０５Ｍトリス塩酸バッファー
中に１〜５Ｔｎ９／ｍｌの濃度に溶解して１７６００ｒ
′Ｐｍで測 定。
）で測定した結果では約５５００との値 を示す。構
成アミノ酸数：仙個 アミノ酸配列： （各符号の意味は前示のとおり、数字は配列順序を示す
。
成アミノ酸数：仙個 アミノ酸配列： （各符号の意味は前示のとおり、数字は配列順序を示す
。
元素分析結果
紫外線部吸収スベクトルニ２７８ｎｍ附近にペプチド特
有の吸収を認める（各サンプルの２ｍｇ／ｍｌを日立２
波長複光束型吸光度計−３５６により測定。
有の吸収を認める（各サンプルの２ｍｇ／ｍｌを日立２
波長複光束型吸光度計−３５６により測定。
）。赤外部吸収スベクトルニ波長１６００ｃｒｆｔ−１
近辺にペプチド特有の吸収を認める（日立格子型赤外分
光光度計．により測定。）。Ｒｓｐ２Ｊ 分子量：４８１２（アミノ酸配列決定の結果から）。
近辺にペプチド特有の吸収を認める（日立格子型赤外分
光光度計．により測定。）。Ｒｓｐ２Ｊ 分子量：４８１２（アミノ酸配列決定の結果から）。
但し超遠心機を用いる沈降平衝法で測定 （手段
はＳＰｌに準じる。）した結果では約 ５５００。構成
アミノ酸数：仙個 アミノ酸配列： （各符号の意味は前示のとおり、数字は配列順序を示す
。
はＳＰｌに準じる。）した結果では約 ５５００。構成
アミノ酸数：仙個 アミノ酸配列： （各符号の意味は前示のとおり、数字は配列順序を示す
。
）元素分析結果：
紫外部吸収スベクトルニ２７８ｎｍ附近にペプチド特
有の吸収を認める。
有の吸収を認める。
赤外部吸収スベクトルニ波数１６００ｃｍ−１近辺にペ
プ チド特有の吸収を認め
る。
プ チド特有の吸収を認め
る。
以上の如くＳＰｌとＳＰ２は物理化学的に極めて近似し
ており、従つて両者の分離も、カルボキシメチル（ＣＭ
）セルローズの如き陽イオン交換性担体を用いるクロマ
トグラフィーによらなければ相互の分離は困難である。
ており、従つて両者の分離も、カルボキシメチル（ＣＭ
）セルローズの如き陽イオン交換性担体を用いるクロマ
トグラフィーによらなければ相互の分離は困難である。
０来歴及び製法ョＳＰｌ及びＳＰ２ならびにそれらの類
似体は麦類（大麦、小麦など）に広く分布している。
似体は麦類（大麦、小麦など）に広く分布している。
小麦では普通系（ＴｒｊｔｉｃｕｒＴｌｍＯｎＯｃＯｕ
ｒｒｌ）のものに最も多量に含まれ、大麦では６条種（
ＨＯｒｄｅｕｍａｇｒｉＯｃｒｉ−ＴｈＯｎ）に属する
ものの方が２条種（Ｈ．ＳＰＯｎｔａ−Ｎｅｕｎｌ）系
のものに比し含量が高い。以下製法の１例を示す。小麦
粉４ｋ９を０．０５Ｎ硫酸２０ｅに懸濁し、３０℃に３
時間保つ。
ｒｒｌ）のものに最も多量に含まれ、大麦では６条種（
ＨＯｒｄｅｕｍａｇｒｉＯｃｒｉ−ＴｈＯｎ）に属する
ものの方が２条種（Ｈ．ＳＰＯｎｔａ−Ｎｅｕｎｌ）系
のものに比し含量が高い。以下製法の１例を示す。小麦
粉４ｋ９を０．０５Ｎ硫酸２０ｅに懸濁し、３０℃に３
時間保つ。
後、室温下に遠心（３０００ｒ′Ｐｍ，ｌＯ分）して不
溶物を除き、上清を１０Ｎ苛性ソーダで中和後５．０゜
Ｃで１２Ｉ寺間放置して生成する沈澱を遠心除去する。
上清を０．０５Ｍ燐酸塩バツアー（ＰＨ７．２）で飽和
したカルボキシメチルセルローズカラム（２．５×８０
ｃｍ）に負荷し、食塩濃度を０．１モルから０．８モル
に向つて直線状に増加させた上記バツアー溶液で溶出す
る（流出速度：５５ｍｔ／時間）。溶出液を一定量づつ
フラクシヨンコレクターで分画すると同時にその吸光度
を測定し、２８０ｎｍ附近に吸光を示す分画を所望によ
り１．５×７５ｃｍのカラムを用い同様の方法で再びク
ロマト分離に附した後、凍結乾燥に附す。収量１２０ｍ
９。上の乾燥物１２０ｍ９を０．２Ｍ重炭酸アンモニウ
ムで緩衝化したＣＭセルローズカラム（３．１×３３ｃ
ｍ）に負荷し、０．２〜０．８モルに濃度を変化させた
重炭酸アンモニウム溶液（ＰＨ８．Ｏ）を用い、６６ｍ
１／時間の速度で溶出する。これを１３ｍ１づつ分画し
ながら同時に２８０ｒ１ｍにおける吸光度を測り、分画
番号６３〜７５及び同８０〜８９の２種の吸光性画分を
集める。第１の画分はＳＰｌであり、第２の画分はＳＰ
２である。本発明はこれらの新規ポリペプチドをウィル
スの検出ならびに定量剤として利用することを要旨とす
るものてある。動植物細胞と用いるウィルスの培養手段
は、ウィルスの分離及びその性質把握ワクチンの製造な
らびにウィルス病の予防及び治療手段の研究などに利用
され、ウィルス研究に多くの献をしている。しかし、そ
れらの研究、開発の前提となるのは先づウィルスを検出
し、かつ゛定量することであるが、今日そのための手段
としては、（１）ウィルスに感染した細胞変性を起こす
ことを利用する方法（細胞変性効果利用法）。
溶物を除き、上清を１０Ｎ苛性ソーダで中和後５．０゜
Ｃで１２Ｉ寺間放置して生成する沈澱を遠心除去する。
上清を０．０５Ｍ燐酸塩バツアー（ＰＨ７．２）で飽和
したカルボキシメチルセルローズカラム（２．５×８０
ｃｍ）に負荷し、食塩濃度を０．１モルから０．８モル
に向つて直線状に増加させた上記バツアー溶液で溶出す
る（流出速度：５５ｍｔ／時間）。溶出液を一定量づつ
フラクシヨンコレクターで分画すると同時にその吸光度
を測定し、２８０ｎｍ附近に吸光を示す分画を所望によ
り１．５×７５ｃｍのカラムを用い同様の方法で再びク
ロマト分離に附した後、凍結乾燥に附す。収量１２０ｍ
９。上の乾燥物１２０ｍ９を０．２Ｍ重炭酸アンモニウ
ムで緩衝化したＣＭセルローズカラム（３．１×３３ｃ
ｍ）に負荷し、０．２〜０．８モルに濃度を変化させた
重炭酸アンモニウム溶液（ＰＨ８．Ｏ）を用い、６６ｍ
１／時間の速度で溶出する。これを１３ｍ１づつ分画し
ながら同時に２８０ｒ１ｍにおける吸光度を測り、分画
番号６３〜７５及び同８０〜８９の２種の吸光性画分を
集める。第１の画分はＳＰｌであり、第２の画分はＳＰ
２である。本発明はこれらの新規ポリペプチドをウィル
スの検出ならびに定量剤として利用することを要旨とす
るものてある。動植物細胞と用いるウィルスの培養手段
は、ウィルスの分離及びその性質把握ワクチンの製造な
らびにウィルス病の予防及び治療手段の研究などに利用
され、ウィルス研究に多くの献をしている。しかし、そ
れらの研究、開発の前提となるのは先づウィルスを検出
し、かつ゛定量することであるが、今日そのための手段
としては、（１）ウィルスに感染した細胞変性を起こす
ことを利用する方法（細胞変性効果利用法）。
（２）ウィルス感染細胞に赤血球を混合すると、赤血球
を凝集する現象を利用する方法（赤血球凝集反応法）。
を凝集する現象を利用する方法（赤血球凝集反応法）。
（３）あるウィルスに感染した細胞が、他のウィルスの
感染を阻止する現象を利用する方法（インターフェア法
）。ｊ（４）特定ウィルスに対し特異的に作用する抗血
清を作り、これを利用する方法（抗血清反応法）。
感染を阻止する現象を利用する方法（インターフェア法
）。ｊ（４）特定ウィルスに対し特異的に作用する抗血
清を作り、これを利用する方法（抗血清反応法）。
（５）ウィルス感染に因つて起こる細胞の代謝変化を利
用する方法（代謝変化測定法）。
用する方法（代謝変化測定法）。
（６）ウィルスを直接に、又は染色後、鏡検観察する方
法（鏡検法）。
法（鏡検法）。
などがあり、この中（１）法が最も一般的であるが、こ
れらの方法では検出できないウィルスも多数存在してお
り、例えばモロニー株マウス白血病ウィルス（Ｍｕｒｉ
ｎｅｌｅｕｋｅｍｉａｖｉｒｕａ（ＭＯ−ＭｕＬＶｖ）
）はその例である。
れらの方法では検出できないウィルスも多数存在してお
り、例えばモロニー株マウス白血病ウィルス（Ｍｕｒｉ
ｎｅｌｅｕｋｅｍｉａｖｉｒｕａ（ＭＯ−ＭｕＬＶｖ）
）はその例である。
また上記（１）〜（６）の普通法で検出可能な場合でも
、結果が不明瞭で正確な判断ができないとか、操作が著
しく煩雑であるとかの場合には、実際問題として以上の
方法をそのまま適用することは難しい。
、結果が不明瞭で正確な判断ができないとか、操作が著
しく煩雑であるとかの場合には、実際問題として以上の
方法をそのまま適用することは難しい。
このため、種々の改良法も提案され、例えばロウ等（Ｗ
．Ｐ．ＲＯｗｅ，ｅｔａｌ９ＶｉｒＯｌＯｇｙ４２，ｌ
ｌ３６〜９（１９７０）は上のＭＯ上ＵＬ，ｙに感染し
た細胞をマウス胎児細胞（ＭＥ）で培養後、紫外線照射
を行つて細胞を静止させ、これにＸＣ細胞（ラウス肉腫
ウイルスプラーク株で癌化したラット腫瘍細胞）を加え
て培養し、生成したプラーク数を染色、測定した。この
方法は、ＸＣ細胞の、ウィルス惑染細胞で増殖したウィ
ルスによつて容易に合胞体（Ｓｙｎｃｙｔｌｕｍ）を形
成する性質を利用したものであつて、いわば間接的なウ
ィルスの検出、定量法である。従つて、例えば細胞変性
効果を利用できる直接法に比べ対象が合胞体を作るウィ
ルスのみに限定されるのはやむを得ない。この他、抗血
清を利用する方法も一部利用されているが、抗血清の作
成が繁雑て時日を要する欠点がある。さらにインターフ
エエア法も特殊なウィルスにしか適用できない。以上の
理由から、ウィルス研究の指針としての、より簡便、か
つ正確で、しかも汎用性のあるウィルスの検出、定量手
段の開発が強く要望されていた。
．Ｐ．ＲＯｗｅ，ｅｔａｌ９ＶｉｒＯｌＯｇｙ４２，ｌ
ｌ３６〜９（１９７０）は上のＭＯ上ＵＬ，ｙに感染し
た細胞をマウス胎児細胞（ＭＥ）で培養後、紫外線照射
を行つて細胞を静止させ、これにＸＣ細胞（ラウス肉腫
ウイルスプラーク株で癌化したラット腫瘍細胞）を加え
て培養し、生成したプラーク数を染色、測定した。この
方法は、ＸＣ細胞の、ウィルス惑染細胞で増殖したウィ
ルスによつて容易に合胞体（Ｓｙｎｃｙｔｌｕｍ）を形
成する性質を利用したものであつて、いわば間接的なウ
ィルスの検出、定量法である。従つて、例えば細胞変性
効果を利用できる直接法に比べ対象が合胞体を作るウィ
ルスのみに限定されるのはやむを得ない。この他、抗血
清を利用する方法も一部利用されているが、抗血清の作
成が繁雑て時日を要する欠点がある。さらにインターフ
エエア法も特殊なウィルスにしか適用できない。以上の
理由から、ウィルス研究の指針としての、より簡便、か
つ正確で、しかも汎用性のあるウィルスの検出、定量手
段の開発が強く要望されていた。
本発明は以上の要望に応えようとするものてちる。本発
明者等は上記ＳＰの生化学的諸性質を研究する過程で、
ＳＰが接触阻止状態にある．正常細胞（細胞周期のＧ期
に在るもの）には作用しないが、ウィルス感染細胞に対
しては接触状態に在つてもこれに作用してそれを死滅さ
せるという、特異な作用を有するものであることを見出
した。本発明は正にこの知見に基くものである。ところ
で、前述のマウス白血病ウィルスは被感染細胞に対し細
胞変性作用を呈しない。即ち、この場合本ウィルス感染
細胞と非感染細胞とは、光学顕微鏡下の外観及びＤＮＡ
合成能等において全く相違が認められないので、慣用の
細胞変性効果によるウィルスの直接検出ないし定量が不
可能な例である。しかるに、実験の結果、接触阻止状態
に在る被感染細胞、例えばＡ３ｌ細胞（マウスＢＡＬＢ
／Ｃ由来のクローン）にＳＰを作用させると、ウィルス
感染細胞だけが死滅し、正常細胞は全く影響を受けない
ことが見出され、かつ、この現象は殆んど定量的であつ
て、前記ロウのＸＣ細胞利用法（ＸＣプラーク法）によ
る測定結果とよく一致することが判つた。因みに、この
ＸＣプラーク法では、ウィルス感染細胞に紫外線を照射
して細胞を静止させた後、それにＸＣ細胞を散布して生
成する合胞体の数から原のウィルス数を算出するので、
ウィルス惑受性を失つた細胞やウィルスに未感染の細胞
を生きた侭分離することはできない（原の細胞は紫外線
照射により静止せしめられており、しかも別のＸＣ細胞
が培地中に加えられている）。ところが、培地中に直培
ＳＰを添加する手段によれば、第一操作が極めて簡単で
ある上に、ウィルスの感染を免れた細胞が培地中にその
まま生残つているため、当該細胞（生残りの原因として
は、ウィルス量の不足や細胞の変異などが挙げられよう
）を分離して、種々の研究に利用できるという効果を持
つている。
明者等は上記ＳＰの生化学的諸性質を研究する過程で、
ＳＰが接触阻止状態にある．正常細胞（細胞周期のＧ期
に在るもの）には作用しないが、ウィルス感染細胞に対
しては接触状態に在つてもこれに作用してそれを死滅さ
せるという、特異な作用を有するものであることを見出
した。本発明は正にこの知見に基くものである。ところ
で、前述のマウス白血病ウィルスは被感染細胞に対し細
胞変性作用を呈しない。即ち、この場合本ウィルス感染
細胞と非感染細胞とは、光学顕微鏡下の外観及びＤＮＡ
合成能等において全く相違が認められないので、慣用の
細胞変性効果によるウィルスの直接検出ないし定量が不
可能な例である。しかるに、実験の結果、接触阻止状態
に在る被感染細胞、例えばＡ３ｌ細胞（マウスＢＡＬＢ
／Ｃ由来のクローン）にＳＰを作用させると、ウィルス
感染細胞だけが死滅し、正常細胞は全く影響を受けない
ことが見出され、かつ、この現象は殆んど定量的であつ
て、前記ロウのＸＣ細胞利用法（ＸＣプラーク法）によ
る測定結果とよく一致することが判つた。因みに、この
ＸＣプラーク法では、ウィルス感染細胞に紫外線を照射
して細胞を静止させた後、それにＸＣ細胞を散布して生
成する合胞体の数から原のウィルス数を算出するので、
ウィルス惑受性を失つた細胞やウィルスに未感染の細胞
を生きた侭分離することはできない（原の細胞は紫外線
照射により静止せしめられており、しかも別のＸＣ細胞
が培地中に加えられている）。ところが、培地中に直培
ＳＰを添加する手段によれば、第一操作が極めて簡単で
ある上に、ウィルスの感染を免れた細胞が培地中にその
まま生残つているため、当該細胞（生残りの原因として
は、ウィルス量の不足や細胞の変異などが挙げられよう
）を分離して、種々の研究に利用できるという効果を持
つている。
従つて、感染に用いたウィルス量（個数）が充分である
場合には、この手段は、ウィルス感受性につき変異した
細胞の分離や増殖性に変異を持つたウィルスの分離にも
利用できるという利点がある。このように、本発明試薬
（ＳＰ）を利用すると、（１） 細胞変性効果を示さな
いウィルスと宿主細胞との混合物から当該ウィルスを簡
単に検出、定量することができ、その操作は細胞変性効
果を有するウィルスと宿主細胞との混合物からウィルス
を検出する操作と殆んど同程度てある。
場合には、この手段は、ウィルス感受性につき変異した
細胞の分離や増殖性に変異を持つたウィルスの分離にも
利用できるという利点がある。このように、本発明試薬
（ＳＰ）を利用すると、（１） 細胞変性効果を示さな
いウィルスと宿主細胞との混合物から当該ウィルスを簡
単に検出、定量することができ、その操作は細胞変性効
果を有するウィルスと宿主細胞との混合物からウィルス
を検出する操作と殆んど同程度てある。
（■） ウィルスに対する感受性を失つた細胞の検出、
分離が可能となる。
分離が可能となる。
という、ウィルス研究上、新規、有用な手段が提供され
る。
る。
実施例１
（ウィルス感染細胞と非惑染細胞に対するＳＰの作用）
１−ａ実験試料細胞：Ａ３ｌ細胞（マウスＢＡＬＢ／Ｃ
由来のクロ ーン）ウイルスニＭＯ−ＭｕＬＶ（モロ
ニー株マウス白 血病ウィルス）培養液：イーグ
ルＭＥＭｌ５％牛脂児血清添加 培地ＳＰ：ＳＰｌ
とＳＰ２の混合物 １−ｂ実験方法 Ａ−３１細胞をプレート当り３×１（１ｆ′個分散し、
同時にＭｕＬＶの充分量を添加感染させて５日間３７℃
で培養後、接触阻止状態の発生を鏡検、確認した上で、
ＳＰを１０μｙ／ｍｌの割で培地に添加して４時間処理
する。
１−ａ実験試料細胞：Ａ３ｌ細胞（マウスＢＡＬＢ／Ｃ
由来のクロ ーン）ウイルスニＭＯ−ＭｕＬＶ（モロ
ニー株マウス白 血病ウィルス）培養液：イーグ
ルＭＥＭｌ５％牛脂児血清添加 培地ＳＰ：ＳＰｌ
とＳＰ２の混合物 １−ｂ実験方法 Ａ−３１細胞をプレート当り３×１（１ｆ′個分散し、
同時にＭｕＬＶの充分量を添加感染させて５日間３７℃
で培養後、接触阻止状態の発生を鏡検、確認した上で、
ＳＰを１０μｙ／ｍｌの割で培地に添加して４時間処理
する。
次いでニュートラルレッド（終濃度０．４％）で染色し
てからトリプシンて細胞を分散させ、被染色細胞を生細
胞とみなして、チ五ルクニビユルカー計算盤を用いて、
ＭＬｌＬ．■非感染ＡＧｌ細胞と比較しながら算定する
。１−Ｃ結果 下表（第１表）に示される。
てからトリプシンて細胞を分散させ、被染色細胞を生細
胞とみなして、チ五ルクニビユルカー計算盤を用いて、
ＭＬｌＬ．■非感染ＡＧｌ細胞と比較しながら算定する
。１−Ｃ結果 下表（第１表）に示される。
上表の示す如く、ＳＰはウィルス感染細胞を極めて特異
的に攻撃死滅させることが窺われる。
的に攻撃死滅させることが窺われる。
実施例２ （ウィルス量の測定）
２−ａ実験材料
細胞：Ａ３ｌ細胞（１−ａと同じ）
ＸＣ細胞（ラウスザルコーマウイルスプ ラーク株
で癌化したラットの腫瘍細胞）ウイルスニＭｕＬＶ（ｙ
−ａ）と同じ）培養液：イーグルＭＥＭ（１−ａ）と同
じ）ＳＰ：１−ａ）と同じ。
で癌化したラットの腫瘍細胞）ウイルスニＭｕＬＶ（ｙ
−ａ）と同じ）培養液：イーグルＭＥＭ（１−ａ）と同
じ）ＳＰ：１−ａ）と同じ。
２−ｂ実験方法
ＭｕＬＶを１０１倍から１ＣＰ倍まで段階的に稀釈，し
、／！３１細胞が各皿当り５×１０１個づつ存在する各
プレート上に夫々の稀釈液を添加し、５時間培養して接
触阻止状態に達したのを確認してからトリプシンで処理
する。
、／！３１細胞が各皿当り５×１０１個づつ存在する各
プレート上に夫々の稀釈液を添加し、５時間培養して接
触阻止状態に達したのを確認してからトリプシンで処理
する。
分散された細胞を各プレート当り３等分し、３７℃で接
触阻止状態にト達するまで再び培養する。以上操作を２
回反覆し、全細胞を被感染細胞化する（もちろん、これ
は分散液中にＭｕＬ，■が存在している場合で、存在し
ていなければ感染は起こらない。）。次に、以上の如く
して得た接触阻止細胞のプレートに、終濃度１０μｙ／
Ｍｔの割でＳＰを加え、２峙間後にニュートラルレッド
で染色し、実施例１と同様にして生細胞数を数える。一
方、上の実験と並行に、前記ＸＣ−プラーク法を用いて
比較を行う。
触阻止状態にト達するまで再び培養する。以上操作を２
回反覆し、全細胞を被感染細胞化する（もちろん、これ
は分散液中にＭｕＬ，■が存在している場合で、存在し
ていなければ感染は起こらない。）。次に、以上の如く
して得た接触阻止細胞のプレートに、終濃度１０μｙ／
Ｍｔの割でＳＰを加え、２峙間後にニュートラルレッド
で染色し、実施例１と同様にして生細胞数を数える。一
方、上の実験と並行に、前記ＸＣ−プラーク法を用いて
比較を行う。
このため、接触阻止状態の細胞に、１５〜２囲２間紫外
線を照射するか又はマイトマシンＣを５〜１０ｐｙ／ｍ
ｌの割で加えて細胞を静止させた後、ＸＣ細胞を各プレ
ート当り２〜４×１Ｃｆ′／ｍｌ個の割で加える。２４
時間後メタノールで固定し、次いでギムザ染色を行つて
、生成したプラーク数を計算する。
線を照射するか又はマイトマシンＣを５〜１０ｐｙ／ｍ
ｌの割で加えて細胞を静止させた後、ＸＣ細胞を各プレ
ート当り２〜４×１Ｃｆ′／ｍｌ個の割で加える。２４
時間後メタノールで固定し、次いでギムザ染色を行つて
、生成したプラーク数を計算する。
シーｃ結果
結果は下表（第２表）に示される。
上表より、ウィルスの稀釈度が１０−４より低いところ
では、ＳＰ処理により生細胞数の急激な減少が認められ
るが、これはＳＰに感受性の高いウィルス感染細胞の存
在を示すものである。
では、ＳＰ処理により生細胞数の急激な減少が認められ
るが、これはＳＰに感受性の高いウィルス感染細胞の存
在を示すものである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 一般式（一次構造式） ▲数式、化学式、表等があります▼ （但し上式中Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｃｙｎ、Ｇｌｎ
、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、
Ｔｈｒ、Ｔｙｒ及びＶａｌは夫々Ｌ型のアラニン、アル
ギニン、アスパラギン、１／２シスチン、グルタミン、
グリシン、ロイシン、リジン、フェニルアラニン、プロ
ニン、セリン、スレオニン、チロシン及びバリン残基を
示し、かつＲ＿１〜Ｒ＿５も夫々以下のＬアミン酸残基
を意味する。 Ｒ＿１リジンのとき：−Ｒ＿２：アスパラギン、Ｒ＿３
：ロイシン、Ｒ＿４：スレオニン、Ｒ＿５：アスパラギ
ン酸。 Ｒ＿１がアルギンニンのとき：−Ｒ＿２及びＲ＿５：グ
リシン、Ｒ＿３：イソロイシン、Ｒ＿４：セリンなお式
中「＝」は−Ｓ−Ｓ−結合を示し、また各アミノ酸記号
の傍に附記されたアラビア数字はＮ末端から附されたア
ミノ酸配列番号である。 ）で示される新規ポリペプチドを有効成分として含むウ
ィルスの検出、定量剤。２ 一次構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （但し上式中Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ
、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、
Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ及びＶａｌは夫々Ｌ型のアラニ
ン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、１／
２シスチン、グルタミン、グリシン、ロイシン、リジン
、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、
チロシン及びバリン残基を示す。 なお式中「＝」は−Ｓ−Ｓ−結合を示し、また各アミノ
酸記号の傍に附記されたアラビア数字はＮ末端から附さ
れたアミノ酸配列番号である。）を有する特許請求の範
囲第１項記載の新規ポリペプチドを有効成分として含む
ウィルスの検出、定量剤。３ 一次構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （但し上式中Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ
、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、
Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ及びＶａｌは夫々Ｌ型のアラニ
ン、アルギニン、アスパラギン、１／２シスチン、グル
タミン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、リジン、
フェニルアラニン、プロニン、セリン、スレオニン、チ
ロシン及びバリン残基を示す。 なお式中「＝」は−Ｓ−Ｓ−結合を示し、また各アミノ
酸記号の傍に附記されたアラビア数字はＮ末端から附さ
れたアミノ酸配列番号である。）を有する特許請求の範
囲第項記載の新規ポリペプチドを有効成分として含むウ
ィルスの検出、定量剤。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP53124412A JPS6058960B2 (ja) | 1978-10-09 | 1978-10-09 | ウィルスの検出，定量剤 |
| DE19792954675 DE2954675C2 (de) | 1978-10-09 | 1979-10-05 | Verwendung von Polypeptiden zur Bekämpfung von Krebs |
| US06/082,657 US4287185A (en) | 1978-10-09 | 1979-10-09 | Method for the detection of viruses |
| US06/274,454 US4427657A (en) | 1978-10-09 | 1981-06-17 | Method for treatment of transplanted tumors in mice |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP53124412A JPS6058960B2 (ja) | 1978-10-09 | 1978-10-09 | ウィルスの検出，定量剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5550897A JPS5550897A (en) | 1980-04-14 |
| JPS6058960B2 true JPS6058960B2 (ja) | 1985-12-23 |
Family
ID=14884823
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP53124412A Expired JPS6058960B2 (ja) | 1978-10-09 | 1978-10-09 | ウィルスの検出，定量剤 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US4287185A (ja) |
| JP (1) | JPS6058960B2 (ja) |
| DE (1) | DE2954675C2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0587368U (ja) * | 1992-04-30 | 1993-11-26 | エヌオーケー株式会社 | ガスケット |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6058960B2 (ja) | 1978-10-09 | 1985-12-23 | サントリー株式会社 | ウィルスの検出，定量剤 |
| US4497799A (en) * | 1981-11-09 | 1985-02-05 | Suntory Ltd. | Polypeptide carcinostatic agent |
| DE3275998D1 (en) * | 1981-12-22 | 1987-05-14 | Baylor College Medicine | Immunological composition and method for hepatitis b virus |
| IE57724B1 (en) * | 1983-05-09 | 1993-03-24 | Todaro George Joseph | Biologically active polypeptides |
| US5240912A (en) * | 1983-05-09 | 1993-08-31 | Todaro George J | Transforming growth factor (TGF) peptides |
| US4863899A (en) * | 1983-05-09 | 1989-09-05 | Todaro George J | Biologically active polypeptides |
| JPS6034997A (ja) * | 1983-05-09 | 1985-02-22 | ジヨージ、ジヨセフ、トダロ | 生物学的活性ポリペプチド類 |
| US4877437A (en) * | 1988-04-29 | 1989-10-31 | Glasstech International L.P. | Vacuum platen for sharp bends |
| US4921847A (en) * | 1988-05-23 | 1990-05-01 | Engelhard Corporation | Trihalo(amine)gold(III) anti-tumor complexes |
| US5376640A (en) * | 1989-12-25 | 1994-12-27 | Nisshin Flour Milling Co., Ltd. | Lipolytic enzyme inhibitors |
| JP2960947B2 (ja) * | 1989-12-25 | 1999-10-12 | 日清製粉株式会社 | 脂質分解酵素阻害剤 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6058960B2 (ja) | 1978-10-09 | 1985-12-23 | サントリー株式会社 | ウィルスの検出，定量剤 |
-
1978
- 1978-10-09 JP JP53124412A patent/JPS6058960B2/ja not_active Expired
-
1979
- 1979-10-05 DE DE19792954675 patent/DE2954675C2/de not_active Expired - Lifetime
- 1979-10-09 US US06/082,657 patent/US4287185A/en not_active Expired - Lifetime
-
1981
- 1981-06-17 US US06/274,454 patent/US4427657A/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0587368U (ja) * | 1992-04-30 | 1993-11-26 | エヌオーケー株式会社 | ガスケット |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5550897A (en) | 1980-04-14 |
| US4427657A (en) | 1984-01-24 |
| US4287185A (en) | 1981-09-01 |
| DE2954675C2 (de) | 1991-07-18 |
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